KR101010100B1 - Method of manufacturing embryonic stem cell being introduced gene using nano particles - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배아 줄기세포를 배양 용기에 부착하는 배양 단계, 자성을 갖는 나노 입자가 포함된 나노 입자 용액 및 특정 세포분화 유도 유전자를 혼합하여 나노입자-유전자 결합체가 포함된 유전자 혼합물을 준비하는 단계, 상기 유전자 혼합물을 상기 배양 용기에 도포하는 단계, 및 상기 배양 용기의 수직 방향으로 자기장을 형성시켜 상기 나노입자-유전자 결합체를 상기 배아줄기세포 내에 침투시키는 단계를 포함하는 유전자도입 배아 줄기세포의 제조 방법을 제공한다. The present invention comprises the steps of culturing the embryonic stem cells attached to the culture vessel, a nanoparticle solution containing a magnetic nanoparticles and a specific cell differentiation inducing gene mixture to prepare a gene mixture containing a nanoparticle-gene conjugate, Applying the gene mixture to the culture vessel, and forming a magnetic field in the vertical direction of the culture vessel to infiltrate the nanoparticle-gene conjugate into the embryonic stem cells. To provide.
Description
본 발명은 유전자도입 배아 줄기세포의 제조 방법에 관한 것으로서, 배아 줄기세포 내로 효율적으로 특정 유전자를 도입할 수 있고, 장기간의 배양에도 안정적으로 유전자 발현이 가능한 유전자도입 배아 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a transgenic embryonic stem cell, and to a method for producing a transgenic embryonic stem cell capable of introducing a specific gene efficiently into embryonic stem cells and stably expressing the gene even in long-term culture. .
본 발명은 유전자도입 배아 줄기세포의 제조 방법에 관한 것으로서, 배아 줄기세포 내로 효율적으로 특정 유전자를 도입할 수 있고, 장기간의 배양에도 안정적으로 유전자 발현이 가능한 유전자도입 배아 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a transgenic embryonic stem cell, and to a method for producing a transgenic embryonic stem cell capable of introducing a specific gene efficiently into embryonic stem cells and stably expressing the gene even in long-term culture. .
최근, 세계적으로 난치병치료를 위해 장기이식이 아닌 세포대체요법(cell replacement therapy)을 이용하고자 하는 노력들이 적극적으로 시도되고 있다. Recently, efforts have been actively attempted to use cell replacement therapy rather than organ transplantation for the treatment of intractable disease.
배아 줄기세포는 성체 줄기세포에 비해 분화능이 뛰어나 다양한 난치성 질환을 치료해 줄 수 있을 것으로 기대되고 있는 세포이다. Embryonic stem cells are expected to be able to treat a variety of refractory diseases because they are superior to adult stem cells.
일반적으로 기능을 상실한 특정 장기에 이식하기 위한 목적으로 특수성장인자 또는 유도인자를 배지에 첨가하는 고전적인 특정세포분화유도 방법은 수율이 너무 낮은 문제점이 있다.In general, the specific cell differentiation-inducing method of adding a special growth factor or inducer to a medium for the purpose of transplanting to a specific organ which has lost function has a problem in that the yield is too low.
이러한 종래 방법을 대체하기 위하여 특정세포분화유도 유전자를 배아줄기세포에 직접주입하여 분화를 유도하고자 하는 다양한 방법이 시도되고 있다. 예를 들면, 바이러스 백터를 이용한 방법, 전압충격법, 화학물질을 이용한 방법 등이다. In order to replace these conventional methods, various methods have been attempted to induce differentiation by directly injecting specific cell differentiation inducing genes into embryonic stem cells. For example, a method using a viral vector, a voltage shock method, a method using a chemical substance and the like.
그러나 이들 대체 방법 역시 수율이 낮고 유전자가 배아줄기 세포에 주입되었다 하더라도 생식선전이(germ line transmission)가 어려워 일시적인 유전자발현으로 효율성을 기대하기 어려운 실정이다. However, these alternative methods also have low yields, and even if the genes are injected into embryonic stem cells, germ line transmission is difficult, so it is difficult to expect efficiency due to temporary gene expression.
본 발명은 전술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 감안하고 이를 해결하고자 하는 것으로서, 수율이 우수하고, 장기간 배양에서도 안정적으로 유전자 발현이 가능한 유전자 도입 배아 줄기세포의 제조 방법을 제공함을 목적으로 한다. The present invention has been made in view of the problems of the prior art as described above, and aims to provide a method for producing a transgenic embryonic stem cell which is excellent in yield and capable of stably expressing genes even in long-term culture.
본 발명의 일 특징에 따른 유전자 도입 배아 줄기세포의 제조 방법은 자성을 갖는 나노 입자를 특정 세포분화 유도 유전자의 유전자 주입 매개체로 이용하여 자기장 내에서 배아줄기세포에 주입하는 것을 특징으로 한다. The method for producing a transgenic embryonic stem cell according to an aspect of the present invention is characterized in that the nanoparticles having magnetic properties are injected into embryonic stem cells in a magnetic field using a gene injection medium for a specific cell differentiation inducing gene.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 특징에 따른 유전자 도입 배아 줄기세포의 제조 방법은 배아줄기세포를 배양 용기에 부착하는 배양 단계, 자성을 갖는 나노 입자가 포함된 나노 입자 용액 및 특정 세포분화 유도 유전자를 혼합하여 나노입자-유전자 결합체가 포함된 유전자 혼합물을 준비하는 단계, 상기 유전자 혼합물을 상기 배양 용기에 도포하는 단계, 및 상기 배양 용기의 수직 방향으로 자기장을 형 성시켜 상기 나노입자-유전자 결합체를 상기 배아줄기세포 내에 침투시키는 단계를 포함한다. More specifically, the method for producing a transgenic embryonic stem cell according to an aspect of the present invention comprises a culture step of attaching embryonic stem cells to a culture vessel, a nanoparticle solution containing magnetic nanoparticles and a specific cell differentiation inducing gene Preparing a gene mixture including nanoparticle-gene conjugates by mixing, applying the gene mixture to the culture vessel, and forming a magnetic field in a vertical direction of the culture vessel to form the nanoparticle-gene conjugate Infiltrating into embryonic stem cells.
상기 줄기 세포의 배양은 상기 배아줄기세포가 배양 용기에 잘 부착되도록 이루어지며 상기 배양 단계는 10 내지 30 시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. The stem cells are cultured so that the embryonic stem cells adhere well to the culture vessel, and the culturing step is preferably performed for 10 to 30 hours.
상기 나노 입자는 내부에 금속 산화물 코어를 포함하고 상기 금속 산화물 코어를 감싸는 고분자 막으로 이루어진 것을 사용할 수 있다. 상기 금속 산화물 코어는 산화철 등으로 이루어질 수 있다.The nanoparticles may be formed of a polymer film including a metal oxide core therein and surrounding the metal oxide core. The metal oxide core may be made of iron oxide or the like.
상기 나노 입자로서 직경이 5 내지 100 nm인 나노 입자를 사용하는 것이 바람직하다.It is preferable to use nanoparticles having a diameter of 5 to 100 nm as the nanoparticles.
상기 유전자 혼합물은 상기 나노 입자 및 특정 세포분화 유도 유전자를 1:1~100의 중량비로 포함하는 것이 바람직하다. The gene mixture preferably comprises the nanoparticles and specific cell differentiation inducing gene in a weight ratio of 1: 1 to 100.
한편, 상기 자기장의 잔류자기력(remanence)의 세기는 1000 내지 1200 mT인 것이 바람직하다. On the other hand, the strength of the residual magnetic force (remanence) of the magnetic field is preferably 1000 to 1200 mT.
또한, 상기 나노입자는 생분해성을 갖는 것을 특징으로 한다. In addition, the nanoparticles are characterized by having biodegradability.
이하 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 도입 배아줄기세포의 제조 방법을 설명하기 위한 개념도이다. 1 is a conceptual diagram for explaining a method for producing a transgenic embryonic stem cell according to an embodiment of the present invention.
도 1을 참조하면, 특정 세포분화 유도 유전자를 배아줄기세포에 도입하기 위해서는 나노입자 및 상기 특정 세포분화 유도 유전자를 혼합 및 반응시켜 나노입자 -유전자 결합체를 준비하여야 한다. Referring to FIG. 1, in order to introduce a specific cell differentiation inducing gene into an embryonic stem cell, a nanoparticle-gene complex should be prepared by mixing and reacting the nanoparticle and the specific cell differentiation inducing gene.
본 방법에 따른 나노 입자는 자성 및 생분해성을 갖는다. 상기 나노 입자는 통상적으로 소정의 용매에 분산되어 용액 상태로 준비된다.Nanoparticles according to the method are magnetic and biodegradable. The nanoparticles are typically prepared in solution by dispersing in a predetermined solvent.
상기 나노 입자는 중심부에 금속 산화물로 이루어진 코어를 포함하고, 상기 코어의 표면에는 고분자 물질이 코팅되어 이루어진 고분자 막을 포함한다. 상기 나노 입자의 입경은 5 내지 100nm인 것이 바람직하다. The nanoparticles include a core made of a metal oxide in a central portion thereof, and a polymer film formed by coating a polymer material on a surface of the core. It is preferable that the particle diameter of the said nanoparticle is 5-100 nm.
상기 금속 산화물로서는, 산화철이 사용될 수 있다. Iron oxide may be used as the metal oxide.
상기 나노입자 및 유전자가 용액 상에서 혼합되어 준비된 유전자 혼합물 내에는 나노입자 및 상기 특정 유전자가 1: 1 ~ 100의 중량비로 포함되는 것이 바람직하다. In the gene mixture prepared by mixing the nanoparticles and genes in a solution, the nanoparticles and the specific genes are preferably included in a weight ratio of 1: 1 to 100.
상기 혼합물은 10 내지 30분간 방치되어 충분히 혼합될 수 있도록 배려한다. The mixture is allowed to stand for 10 to 30 minutes to allow sufficient mixing.
상기 나노입자-유전자 결합체가 포함된 유전자 혼합물은 미리 준비된 배아줄기세포 배양용기 내에 도포 및 혼합된다. 상기 배아줄기세포 배양용기는 미리 준비되는 것으로서, 약 10 시간 내지 30 시간 동안 방치하여 상기 배아줄기세포가 상기 배양 용기에 견고하게 부착될 수 있도록 한다. The gene mixture including the nanoparticle-gene conjugate is applied and mixed in a embryonic stem cell culture vessel prepared in advance. The embryonic stem cell culture vessel is prepared in advance, so that the embryonic stem cells can be firmly attached to the culture vessel by standing for about 10 to 30 hours.
상기 나노입자-유전자 결합체가 포함된 혼합물 및 상기 배아줄기세포는 약 10 내지 30분간 자기장 내에서 혼합됨으로써, 상기 나노입자-유전자 결합체가 상기 배아줄기세포 내로 침투된다. The mixture containing the nanoparticle-gene conjugate and the embryonic stem cell are mixed in a magnetic field for about 10 to 30 minutes, so that the nanoparticle-gene conjugate is penetrated into the embryonic stem cell.
상기 자기장은 상기 배아줄기세포가 배양된 배양용기와 수직한 방향으로 형성되며, 상기 자기장의 잔류자기력(remanence)의 세기는 1000 내지 1200 mT로 유지 되는 것이 바람직하다. The magnetic field is formed in a direction perpendicular to the culture vessel in which the embryonic stem cells are cultured, the strength of the residual magnetic force (remanence) of the magnetic field is preferably maintained at 1000 to 1200 mT.
상기 나노입자-유전자 결합체가 침투되면, 배양액을 교체하고 소정의 목적에 따라 상기 특정 세포분화 유도 유전자를 발현시키기 위하여 상기 나노입자-유전자 결합체가 침투된 배아줄기세포에 대하여 추가적인 배양을 실시한다. When the nanoparticle-gene conjugate is infiltrated, the culture medium is replaced and additional cultures are performed on embryonic stem cells in which the nanoparticle-gene conjugate is infiltrated in order to express the specific cell differentiation inducing gene according to a predetermined purpose.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세하게 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the technical spirit of the present invention is not limited by the following examples.
유전자 도입 및 발현 성능 검증Gene introduction and expression performance verification
1. 대상 분류1. Target classification
유전자 도입 하루 전에 대상 세포를 다음과 같이 준비하였다. One day before the transduction, the target cells were prepared as follows.
1) 실험군인 D3 마우스 배아줄기세포를 1x104개의 농도로 24웰(well)에 배양하였다.1) Experimental group D3 mouse embryonic stem cells were cultured in 24 wells at a concentration of 1 × 10 4 .
2) 비교군인 NIH3T3 세포를 1x104개의 농도로 24웰에 배양하였다. 2) Comparative groups NIH3T3 cells were cultured in 24 wells at a concentration of 1 × 10 4 .
2. 마우스 배아줄기세포에 유전자 도입2. Introduction of genes into mouse embryonic stem cells
(1) 실험군(1) experimental group
나노입자 용액(제품명: polymag)과 eGFP-N1 유전자를 1:1 (1ul ; 1ug) 의 비율로 혼합하여 15분간 상온에서 방치 후, 이 혼합물을 세포 배양 접시에 뿌려 준 후 전용 자석판 위에 올려 37℃ 배양기에서 15 분간 반응시켰다. 반응 후 배양액을 교체하여 37℃ 배양기에서 배양하였다.Mix nanoparticle solution (product name: polymag) and eGFP-N1 gene at a ratio of 1: 1 (1ul; 1ug) and leave at room temperature for 15 minutes.After spraying the mixture on a cell culture dish, put it on a dedicated magnetic plate and place it at 37 ℃. The reaction was carried out for 15 minutes in the incubator. After the reaction, the culture medium was replaced and cultured in a 37 ° C. incubator.
(2) 비교군(2) comparison group
FuGENE 6 시약을 eGFP-N1 유전자와 3:1 (3ul ; 1ug) 의 비율로 15분간 반응시키고, 이 혼합액을 세포 배양 접시에 뿌려 준 후 37℃ 배양기에서 24시간 반응 시켰다. 반응 후 배양액을 교체하고 37℃ 배양기에서 배양하였다. The FuGENE 6 reagent was reacted with the eGFP-N1 gene at a ratio of 3: 1 (3ul; 1ug) for 15 minutes, and the mixture was sprayed on a cell culture dish and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After the reaction, the culture medium was replaced and incubated in a 37 ° C. incubator.
도 2는 NIH3T3 세포와 마우스 배아줄기세포에서의 eGFP 형광발현 사진이다. Figure 2 is a photograph of eGFP fluorescence in NIH3T3 cells and mouse embryonic stem cells.
도 2를 참조하면, 마우스 배아 줄기 세포에서 나노입자를 사용했을 때 높은 eGFP 형광발현을 나타냄을 알 수 있었다. Referring to Figure 2, it can be seen that when using the nanoparticles in mouse embryonic stem cells exhibited high eGFP fluorescence.
도 3은 유전자 투입 량에 따른 도입 성능 결과를 보여주는 형광 사진이다. Figure 3 is a fluorescence picture showing the results of introduction performance according to the gene dosage.
0.25, 1, 2ug/ml 의 pEGFP-N1 유전자 농도와 polymag 2ul 또는 FuGENE6 6ul를 각각 처리하여 유전자 도입 여부를 48시간 후에 형광현미경하에서 조사하였을 때, 2ug의 농도에서 가장 나은 유전자 발현율을 확인하였다. 24-well을 이용하여 500ul 내용 물로 반응시키므로 실제 well 내의 농도는 앞서 말한 바와 같이 PolyMAG 사용의 경우 1ug/1ul (1:1), FuGENE 6의 경우 1ug/3ul (1;3)이 된다.When the genes were irradiated under fluorescence microscopy 48 hours after the pEGFP-N1 gene concentration of 0.25, 1, 2ug / ml and polymag 2ul or FuGENE6 6ul, respectively, the best gene expression was confirmed at the concentration of 2ug. As it is reacted with 500ul contents using 24-well, the concentration in the well is 1ug / 1ul (1: 1) for PolyMAG use and 1ug / 3ul (1; 3) for FuGENE 6 as mentioned above.
3. FACS (Fluorescence activated cell sorter)를 통한 유전자 도입 효율 검정3.Effection of gene introduction efficiency through FACS (Fluorescence activated cell sorter)
48시간 후 배양 세포의 eGFP-N1 유전자 도입여부는 FACS 분석법을 통하여 실시하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 48 hours later, eGFP-N1 gene was introduced into cultured cells by FACS analysis. The results are shown in FIG.
도 4는 FACS 염색을 통한 마우스 배아줄기세포에서의 eGFP 형광 발현 분석 결과를 도시한 그래프이다. 4 is It is a graph showing the results of eGFP fluorescence expression analysis in mouse embryonic stem cells through FACS staining.
도 4를 참조하면, FACS 분석을 통하여 마우스 배아줄기세포에 나노입자를 이용해서 형질전환 하였을 때 eGFP 유전자가 45% 이상 발현하는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 4, when the mouse embryonic stem cells were transformed by using nanoparticles, FAG analysis showed that the eGFP gene was expressed by 45% or more.
4. eGFP 유전자가 도입 된 형질전환 세포주의 선별 4. Selection of Transgenic Cell Line Introduced with eGFP Gene
유전자 도입 48시간 후 형광발현을 형광현미경하에서 검정한 후 250ug/ml G418 항생제를 2일 간격으로 처리하였다. 2주 후 선별된 세포 콜로니는 각각 따로 증식 배양하였다.48 hours after transfection, the fluorescence was assayed under fluorescence microscopy and then treated with 250 ug / ml G418 antibiotics at 2 day intervals. After 2 weeks, the selected cell colonies were propagated separately.
5. 면역학적 세포염색(immunocytochemistry) 와 FACS 방법을 통한 형질전환 마우스 배아줄기세포의 미분화능 검정5. Undifferentiation of Transgenic Mouse Embryonic Stem Cells by Immunocytochemistry and FACS Method
형질전환 된 마우스 배아줄기세포를 4well 접시에 부착하여 미분화 표지인자인 Oct4 와 SSEA1 항체를 반응시키고 면역학적 세포염색과 FACS를 실시하여 미분화능을 검정하였다. The transformed mouse embryonic stem cells were attached to a 4 well plate to react the undifferentiated markers Oct4 and SSEA1 antibody, and immunological cell staining and FACS were performed to test the undifferentiated ability.
도 5는 면역학적 세포염색을 통하여 형질전환된 마우스 배아줄기세포의 미분화능 검정 결과를 보여주는 사진이다. Figure 5 is a photograph showing the results of undifferentiated assay of mouse embryonic stem cells transformed through immunological cell staining.
도 5를 참조하면, 나노입자를 이용하여 eGFP 유전자를 형질전환 도입 후 미분화능을 검증한 결과 Oct4, SSEA1등의 미분화 관련 유전자가 발현됨을 면역학적 세포염색을 통하여 확인할 수 있었다(A, D). 또한, DAPI 염색한 결과 전체의 세포가 미분화 줄기세포임을 확인할 수 있었다(B,E). 한편, 전체 세포에 GFP 유전자가 완전하게 도입되었음을 확인할 수 있었다(C,F)Referring to FIG. 5, as a result of verifying undifferentiation ability after transduction of eGFP gene using nanoparticles, it was confirmed through immunological cell staining that undifferentiation related genes such as Oct4 and SSEA1 were expressed (A, D). In addition, as a result of DAPI staining, it was confirmed that the whole cells were undifferentiated stem cells (B, E). On the other hand, it was confirmed that the GFP gene was completely introduced into the whole cell (C, F)
6. 형질전환된 마우스 배아줄기세포를 이용한 신경세포 분화6. Neuronal differentiation using transformed mouse embryonic stem cells
Retinoic acid를 이용한 4-/4+ 방법을 이용하여 형질전환된 마우스 배아줄기세포를 신경세포로 분화 유도하였다. 유도된 신경세포는 형광현미경을 통하여 GFP 형광발현을 검정하였다. 또한 면역학적 염색을 통하여 신경세포 표지인자인 TUj1과 성상세포 마커인 GFAP 항체를 반응시켜 염색을 실시하였다. Transformed mouse embryonic stem cells were induced into neurons by using the 4- / 4 + method using retinoic acid. Induced neurons were assayed for GFP fluorescence by fluorescence microscopy. In addition, staining was performed by reacting TUj1, a neuronal marker, and GFAP antibody, an astrocyte marker, through immunological staining.
도 6은 나노입자를 이용하여 eGFP 유전자가 도입된 형질전환 마우스 배아줄기세포의 신경세포 분화를 보여주는 사진이다.6 is a photograph showing neuronal differentiation of transgenic mouse embryonic stem cells into which the eGFP gene was introduced using nanoparticles.
도 6을 참조하면, 나노입자를 이용하여 획득한 형질전환 마우스 배아줄기세포 (A, B)를 4-/4+분화 방법을 이용하여 신경세포로 분화시켰을 때 배상체(embryonic body) (C, D)와 신경모양의 세포 (E, F) 에서 eGFP 유전자가 발현함을 확인할 수 있었고 (B, D & F), 외배엽의 성상세포 표지인자나 신경세포 표지인자인 GFAP와 TUJ1이 발현됨이 확인할 수 있었다(G, H). 또한, 중배엽의 근육제포 표지인자인 SMA(smooth muscle actin)가 발현됨을 확인됨을 알 수 있었고(I), 내배엽의 표지인자로서 간세포 표지인자인 헤파토사이트 핵인자-3β(hepatocyte nuclear factor-3β, HNF-3β)가 발현됨을 면역학적 세포염색을 통하여 확인할 수 있었다(J).Referring to Figure 6, when transformed mouse embryonic stem cells (A, B) obtained using nanoparticles into neurons using a 4- / 4 + differentiation method (embryonic body) (C, D) and eGFP genes were expressed in neuronal cells (E, F) (B, D & F), and GFAP and TUJ1, astrocytic markers or neuronal markers of ectoderm, were expressed. (G, H). In addition, it was confirmed that SMA (smooth muscle actin), which is a marker of mesodermal myoblast, was expressed (I), and hepatocyte nuclear factor-3β, a hepatocyte marker, as a marker of endoderm HNF-3β) expression was confirmed by immunological cell staining (J).
6. RT-PCR 방법을 이용한 미분화 및 분화 특성 검정6. Differentiation and Differentiation Characterization Using RT-PCR Method
트리졸(trizol) 시약을 이용하여 미분화와 분화된 마우스 배아줄기세포에서 total RNA를 추출하였다. oligo dT와 역전사 효소를 이용하여 total RNA에서 cDNA를 합성하였다. 미분화 또는 분화 마커를 이용하여 PCR을 실시하였다.Total RNA was extracted from undifferentiated and differentiated mouse embryonic stem cells using a trizol reagent. cDNA was synthesized from total RNA using oligo dT and reverse transcriptase. PCR was performed using undifferentiated or differentiation markers.
도 7은 RT-PCR 분석을 통한 줄기세포와 EB 형성시 관련 유전자 발현 검정 결과를 보여주는 도면이다. 7 is a view showing the results of the relevant gene expression assay when forming stem cells and EB by RT-PCR analysis.
도 7을 참조하면, 아래와 같다.Referring to Figure 7, it is as follows.
A: 나노입자를 이용하여 형질전환된 마우스 배아줄기세포에서의 미분화 관련 유전자 분석A: Analysis of undifferentiated genes in mouse embryonic stem cells transformed with nanoparticles
- OCT4, Nanog, TERT 유전자가 발현됨을 확인할 수 있어다(1, 2, 3). -OCT4, Nanog, TERT gene expression can be confirmed (1, 2, 3).
B: 4-/4+ 방법을 이용하여 형질전환된 줄기세포를 EB 형성 후 germ layer 관련 유전자 분석B: Gene analysis of germ layer after EB formation of transformed stem cells using 4- / 4 + method
- 1-3 미분화 관련 유전자(Oct4, Nanog, TERT)1-3 undifferentiated genes (Oct4, Nanog, TERT)
- 4-5 Ectoderm 관련 유전자(Keratin, Map-2)4-5 Ectoderm-related genes (Keratin, Map-2)
- 6-7 Endoderm 관련 유전자(β-amylase,α-fetoprotein)6-7 Endoderm related genes (β-amylase, α-fetoprotein)
- 8-9 Mesoderm 관련 유전자(Rennin, β-enolse)8-9 Mesoderm related genes (Rennin, β-enolse)
상기 A 결과를 참조하면, 형질전환된 마우스 배아줄기세포가 미분화특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. Referring to the results of A, it was confirmed that the transformed mouse embryonic stem cells have undifferentiated properties.
상기 B 결과를 참조하면, 분화 유도하였을 때 다양한 조직으로의 분화가 가능함을 나타내어 줄기세포의 고유특성을 보여줌을 알 수 있었다. Referring to the results of B, it was found that differentiation into various tissues was possible when inducing differentiation, thereby showing intrinsic characteristics of stem cells.
7. 서던 압지기술(southern blotting)을 이용한 도입 유전자의 DNA 인테그레이션 확인7. Confirmation of DNA integration of the introduced gene using Southern blotting
형질전환된 마우스 배아줄기세포를 total genomic DNA를 추출하였다. genomic DNA는 특정 제한효소를 (EcoRI, NotI, EcoRI+NotI) 사용하여 잘라 내었다. DNA 시료를 1% agarose에 전기영동을 실시한 후 hybond N membrane으로 transfer한다. 32P-labeled DNA probe(primers 5'-GAGGTGAAGTTCGAGG-3' and 5'-TGTACAGCTCGTCCAT-3')와 65°C에서6시간 동안 hybridization을 실시한 후 X-ray film으로 현상하였다.Total genomic DNA was extracted from the transformed mouse embryonic stem cells. Genomic DNA was cut using specific restriction enzymes (EcoRI, NotI, EcoRI + NotI). DNA samples are electrophoresed on 1% agarose and transferred to hybond N membrane. After hybridization at 32 ° C. with 32P-labeled DNA probes (primers 5'-GAGGTGAAGTTCGAGG-3 'and 5'-TGTACAGCTCGTCCAT-3') for 6 hours, they were developed by X-ray film.
도 8은 서던 압지기술을 을 이용한 pEGFP-N1 유전자의 DNA 인테그레이션을 확인한 결과를 보여주는 도면이다. 8 is a diagram showing the results of confirming DNA integration of the pEGFP-N1 gene using Southern blotting technology.
도 8을 참조하면, 화살표로 표시된 밴드 부분이 GFP유전자가 검출된 것으로 마우스 배아줄기세포 내의 genomic DNA내에 eGFP유전자가 인테그레이션 되었음을 되었음을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 8, the band region indicated by the arrow indicates that the GFP gene was detected, indicating that the eGFP gene was integrated in genomic DNA in mouse embryonic stem cells.
8. 요약8. Summary
마우스 배아줄기세포에 나노입자를 이용하여 유전자 도입을 실시한 후 FACS 분석을 통하여 eGFP-N1 유전자의 형광발현을 검정하고 G418 항생제 저항성 선발을 통하여 eGFP-N1유전자가 도입된 마우스 배아줄기세포를 선별하였으며, 선별된 줄기세포의 미분화능을 검정하기 위하여 Oct4와 SSEA1 항체를 이용하여 면역학적 세포 염색을 통하여 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포의 미분화능을 검정하였다. 또한 4-/4+방법을 이용한 신경세포분화를 통하여 신경세포로의 분화가 가능함을 검정하였다. After introducing genes into mouse embryonic stem cells using nanoparticles, fluorescence expression of the eGFP-N1 gene was assayed by FACS analysis, and mouse embryonic stem cells into which the eGFP-N1 gene was introduced were selected through G418 antibiotic resistance selection. In order to assay the undifferentiated ability of the selected stem cells, the undifferentiated ability of the transgenic stem cells into which the gene was introduced through immunological cell staining was assayed using Oct4 and SSEA1 antibodies. In addition, it was verified that the differentiation into neurons is possible through neuronal differentiation using 4- / 4 + method.
9 결과 분석9 Results Analysis
NIH3T3 세포를 이용한 FuGENE 6와 나노입자 (polymag) 의 유전자 도입 효율은 60% 정도로 유사하였다. 그러나 마우스 배아줄기세포에 FuGENE 6을 이용한 유전자 도입은 15% (8~17%)인 반면, 나노입자를 이용한 유전자 도입은 45% (30~55%)의 높은 차이를 나타냈다. 나노입자를 이용하여 형질 전환된 마우스 배아줄기세포주는 장기간 배양 (>50계대 이상) 에도 미분화능이 유지되며 또한 신경세포분화도 용이함을 알 수 있었다. 하기 표 1에는 FuGENE 6 와 PolyMAG을 이용한 NIH3T3와 D3 마우스 배아줄기세포의 유전자 도입 효율 결과를 나타내었다. The gene transduction efficiency of
NIH3T3
D3 mES
본 발명에 따른 유전자 도입 배아줄기세포의 제조 방법은 나노 입자를 이용하여 마우스 배아줄기세포에 eGFP 유전자를 도입하였을 때 15분 정도의 짧은 반응만으로도 간편하고 효율적으로 유전자를 도입할 수 있다. 한편 독성이 없는 장점이 있다. In the method for producing a transgenic embryonic stem cell according to the present invention, when the eGFP gene is introduced into a mouse embryonic stem cell using nanoparticles, the gene can be introduced simply and efficiently with only a short response of about 15 minutes. On the other hand there is no toxicity.
따라서, 유용 유전자를 인간 배아줄기세포에 도입할 때 나노입자는 효과적인 매개체로 사용될 수 있을 것이다.Therefore, nanoparticles may be used as effective mediators when introducing useful genes into human embryonic stem cells.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 도입 배아줄기세포의 제조 방법을 설명하기 위한 개념도이다.1 is a conceptual diagram for explaining a method for producing a transgenic embryonic stem cell according to an embodiment of the present invention.
도 2는 NIH3T3 세포와 마우스 배아줄기세포에서의 eGFP 형광발현 사진이다. Figure 2 is a photograph of eGFP fluorescence in NIH3T3 cells and mouse embryonic stem cells.
도 3은 도 3은 유전자 투입 량에 따른 도입 성능 결과를 보여주는 형광 사진이다.3 is a fluorescence picture showing the results of the introduction performance according to the gene input amount.
도 4는 FACS 염색을 통한 마우스 배아줄기세포에서의 eGFP 형광 발현 분석 결과를 도시한 그래프이다. 4 is It is a graph showing the results of eGFP fluorescence expression analysis in mouse embryonic stem cells through FACS staining.
도 5는 면역학적 세포염색을 통하여 형질전환된 마우스 배아줄기세포의 미분화능 검정 결과를 보여주는 사진이다. Figure 5 is a photograph showing the results of undifferentiated assay of mouse embryonic stem cells transformed through immunological cell staining.
도 6은 나노입자를 이용하여 eGFP 유전자가 도입된 형질전환 마우스 배아줄기세포의 신경세포 분화를 보여주는 사진이다.6 is a photograph showing neuronal differentiation of transgenic mouse embryonic stem cells into which the eGFP gene was introduced using nanoparticles.
도 7은 RT-PCR 분석을 통한 줄기세포와 EB 형성시 관련 유전자 발현 검정 결과를 보여주는 도면이다. 7 is a view showing the results of the relevant gene expression assay when forming stem cells and EB by RT-PCR analysis.
도 8는 서던 압지기술을 을 이용한 pEGFP-N1 유전자의 DNA 인테그레이션을 확인한 결과를 보여주는 도면이다. 8 is a diagram showing the results of confirming DNA integration of the pEGFP-N1 gene using Southern blotting technology.
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