KR101000952B1 - Method for preparation of lactic acid bacteria microparticle with alginate and low molecular weight water-soluble chitosan - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알긴산과 저분자량 수용성 키토산을 이용한 유산균 미세입자의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 담지체로 알긴산 및 코팅제로 저분자량 수용성 키토산을 이용한 다기능성 유산균 미세입자에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 유산균 미세입자는 위에서의 유산균 사멸을 방지함으로써 대장까지 효과적으로 유산균을 전달할 수 있고, 담지체 및 코팅제로 사용된 알긴산 및 저분자량 수용성 키토산 고유의 생리 활성을 모두 나타낼 수 있는 다기능성 유산균 미세입자로 이용될 수 있다.
유산균 미세입자, 알긴산, 저분자량 수용성 키토산
The present invention relates to a method for producing lactic acid bacteria microparticles using alginic acid and low molecular weight water soluble chitosan, and more particularly, to a multifunctional lactic acid bacteria microparticle using low molecular weight water soluble chitosan as a carrier. The lactic acid bacteria microparticles produced by the method of the present invention can effectively transfer lactic acid bacteria to the large intestine by preventing the death of lactic acid bacteria in the stomach, and can exhibit both the intrinsic physiological activity of alginic acid and low molecular weight water-soluble chitosan used as a carrier and coating agent. Multifunctional lactic acid bacteria can be used as microparticles.
Lactic acid bacteria microparticles, alginic acid, low molecular weight water soluble chitosan
Description
본 발명은 경구 투여된 유산균을 대장까지 안전하게 전달하기 위한 유산균을 함유한 미세입자 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing microparticles containing lactic acid bacteria for safe delivery of orally administered lactic acid bacteria to the large intestine.
알긴산(Alginate)은 라미나리아(Laminaria)속 갈조류 및 해초류의 세포벽을 구성하는 천연 다당류로써 D-만누론산(D-mannuronic acid)과 L-글루쿠론산(L-glucuronic acid)이 1,4-글리코시드 결합(1,4-glycosidic linkage)하여 있는 공중합체로 알려져 있다. 상기 알긴산은 인체에 무해하며 특히 소화기관에 매우 안정한 첨가제로 이용하여 다양한 생리적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기 생리적 효과로는 금속이온과의 반응성에 의한 중금속의 체외배출 및 흡수억제, 혈중 콜레스테롤 저하, 혈당강하, 식이 섬유에 의한 정장 작용, 면역증강, 장내 유해미생물의 증식억제 등이 보고되고 있다. 또한 알긴산은 화학적으로 2개의 나트륨 이온과 1개의 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 양이온 교환에 의해 가교 결합하여 수용성 겔 또는 구형을 형성하는 특징이 있어 인체에 유용한 미생물을 쉽게 담지 할 수 있다. 또한 상기 가교제로 사용되는 금속이온 중 특히 칼슘 이온은 인체 필수원소의 하나로 인체에서 뼈, 치아의 생성, 세포막 투과성 등에 관여하고, 상기 칼슘 이온이 부족할 때에는 대표적인 증상인 골다공증을 유발한다. 따라서 알긴산을 이용한 미세입자는 알긴산 자체의 생리활성 및 가용되는 금속이온에 의해 생체에 다양한 기능을 부여할 수 있다. 상기 알긴산은 낮은 pH가 아닌 중성에서 팽윤 및 분해되므로, 상기 알긴산을 이용하여 캡슐화된 미세입자는 위(stomach)에서는 안정한 상태로 있으며 소장 및 대장에서는 팽윤되어 함유된 유용 물질의 방출을 조절할 수 있다.Alginate is a natural polysaccharide that forms the cell walls of brown algae and seaweeds of the genus Laminaria. D-mannuronic acid and L-glucuronic acid are 1,4-glycolic. Known copolymers are seed bonded (1,4-glycosidic linkage). The alginic acid is known to exhibit various physiological effects by using it as an additive that is harmless to the human body and is particularly stable to the digestive organs. The physiological effects have been reported to inhibit in vitro excretion and absorption of heavy metals by reactivity with metal ions, lowering blood cholesterol, lowering blood sugar, intestinal action by dietary fiber, immune enhancement, inhibiting the growth of harmful microorganisms in the intestine. In addition, alginic acid is chemically crosslinked by cation exchange of two sodium ions with one calcium ion and magnesium ions to form a water-soluble gel or sphere, so that the microorganisms useful for the human body can be easily carried. In addition, among the metal ions used as the crosslinking agent, calcium ions, in particular, are involved in bone, tooth formation, cell membrane permeability, etc. in the human body as one of essential elements of the human body, and when the calcium ions are insufficient, they cause osteoporosis, which is a typical symptom. Therefore, the microparticles using alginic acid can impart various functions to the living body by the physiological activity of the alginic acid itself and the available metal ions. Since the alginic acid swells and decomposes at neutral rather than low pH, the microparticles encapsulated using the alginic acid remain stable in the stomach and swell in the small intestine and large intestine to control the release of the contained useful substances.
키토산은 무척추동물 특히 새우나 게와 같은 갑각류, 연체동물인 갑 오징어의 뼈 및 곤충류의 겉껍질 주성분인 키틴을 탈아세틸화하여 추출시킨 양이온 다당류이다. 상기 양이온 다당류는 세포의 활성을 높여주고, 여러 가지 질병이나 종양 또는 암에 대한 저항력을 증강하는 역할을 하며, 점막과의 접착력이 우수하여 장 및 코 등의 점액질로 구성되어 있는 인체의 장기에 효과적으로 장시간 체류하는 특징이 있다. 또한 대한민국 특허(제0441270호)에 의해 고분자량 키토산으로부터 제조된 저분자량 수용성 키토산(low molecular weight water-soluble, LMWSC)은 생체 적합성, 생분해성, 무독성 등의 장점이 입증되어 수술용 봉합사, 약물 전달체, 혈액응고 방지제, 인공 위장막 등의 의약 분야뿐만 아니라 식품, 섬유, 환경, 화장품, 농축산 등에 이르기까지 다양한 분야에서의 이용이 활발히 연구되고 있다. Chitosan is a cationic polysaccharide extracted by deacetylating chitin, which is a major component of the shells of invertebrates, particularly shellfish such as shrimp and crabs, and bones and insects of molluscs. The cationic polysaccharides enhance the activity of cells, and enhance the resistance to various diseases, tumors or cancers, and have excellent adhesion to mucous membranes, which are effective for organs of the human body composed of mucus such as intestines and nose. It is characterized by a long stay. In addition, low molecular weight water-soluble (LMWSC) prepared from high molecular weight chitosan by Korean patent (0441270) has been proven to have advantages such as biocompatibility, biodegradability, non-toxicity, etc. In addition to pharmaceutical fields such as anticoagulants and artificial gastrointestinal membranes, their use in a variety of fields, including food, textiles, the environment, cosmetics, and concentrates, has been actively studied.
한편 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해하여 유산(젖산)을 생성하는 박테리아로서 단백질을 분해하지만 부패시키는 능력은 없다. 지금까지 밝혀진 유산균은 300~400여 종 정도 알려지고 있으며 그 가운데 20여 종류가 주로 발효유 및 발효산업에 이용되고 있다. 유산균은 그람 양성균으로 포자를 형성하지 않고, 사람이나 동물의 소화관, 구강, 질, 발효유제품, 자연발효식품 가축의 사료 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 인류의 생활에 직·간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있는 유익한 공동체임을 알 수 있다.On the other hand, lactic acid bacteria are bacteria that break down carbohydrates such as glucose or lactose to produce lactic acid (lactic acid). About 300-400 species of lactic acid bacteria are known so far, and about 20 kinds are mainly used in fermented milk and fermentation industry. Lactic acid bacteria are Gram-positive bacteria that do not form spores and are widely distributed in the natural world, including human and animal digestive tracts, oral cavity, vagina, fermented dairy products, and fermented dairy foods, and have direct and indirect relationships with human life. It can be seen that it is a beneficial community.
건강한 사람의 장내 균총이 질병이나 항생제 투여 등에 의해 균형을 잃게 되면, 장내에 유해한 미생물이 증가하여 소화불량이나 복부 팽만 등의 증상이 나타난다. 이의 예방 및 치료제로서 유산균 제제가 사용되어 왔으며 우유나 유산균 발효유의 섭취가 권장되어 왔다. 이때 경구 투여된 유산균은 위장의 낮은 pH와 담즙산 등으로 인하여 위장과 소장 상부에서 사멸될 수 있으므로, 낮은 pH에서 생존할 수 있거나 낮은 pH로의 노출을 방어하는 방법이 필요하다. 이러한 필요에 부응하기 위하여 장내 유익균을 캡슐화하는 방안이 대두하였는데, 이때 캡슐은 외부로부터 내부의 유산균을 보호하고, 적절한 안전성과 견고성을 가지며, 동시에 장내에서는 분해되어 목적하는 유산균이 유리되도록 해야 한다.When the intestinal flora of a healthy person is unbalanced due to disease or antibiotic administration, harmful microorganisms increase in the intestine, causing symptoms such as indigestion and bloating. As a prophylactic and therapeutic agent for this, lactobacillus preparations have been used and milk or lactobacillus fermented milk has been recommended. At this time, the orally administered lactic acid bacteria can be killed in the stomach and small intestine due to the low pH of the stomach and bile acids, etc., it is necessary to survive at low pH or to protect the exposure to low pH. In order to meet this need, a method for encapsulating enteric beneficial bacteria has emerged, in which the capsule should protect the lactic acid bacteria from the outside, have adequate safety and robustness, and at the same time, it should be decomposed in the intestine to release the desired lactic acid bacteria.
이에 본 발명자들은 알긴산을 이용하여 유산균을 캡슐화하고 저분자량 수용성 키토산을 이용하여 코팅된 유산균 미세입자의 제조 공정을 개발하고, 상기 미세입자가 위장의 pH인 1.2에서는 팽윤 및 분해되지 않고 대장의 pH인 7.4에서는 팽윤 및 분해되는 내산성을 지니는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors encapsulate lactic acid bacteria using alginic acid and develop a process for preparing lactic acid bacteria microparticles coated using low molecular weight water-soluble chitosan, and the microparticles do not swell and decompose at pH 1.2 of the stomach, In 7.4, the present invention was completed by confirming that it had acid resistance to swell and decompose.
본 발명의 목적은 경구 투여한 유산균이 산성의 위에서 사멸하지 않고 대장까지 전달될 수 있도록 하는 것이다.An object of the present invention is to allow the orally administered lactic acid bacteria to be delivered to the large intestine without killing the acidic stomach.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention
1) 1.5 내지 2.5wt%(w/w) 알긴산 수용액과 1.5 내지 2.5wt%(w/w) 유산균 수용액 동량을 균일하게 혼합하는 단계;1) uniformly mixing the same amount of 1.5 to 2.5 wt% (w / w) alginic acid solution and 1.5 to 2.5 wt% (w / w) lactic acid bacteria solution;
2) 단계 1)의 혼합액을 트윈 20 수용액에 적가하여 유화하는 단계;2) emulsifying the mixed solution of step 1) by dropwise addition to an aqueous solution of Tween 20;
3) 단계 2)의 유화액에 0.15 내지 0.25 M CaCl2 수용액을 적가하여 유산균 미세입자를 생성하는 단계; 및,3) adding 0.15 to 0.25 M CaCl 2 aqueous solution dropwise to the emulsion of step 2) to produce lactic acid bacteria microparticles; And,
4) 상기 유산균 미세입자를 여과 및 세척한 후, 0.5 내지 1.5wt%(w/w) 저분자량 수용성 키토산 용액에 넣어서 코팅하는 단계를 포함하는 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자 제조 방법을 제공한다.4) Alginate microparticles containing lactic acid bacteria coated with low molecular weight water-soluble chitosan, including the step of filtering and washing the lactic acid bacteria microparticles, and then coating the lactic acid bacteria microparticles in a 0.5 to 1.5 wt% (w / w) low molecular weight aqueous chitosan solution. It provides a manufacturing method.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자를 제공한다.The present invention also provides alginic acid microparticles containing lactic acid bacteria coated with a low molecular weight water-soluble chitosan prepared by the above method.
아울러, 본 발명은 상기 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자를 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for improving the intestinal flora total containing alginic acid microparticles containing lactic acid bacteria coated with the low molecular weight water-soluble chitosan as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention
1) 1.5 내지 2.5wt%(w/w) 알긴산 수용액과 1.5 내지 2.5wt%(w/w) 유산균 수용액 동량을 균일하게 혼합하는 단계;1) uniformly mixing the same amount of 1.5 to 2.5 wt% (w / w) alginic acid solution and 1.5 to 2.5 wt% (w / w) lactic acid bacteria solution;
2) 단계 1)의 혼합액을 트윈 20 수용액에 적가하여 유화하는 단계;2) emulsifying the mixed solution of step 1) by dropwise addition to an aqueous solution of Tween 20;
3) 단계 2)의 유화액에 0.15 내지 0.25 M CaCl2 수용액을 적가하여 유산균 미세입자를 생성하는 단계; 및,3) adding 0.15 to 0.25 M CaCl 2 aqueous solution dropwise to the emulsion of step 2) to produce lactic acid bacteria microparticles; And,
4) 상기 유산균 미세입자를 여과 및 세척한 후, 0.5 내지 1.5wt%(w/w) 저분자량 수용성 키토산 용액에 넣어서 코팅하는 단계를 포함하는 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자 제조 방법을 제공한다.4) Alginate microparticles containing lactic acid bacteria coated with low molecular weight water-soluble chitosan, including the step of filtering and washing the lactic acid bacteria microparticles, and then coating the lactic acid bacteria microparticles in a 0.5 to 1.5 wt% (w / w) low molecular weight aqueous chitosan solution. It provides a manufacturing method.
상기 제조과정은 도 1에서 설명하고 있다. 상기 알긴산 수용액의 농도는 1.5 내지 2.5wt%(w/w)이고 유산균 수용액은 알긴산 수용액과 농도가 동일하며, CaCl2 수용액의 농도는 0.15 내지 0.25 M인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 알긴산 수용액의 농도는 2wt%(w/w)이고 유산균 수용액은 알긴산 수용액과 동일하며, CaCl2 수용액의 농도는 0.2 M이다. 또한, 저분자량 수용성 키토산 용액은 0.5 내지 1.5wt%(w/w)이고 바람직하게는 1wt%(w/w)이다.The manufacturing process is described in FIG. The concentration of the aqueous alginic acid solution is 1.5 to 2.5wt% (w / w) and the aqueous solution of lactic acid bacteria is the same concentration as the aqueous alginic acid solution, the concentration of the CaCl 2 aqueous solution is preferably 0.15 to 0.25 M, more preferably of the aqueous alginic acid solution The concentration is 2wt% (w / w) and the aqueous solution of lactic acid bacteria is the same as the aqueous solution of alginic acid, the concentration of the aqueous solution of CaCl 2 is 0.2M. Further, the low molecular weight water soluble chitosan solution is 0.5 to 1.5 wt% (w / w) and preferably 1 wt% (w / w).
상기 유산균은 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifi-dobacterium) 속의 균주 중에서 인체에 유익한 균을 1 종 이상 선택하여 사용할 수 있다.The lactic acid bacteria Streptococcus genus, Lactococcus genus, Leuconostoc genus, Pediococcus genus Enterococcus genus, Lactobacillus genus, Bifidobacterium Among the strains of the genus (Bifi-dobacterium), one or more kinds of bacteria beneficial to the human body can be selected and used.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 알긴산 수용액의 농도를 1, 2 및 3wt%(w/w), CaCl2는 0.1, 0.2 및 0.3 M로 농도를 변화시키면서 미세입자를 제조한 결과, 알긴산의 농도가 1wt%(w/w)인 경우에는 입자를 형성시키지 못하였으며, 3wt%(w/w)인 경우에는 젤을 형성하였다. 또한 CaCl2의 농도가 0.1 M인 경우에는 입자를 잘 형성하지 못하였으며, 0.3 M인 경우에는 젤의 형태를 유지하였다. 즉, 알긴산의 농도는 2wt%(w/w), CaCl2의 농도는 0.2 M인 때를 최적 조건으로 도출하였다. 상기 최적 조건에서 생성한 미세입자의 크기를 확인한 결과, 150 내지 200 ㎚의 작은 미세입자를 생성한 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 상기 최적 조건의 알긴산과 동일한 농도의 유산균 수용액을 이용하여 유산균을 포함한 알긴산 미세입자를 생성한 후, 1wt%(w/w) 저분자량 수용성 키토산 용액으로 코팅하여 크기와 형태를 관찰한 결과, 입자 크기가 6-10 ㎛인 구형의 미세입자가 형성된 것을 확인하였다(도 3 참조).In a specific embodiment of the present invention, the concentration of the alginic acid solution is 1, 2 and 3wt% (w / w), CaCl 2 is 0.1, 0.2 and 0.3 M by varying the concentration as a result, the concentration of alginic acid is 1wt In the case of% (w / w), no particles were formed, and in the case of 3wt% (w / w), gels were formed. In addition, when the concentration of CaCl 2 was 0.1 M, the particles did not form well, and in the case of 0.3 M, the gel was maintained. That is, the optimum conditions were derived when the concentration of alginic acid was 2 wt% (w / w) and the concentration of CaCl 2 was 0.2 M. As a result of confirming the size of the microparticles produced under the optimum conditions, it was confirmed that small microparticles of 150 to 200 nm were produced (see FIG. 2). In addition, after producing alginate microparticles including lactic acid bacteria using an aqueous solution of lactic acid bacteria in the same concentration as the alginic acid of the optimum conditions, and coated with a 1wt% (w / w) low molecular weight aqueous chitosan solution to observe the size and shape, It was confirmed that spherical fine particles having a particle size of 6-10 μm were formed (see FIG. 3).
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자를 제공한다.The present invention also provides alginic acid microparticles containing lactic acid bacteria coated with a low molecular weight water-soluble chitosan prepared by the above method.
알긴산은 산성에서는 분해나 팽윤되지 않고, 중성에서는 분해가 되는 특성을 나타내기 때문에 본 발명의 미세입자는 산성인 위에서는 팽윤 및 분해되지 않고, 중성인 대장까지 운반된 후 팽윤 및 분해될 수 있다. 상기 산성은 pH 0 내지 3.0의 범위를 나타내고, 상기 중성은 pH 6 내지 8의 범위를 나타낸다. 또한 저분자량 수용성 키토산은 대장의 점막과 효과적으로 점착되는 특성이 있음으로 유산균 미세입자는 충분한 시간 동안 대장에서 머물러 있을 수 있다. 따라서 산성인 위에서 분해가 전혀 일어나지 않음으로써 내부의 유산균이 위에서 전혀 사멸되지 않고, 중성인 대장에서 활성을 나타낼 수 있을 것이다.Alginic acid does not decompose or swell in acidity, and decomposes in neutral, so the microparticles of the present invention may not swell and decompose in the acidic stomach, but may be swelled and decomposed after being transported to the neutral colon. The acidity ranges from
본 발명의 구체적인 실시예에서 pH 7.4 및 1.2의 PBS에 상기 미세입자를 7일간 두어 생분해 거동을 각각 관찰한 결과, pH 7.4인 경우 1일째부터 팽윤과 동시에 분해가 일어나기 시작하여, 7일째는 안전히 분해가 되는 것을 확인하였고(도 4 참조), 반면에 pH 1.2인 경우 거의 분해가 일어나지 않았다(도 5 참조). 상기 결과는 본 발명의 유산균 미세입자가 유산균, 알긴산 및 저분자량 수용성 키토산 고유의 생리적인 특성을 모두 나타낼 수 있는 다기능성 미세입자인 것을 시사한다.In a specific embodiment of the present invention, the microparticles were placed in PBS at pH 7.4 and 1.2 for 7 days and the biodegradation behavior was observed, respectively. It was confirmed that (see FIG. 4), whereas, at pH 1.2, almost no decomposition occurred (see FIG. 5). The results suggest that the lactic acid bacteria microparticles of the present invention are multifunctional microparticles capable of exhibiting all of the physiological characteristics inherent in lactic acid bacteria, alginic acid and low molecular weight water-soluble chitosan.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 미세입자 내의 유산균 활성을 측정하였다. 즉, pH 1.2에서 6시간, pH 7.4에서 24시간 교반 후의 생균수가 326 ± 15 × 103 CFU/g으로 유산균 미세입자가 산성에서 안정적으로 유산균을 보호할 수 있음을 확인하였다(도 6 참조). 상기 수치는 미세입자의 크기(6-10 ㎛)와 관련해서 볼 때, 이전의 보고보다 높은 결과이다(한국식품과학회지 Vol. 39, No 1 (2007): 400 ㎛이상, 생균수 107, 한국식품과학회지 Vol. 34, No 2 (2002): 1~2 ㎜, 생균수 108). 또한, 상기 미세입자를 배양하면서 pH 변화를 측정한 결과, 초기 pH 6.7에서 24시간 후에 5.6까지 급격하게 감소하는 것을 알 수 있었다(도 7 참조). 이는 유산균이 당류를 발효해서 몸에 유용한 젖산을 생성하기 때문이며, 이 결과로부터 유산균 미세입자 내의 유산균이 사멸되지 않고 생존함과 동시에 활성을 나타내는 것을 시사한다. 아울러, 유산균이 활성을 나타내는 경우, 유산균이 생성하는 젖산에 의해서 명도가 어두운 색에서 밝은 색으로 바뀌게 되는데, 상기 미세입자를 리트머스 우유(litmus milk)에서 배양하면서 명도 변화를 측정한 결과, 대조군에 비해 밝기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.(도 8 및 도 9 참조).In addition, in a specific embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria activity in the microparticles was measured. That is, it was confirmed that the lactic acid bacteria microparticles were able to stably protect the lactic acid bacteria in acidity at 326 ± 15 × 10 3 CFU / g after stirring for 6 hours at pH 1.2 and 24 hours at pH 7.4 (see FIG. 6). This value is higher than the previous report in relation to the size of microparticles (6-10 μm) (Korean Society of Food Science and Technology Vol. 39, No 1 (2007): 400 μm or more,
아울러, 본 발명은 상기 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자를 유효성분으로 포함하는 장내 균총 개선용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for improving the intestinal flora total containing alginic acid microparticles containing lactic acid bacteria coated with the low molecular weight water-soluble chitosan as an active ingredient.
본 발명의 미세입자를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.The microparticles of the present invention can be added as it is or used with other food or food ingredients, and can be suitably used according to conventional methods. The blending amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or hygiene).
또한, 상기 건강식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.In addition, there is no particular limitation on the form and type of the health food. The form of the health food to which the substance can be added may be tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills, etc., and the types of health foods are dairy products including butter, yogurt, cheese, dairy products including ice cream, bread, Chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, other noodles, gum, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all healthy foods in the ordinary sense.
본 발명의 건강식품은 통상의 건강식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g이다.The health food of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates and the like as additional ingredients, as in general health foods. Such natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Examples of sweeteners include natural sweeteners such as tau martin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the health food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols. And carbonation agents used in carbonated beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
본 발명의 방법에 의해 생성된 유산균 미세입자는 위에서의 유산균 사멸을 방지함으로써 대장까지 효과적으로 유산균을 전달할 수 있고, 담지체 및 코팅제로 사용된 알긴산 및 저분자량 수용성 키토산 고유의 생리 활성을 모두 나타낼 수 있는 다기능성 유산균 미세입자로 이용될 수 있다.The lactic acid bacteria microparticles produced by the method of the present invention can effectively transfer lactic acid bacteria to the large intestine by preventing the death of lactic acid bacteria in the stomach, and can exhibit both the intrinsic physiological activity of alginic acid and low molecular weight water-soluble chitosan used as a carrier and coating agent. Multifunctional lactic acid bacteria can be used as microparticles.
이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples and formulation examples.
단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Preparation Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples.
<실시예 1> 유산균 미세입자 제조Example 1 Preparation of Lactic Acid Bacteria Microparticles
본 발명자들은 도 1에 나타난 바와 같은 공정으로 유산균 미세입자를 제조하였다. 유산균으로는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus; (주)메디오젠, Korea)를, 담지체로는 알긴산(Fulka, Japan)을, 가교제로는 CaCl2(Sigma, USA)를 사용하여 미세입자로 제조하였고, 상기 미세입자의 외부 코팅제로는 분자량 9 kDa의 저분자량 수용성 키토산(KITTOLIFE, 한국)을 사용하였다.The present inventors prepared lactic acid bacteria microparticles by the process as shown in FIG. Prepared as microparticles using Streptococcus thermophilus (Medogen, Korea) as lactic acid bacteria, alginic acid (Fulka, Japan) as a carrier, and CaCl 2 (Sigma, USA) as a crosslinking agent. As the outer coating agent of the fine particles, a low molecular weight water soluble molecular weight of 9 kDa Chitosan (KITTOLIFE, South Korea) was used.
<1-1> 구성비 결정<1-1> Determination of composition ratio
알긴산과 CaCl2를 이용하여 미세입자를 형성할 수 있는 구성비를 결정하고자, 알긴산은 1, 2 및 3wt%(w/w), CaCl2는 0.1, 0.2 및 0.3 M로 농도를 변화시키면서 미세입자를 제조하였다.Alginate and CaCl 2 were used to determine the compositional ratios that can form the microparticles.Alginate was changed to 1, 2 and 3wt% (w / w), and CaCl 2 was 0.1, 0.2 and 0.3 M. Prepared.
구체적으로, 알긴산 수용액 10 ㎖을 1wt% 트윈 20(Sigma, USA) 수용액 250 ㎖에 균질기를 이용하여 13,000 rpm으로 교반하면서 천천히 적가하여 미세입자가 생성되도록 10분 동안 충분히 유화시켰다. 유화된 용액에 가교제인 CaCl2 수용액 25 ㎖을 온화한 상태로 교반하면서 천천히 적가한 후, 10분 동안 교반하면서 가교가 충분히 발생하도록 하였다. 제조된 미세입자를 여과지에 여과한 후, 2차 증류수를 이용하여 세척하여 유화제 및 미반응 CaCl2를 제거하였고, 동결 진공건조(Lab Conco, USA)하여 미세입자를 수득하였다. 상기 미세입자를 1 ㎎/㎖의 농도로 증류수에 현탁한 후 TEM Grid(200mesh)에 적가한 후 자연건조한 후, 2wt% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate; TED PELLA Inc. USA)로 염색 후 자연건조하여 120 kV의 가속전압으로 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM, Jeol, Japan)으로 관찰하였다. 또한, 상기 미세입자 현탁액을 실리곤 웨이퍼에 증착시키고 자연건조 후 비접촉(non-contact) 모드로 원자력현미경(Automic Force Microscope; AFM, PSIA, USA)으로 관찰하였다.Specifically, 10 ml of an aqueous alginic acid solution was slowly added dropwise while stirring at 13,000 rpm using a homogenizer to 250 ml of an aqueous 1 wt% Tween 20 (Sigma, USA) solution and sufficiently emulsified for 10 minutes to generate fine particles. 25 ml of CaCl 2 aqueous solution as a crosslinking agent was slowly added dropwise to the emulsified solution with gentle stirring, and then sufficient crosslinking occurred while stirring for 10 minutes. The prepared microparticles were filtered on a filter paper, washed with secondary distilled water to remove the emulsifier and unreacted CaCl 2 , and freeze vacuum drying (Lab Conco, USA) to obtain microparticles. The fine particles were suspended in distilled water at a concentration of 1 mg / ml, added dropwise to TEM Grid (200mesh), followed by natural drying, followed by dyeing with 2wt% uranyl acetate (TED PELLA Inc. USA) and then naturally drying. It was observed by transmission electron microscopy (TEM, Jeol, Japan) at an acceleration voltage of 120 kV. In addition, the microparticle suspension was deposited on a silicon wafer and observed by atomic force microscope (Automatic Force Microscope; AFM, PSIA, USA) in a non-contact mode after natural drying.
그 결과, 알긴산의 농도가 1wt%(w/w)인 경우에는 입자를 형성시키지 못하였으며, 3wt%(w/w)인 경우에는 젤을 형성하였다. 또한 CaCl2의 농도가 0.1 M인 경우에는 입자를 잘 형성하지 못하였으며, 0.3 M인 경우에는 젤의 형태를 유지하였다. 즉, 알긴산의 농도는 2wt%(w/w), CaCl2의 농도는 0.2 M인 때를 최적 조건으로 도출하였다. 또한, 최적 조건에서 생성한 미세입자의 크기를 확인한 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 150 내지 200 ㎚이었다.As a result, particles were not formed when the concentration of alginic acid was 1wt% (w / w), and gels were formed when 3wt% (w / w). In addition, when the concentration of CaCl 2 was 0.1 M, the particles did not form well, and in the case of 0.3 M, the gel was maintained. That is, the optimum conditions were derived when the concentration of alginic acid was 2 wt% (w / w) and the concentration of CaCl 2 was 0.2 M. In addition, as a result of confirming the size of the microparticles produced under the optimum conditions, it was 150 to 200 nm as shown in FIG.
<1-2> 유산균 미세입자 제조<1-2> lactic acid bacteria microparticles
최적농도의 알긴산과 CaCl2에서 유산균 미세입자를 제조하였다.Lactic acid bacteria microparticles were prepared in the optimal concentration of alginic acid and CaCl 2 .
구체적으로, 2wt%(w/w) 알긴산 수용액 10 ㎖과 2wt%(w/w) 유산균 수용액(CFU = 5.4 × 105 CFU/g) 10 ㎖을 균일하게 혼합한 후, 상기 혼합액을 1% 트윈 20(Sigma, USA) 수용액 250 ㎖에 균질기를 이용하여 13,000 rpm으로 교반하면서 천천히 적가하여 유산균 미세입자가 생성되도록 10분 동안 충분히 유화시켰다. 유화된 용액에 가교제인 0.2 M CaCl2 수용액 25 ㎖을 온화한 상태로 교반하면서 천천히 적가한 후, 10분 동안 교반하면서 가교가 충분히 발생하도록 하였다. 유산균 미세입자가 제조된 후 여과 및 세척하여 유화제 및 미반응 CaCl2를 제거하였다. 이어서 상기 유산균 미세입자를 1wt%(w/w) 키토산 용액에 넣은 후 교반하면서 키토산으로 코팅하였고, 여과 및 세척 후 동결 건조하여 유산균 미세입자를 제조하였다. 상기 유산균 미세입자를 금(HITACHI, Japan)으로 진공증착 시킨 후, 시차주사전자 현미경(SEM; S-3500N, HITACHI, Japan)으로 관찰하며 크기와 형태를 관찰하였다. 이때의 가속전압은 20 kV 이었다.Specifically, 10 ml of 2 wt% (w / w) alginic acid aqueous solution and 10 ml of 2 wt% (w / w) lactic acid bacteria aqueous solution (CFU = 5.4 × 10 5 CFU / g) are uniformly mixed, and then the mixed solution is mixed with 1% Tween. To 250 ml of 20 (Sigma, USA) aqueous solution was slowly added dropwise while stirring at 13,000 rpm using a homogenizer to sufficiently emulsify for 10 minutes to produce lactic acid bacteria microparticles. 25 ml of a 0.2 M CaCl 2 aqueous solution, which is a crosslinking agent, was slowly added dropwise with stirring to the emulsified solution, followed by stirring for 10 minutes to allow sufficient crosslinking to occur. The lactic acid bacteria microparticles were prepared, filtered and washed to remove the emulsifier and unreacted CaCl 2 . Subsequently, the lactic acid bacteria microparticles were placed in a 1 wt% (w / w) chitosan solution, coated with chitosan while stirring, and filtered and washed, followed by freeze drying to prepare lactic acid bacteria microparticles. The lactic acid bacteria microparticles were vacuum-deposited with gold (HITACHI, Japan) and then observed with a differential scanning electron microscope (SEM; S-3500N, HITACHI, Japan) to observe the size and shape. The acceleration voltage at this time was 20 kV.
그 결과, 도 3에서 나타나 바와 같이 입자 크기가 6-10 ㎛인 구형의 미세입자가 형성된 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that spherical fine particles having a particle size of 6-10 μm were formed.
<< 실험예Experimental Example 1> 유산균 미세입자의 생분해 거동 1> Biodegradation Behavior of Lactic Acid Bacteria Microparticles
대장 및 위의 pH인 pH 7.4 및 pH 1.2의 PBS(phosphate buffered saline)에서 상기 유산균 미세입자의 생분해 거동을 각각 실험하였다.The biodegradation behavior of the lactic acid bacteria microparticles was examined in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 and pH 1.2, respectively, of colon and stomach.
구체적으로, 실시예 1의 방법으로 제조한 유산균 미세입자를 1% 농도가 되도록 PBS에 넣은 후에 37℃에서 교반하면서, 1일 간격으로 시료를 채취하여 건조한 후 실시예 1-3과 동일한 방법으로 시차주사 전자현미경을 이용하여 형태 변화를 관찰하였다.Specifically, the lactic acid bacteria microparticles prepared by the method of Example 1 was added to PBS to 1% concentration, while stirring at 37 ℃, taking samples at daily intervals and dried and the time difference in the same manner as in Example 1-3 Morphological changes were observed using a scanning electron microscope.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH 7.4인 경우 1일째부터 팽윤과 동시에 분해가 일어나기 시작하여, 7일째는 안전히 분해가 되는 것을 확인하였다. 반면에 pH 1.2인 경우, 도 5에 나타난 바와 같이 거의 분해가 일어나지 않았다.As a result, as shown in FIG. 4, in the case of pH 7.4, decomposition began to occur at the same time as swelling from the first day, and it was confirmed that the decomposition was safely on the seventh day. On the other hand, in case of pH 1.2, almost no decomposition occurred as shown in FIG. 5.
<< 실시예Example 2> 유산균 활성 특성 2> Lactobacillus Active Properties
<2-1> 생균수 측정<2-1> viable cell count
유산균 미세입자의 생균수를 측정하였다.The number of viable cells of lactic acid bacteria microparticles was measured.
구체적으로, 실시예 1의 방법으로 제조한 유산균 미세입자 5 ㎎을 PBS(pH 1.2)에서 6시간 동안 정치시킨 후, 이어서 PBS(pH 7.4) 2 ㎖에 넣고 24시간 동안 균일하게 교반하였다. 상기 혼합액 50 ㎕을 락토바실라이 MRS 아가 배지(Lactobacilli MRS agar; Sigma, USA)로 고정하고 25℃에서 3일간 배양한 후 콜로니의 개수를 측정하여 생균수를 산출하였다.Specifically, 5 mg of the lactic acid bacteria microparticles prepared by the method of Example 1 was allowed to stand in PBS (pH 1.2) for 6 hours, and then placed in 2 ml of PBS (pH 7.4) and stirred uniformly for 24 hours. 50 μl of the mixed solution was fixed with Lactobacilli MRS agar medium (Lactobacilli MRS agar; Sigma, USA) and cultured at 25 ° C. for 3 days, and the number of colonies was measured to calculate viable cell numbers.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 생균수는 326 ± 15 × 103 CFU/g 이었다.As a result, the viable cell number was 326 ± 15 × 10 3 CFU / g as shown in FIG.
<2-2> pH 변화<2-2> pH change
또한 유산균 미세입자 40 ㎕을 락토바실라이 MRS 배양액(Lactobacilli MRS broth; Sigma, USA)에 넣어 25℃에서 배양하면서 24시간마다 pH 변화를 측정하여 유산균의 생존율을 측정하였다.In addition, 40 μl of lactic acid bacteria microparticles were added to Lactobacilli MRS broth (Lactobacilli MRS broth; Sigma, USA) and cultured at 25 ° C. while measuring pH change every 24 hours to measure the survival rate of lactic acid bacteria.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 초기 pH는 6.7에서 24시간 후에 5.6까지 급격하게 감소하는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 7, the initial pH was found to decrease rapidly from 6.7 to 5.6 after 24 hours.
<2-3> 명도 측정<2-3> brightness measurement
아울러, 유산균 미세입자 40 ㎕를 리트머스 우유(litmus milk; Sigma, USA)에 넣어 25℃에서 배양하면서 24시간마다 색차계(Chroma Meter CR-200, MINOLTA, Japan)를 이용하여 명도를 측정하였다.In addition, 40 μl lactic acid bacteria microparticles were put in litmus milk (Sigma, USA) and cultured at 25 ° C., and brightness was measured every 24 hours using a color meter (Chroma Meter CR-200, MINOLTA, Japan).
그 결과, 도 8과 도 9에서 나타난 바와 같이 대조군(유산균을 포함하지 않는 미세입자)에 비해 밝기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다As a result, as shown in Figures 8 and 9 it was confirmed that the brightness is increased compared to the control (microparticles not containing lactic acid bacteria).
<제제예 1> 유제품(dairy products)의 제조Preparation Example 1 Preparation of Dairy Products
본 발명의 저분자량 수용성 키토산으로 코팅된 유산균을 함유한 알긴산 미세입자 5 ~ 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 요구르트와 같은 다양한 유제품을 제조하였다.Low molecular weight water soluble of the present invention 5-10 parts by weight of alginic acid microparticles containing lactic acid bacteria coated with chitosan were added to 100 parts by weight of milk, and various dairy products such as butter and yogurt were prepared using the milk.
도 1은 유화기법(emulsion method)에 의한 유산균 미세입자 제조 공정을 나타낸 도이다.1 is a view showing a process for producing lactic acid bacteria microparticles by an emulsion method (emulsion method).
도 2는 유산균 미세입자의 크기와 형태를 관찰한 결과를 나타낸 도이다:Figure 2 is a view showing the results of observing the size and shape of the lactic acid bacteria microparticles:
a: AFM; 및,a: AFM; And,
b: TEM.b: TEM.
도 3은 유산균 미세입자의 크기와 형태를 SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.Figure 3 is a view showing the results of observation the size and shape of the lactic acid bacteria microparticles.
도 4는 pH 7.4 PBS에서 유산균 미세입자의 생분해 거동을 SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.Figure 4 is a diagram showing the results of the observation of the biodegradation behavior of lactic acid bacteria microparticles in pH 7.4 PBS.
도 5는 pH 1.2 PBS에서 유산균 미세입자의 생분해 거동을 SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.Figure 5 is a diagram showing the results observed by the SEM biodegradation behavior of lactic acid bacteria microparticles in pH 1.2 PBS.
도 6은 유산균 미세입자의 생균수 측정 결과를 나타낸 도이다.Figure 6 is a diagram showing the result of measuring the viable cell count of lactic acid bacteria microparticles.
도 7은 25℃에서 72시간 동안 유산균 미세입자를 배양하면서 pH 변화를 나타 낸 도이다.Figure 7 is a diagram showing the pH change while incubating the lactic acid bacteria microparticles for 72 hours at 25 ℃.
도 8은 25℃에서 72시간 동안 유산균 미세입자를 배양하면서 명도(Hunter color degree) 변화를 나타낸 도이다(●; 유산균 미세입자, ○; 대조군):8 is a view showing the change in brightness (Hunter color degree) while culturing lactic acid bacteria microparticles for 72 hours at 25 ℃ (●; lactic acid bacteria microparticles, ○; control):
a: 밝음(lightness);a: lightness;
b: 적색(redness); 및,b: redness; And,
c: 황색(yellowness).c: yellowness.
도 9는 25℃에서 72시간 동안 유산균 미세입자를 리트머스 우유에서 배양하면서 색상 변화를 나타낸 도이다.9 is a view showing the color change while culturing lactic acid microparticles in litmus milk for 25 hours at 25 ℃.
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