KR100994752B1 - Direct Electrical Detection Method of DNA-Hybridization and chip Fabrication - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 하이브리드형성(hybridization)의 전기적 검출방법과 이를 위한 DNA칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, DNA의 5' 말단과 3' 말단을 각각 칩상에 구현된 전극에 고정시키고 직접적인 DNA 하이브리드형성에 따른 전기적 특성값의 변화를 측정함으로써 별도의 화학물질이나 전기화학적 검출을 위한 인터칼레이터 물질을 사용하지 않고도 전기적인 방법만으로 DNA 하이브리드형성을 검출할 수 있는 방법과 이를 위한 DNA 칩 및 그 제조방법이 제공된다. 본 발명에 따르면 고가의 형광물질이나 그에 따른 광학기기, 별도의 화학물질이나 인터칼레이터 물질을 사용할 필요가 없으므로 그에 따른 경제적 장점과 기기의 소형화라는 장점을 갖게 되며, 기존의 방법에서 필요한 여러 공정을 줄임으로써 유전자 분석 및 임상실험에 소요되는 많은 시간과 노력을 줄일 수 있게 된다. 특히 본 발명에서는 하이브리드형성의 전기적 검출에 있어서 탈이온수나 가스 또는 진공상태에서 전기를 인가하여 검출함으로써 기존의 전기적 검출의 문제점을 해결하고 높은 재현성과 신뢰성이 있는 전기적 결과값을 얻을 수 있다. The present invention relates to an electrical detection method of DNA hybridization, a DNA chip for the same, and a method of manufacturing the same. In the present invention, the 5 'end and the 3' end of the DNA are fixed to the electrodes implemented on the chip, respectively, and the intercalator for the separate chemical or electrochemical detection by measuring the change of the electrical property value according to the direct DNA hybridization. Provided are a method for detecting DNA hybridization by an electrical method without using a substance, a DNA chip for the same, and a method of manufacturing the same. According to the present invention, there is no need to use expensive fluorescent materials or optical apparatuses, separate chemicals or intercalator materials, and thus, economical advantages and miniaturization of the apparatuses can be obtained. By reducing the time and effort required for genetic analysis and clinical trials. In particular, in the present invention, the detection of the hybrid formation by applying electricity in deionized water, gas, or vacuum state can solve the problem of the existing electrical detection and obtain high reproducibility and reliable electrical results.
DNA 칩, Hybridization, 하이브리드, 전기적 검출방법, 유전자 분석 DNA chip, Hybridization, Hybrid, Electrical detection method, Genetic analysis
Description
도 1은 본 발명에 따른 DNA 칩의 바람직한 일 실시예를 개념적으로 도시한 것이다. Figure 1 conceptually illustrates a preferred embodiment of the DNA chip according to the present invention.
도 2는 DNA와 결합된 전도성 폴리머를 티올기를 이용하여 SAM(Self Assembled Monolayer: 자기조립단층막) 방법으로 전극에 고정시키는 것을 도시한 것이다. FIG. 2 illustrates fixing a conductive polymer coupled to DNA to an electrode by a SAM (Self Assembled Monolayer) method using a thiol group.
도 3은 폴리머와 메탈비드를 사용하여 프로브 DNA의 말단을 자기력으로 양(+)전극에 부착하는 것을 도시한 것이다.
Figure 3 illustrates the attachment of the ends of the probe DNA to the positive electrode by magnetic force using a polymer and metal beads.
〈도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명〉Description of the Related Art
10: DNA 칩 11: 기판10: DNA chip 11: substrate
12: 양(+)전극 13: 음(-)전극12: positive electrode 13: negative electrode
14: 탈이온수/가스 주입구 15: 시료주입구14: deionized water / gas inlet 15: sample inlet
16: 배출구 17: 마이크로밸브16: outlet 17: microvalve
18: DNA 19: 채널18: DNA 19: channel
21: 폴리머 22: 메탈비드 또는 스트렙타비딘-바이오틴
21: polymer 22: metal bead or streptavidin-biotin
본 발명은 DNA 하이브리드형성(hybridization)의 전기적 검출방법과 이를 위한 DNA 칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to an electrical detection method of DNA hybridization, a DNA chip for the same, and a method of manufacturing the same.
바이오센서(biosensor)는 효소센서와 면역계의 반응을 이용한 면역센서로 대표되어져 왔다. 그러나, 인간 게놈프로젝트에서 얻어진 방대한 DNA의 정보로부터 인간의 유전병을 조기에 발견하고 치료할 수 있는 가능성과 그에 따른 기대가 커지고 있으며, 이에 따라 바이오센서 분야에 또 다른 센서로서 DNA칩이 자리 매김을 하고 있다. Biosensor has been represented as an immune sensor using the reaction of the enzyme sensor and the immune system. However, the possibility of early detection and treatment of human genetic diseases from the vast DNA information obtained from the Human Genome Project is increasing, and accordingly, the DNA chip is becoming another sensor in the biosensor field. .
DNA 칩은 유전자 검색용으로 엄청나게 많은 종류의 DNA를 실리콘이나 유리 등의 작은 기판에 고밀도로 붙여 놓은 것으로서, 동시에 최소한 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 동시에 검색할 수 있다. DNA 칩은 기존의 서던블럿(Southern blot)이나 노던블럿(Northern blot)을 대체하여 짧은 시간에 대량으로 유전자검색을 할 수 있으며, DNA 서열분석, 분자생물학적 연구에 필수적인 대량의 RNA 발현측정, 돌연변이 검색, 유전자 진단, 약물유전학 등에 이용될 수 있다. 현재 바이오센서 개발의 추세는 저렴성, 신속성, 정확성, 조작의 간편성 그리고 소형화(휴대성)에 주력하고 있으며, DNA 칩 또한 이러한 점에 초점을 맞추어 개발되어야 세계시장에서의 경쟁력을 갖출 수 있다. The DNA chip is a high density paste that attaches a huge number of DNA to small substrates, such as silicon or glass, for gene discovery, and can simultaneously search for at least several hundred genes at the same time. DNA chip replaces the existing Southern blot or Northern blot and can search genes in large quantities in a short time, and can detect large amounts of RNA expression and mutations necessary for DNA sequencing, molecular biology research , Genetic diagnosis, pharmacogenetics, and the like. Current trends in biosensor development focus on low cost, speed, accuracy, ease of operation, and miniaturization (portability), and DNA chips must be developed with this focus in order to be competitive in the global market.
일반적으로 알려져 있는 DNA 칩의 기본 원리는 특정 염기서열을 가진 프로브 DNA를 칩에 다양한 방법으로 집적한 후 집적된 프로브 DNA 중 어떤 프로브 DNA가 시료 중의 표적 DNA(target DNA) 또는 RNA와 상보적으로 결합하였는지를 다량으로 검출하는 것이다. In general, the basic principle of a DNA chip is that a probe DNA having a specific sequence is integrated into the chip in various ways, and then any probe DNA in the integrated probe DNA complementarily binds to a target DNA or RNA in a sample. It is to detect a large amount.
시료 중의 표적 DNA와 칩 내에 집적된 프로브 DNA와의 결합 여부, 즉 하이브리드형성 여부를 검출하는 방법으로는, 종래에 방사선 동위원소를 사용하거나 또는 고가의 형광물질과 함께 레이저 스캐너(Laser Scanner)와 같은 장비를 사용하였다. 그러나 이러한 방법들은 조작상 번거롭고 시간이 소요되며, 형광물질로 시료 DNA를 표지할 때 고비용이 소용되고, 고가의 레이저 스캐너의 사용과 이로 인해 휴대가 불가능하다는 점 등 여러 가지 문제점과 단점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로서 최근 개발된 것이 하이브리드형성의 전기화학적 또는 전기적 검출방법이다. As a method of detecting whether the target DNA in the sample binds to the probe DNA integrated in the chip, that is, hybridization, a device such as a laser scanner or a radioactive isotope is conventionally used or an expensive fluorescent material is used. Was used. However, these methods are cumbersome and time-consuming to operate, have high costs when labeling sample DNA with fluorescent materials, and use of expensive laser scanners and their portableness make them difficult. Recently developed as a method for solving this problem is an electrochemical or electrical detection method of hybrid formation.
1990년대에 들어와 California Institute of Technology에서 DNA 이중나선구조가 전기적 전도성을 가지고 있다는 연구결과를 (Shana O. Kelly 등, 1998 ; 1999; Elizabeth M. Boon 등, 2000) 발표한 이후, DNA가 전기적 전도성을 갖는다는 많은 연구 논문들이 발표되었다 (Hans-Werner Fink & Christian Schoenenberger, 1999; Frederick D. Lewis 등, 2000; Danny Porath 등, 2000; Ann-Chrisine Syvaenen & Hans Soederlund, 2002). 즉, DNA가 단일가닥(Single strand)일 때는 전도성을 거의 가지고 있지 않으나, 이중가닥(double strand)에서는 구조상 생성되는 터널(Tunnel)을 통하여 전자가 이동을 하며, 이 전자의 이동으로 인해 DNA는 전도성을 갖게 된다는 것이다. Since the 1990s, the California Institute of Technology published a study showing that DNA double helixes have electrical conductivity (Shana O. Kelly et al., 1998; 1999; Elizabeth M. Boon et al., 2000). Many research papers have been published (Hans-Werner Fink & Christian Schoenenberger, 1999; Frederick D. Lewis et al., 2000; Danny Porath et al., 2000; Ann-Chrisine Syvaenen & Hans Soederlund, 2002). In other words, when DNA is a single strand, it has almost no conductivity, but in the double strand, electrons move through a tunnel generated structurally, and due to the movement of the DNA, DNA is conductive. Is to have.
이러한 이론적 결과를 토대로 진옴(GeneOhm)사에서 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)칩을 개발하였다. 이 센서의 원리는 인터칼레이터 화합물 (Photoinduced Dye Molecule 등)을, Au-전극 표면에 고정된 DNA에 삽입시켜 한 개의 뉴클레오티드 염기의 미스맷치를 전기적으로 검출할 수 있도록 하는 것이다. (http://www.geneohm.com) Based on these theoretical results, GeneOhm developed SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) chips. The principle of this sensor is to insert intercalator compounds (such as photoinduced dye molecules) into the DNA immobilized on the Au-electrode surface to detect mismatches of one nucleotide base electrically. (http://www.geneohm.com)
진옴(GeneOhm)사의 전기적 SNPs 검출시스템(Detection System)은 DNA의 한쪽 말단(5' End)만을 Au-전극에 고정시키고 DNA의 3' 말단은 완충액상에 떠 있는 상태로 인터칼레이터 화합물을 DNA에 삽입시켜 전도성 및 전하값을 측정하고 있다. 그러나, 바이오 물질의 전기화학적 또는 전기적 검출에 있어서 재현성있는 결과값을 찾아내는 것에는 많은 어려움이 있다. 그 이유는 많은 생물 반응이 여러 이온들로 이루어진 완충액(buffer) 상에서 이루어지게 되는데, 이러한 완충액이 바이오 물질의 전기적 검출 방법에서 재현성있는 결과값을 얻는데 문제가 되기 때문이다. 이러한 문제가 현재 바이오센서를 개발하는 기업들이 검출의 이론적 원리와 메커니즘을 밝히고 시스템을 구현했음에도 불구하고 제품을 시장에 내놓지 못하는 큰 이유 중의 하나이다.GeneOhm's Electrical SNPs Detection System (Detection System) immobilizes only one end of the DNA (5 'End) to the Au-electrode, while the 3' end of the DNA is suspended in a buffer solution. The conductivity and charge values are measured by insertion. However, there are many difficulties in finding reproducible results in electrochemical or electrical detection of biomaterials. The reason for this is that many biological reactions take place in a buffer consisting of several ions, which is problematic for obtaining reproducible results in the electrical detection of biomaterials. This is one of the major reasons why companies developing biosensors are not able to bring their products to market despite the fact that they have developed a system and the theoretical principles and mechanisms of detection.
최근에 개발된 또 다른 전기화학적 검출방법으로, 클리니칼 마이크로센서스사(Clinical Microsensors Inc., 미국)에서는 전이금속 착물과 같은 산화환원 활성물질을 프로브 DNA의 특정 위치에 선택적으로 공유결합시킨 후 표적 DNA가 프로브 DNA에 하이브리드화하는 경우에 나타나는 전자전달 속도의 변화를 이용하여 결합여부를 확인하는 기술을 개발하였다. 이 방법은 프로브 DNA와 단일가닥으로 해리된 시료 DNA를 전기화학활성 인터칼레이터의 존재하에 결합시켜 프로브 DNA와 시료 DNA에 의해 형성된 이중가닥 DNA에 삽입된 인터칼레이터에 흐르는 전류를 측정함으로써 시료 DNA의 유전자를 검색한다는 원리이다. Another recently developed electrochemical detection method, Clinical Microsensors Inc. (USA), selectively covalently binds a redox activator such as a transition metal complex to a specific position of a probe DNA and then target DNA. Developed a technique to confirm the binding by using a change in the electron transfer rate appears when hybridization to the probe DNA. This method combines probe DNA and single-stranded sample DNA in the presence of an electrochemically active intercalator to measure the current flowing through the intercalator inserted into the double-stranded DNA formed by the probe DNA and the sample DNA. The principle is to search for genes.
상기 진옴사의 방법이나 클리니칼 마이크로센서스사의 방법은 구체적인 방법에는 서로 차이가 있지만 모두 별도의 화학물질이나 인터칼레이터 물질을 사용하여야 한다는 공정 및 비용상의 문제와 완충액내의 조건에서 전기적 검출을 함에 따른 결과값의 재현성 문제를 안고 있다. Although the method of Gene Ohm and Clinical Microsensus Co., Ltd. are different from each other in the specific method, all of them have to use a separate chemical or intercalator material, and the result of the electrical detection under the conditions in the buffer and the cost and the problem in the buffer solution. Has reproducibility problems.
본 발명은 종래에 시도되고 있는 전기적 또는 전기화학적 검출방법과 마찬가지로 기본적으로 DNA가 이중나선 구조를 가질 때 전도성을 가진다는 것에 착안한 것이다. The present invention focuses on the fact that DNA has conductivity when the DNA has a double helix structure, as in the conventional methods of electrical or electrochemical detection.
본 발명에서는 전극이 구현된 DNA 칩의 양쪽 전극에 프로브 DNA의 5' 말단과 3' 말단을 각각 고정시키고 직접적인 DNA 하이브리드형성에 따른 전기적 특성값의 변화를 측정함으로써 별도의 화학물질이나 전기화학적 검출을 위한 인터칼레이터 물질을 사용하지 않고도 전기적인 방법만으로 DNA 하이브리드형성을 검출할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다. In the present invention, the 5 'and 3' ends of the probe DNA are fixed to both electrodes of the DNA chip in which the electrode is implemented, and separate chemical or electrochemical detection is performed by measuring the change in the electrical property value according to direct DNA hybridization. It is an object of the present invention to detect DNA hybridization by an electrical method without using an intercalator material.
또한, 본 발명에서는 완충액 내에서 바이오 물질을 전기적으로 검출함으로써 나타나는 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여, 완충액이 아닌 탈이온수나 가스 또는 진공상태에서 전기를 인가하여 DNA 하이브리드형성을 검출함으로써 높은 재현성과 신뢰성 있는 전기적 결과값을 얻을 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.
In addition, in the present invention, in order to solve various problems caused by the electrical detection of biomaterials in the buffer solution, high reproducibility and reliability by detecting the DNA hybridization by applying electricity in deionized water, gas, or vacuum state instead of the buffer solution. The purpose is to obtain electrical results.
본 발명에서는, In the present invention,
(a) 프로브 DNA의 양말단이 칩상에 구현된 음(-)전극과 양(+)전극에 각각 고정된 상태에서 전기를 인가하여 단일 가닥 프로브 DNA의 전기적 특성값을 측정하는 단계; (b) 양말단 또는 한쪽 말단이 전극에 고정되어 있는 프로브 DNA와 분석하고자 하는 시료 DNA를 완충액(buffer) 상에서 반응시켜 하이브리드형성이 일어나도록 하는 단계; 및 (c) 반응 후 남은 시료와 완충액을 칩으로부터 제거한 후 DNA의 양말단이 양쪽 전극에 각각 고정된 상태에서 전기를 인가하여 각 DNA의 전기적 특성값을 구해 상기 단계 (a)의 값과 비교함으로써 어떤 프로브 DNA가 하이브리드를 형성하였는가를 판단하는 단계; 를 포함하는 DNA 하이브리드형성의 전기적 검출방법이 제공된다.(a) measuring electrical characteristics of the single-stranded probe DNA by applying electricity while the sock ends of the probe DNA are fixed to the negative and positive electrodes respectively implemented on the chip; (b) reacting the probe DNA having the sock end or one end fixed to the electrode with the sample DNA to be analyzed on a buffer to allow hybridization to occur; And (c) removing the remaining sample and the buffer solution from the chip, and then applying electricity while the sock ends of the DNA are fixed to both electrodes, respectively, to obtain electrical characteristics of each DNA, and comparing the values with those of step (a). Determining which probe DNA formed a hybrid; Provided is an electrical detection method for forming a DNA hybrid comprising a.
또한 본 발명에서는,
마이크로 내지 나노 규모의 채널과, 상기 채널의 양측에 구현된 음(-)전극 및 양(+)전극과, 상기 전극에 양쪽 말단이 각각 또는 어느 한쪽 말단이 고정된 프로브 DNA를 포함하는 DNA 칩이 제공된다.In the present invention,
A DNA chip comprising a micro-nano scale channel, a negative electrode and a positive electrode implemented on both sides of the channel, and probe DNAs fixed at both ends or one end thereof on the electrode. Is provided.
또한 본 발명에서는,
(a) 칩용 기판에 마이크로 내지 나노 규모의 채널을 형성하는 단계; (b) 상기 채널의 양측에 음(-)전극과 양(+)전극을 구현하는 단계; 및 (c) 프로브 DNA의 양쪽 말단 또는 어느 한쪽 말단을 상기 전극에 고정시키는 단계;를 포함하는 DNA 칩의 제조방법이 제공된다.In the present invention,
(a) forming micro to nano scale channels in the chip substrate; (b) implementing negative and positive electrodes on both sides of the channel; And (c) fixing both ends or one end of the probe DNA to the electrode.
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이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 검출방법과 이를 위한 DNA칩 및 그 제조방법을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기에 설명되는 것은 본 발명의 기술사상을 구체화한 바람직한 일 실시예로서 본 발명의 기술적 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in more detail the detection method of the present invention and a DNA chip and a method for manufacturing the same. However, what is described below is not limited to the technical scope of the present invention as a preferred embodiment that embodies the technical spirit of the present invention.
칩의 구성The composition of the chip
도 1은 본 발명의 DNA 칩의 바람직한 일 실시예를 개념적으로 도시한 것이다. Figure 1 conceptually illustrates one preferred embodiment of the DNA chip of the present invention.
본 발명의 DNA 칩은 실리콘(Silicon), 유리, 플라스틱 등의 기판에 MEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems) 기술을 이용하여 마이크로 내지 나노 규모로 채널 또는 챔버를 형성시키고, 이 채널 또는 챔버 내에 전극을 만든 후 전극에 많은 종류의 프로브 DNA를 고정시킨 것이다. The DNA chip of the present invention forms a channel or a chamber on a micro-to-nano scale using MEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems) technology on a substrate such as silicon, glass, plastic, and the like. After making many kinds of probe DNA to the electrode was fixed.
도 1은 본 발명에 따른 DNA 칩의 바람직한 일 실시예로서, 기판(11)에 채널 또는 챔버(19)(이하, 본 명세서에서는 "채널"을 채널과 챔버를 포함하는 의미로 사용한다)가 형성되고, 채널의 일측에는 하이브리드형성 반응이 끝난 후 남은 시료와 완충액을 배출하기 위한 배출구(outlet-hole)(16)가 구비되고, 배출구(16)의 반대 편으로는 채널이 Y자 형상으로 좌·우로 갈라져 연장된 연장부가 형성되어 일측 연장부에는 탈이온수나 가스 등을 주입하기 위한 주입구 (DIW/Gas inlet-hole)(14)가 형성되고, 타측 연장부에는 검색하고자 하는 시료를 주입할 수 있는 시료 주입구(sample inlet-hole)(15)가 형성된다. 또한, 배출 및 주입을 조절할 수 있도록 배출구나 주입구에는 마이크로밸브(17)가 구비될 수 있다. 1 is a preferred embodiment of a DNA chip according to the present invention, in which a channel or a chamber 19 (hereinafter, "channel" is used herein to mean a channel and a chamber) is formed on a
채널(19)의 양 측에는 각각 양극(Au, Pt, Ag 등)(12)과 음극(Au 등)(13)이 형성되고, 프로브 DNA(18)의 양쪽 말단(5' 및 3')이 양쪽 전극에 각각 고정된다. On both sides of the
통상의 DNA 칩과 마찬가지로 본 발명의 DNA 칩에도 적게는 수백개에서 많게는 수십만개의 DNA가 고밀도로 부착됨으로써 동시에 수백개에서 수십만개의 유전자를 검색할 수 있다. 본 발명에 따른 칩의 특징은 하이브리드형성 여부를 인터컬레이터 물질의 삽입이나 산화환원제와 같은 화학물질을 별도로 사용하지 않고 완전히 전기적인 방법만으로 신속하고도 정확하게 검출할 수 있다는 것이다. Like a conventional DNA chip, a few hundred to many hundreds of thousands of DNAs are attached to the DNA chip of the present invention at high density, so that hundreds to hundreds of thousands of genes can be searched at the same time. A feature of the chip according to the present invention is that the hybrid formation can be detected quickly and accurately by a completely electrical method without inserting an intercalator material or using a chemical such as a redox agent.
칩의 제조방법Chip manufacturing method
본 발명의 DNA 칩의 제조방법은 크게 기판에 채널을 형성하는 단계; 형성된 채널에 전극을 구현하는 단계 및 상기 채널에 프로브 DNA를 고정하는 단계로 나눌 수 있다. 이하, 각 단계별로 본 발명의 DNA 칩 제조방법을 상세히 설명한다.Method for producing a DNA chip of the present invention comprises the steps of forming a channel on a substrate; Implementing an electrode in the formed channel and fixing the probe DNA to the channel can be divided into. Hereinafter, each step of the DNA chip manufacturing method of the present invention will be described in detail.
1. 기판에 채널을 형성하는 단계 1. Forming Channels in the Substrate
DNA 칩용 기판으로는 기존에 알려져 있는 실리콘웨이퍼(Silicon Wafer), 유리, 플라스틱 등을 사용할 수 있다. 기판에 MEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems) 기술을 이용하여 마이크로 내지 나노 규모의 채널을 형성한다. 이때 형성되는 채널의 폭은 하이브리드를 형성하게 되는 표적 DNA(Target DNA)의 염기서열 크기에 따라 마이크로 내지 나노 규모로 조정된다. As a substrate for a DNA chip, a conventionally known silicon wafer, glass, or plastic may be used. Micro-Electro-Mechanical-Systems (MEMS) technology is used to form micro-to-nanoscale channels on the substrate. At this time, the width of the channel to be formed is adjusted on a micro to nano scale according to the size of the base sequence of the target DNA (Target DNA) to form a hybrid.
또한, 실리콘이나 유리기판을 이용한 칩의 제작의 경우 바람직하게는 실리콘 또는 실리콘 옥사이드 표면에서의 DNA의 비특이적 흡착(Adsorption) 및 반응을 막기 위하여 파릴렌 N-타입(Parylene N-Type)으로 전극 패턴을 제외한 채널 표면을 코팅한다.
In addition, in the case of manufacturing a chip using silicon or a glass substrate, an electrode pattern may be formed of parylene N-type in order to prevent non-specific adsorption and reaction of DNA on the silicon or silicon oxide surface. Coat the channel surface except.
2. 채널에 전극을 구현하는 단계2. Implementing electrodes in the channel
상기 단계에서 형성된 채널의 양측에 각각 양(+)전극(12)과 음(-)전극(13)을 형성한다. 양(+)전극(12)은 Au, Pt 또는 Ag 등으로 형성하고, 음(-)전극(13)은 Au 등으로 형성한다.
3. 채널에 프로브 DNA를 고정하는 단계3. Fixing Probe DNA to Channels
상기 채널에 형성된 전극에 프로브 DNA를 고정시킨다. The probe DNA is fixed to the electrode formed in the channel.
(1) 음전극에의 고정(1) fixing to the negative electrode
프로브 DNA의 한쪽 말단(5' 또는 3')을 음전극에 고정한다. 고정방법으로는 프로브 DNA의 한쪽 말단(5' 또는 3')에 탄소기 또는 전도성 고분자 (conductive polymer)를 결합시킨 후 이를 음전극에 자기조립단층막(SAM) 방법으로 고정(Immobilization)시킨다. One end (5 'or 3') of the probe DNA is fixed to the negative electrode. As a fixing method, a carbon group or a conductive polymer is bonded to one end (5 'or 3') of the probe DNA and immobilized to a negative electrode by a self-assembled monolayer (SAM) method.
상기 전도성 폴리머로는, 공지된 전도성 폴리머가 모두 사용될 수 있으며, 특히 고전도성 폴리머인 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 폴리(p-페닐렌) (Poly(p-phenylen): PPP), 폴리피롤(Polypyrrole: PPy), 폴리아닐린(Polyaniline), 폴리티오펜(Polythiophene) 등이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머와 프로브 DNA는, 폴리머와 DNA간의 공지된 결합방법을 이용하여 결합시킬 수 있다. 예컨대, 프로브 DNA의 제조시 DNA 말단에 NH2기를 붙인 후 DNA의 NH2기와 폴리머의 알데히드기 간의 화학반응을 이용하여 결합시킬 수 있다. As the conductive polymer, all known conductive polymers may be used. In particular, polyacetylene, poly (p-phenylene) (Poly (p-phenylen): PPP), and polypyrrole (PPy), which are highly conductive polymers, may be used. ), Polyaniline (Polyaniline), polythiophene (Polythiophene) and the like can be used. The conductive polymer and the probe DNA can be bonded using a known bonding method between the polymer and the DNA. For example, in the preparation of the probe DNA, the NH 2 group may be attached to the DNA terminal and then bound using a chemical reaction between the NH 2 group of the DNA and the aldehyde group of the polymer.
이와 같이 프로브 DNA와 전도성 폴리머를 결합시킨 후 DNA와 결합되어 있는 전도성 폴리머를 공지된 자기조립단층막(SAM) 방법을 이용하여 채널의 음전극에 고정시킨다. 도 2에 도시된 바와 같이, 일 실시예로 티올기(Thiol Functional group)를 이용하여 자기조립단층막(SAM) 방법으로 고정시킬 수 있다. After coupling the probe DNA and the conductive polymer in this manner, the conductive polymer bound to the DNA is fixed to the negative electrode of the channel using a known self-assembled monolayer (SAM) method. As shown in FIG. 2, in one embodiment, a thiol group may be fixed by a self-assembled monolayer (SAM) method.
(2) 양(+)전극에의 고정(2) fixing to the positive electrode
프로브 DNA의 다른쪽 말단(5' 또는 3')을 양(+)전극(positive Electrode)에 고정시킨다. 이때 고정방법으로는 전기장(Electric field)을 이용하는 방법, 자기장(Magnetic Field)을 이용하는 방법, 또는 스트렙타비딘-바이오틴 (Streptavidin-Biotin)의 특이적 결합반응을 이용하는 방법 등이 사용될 수 있다. The other end (5 'or 3') of the probe DNA is fixed to the positive electrode. In this case, a method of using an electric field, a method of using a magnetic field, or a method of using a specific binding reaction of streptavidin-biotin may be used.
1) 전기적 방법: 1) Electrical method:
DNA는 인산기에 음전하(Negative Charge)를 가지고 있는 전하체이므로 전기장 내에서 양극(+)으로 끌려가 전극에 부착되는 성질을 가지고 있다. 바로 이러한 DNA의 특성을 이용하여, 채널내에 전류를 흐르게 하여 전기장을 형성하면 프로브 DNA의 다른 쪽 말단을 양(+)전극에 고정시킬 수 있다.
DNA is a charge that has a negative charge in the phosphate group, so it is attracted to the anode (+) in the electric field and attaches to the electrode. Using this DNA characteristic, an electric field can be formed by flowing an electric current in a channel to fix the other end of the probe DNA to the positive electrode.
2) 자기적 방법: 2) Magnetic method:
도 3은 폴리머와 메탈비드를 사용하여 프로브 DNA의 다른 쪽 말단을 양(+)전극에 부착하는 일 실시예를 도시한 것이다. Figure 3 illustrates an embodiment of attaching the other end of the probe DNA to the positive electrode using a polymer and metal beads.
먼저, 한쪽 끝에 티올기를 그리고 다른쪽 끝에는 알데히드 또는 카르복실기를 가지고 있는 합성 폴리머나 카본나노튜브(Carbon Nanotube) 또는 카본체인 (Carbon Chain)을 메탈비드에 자기조립단층막(SAM) 방법을 이용하여 고정시킨다. 이렇게 메탈비드에 고정된 폴리머를, 한쪽 말단이 채널의 음전극에 고정되어 있는 프로브 DNA와 결합시킨다. 폴리머와 DNA 간의 결합은 상기에서와 같이 공지된 폴리머와 DNA 간의 결합방법을 이용할 수 있다. 일 예로, 도 3에 도시된 바와 같이 프로브 DNA의 제조시 DNA 말단에 NH2기를 붙인 후 NH2기와 폴리머의 알데히드기 간의 화학반응을 이용하여 결합시킬 수 있다 (도 3 참조). 이렇게 하여 "음전극-폴리머-DNA-폴리머-메탈비드"의 순서로 결합시키고, 채널(19)의 양(+)전극(12) 쪽에서 자석물질에 의한 자기장을 형성시키면 상기 메탈비드가 양(+)전극에 자기력으로 부착됨으로써 프로브 DNA의 다른 쪽 말단이 양(+)전극에 고정되게 된다. First, a synthetic polymer, carbon nanotube, or carbon chain, which has a thiol group at one end and an aldehyde or carboxyl group at the other end, is fixed to the metal bead using a self-assembled monolayer film (SAM) method. . The polymer immobilized in the metal bead is combined with probe DNA having one end fixed to the negative electrode of the channel. As the binding between the polymer and the DNA, a binding method between the known polymer and the DNA may be used as described above. As an example, as shown in FIG. 3, the NH 2 group may be attached to the DNA terminal at the time of preparation of the probe DNA, and then bound using a chemical reaction between the NH 2 group and the aldehyde group of the polymer (see FIG. 3). In this way, when the negative electrode-polymer-DNA-polymer-metal bead is combined and a magnetic field is formed by the magnetic material on the
3) 스트렙타비딘-바이오틴 (Streptavidin-Biotin)의 특이적 결합반응을 이용하는 방법:3) using specific binding reaction of streptavidin-Biotin:
메탈비드 대신 폴리머 끝단에 스트렙타비딘을 부착시키는 것을 제외하고는 상기 2)의 자기적 방법과 동일한 방법으로 "음전극-폴리머-DNA-폴리머-스트렙타비딘"의 순차적인 결합을 만들고, 채널(19)의 양(+)전극(12) 표면에 하이드로겔 또는 PEG (Polyethylen-glycol)와 함께 박막으로 바이오틴(Biotin)을 고정시켜, 스트렙타비딘과 바이오틴의 특이적 결합반응을 이용하여 프로브 DNA의 다른 쪽 말단을 양(+)전극에 고정시킨다. A sequential bond of "cathode-polymer-DNA-polymer-streptavidin" is made in the same manner as the magnetic method of 2) except that the streptavidin is attached to the polymer end instead of the metal bead, and the channel (19) The biotin was fixed in a thin film together with a hydrogel or PEG (Polyethylen-glycol) on the surface of the positive electrode (12), and the specific binding reaction of the streptavidin and biotin was used. One end is fixed to the positive electrode.
DNA 하이브리드형성 및 검출DNA hybridization and detection
상기와 같이 제조된 DNA 칩을 이용하여 유전자 검색을 하고자 하는 시료 DNA와 프로브 DNA를 반응시켜 하이브리드를 형성한 후 그 결과를 검출하는 방법은 다음과 같다. The method of detecting a result after forming a hybrid by reacting a sample DNA to be searched for a gene and a probe DNA using the DNA chip prepared as described above is as follows.
1. ss-DNA 의 전기적 특성 값을 구하는 단계1. Obtaining Electrical Characteristics of ss-DNA
상기와 같이 제조된 칩에서 프로브 DNA의 양말단이 각각 채널 내의 음(-)전극과 양(+)전극에 고정된 상태에서 채널에 탈이온수(DIW: Deionized Water)나 가스를 주입하거나 또는 채널 내에 진공환경을 조성한 후 DC 또는 AC의 전기를 인가하여 ss-DNA (single-stranded DNA)의 전도성 (Amperomtric, Potentiometric, CV) 및 전기적 특성 (전하량의 변화, Impedance, 어드미턴스, 유전손실)을 측정한다. 여기서 얻은 전도성 및 전기적 특성 값을 하이브리드 형성 후의 ds-DNA(double-stranded DNA)의 전도성 및 전기적 특성 값에 대한 비교값(reference)으로 사용된다.In the chip manufactured as described above, deionized water (DIW) or gas is injected into the channel or in the channel with the sock end of the probe DNA fixed to the negative and positive electrodes in the channel, respectively. After creating a vacuum environment, DC or AC is applied to measure the conductivity (Amperomtric, Potentiometric, CV) and electrical characteristics (change of charge, impedance, admittance, dielectric loss) of ss-DNA (single-stranded DNA). The conductivity and electrical property values obtained here are used as a reference to the conductivity and electrical property values of the double-stranded DNA (ds-DNA) after hybrid formation.
2. 하이브리드형성 단계2. Hybrid Formation Step
단일 가닥으로 해리된 분석하고자 하는 시료 DNA를 완충액(buffer) 상태로 상기 채널에 주입하여 프로브 DNA와 하이브리드형성이 일어나도록 한다. Sample DNA to be dissociated into single strands is injected into the channel in a buffer to hybridize with the probe DNA.
하이브리드를 형성시킬 때 프로브 DNA는 칩에 양쪽 말단이 모두 고정된 상태로 있거나 또는 한쪽 말단만 고정된 상태로 있을 수 있다. 예를 들어, 프로브 DNA의 한쪽 말단을 음전극에 고정한 후 다른 쪽 말단을 상기한 바와 같이 전기장(Electric field)을 이용하여 양(+)전극에 고정시킨 경우는 전류를 통하지 않으면 양(+)전극 쪽은 다시 프로브 DNA가 떨어지게 된다. 또한, 상기한 바와 같이 자기장(Magnetic Field)을 이용하여 DNA의 한쪽 말단을 양(+)전극에 고정한 경우도 자석을 분리시키는 등의 방법으로 자기장 형성을 중단하면 양(+)전극 쪽은 DNA가 떨어지게 된다. 이렇게 하여 프로브 DNA의 한쪽 끝만 전극(음전극)에 부착시킨 상태에서 시료와 반응시켜 하이브리드형성이 되게 할 수 있다. 또한, 상기한 방법 중 스트렙타비딘-바이오틴 (Streptavidin-Biotin)의 특이적 결합반응을 이용하여 DNA의 한쪽 끝을 양(+)전극에 고정한 경우와 같이 프로브 DNA의 양쪽 말단이 모두 전극에 부착된 상태에서 하이브리드형성이 일어나게 할 수도 있다. When forming a hybrid, the probe DNA may be fixed at both ends or fixed at one end to the chip. For example, in the case where one end of the probe DNA is fixed to the negative electrode and the other end is fixed to the positive electrode using an electric field as described above, the positive electrode side is not allowed to pass through the current. Will cause the probe DNA to fall again. In addition, even when one end of the DNA is fixed to the positive electrode using a magnetic field as described above, when the magnetic field is stopped by a method such as separating a magnet, the positive electrode is formed on the positive electrode side. Will fall. In this way, one end of the probe DNA is attached to the electrode (negative electrode) and reacted with the sample to allow hybridization. In addition, both ends of the probe DNA are attached to the electrode, such as when one end of the DNA is fixed to the positive electrode by using a specific binding reaction of Streptavidin-Biotin. Hybridization may also occur in a state.
예를 들어, 백혈구 또는 모근세포를 용해(lysis)하여 추출된 변성(denaturation) DNA를 완충액 상태로 채널(19)에 주입하여 채널에 이미 고정되어 있는 ss-DNA, 즉 프로브 DNA와 상보적인 결합이 일어나도록 할 수 있다. For example, denatured DNA extracted by lysing leukocytes or hair follicle cells is injected into the
3. 검출단계3. Detection step
상기 단계에서 하이브리드형성된 DNA를 전기적인 방법으로 검출한다. In this step, the hybridized DNA is detected by an electrical method.
먼저 반응 후 남은 시료와 완충액을 모두 채널로부터 배출시킨 후, DNA의 양말단이 양쪽 전극에 각각 고정된 상태에서 채널에 다시 탈이온수나 가스를 주입하거나 또는 진공환경을 조성하고 전기를 인가하여 각 DNA의 전기적 특성값을 구한다. First, after discharging all the remaining sample and buffer from the channel, deionized water or gas is injected again into the channel while the sock end of the DNA is fixed to both electrodes, or a vacuum environment is applied and electricity is applied to each DNA. Find the electrical characteristics of.
DNA의 양말단이 모두 전극에 고정된 상태에서 전기적 특성값을 구해야 하므로, 프로브 DNA의 한쪽 말단만 전극에 고정된 상태에서 하이브리드화한 경우는 우선 고정되지 않은 DNA의 다른 쪽 말단을 전극에 고정시킨다. 이때 고정시키는 방법은, 상기에서 설명한 프로브 DNA의 전극 고정방법과 동일하다. 예를 들어, 하이브리드형성이 된 후 채널에 전기장을 형성하여 고정되지 않은 DNA의 말단을 양(+)전극에 고정시킬 수도 있으며, 또는 DNA 말단에 메탈비드가 결합되어 있는 경우에는 채널에 자기장을 형성시켜 양(+)전극에 고정시킬 수 있다. Since the electrical characteristic value should be obtained with all the sock ends of DNA fixed to the electrode, when hybridizing with only one end of the probe DNA fixed to the electrode, first fix the other end of the immobilized DNA to the electrode. . At this time, the fixing method is the same as the electrode fixing method of the probe DNA described above. For example, after hybridization, an electric field is formed in a channel to fix an unfixed end of DNA to a positive electrode, or a magnetic field is formed in a channel when metal beads are bonded to the end of the DNA. It can be fixed to the positive electrode.
DNA의 양말단이 모두 전극에 고정된 상태에서, 정확한 전기적 특성값을 구하기 위하여 채널에 탈이온수(DIW: Deionized Water)나 가스를 주입하거나 또는 채널 내에 진공환경을 조성한 후 DC 또는 AC의 전기를 인가하여 하이브리드화된 ds-DNA (double-stranded DNA)의 전도성 (Amperomtric, Potentiometric, CV) 및 전기적 특성 (전하량의 변화, Impedance, 어드미턴스, 유전손실)을 측정한다. 이렇게 얻은 ds-DNA 전기적 특성 값과 상기 단계에서 얻은 ss-DNA의 비교값을 비교함으로써 어떤 프로브 DNA에 하이브리드형성이 이루어졌는지를 판단하여 표적 DNA를 정성 정량 측정할 수 있다.
In the state where both ends of DNA are fixed to electrodes, DC or AC electricity is applied after deionized water (DIW) or gas is injected into the channel or a vacuum environment is established in the channel to obtain accurate electrical characteristics. The conductivity (Amperomtric, Potentiometric, CV) and electrical properties (change of charge, impedance, admittance, dielectric loss) of the hybridized ds-DNA (double-stranded DNA) are measured. By comparing the ds-DNA electrical property values thus obtained with the comparison values of the ss-DNA obtained in the above step, it is possible to qualitatively measure the target DNA by determining which probe DNA has been hybridized.
본 발명에 따르면 고가의 형광물질이나 그에 따른 광학기기, 별도의 화학물질이나 인터칼레이터 물질을 사용할 필요가 없으므로, 그에 따른 경제적 장점 및 기기의 소형화라는 장점을 갖게 된다. 또한, 본 발명의 칩과 검출방법에서는 기존 방법에서 필요한 형광물질의 표지나 인터칼레이터 물질의 삽입 등 여러 공정을 줄임으로써 현재 유전자 분석 및 임상실험에 소요되는 많은 시간과 노력을 줄일 수 있으며, 특히 하이브리드형성의 전기적 검출에 있어서 완충액이 아닌 탈이온수나 가스 또는 진공상태에서 전기를 인가하여 검출함으로써 기존의 전기적 검출의 문제점을 해결하고 높은 재현성과 신뢰성이 있는 전기적 결과값을 얻을 수 있다. According to the present invention, there is no need to use an expensive fluorescent material or an optical device, an additional chemical material or an intercalator material, and thus, there is an economic advantage and a miniaturization of the device. In addition, the chip and the detection method of the present invention can reduce a lot of time and effort for the current genetic analysis and clinical experiments by reducing various processes such as the labeling of fluorescent material or the insertion of intercalator material required by the existing method. In the electrical detection of hybrid formation, it is possible to solve the problem of the existing electrical detection by obtaining electricity in deionized water, gas, or vacuum state, not a buffer solution, and obtain high reproducibility and reliable electrical results.
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