KR100988945B1 - Simulation Device of Cell Induction·Fixation in Target Part of Blood Vessels Using Microchannels and Method for Simulation Using the Same - Google Patents
Simulation Device of Cell Induction·Fixation in Target Part of Blood Vessels Using Microchannels and Method for Simulation Using the SameInfo
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Abstract
본 발명은 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치 및 이를 이용하는 시뮬레이션 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자성 나노입자를 도입한 세포를 마이크로 채널 내로 주입하고 외부 자기장을 가하여 혈류를 모사한 유속 하에서 채널 내 특정 부위에 유도·고정되는지를 시뮬레이션하는 장치 및 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a simulation apparatus for inducing and fixing cells in a specific region in a blood vessel using a microchannel and a simulation method using the same. The present invention relates to a device and a method for simulating whether or not a specific flow in a channel is induced or fixed under a flow rate that simulates blood flow.
본 발명에 따른 시뮬레이션 장치 및 방법은 유체 공급부를 조정하여 유속을 조절하고, 세포 내 자성 나노입자 농도를 조절하며, 마이크로채널의 폭과 깊이를 조절함으로써, 다양한 부위와 상황에서의 치료용 세포의 유도 및 고정을 효과적으로 시뮬레이션할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시뮬레이션 장치 및 방법은 실제 사람이나 동물을 대상으로 치료 효과를 시험하기 전, 적은 비용과 시간으로 세포 치료에 필요한 최적의 조건을 효과적으로 얻을 수 있게 하므로 유용하다. Simulation device and method according to the present invention by adjusting the fluid supply to control the flow rate, the concentration of magnetic nanoparticles in the cell, by controlling the width and depth of the microchannel, induction of therapeutic cells in various sites and situations And fixation can be effectively simulated. Therefore, the simulation apparatus and method according to the present invention is useful because it is possible to effectively obtain the optimal conditions for cell treatment at low cost and time before testing the therapeutic effect on real humans or animals.
자성 나노입자, 마이크로채널, 시뮬레이션, 혈관, 유도, 고정 Magnetic nanoparticles, microchannels, simulations, blood vessels, induction, fixation
Description
본 발명은 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치 및 이를 이용하는 시뮬레이션 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자성 나노입자를 도입한 세포를 마이크로 채널 내로 주입하고 외부 자기장을 가하여 혈행을 모사한 유속 하에서 채널 내 특정 부위에 유도·고정되는지를 시뮬레이션하는 장치 및 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a simulation apparatus for inducing and fixing cells in a specific region in a blood vessel using a microchannel and a simulation method using the same. The present invention relates to a device and a method for simulating whether a blood flow is induced or fixed at a specific part of a channel under a flow rate that simulates blood circulation.
생명공학의 발전은 식량, 환경, 의료 분야의 비약적인 발전을 견인해 왔다. 특히 의료 분야에서 신체 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 줄기세포에 대한 연구가 진행되면서 지금까지 불가능하다고 여겨졌던 질환들의 치료가 가능해질 것으로 기대되고 있다. 그러나 줄기세포를 이용한 질환 치료가 실용화되기 위해서는 종 양(tumor)의 형성, 원하는 특정 세포로의 분화, 줄기세포의 추출과 정제 및 체외배양을 통한 다량의 세포확보 등의 문제의 해결이 선행되어야 한다. Advances in biotechnology have led to dramatic advances in food, the environment and healthcare. In particular, as the research on stem cells capable of differentiating into all kinds of cells in the medical field is expected, it is expected to be able to treat diseases which were considered impossible until now. However, in order to treat diseases using stem cells, it is necessary to solve problems such as formation of tumors, differentiation into specific cells as desired, extraction and purification of stem cells, and securing a large amount of cells through in vitro culture. .
한편, 줄기세포 치료의 실용화를 위한 필수적인 기술 중 하나는 줄기세포를 환부에 유도, 고정하는 기술이다. 근육과 같이 격렬하게 움직이는 부위, 심장이나 동맥 등 혈류가 빠른 부분에서는 주입한 줄기세포가 쉽게 떨어져 나가 주위 혈류를 타고 목표 부위에서 멀어져 버리게 된다. 따라서 효율적인 줄기세포 치료를 위하여 줄기세포를 효과적으로 환부에 유도, 고정시킬 수 있어야 한다.On the other hand, one of the essential techniques for the practical use of stem cell treatment is a technique for inducing and fixing stem cells in the affected area. In intensely moving areas, such as muscles, heart or arteries, the flow of blood flows quickly, and the injected stem cells easily fall off, taking the surrounding blood flow away from the target site. Therefore, stem cells should be effectively induced and fixed to the affected area for efficient stem cell treatment.
줄기세포의 효과적인 유도와 고정을 위하여 목표 질환 부위로 유도될 수 있는 사이토카인 등의 화학 물질을 이용하는 방법과 함께 세포 지지체를 이식하거나 자성 나노입자를 줄기세포 내에 도입하여 자기장을 통하여 고정시키는 방법들이 연구되고 있다. 특히 대한민국 등록특허 제 10-0792185호 “자성 나노입자를 이용한 세포의 이동과 고정 방법”에서 박테리아로부터 수득한 자성 나노입자를 세포 내에 함입시켜 응용하는데 사용될 수 있음을 보인 바 있다. For the effective induction and fixation of stem cells, studies have been made on the use of chemicals such as cytokines that can be induced to target disease sites, and implantation of cell scaffolds or introduction of magnetic nanoparticles into stem cells to fix them through magnetic fields. It is becoming. In particular, the Republic of Korea Patent No. 10-0792185 "method of movement and fixation of cells using magnetic nanoparticles" has been shown that the magnetic nanoparticles obtained from bacteria can be used for application by incorporating into the cells.
그러나, 상기와 같은 여러 가지 접근을 통해 줄기세포 치료 효율을 높이는 연구에 있어서 방법을 시험하고 적절한 조건을 찾는데 적절한 모델의 사용은 필수적이다. 실제 사람에게 적용되기 이전 쥐, 토끼 등의 동물에 대한 실험이 선행되어 그 안정성과 효용을 평가하고 있으나, 적절한 조건을 찾기 위하여 실험을 반복하는 과정에서 실험 동물의 희생과 비용이 커지게 된다. 따라서 동물 실험에 들어가기 전 실제 생체에서의 환경을 시뮬레이션할 수 있는 체외 모형을 설정하여 최적의 조건을 설정하는 것이 필요하다. However, the use of appropriate models for testing methods and finding appropriate conditions is essential in studies to increase stem cell treatment efficiency through such approaches. Experiments on animals such as rats and rabbits have been conducted before they are applied to humans to evaluate their stability and utility. However, the sacrifice and cost of experimental animals increases in the process of repeating experiments to find appropriate conditions. Therefore, before entering animal experiments, it is necessary to set up an in vitro model that can simulate the environment in real life to set the optimal conditions.
혈관을 모사하는 기존 기술로 대한민국 등록특허 10-0721117호 유체순환시스템을 갖는 팬텀장치”가 있으나, 이는 의료용 영상 촬영장치에 장착되어 주로 장치의 성능을 평가하거나 유체의 유동량, 유출량을 분석하는 목적으로 쓰이는 기술로 혈관 내의 세포 고정을 시뮬레이션하여 세포 치료에 응용하는 것과는 거리가 있다.Phantom device having a fluid circulation system is a conventional technology that simulates blood vessels ”, but it is installed in a medical imaging device, mainly for the purpose of evaluating the performance of the device or analyzing the flow rate and flow rate of the fluid. This technique is far from being used for cell therapy by simulating cell fixation in blood vessels.
또한 상기한 대한민국 등록특허 제 10-0792185호 “자성 나노입자를 이용한 세포의 이동과 고정 방법”에서 자성 나노입자를 사용하여 유체 흐름이 존재하는 상황에서 세포를 유도, 고정시킬 수 있음을 보였으나, 혈관 내 세포의 이동과 고정을 시뮬레이션할 수 있는 방법의 설정은 미흡하였다. In addition, the Korean Patent No. 10-0792185, "Method for Moving and Immobilizing Cells Using Magnetic Nanoparticles", showed that the magnetic nanoparticles were used to induce and fix the cells in the presence of a fluid flow. There is a poor set of methods to simulate the movement and fixation of cells in blood vessels.
이에, 본 발명자들은 혈관 내 혈류가 존재하는 상황에서의 세포의 유도 및 고정 효과를 시뮬레이션할 수 있는 새로운 장치 및 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 자성 나노입자를 도입한 세포를 마이크로 채널 내로 주입하고 외부 자기장을 가하여 혈행을 모사한 유속 하에서 관찰한 결과, 자성 나노입자의 농도, 유속, 마이크로 채널의 폭 및 깊이 등을 변화시키며 혈관 내 세포의 유도 및 고정을 시뮬레이션 할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to provide a novel apparatus and method capable of simulating the induction and fixation effect of cells in the presence of blood flow in the blood vessels. As a result of observing the blood circulation by applying a magnetic field, it was confirmed that it was possible to simulate the induction and fixation of cells in blood vessels by changing the concentration of magnetic nanoparticles, the flow rate, the width and depth of microchannels, and completed the present invention. It was.
본 발명의 목적은 자성 나노입자 함유 세포를 이용하고 특정 조건을 변화시켜 효과적으로 혈관 내 특정부위에 세포가 유도·고정되는지를 시뮬레이션할 수 있는 새로운 장치 및 방법을 제공하는 데 있다. SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a novel apparatus and method capable of effectively simulating whether cells are induced or fixed at specific sites in blood vessels by using magnetic nanoparticle-containing cells and changing specific conditions.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는, 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a simulation apparatus for inducing and fixing cells in a specific region in a blood vessel using a microchannel, including:
(a) 자성 나노입자 함유 세포를 공급하는 유체 공급부; (a) a fluid supply for supplying magnetic nanoparticle-containing cells;
(b) 상기 유체 공급부의 일단에 연결되는 마이크로 채널;(b) a microchannel connected to one end of the fluid supply;
(c) 상기 마이크로 채널에 외부 자기장을 형성하는 자석; 및(c) a magnet forming an external magnetic field in the microchannel; And
(d) 상기 마이크로 채널 내 특정부위에 자성 나노입자 함유 세포가 유도·고정되는지를 관찰하는 관측부.(d) an observation unit for observing whether or not the magnetic nanoparticle-containing cells are induced or fixed at a specific site in the microchannel.
본 발명은 또한, 상기 시뮬레이션 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 세포의 유도 및 고정 시뮬레이션 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for simulating induction and fixation of intravascular cells using microchannels, which comprises using the simulation device.
본 발명은 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치 및 이를 이용하는 시뮬레이션 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 시뮬레이션 장치 및 방법은 유체 공급부를 조정하여 유속을 조절하고, 세포 내 자성 나노입자 농도를 조절하며, 마이크로채널의 폭과 깊이를 조절함으로써, 다양한 부위와 상황에서의 치료용 세포의 유도 및 고정을 효과적으로 시뮬레이션할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시뮬레이션 장치 및 방법은 실제 사람이나 동물을 대상으로 치료 효과를 시험하기 전, 적은 비용과 시간으로 세포 치료에 필요한 최적의 조건을 효과적으로 얻을 수 있게 하므로 유용하다. The present invention has the effect of providing a simulation apparatus for inducing and fixing cells in a specific region in a blood vessel using a microchannel and a simulation method using the same. Simulation device and method according to the present invention by adjusting the fluid supply to control the flow rate, the concentration of magnetic nanoparticles in the cell, by controlling the width and depth of the microchannel, induction of therapeutic cells in various sites and situations And fixation can be effectively simulated. Therefore, the simulation apparatus and method according to the present invention is useful because it is possible to effectively obtain the optimal conditions for cell treatment at low cost and time before testing the therapeutic effect on real humans or animals.
본 발명은 다음을 포함하는, 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치에 관한 것이다:The present invention relates to a simulation apparatus for inducing and fixing a cell in a specific region in a blood vessel using a microchannel, comprising:
(a) 자성 나노입자 함유 세포를 공급하는 유체 공급부; (a) a fluid supply for supplying magnetic nanoparticle-containing cells;
(b) 상기 유체 공급부의 일단에 연결되는 마이크로 채널;(b) a microchannel connected to one end of the fluid supply;
(c) 상기 마이크로 채널에 외부 자기장을 형성하는 자석; 및(c) a magnet forming an external magnetic field in the microchannel; And
(d) 상기 마이크로 채널 내 특정부위에 자성 나노입자 함유 세포가 유도·고정되는지를 관찰하는 관측부.(d) an observation unit for observing whether or not the magnetic nanoparticle-containing cells are induced or fixed at a specific site in the microchannel.
본 발명에 있어서, 상기 유체 공급부는 마이크로 채널로 공급되는 자성 나노입자 함유 세포의 유속을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다. 유체 공급부는 혈류를 모사하는 유체 흐름을 제공하는 것으로서, 시린지 펌프(syringe pump) 혹은 연 동 펌프(peristatic pump)으로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the fluid supply may be characterized in that for controlling the flow rate of the magnetic nanoparticle-containing cells supplied to the microchannel. The fluid supply unit may provide a fluid flow that simulates blood flow, and may be formed of a syringe pump or a peristatic pump, but is not limited thereto.
본 발명에서 마이크로채널은 혈관을 모사하는데, DMS(polydimethylsiloxane) 등의 고분자 혹은 실리콘 재질로 채널의 폭은 10~500um인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 관측부는 이러한 마이크로 채널 내부의 세포의 유도 및 고정 특성을 관찰하는 장치로, 전하결합소자 카메라가 장착된 광학현미경 혹은 형광현미경으로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the microchannels simulate blood vessels, but the width of the channel is made of a polymer or silicon material such as polydimethylsiloxane (DMS), but is not limited thereto. Observation unit is a device for observing the induction and fixation characteristics of the cells in the micro-channel, it may be characterized in that consisting of an optical microscope or a fluorescent microscope equipped with a charge coupled device camera, but is not limited thereto.
본 발명은 다른 관점에서, 시뮬레이션 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 혈관 내 특정부위에 세포를 유도·고정하기 위한 시뮬레이션 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a simulation method for inducing and fixing a cell at a specific site in a blood vessel, characterized by using a simulation apparatus.
본 발명에 있어서, 상기 시뮬레이션 장치에 공급되는 자성 나노입자 함유 세포 내의 자성 나노입자의 농도를 변화시켜 마이크로 채널 내 특정 부위에 자성 나노입자 함유 세포가 유도·고정되는 것을 변화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the concentration of the magnetic nanoparticles in the magnetic nanoparticle-containing cells supplied to the simulation apparatus may be characterized by changing the induction and fixation of the magnetic nanoparticle-containing cells in a specific region in the microchannel. .
본 발명에 있어서, 상기 시뮬레이션 장치에 공급되는 자성 나노입자 함유 세포의 유속을 변화시켜 마이크로 채널 내 특정 부위에 자성 나노입자 함유 세포가 유도·고정되는 것을 변화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the flow rate of the magnetic nanoparticle-containing cells supplied to the simulation apparatus may be changed so as to change the induction and fixation of the magnetic nanoparticle-containing cells in a specific region in the microchannel.
본 발명에 있어서, 상기 시뮬레이션 장치의 마이크로 채널의 폭과 깊이를 변화시켜 마이크로 채널 내 특정 부위에 자성 나노입자 함유 세포가 유도·고정되는 것을 변화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the width and depth of the microchannel of the simulation apparatus may be changed to change the induction and fixation of the magnetic nanoparticle-containing cells in a specific region of the microchannel.
본원에서 "자성 나노입자 함유 세포“란, 자성나노입자를 세포 내 함유하거나 또는 자성 나노입자가 세포 표면에 부착된 세포를 의미한다.As used herein, the term "magnetic nanoparticle-containing cell" refers to a cell containing magnetic nanoparticles in a cell or having magnetic nanoparticles attached to a cell surface.
본 발명의 방법에 사용되는 자성 나노입자 함유 세포는 세포치료제용 세포, 세포치료제용 줄기 세포 또는 세포치료제용 줄기세포로부터 분화된 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 줄기세포에서 분화된 세포는 연골세포, 골형성 세포, 신경 세포, 성상세포, 지방세포 또는 인슐린 분비 췌장 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 세포치료제용 세포들은 사람에게 적용하기 전, 동물실험들을 거치고 있으나, 적절한 조건을 찾기 위하여 실험을 반복하는 과정에서 실험동물들의 희생과 비용이 커지므로, 동물실험 전 실제 생체의 환경을 시뮬레이션 할 수 있는 체외모형에의 적용이 필요한데, 본 발명에 따른 방법은 이러한 생체 내 환경을 시뮬레이션할 수 있게 하는 장점이 있다. The magnetic nanoparticle-containing cells used in the method of the present invention may be characterized in that they are cells differentiated from cells for cell therapy, stem cells for cell therapy or stem cells for cell therapy. At this time, the cells differentiated from the stem cells may be characterized in that the chondrocytes, osteogenic cells, nerve cells, astrocytic cells, adipocytes or insulin secreting pancreatic cells. Cell therapy cells undergo animal experiments before they are applied to humans, but the sacrifice and cost of experimental animals increases in the process of repeating experiments to find appropriate conditions. Application to an in vitro model is required, and the method according to the present invention has the advantage of being able to simulate such an in vivo environment.
한편, 상기 세포에 도입되는 자성 나노입자는 금속이온들을 함께 침전하여 제조하는 공침법(co-precipitation), 미셀 내부에 금속 산화물을 침전시켜 제조하는 마이크로에멀젼 방법, 금속-올레산 복합물을 합성한 다음 가열하고 산화시켜 제조하는 방법에 의해 제조된 것일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 또한 세포에 처리된 자성 나노입자는 자성 박테리아를 자성 박테리아 배양 배지에 배양한 다음 파쇄하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. On the other hand, the magnetic nanoparticles introduced into the cell is co-precipitation (precipitation) to be prepared by the precipitation of metal ions together, a microemulsion method to be prepared by precipitating the metal oxide inside the micelle, a metal-oleic acid composite synthesized and then heated And may be prepared by a method of oxidizing, but is not limited thereto. In addition, the magnetic nanoparticles treated in the cells may be obtained by culturing the magnetic bacteria in a magnetic bacterial culture medium and then crushing the same, but is not limited thereto.
본 발명의 실시예에서는 마그네틱 박테리아인 마그네토스피릴륨속 AMB-1을 이용하여, 자성 나노입자를 수득하였으나, 이에 제한되지 않고, 다른 마그네틱 박테리아로부터 자성 나노입자를 수득하거나, 여러 가지 방법으로 자성 나노입자를 합성하여 사용하는 것도 가능하다. In the embodiment of the present invention, magnetic nanoparticles were obtained by using the magnetic bacteria of the genus Magnetospirylium AMB-1. However, the present invention is not limited thereto, and magnetic nanoparticles may be obtained from other magnetic bacteria, or magnetic nanoparticles may be used in various ways. It is also possible to use synthesized.
본 발명의 실시예에서는, 상기 방법을 통해 수득한 자성 나노입자를 세포 배양 배지에 첨가하여, 내피전구세포 내로 도입하였다. 내피전구세포(Endothelial Progenitor Cell, EPC)는 인간 골수에서 추출된 세포로 성숙한 내피세포로 분화될 수 있는 능력을 지녀 허혈성 조직에의 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 따라서 허혈성 질환이나 심근 경색 등의 치료에 활용될 수 있어 연구가 활발하게 진행되고 있는 세포이다. 그러나 내피전구세포에 제한되지 않고, 여타 줄기 세포를 포함한 다른 여러 세포에도 용이하게 본 발명의 적용이 가능함은 자명하다. In the embodiment of the present invention, the magnetic nanoparticles obtained through the above method were added to the cell culture medium and introduced into endothelial progenitor cells. Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are cells extracted from human bone marrow and have the ability to differentiate into mature endothelial cells, thereby promoting angiogenesis to ischemic tissues. Therefore, it can be used for the treatment of ischemic disease or myocardial infarction, and is a cell that is being actively researched. However, the present invention is not limited to endothelial progenitor cells, and it is obvious that the present invention can be easily applied to various other cells including other stem cells.
본 발명의 실시예에서는 또한, 상기 자성 나노입자가 도입된 세포를 유체 공급부를 통해 마이크로 채널에 흘려 채널 내 목적한 특정 부위에 세포가 고정되는 것을 관측 장비로 관찰하였다. 본 발명의 실시예에서는 시린지 펌프를 통해 일정 유량과 속도로 세포가 포함된 세포 배양액을 채널 내에 통과시켜 전하결합소자 카메라가 부착된 광학 현미경을 통하여 관찰하였으나, 이에 국한되지 않고 연동 펌프 등의 다른 유체 공급 장치를 사용하거나 형광 현미경 등의 다른 여러 가지 관측 장비를 사용하는 것도 가능하다.In the embodiment of the present invention, it was also observed with the observation equipment that the cells into which the magnetic nanoparticles were introduced were fixed in a specific region in the channel by flowing the microchannel through the fluid supply unit. In the embodiment of the present invention, the cell culture medium containing the cells were passed through the syringe pump at a constant flow rate and speed in the channel, and observed through an optical microscope with a charge coupled device camera, but the present invention is not limited thereto. It is also possible to use a feeding device or other various observation equipment such as a fluorescence microscope.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예Example 1: 내피전구세포로의 자성 나노입자의 도입 1: Introduction of magnetic nanoparticles into endothelial progenitor cells
서울대학교 병원에서 제공받은 인간 내피전구세포(endothelial progenitor cell)를 내피세포 성장 원(growth supplement)이 포함된 세포배양 배지를 사용하여 1.5% 젤라틴으로 코팅된 세포배양 플라스크에서 배양하였다. 배양된 내피전구세포를 떼어내어 멀티 웰 플레이트에 옮겨 부착시킨 뒤 마그네틱 박테리아인 마그네토스피릴륨속 AMB-1(Magnetospirillum sp . AMB-1) (ATCC Cat. No. 700264) 세포에서 분리, 정제된 자성 나노입자를 세포 배양 배지에 10μg/104 cells의 농도로 첨가하여 24시간 배양하여 자성 나노입자를 내피전구세포에 도입하였다. Human endothelial progenitor cells provided by Seoul National University Hospital were cultured in cell culture flasks coated with 1.5% gelatin using cell culture medium containing endothelial growth supplements. The cultured endothelial progenitor cells were detached, transferred to a multi-well plate, and attached to the magnetic bacteria magnetospirillium genus AMB-1 ( Magnetospirillum sp . AMB-1) (ATCC Cat. No. 700264) Magnetic nanoparticles isolated and purified from cells were added to the cell culture medium at a concentration of 10 μg / 10 4 cells and cultured for 24 hours to introduce the magnetic nanoparticles into endothelial progenitor cells. .
그 후, 내피전구세포에 자성 나노입자가 성공적으로 도입되었는지 확인하기 위하여 투과전자현미경을 이용해 분석하였다. 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포를 웰 플레이트에서 떼어낸 다음 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 2% 파라포름알데히드(praformaldehyde)를 포함한 100mM 카코딜나트륨(sodium cacodylate) 용액에 15분간 반응시켜 고정화한 뒤 원심분리기를 이용하여 세포를 모은 후 100 mM 카코딜나트륨(sodium cacodylate) 용액으로 20분간 두 번 세척하였다. 1% 테트라옥사이드나트륨(sodium tetroxide)를 포함한 0℃ 100 mM 카코딜나트륨(sodium cacodylate) 용액으로 30분간 후고정한 뒤 0℃ 증류수로 두 번 세척하였다. 얻어진 세포 펠릿을 0.5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액에 넣어 4℃ 에서 밤새도록 반응시켜 염색한 뒤 염색된 세포 펠릿을 30%에서 100% 농도의 에탄올로 순차적으로 탈수시키고 100% 산화폴리필렌(propylene oxide)에 두 번 세척하였다. 마지막으로, 세포 펠릿을 소수성 레진인 Spurr에 포매하여 얇게 잘라 시료를 만들고, 이를 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 lead citrate로 음성염색한 뒤 구리 격자에 놓아 투과전자현미경에서 분석하였다. Then, to confirm whether the magnetic nanoparticles were successfully introduced into endothelial progenitor cells were analyzed using transmission electron microscope. The endothelial progenitor cells into which the magnetic nanoparticles were introduced were removed from the well plate, and then immobilized by reacting with 100 mM sodium cacodylate solution containing 2% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde for 15 minutes. After the cells were collected using a centrifuge, the cells were washed twice with 100 mM sodium cacodylate solution for 20 minutes. After fixing for 30 minutes with a 0 ° C. 100 mM sodium cacodylate solution containing 1% sodium tetroxide, the mixture was washed twice with 0 ° C. distilled water. The obtained cell pellet was placed in a 0.5% uranyl acetate solution and reacted at 4 ° C. overnight, followed by staining. The stained cell pellet was sequentially dehydrated with ethanol at a concentration of 30% to 100%, followed by 100% polypropylene oxide ( propylene oxide) twice. Finally, the cell pellet was embedded in a hydrophobic resin, Spurr, thinly sliced to make a sample, which was negatively stained with 2% uranyl acetate and lead citrate, and placed on a copper grid to be analyzed on a transmission electron microscope.
그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포가 영구자석에 의해 이동, 고정된 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 1A, it was confirmed that endothelial progenitor cells into which the magnetic nanoparticles were introduced were moved and fixed by the permanent magnet.
또한, 도 1의 B는 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포를 투과전자현미경을 이용하여 촬영한 사진으로, 사진상의 검고 작은 알갱이로 보이는 것이 자성 나노입자이다. 이에 자성 나노입자가 내피전구세포 내에 효과적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다.In addition, FIG. 1B is a photograph obtained by using a transmission electron microscope of endothelial progenitor cells into which the magnetic nanoparticles are introduced, and the magnetic nanoparticles are seen as black and small grains on the photograph. It was confirmed that the magnetic nanoparticles were effectively introduced into endothelial progenitor cells.
실시예Example 2: 혈관 내 자성 나노입자 함유 세포의 유도 및 고정 시뮬레이션 장치의 제작 및 시뮬레이션의 실행 2: Fabrication of magnetic nanoparticle-containing cells in blood vessels and fabrication of fixed simulation device and execution of simulation
다음와 같이, 혈관 내에서 치료용 세포가 목표 위치에 효과적으로 유도, 고정되는 조건을 찾기 위한 본 발명에 따른 시뮬레이션 장치를 제작하였다 (도 2). 이하 괄호 안의 숫자는 도 2의 A에 표시된 숫자와 대응한다.As follows, a simulation apparatus according to the present invention was manufactured to find a condition in which a therapeutic cell is effectively induced and fixed in a target position in a blood vessel (FIG. 2). The numbers in parentheses below correspond to the numbers shown in A in FIG. 2.
먼저 마이크로 채널(5)을 내부 깊이는 50 μm, 너비는 400 μm , 길이는 20 mm로 제작하였다. 마이크로채널은 소프트 리소그라피(soft lithography) 방법을 통 하여 제작된 마스크 위에 curing agent와 10:1 비율로 혼합된 PDMS prepolymer를 붓고 100℃에서 1시간 동안 curing하여 PDMS replica를 얻은 뒤 25W 산소 플라즈마(oxygen plasma) 처리를 통해 유리판과 접합 되었다. First, the
그런 다음, 실시예 1에서 수득한 자성나노입자(1)가 도입된 내피전구세포(2)를 포함하는 유체를 시린지 펌프(3)를 사용하여 1에서 10 μl/min의 유량으로 마이크로채널에 흘려 보내 혈류를 모사하였다. 마이크로 채널 내 유체 흐름이 일정하게 조절된 뒤 네오디뮴 영구자석(6, 가로 20 mm, 세로 20 mm, 높이 10 mm)을 마이크로 채널의 옆에 놓아 외부 자기장을 가하였다. 도 2의 B는 FEMM이라는 무료 소프트웨어를 사용하여 거리에 따른 영구자석 주위의 자기장을 모사한 것이다. 상기와 같이 만들어진 모형은 일정한 속도의 혈류가 흐르는 혈관 내에서 세포가 목적 부위에 유도되어 고정되는 것을 효과적으로 모사하였다.Then, the fluid containing the
실시예Example 3: 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포의 혈관 내 유도 및 고정 관찰 3: Intravascular Induction and Fixation of Endothelial Progenitor Cells Incorporated with Magnetic Nanoparticles
실시예 2에 의해 만들어진 시뮬레이션 모형 상에서 자성 나노입자를 도입한 내피전구세포의 외부 자기장에 의한 유도 및 고정 효과를 관찰하였다. 2μg/104 cells, 10μg/104 cells의 두 가지 농도로 자성 나노입자를 처리한 내피전구세포를 시린지 펌프를 이용하여 1~5μl/min의 유속으로 마이크로채널에 흘려 주면서 네오디뮴 영구자석으로 외부 자기장을 걸어 준 부분에 모여 고정되는 세포와 유체의 흐름을 따라 흘러가는 세포를 각각 세어 고정 효율을 관찰하였다.The induction and fixation effect by the external magnetic field of endothelial progenitor cells incorporating magnetic nanoparticles was observed on the simulation model made by Example 2. Endothelial progenitor cells treated with magnetic nanoparticles at two concentrations, 2μg / 10 4 cells and 10μg / 10 4 cells, were flowed into the microchannel at a flow rate of 1 to 5 μl / min using a syringe pump, and an external magnetic field was used as a neodymium permanent magnet. The fixed efficiency was measured by counting the cells flowing along the flow of the fluid and the cells gathered in the hanging portion.
그 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 2μg/104 cells에 비하여 10μg/104 cells의 농도로 자성 나노입자를 처리한 내피 전구세포의 경우 외부 자기장이 영향을 미치는 목표 위치에서 더 높은 수준으로 채널 벽면에 고정되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명에 따른 시뮬레이션 방법에 있어서, 세포 내 자성 나노입자의 함량을 변화시켜 자성 나노입자 함유 세포의 유도 및 고정의 수준을 변화시킬 수 있음을 확인하였다. As a result, as shown in 3 A, 2μg / 10 4 cells 10μg / 10 4 cells a higher level at the target position if the EPCs treated with magnetic nanoparticles, the external magnetic field that affects the concentration of as compared to It can be confirmed that it is fixed to the channel wall. In the simulation method according to the present invention, it was confirmed that the level of induction and fixation of the magnetic nanoparticle-containing cells can be changed by changing the content of the magnetic nanoparticles in the cells.
또한, 도 3의 B에 나타나 바와 같이, 전체 세포 중 성공적으로 고정된 세포의 비를 측정하였을 때, 유속이 증가함에 따라 고정되는 세포의 비율이 감소함을 관찰할 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 3B, when the ratio of the cells fixed successfully among all the cells was measured, it was observed that the proportion of the cells fixed as the flow rate increased.
이에 본 발명의 시뮬레이션 방법은 자성 나노입자의 농도, 유속 등의 조건을 조절하는 것으로 특정 부위의 실제 혈관 내에서의 세포 유도 및 고정을 효율적으로 시뮬레이션할 수 있음을 확인할 수 있었다.Therefore, the simulation method of the present invention was confirmed that it is possible to efficiently simulate the cell induction and fixation in the actual blood vessels of a specific site by adjusting the conditions, such as the concentration of the magnetic nanoparticles, the flow rate.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those skilled in the art, such a specific description is only a preferred embodiment, which is not limited by the scope of the present invention Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
도 1은 자성나노입자가 내피전구세포 내에 도입되었음을 나타내는 것으로, A는 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포가 영구자석에 의해 이동, 고정된 것을 나타낸 도 및 사진이고, B는 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포를 투과전자현미경을 이용하여 촬영한 사진이다. 1 shows that magnetic nanoparticles are introduced into endothelial progenitor cells, A is a diagram and a photograph showing that endothelial progenitor cells into which magnetic nanoparticles are introduced are fixed and moved by permanent magnets, and B is magnetic nanoparticles introduced thereto. The endothelial progenitor cells were photographed using a transmission electron microscope.
도 2는 마이크로채널을 이용한 시뮬레이션 장치의 일 실시예를 나타내는 도면이다.2 is a diagram illustrating an embodiment of a simulation apparatus using a microchannel.
도 3은 시뮬레이션 장치를 이용하여 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포의 채널 내 고정 효과를 관찰한 것으로, A는 외부 자기장이 미치는 목표 위치에서 자성 나노입자가 도입된 내피전구세포가 채널 벽면에 고정된 것을 나타내는 사진 및 도면이고, B는 전체 세포 중 성공적으로 고정된 세포의 비를 측정한 그래프이다.FIG. 3 illustrates the effect of fixation in the channel of endothelial progenitor cells into which magnetic nanoparticles are introduced using a simulation device. A is the endothelial progenitor cells into which magnetic nanoparticles are introduced at a target position exerted by an external magnetic field. It is a photograph and a drawing which show that it was done, and B is the graph which measured the ratio of the successfully fixed cell among all the cells.
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Families Citing this family (6)
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20060094416A (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-29 | 한국과학기술원 | Magnetic force-based microfluidic chip using magnetic nanoparticles and microbeads, and bioassay apparatus and method using the same |
| KR20070050483A (en) * | 2004-08-23 | 2007-05-15 | 키스트-유로페 포르슝스게젤샤프트 엠비에치 | Microfluid system for the isolation of biological particles using immunomagnectic separation |
| KR20070063189A (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-19 | 삼성전자주식회사 | Microfluidic device and method for concentration and lysis of cells or viruses |
| KR20070119785A (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | 연세대학교 산학협력단 | Method and apparatus for detecting or sorting apoptotic cells using microfulidic channel and magnetic field |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070050483A (en) * | 2004-08-23 | 2007-05-15 | 키스트-유로페 포르슝스게젤샤프트 엠비에치 | Microfluid system for the isolation of biological particles using immunomagnectic separation |
| KR20060094416A (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-29 | 한국과학기술원 | Magnetic force-based microfluidic chip using magnetic nanoparticles and microbeads, and bioassay apparatus and method using the same |
| KR20070063189A (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-19 | 삼성전자주식회사 | Microfluidic device and method for concentration and lysis of cells or viruses |
| KR20070119785A (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | 연세대학교 산학협력단 | Method and apparatus for detecting or sorting apoptotic cells using microfulidic channel and magnetic field |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014084545A1 (en) * | 2012-11-28 | 2014-06-05 | 서울대학교산학협력단 | Nanoparticle separation using microfluidic chip, and biomaterial analysis method using same |
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