KR100987592B1 - MR Contrast Medium And Method For Preparing The Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 펩타이드와 Gd 전구물질을 포함하는 암진단용 MR 조영제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 (a) 리간드와 RGD 서열을 포함하는 펩타이드를 에스테르화시키는 단계와 (b) 상기의 에스테르화된 화합물에 Gd(가돌리늄) 전구물질을 결합시키는 단계를 포함하는 암진단용 MR 조영제의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a MR imaging contrast agent for cancer diagnosis comprising a peptide comprising a RGD (Arg-Gly-Asp) sequence and a Gd precursor. The present invention also provides a method for preparing a MR diagnostic agent for cancer diagnosis, comprising the steps of: (a) esterifying a peptide comprising a ligand and an RGD sequence; and (b) binding a Gd (gadolinium) precursor to the esterified compound. It is about.
리간드, 펩타이드, 가돌리늄, 암 진단용 조영제, 세포독성 Ligands, Peptides, Gadolinium, Contrast Agents for Cancer Diagnosis, Cytotoxicity
Description
본 발명은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 펩타이드와 Gd 전구물질을 포함하는 암진단용 MR 조영제와 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a MR diagnostic agent for cancer diagnosis comprising a peptide comprising a RGD (Arg-Gly-Asp) sequence and a Gd precursor and a method for producing the same.
조영제는 CT 촬영시 사용되는 요오드계 조영제와 자기공명(MR) 조영제로 크게 분류된다. 독성이 강한 1세대 요오드 조영제 이후 2세대 이온성 조영제가 개발되었으나, 높은 삼투압의 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 3세대 비이온성 조영제가 현재 주류를 이루고 있는데, 삼투압이 낮고, 히드록실기 첨가로 인해 수용성을 가짐으로써 화학적 독성이 낮아졌다. MR 조영제는 조영 증강효과가 나타나는 조직의 신호에 따라 양성/음성 또는 T1/T2 조영제로 분류된다. T1 조영제는 망간, 철, 가돌리늄과 같은 안정화된 중금속을 함유한 킬레이트 구조를 가지며, T2 조영제는 산화철 등 자석성질을 띠는 나노입자를 함유하고 있다. Contrast agents are broadly classified into iodine contrast agents and magnetic resonance (MR) contrast agents used in CT imaging. Second generation ionic contrast agent was developed after the first generation toxic iodine contrast agent, but there was a problem of high osmotic pressure. In order to overcome this problem, the third generation of nonionic contrast agent is currently mainstream. The osmotic pressure is low, and the chemical toxicity is lowered due to the water solubility due to the addition of hydroxyl groups. MR contrast agents are classified as either positive / negative or T1 / T2 contrast agents depending on the signal of the tissue in which the enhancement effect is shown. T1 contrast agent has a chelate structure containing stabilized heavy metals such as manganese, iron and gadolinium, and T2 contrast agent contains nanoparticles having magnetic properties such as iron oxide.
T1 조영제로는 Gd-DTPA-BMA(Gadolinum-Diethylenetriamine pentaacetic acid-bismethylamide, Gd-디에틸렌트리아민트리아세트산-비스메틸아미드), Gd-DOTA(Gadolinium chelate gadoterate meglumine, Gd-테트라아자시클로도데칸 테트 라아세트산), Gd-DO3A(Gadolinium-1,4,7,10-tetraazacyclododecan, Gd-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세트산) 등이 있다. 상기의 조영제 중의 일부는 세포독성이 강하고, 일부는 암세포에서의 신호가 오랫동안 지속되지 못하는 문제점이 있다. T2 조영제는 그림자와 허상이 맺혀 뇌출혈, 석회조직, 금속축적 등을 영상으로 잘 구분하지 못하는 단점 때문에 오진할 가능성이 있다는 문제점이 있다.T1 contrast agents include Gd-DTPA-BMA (Gadolinum-Diethylenetriamine pentaacetic acid-bismethylamide, Gd-diethylenetriaminetriacetic acid-bismethylamide), Gd-DOTA (Gadolinium chelate gadoterate meglumine, Gd-tetraazacyclododecane tetra Acetic acid), Gd-DO3A (Gadolinium-1,4,7,10-tetraazacyclododecan, Gd-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), and the like. Some of the above contrast agents have a strong cytotoxicity, some have a problem that the signal from cancer cells does not last long. T2 contrast agent has the problem that there is a possibility of misdiagnose due to the drawback of the brain hemorrhage, lime tissue, metal accumulation, etc. due to the shadow and virtual image formed.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명은 암진단용 MR 조영제 및 그 제조방법에 있어서, RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 펩타이드를 사용함으로써, 암세포에 대한 선택적 특이성을 높이는 것을 목적으로 한다.The present invention has been made to solve the above problems, the present invention in the cancer diagnostic MR contrast agent and its preparation method, by using a peptide comprising the RGD (Arg-Gly-Asp) sequence, selective for cancer cells The purpose is to increase the specificity.
또한 본 발명에 따른 암진단용 MR 조영제가 기존의 MR 조영제보다 신호의 지속성을 향상시키는 것을 목적으로 한다.In addition, the MR imaging contrast agent for cancer according to the present invention aims to improve the persistence of the signal than conventional MR contrast agents.
또한 본 발명에 따른 암진단용 MR 조영제가 기존의 MR 조영제보다 세포독성을 감소시키는 것을 목적으로 한다.In addition, the MR diagnostic contrast agent for cancer according to the present invention aims to reduce cytotoxicity than conventional MR contrast agent.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 안출된 본 발명에 따른 암진단용 MR 조영제는 리간드와 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 펩타이드와 Gd 전구물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.MR imaging contrast agent according to the present invention devised to achieve the above object is characterized in that it comprises a peptide and a Gd precursor comprising a ligand and RGD (Arg-Gly-Asp) sequence.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 Arg-Gly-Asp-(X)n 으로서 환을 형성할 수 있고, X는 각각 독립적인 아미노산을 나타내며, 적어도 하나의 X는 리신(Lys)이고 n은 1 내지 2 인 것을 특징으로 한다.Preferably, the peptide may form a ring as Arg-Gly-Asp- (X) n, each X represents an independent amino acid, at least one X is lysine (Lys) and n is 1 to 2 It is characterized by.
또한 본 발명에 따른 암진단용 MR 조영제의 제조방법은 (a) 리간드와 RGD 서열을 포함하는 펩타이드를 에스테르화시키는 단계와 (b) 상기의 에스테르화된 화합물에 Gd(가돌리늄) 전구물질을 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the method for preparing MR contrast agent for cancer diagnosis according to the present invention comprises the steps of (a) esterifying a peptide comprising a ligand and an RGD sequence, and (b) binding a Gd (gadolinium) precursor to the esterified compound. It is characterized by including.
바람직하게는, 상기 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DPTA(Diethylenetriamine pentaacetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecan)인 것을 특징으로 한다.Preferably, the ligand is DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DPTA (diethylenetriamine pentaacetic acid), DO3A (1,4,7,10-tetraazacyclododecan) It is characterized by that.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 Arg-Gly-Asp-(X)n 으로서 환을 형성할 수 있고, X는 각각 독립적인 아미노산을 나타내며, 적어도 하나의 X는 리신(Lys)이고 n은 1 내지 2 인 것을 특징으로 한다. Preferably, the peptide may form a ring as Arg-Gly-Asp- (X) n, each X represents an independent amino acid, at least one X is lysine (Lys) and n is 1 to 2 It is characterized by.
바람직하게는, 상기 Gd 전구물질은 GdCl3·6H2O 인 것을 특징으로 한다.Preferably, the Gd precursor is characterized in that GdCl 3 · 6H 2 O.
바람직하게는, 상기 에스테르화된 화합물과 Gd 전구물질의 M농도(mol/L) 비율이 1 : 1 내지 1 : 6인 것을 특징으로 한다.Preferably, the M concentration (mol / L) ratio of the esterified compound and the Gd precursor is characterized in that 1: 1 to 1: 6.
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 암진단용 MR 조영제의 제조방법을 제공함으로써, 암세포에 대한 선택적 특이성을 높이는 효과가 있다.As described above, the present invention provides a method for preparing an MR imaging agent for cancer diagnosis, including an RGD (Arg-Gly-Asp) sequence, thereby increasing the selective specificity of cancer cells.
또한 본 발명은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 암진단용 MR 조영제의 제조방법을 제공함으로써, 기존의 MR 조영제보다 신호의 지속성을 향상시키는 효과가 있다.In another aspect, the present invention provides a method for producing an MR imaging contrast agent for cancer diagnosis comprising the RGD (Arg-Gly-Asp) sequence, thereby improving the signal persistence than conventional MR contrast agents.
또한 본 발명은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 포함하는 암진단용 MR 조영제의 제조방법을 제공함으로써, 기존의 MR 조영제보다 세포독성을 감소시키는 효과가 있다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a cancer diagnostic MR contrast agent containing an RGD (Arg-Gly-Asp) sequence, thereby reducing the cytotoxicity than conventional MR contrast agents.
세포의 표면에는 수용체(receptor)가 존재하는데, 세포 외부로부터 전달되는 신호를 세포 안으로 알리는 구실을 담당한다. 세포는 여러 가지 외부 신호에 노출되어 있으며, 그만큼 수용체의 종류도 다양하다. 이런 수용체 종류 중의 하나인 인테그린 단백질은 세포의 고착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α및 β 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체로서, 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 세포조직의 초기 발달에도 관여하며, 염증이나 혈액 응고, 세포 운동 등에도 인테그린 단백질의 기능이 필요하며 세포에 따라 여러가지 종류가 존재한다. 그 중에서도 vitronection receptor라고 불리는 ανβ3 인테그린은 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암 세포의 신생혈관형성시에 발현되며 RGD(arg-gly-asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드와 결합하는 특징이 있다. 따라서 본 발명은 RGD(arg-gly-asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드에 리간드를 결합시키고 Gd를 착화시켜서 조영제를 제조하는 방법을 제공함으로써, 암 세포에 특이성이 있는 조영제를 제공한다. 이하에서는 간암 세포를 이용하여 실험을 하였으나, 본 발명에 따른 조영제는 간암 세포에만 한정되는 것이 아니고, 다양한 종류의 암 세포에 대해서도 작용될 수 있다.Receptors are present on the surface of the cell, which serves as a pretext for signaling signals from outside the cell into the cell. Cells are exposed to various external signals, and the types of receptors vary. Integrin protein, one of these receptor types, is a protein complex composed of α and β subunits involved in cell adhesion and migration, and mediates interactions between cells. Involved in the early development of cellular tissues, inflammation, blood clotting, cell movement, etc. The function of the integrin protein is required, there are many kinds depending on the cell. Among them, α ν β 3 integrins, called vitronection receptors, are not expressed in normal vascular endothelial cells but are expressed during neovascularization of cancer cells, and bind to peptides having an arg-gly-asp (RGD) sequence. Accordingly, the present invention provides a contrast agent having specificity to cancer cells by providing a method for preparing a contrast agent by binding a ligand to a peptide having an arg-gly-asp (RGD) sequence and complexing Gd. Hereinafter, experiments were performed using liver cancer cells, but the contrast agent according to the present invention is not limited to liver cancer cells, and may also work on various types of cancer cells.
정의Justice
본원에서 사용된 용어 “리간드”는 착화합물에서 중심 금속 원자에 전자쌍을 제공하면서 배위 결합을 형성하는 원자나 원자단을 말한다. 본원에서는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DPTA(Diethylenetriamine pentaacetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecan)를 리간드로 사용하였다.As used herein, the term “ligand” refers to an atom or group of atoms that forms a coordinating bond while providing an electron pair to a central metal atom in the complex. In this application, DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DPTA (Diethylenetriamine pentaacetic acid) and DO3A (1,4,7,10-tetraazacyclododecan) were used as ligands. .
본원에서 사용된 용어 “RGD(Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 펩타이드”는 Arg-Gly-Asp의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 말하는데, Arg-Gly-Asp-(X)n 으로 표시할 수 있다. Arg-Gly-Asp-(X)n는 환을 형성할 수 있고, X는 각각 독립적인 아미노산을 나타내며, 적어도 하나의 X는 리신(Lys)이고 n은 1 내지 2가 될 수 있다. 이하에서 사용한 cRGDYK는 상기의 펩타이드의 일례로서, Arg-Gly-Asp-Try-Lys의 아미노산이 고리를 형성한 형태를 가진 것을 말하며, 여기서, 트립토판(Try)과 리신(Lys)이 X가 된다.As used herein, the term “peptide comprising an Arg-Gly-Asp) sequence refers to a peptide having the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp, which may be represented as Arg-Gly-Asp- (X) n. . Arg-Gly-Asp- (X) n may form a ring, each X represents an independent amino acid, at least one X is lysine (Lys) and n may be 1 to 2. CRGDYK used below is an example of the peptide, and refers to a form in which amino acids of Arg-Gly-Asp-Try-Lys form a ring, wherein tryptophan (Try) and lysine (Lys) become X.
본원에서 사용된 용어 "DOTA-RGD"는 DOTA와 cRGDYK 펩타이드를 반응시켜서 제조된 화합물을 간단히 표현한 것이다. 상기의 DOTA-RGD는 DOTA와 cRGDYK 펩타이드의 리신(Lys)이 에스테르화 반응을 하면서 화합물이 만들어지게 된 것이다.As used herein, the term “DOTA-RGD” is a simplified representation of a compound prepared by reacting DOTA with a cRGDYK peptide. The DOTA-RGD is a compound made while the lysine (Lys) of DOTA and cRGDYK peptide is esterified.
본원에서 사용된 용어 "Gd-DOTA-RGD" 는 상기의 DOTA-RGD에 Gd(가돌리늄) 전구물질을 반응시켜서 제조된 화합물을 말한다.The term "Gd-DOTA-RGD" as used herein refers to a compound prepared by reacting a Gd (gadolinium) precursor with DOTA-RGD.
본원에서 사용된 용어 "Omniscan®" 는 Gd-DTPA-BMA을 포함하는 T1 조영제로서, 본원에서는 지이헬스케어 바이오사이언스 회사에서 제조한 것을 사용하였다. 여기서 Gd-DTPA-BMA는 Gadolinum-Diethylenetriamine pentaacetic acid-bismethylamide(Gd-디에틸렌트리아민트리아세트산-비스메틸아미드)의 약자이다.The term "Omniscan ® ", as used herein, is a T1 contrast agent comprising Gd-DTPA-BMA, used herein by GE Healthcare Biosciences. Gd-DTPA-BMA is an abbreviation of Gadolinum-Diethylenetriamine pentaacetic acid-bismethylamide (Gd-diethylenetriamine triacetic acid-bismethylamide).
본원에서 사용된 용어 "Dotarem®" 는 Gd-DOTA를 포함하는 T1 조영제로서, 본원에서는 게르베코리아(주) 회사에서 제조한 것을 사용하였다.As used herein, the term "Dotarem ® " is a T1 contrast agent including Gd-DOTA, and here, manufactured by Gerve Korea Co., Ltd. was used.
제조예Production Example
(1) (One) DOTADOTA -- RGDRGD
DOTA 96.0 mg(192.0 μmol)를 증류수 4.0 mL에 녹인 후에, 증류수 1 ml에 녹인 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 18.4 mg(96.0 mmol)를 첨가하고 교반한다. 여기에 NaOH 0.1 M을 첨가하면서 상기의 용액의 pH를 5.0 으로 맞춘다. 상기의 용액에 Sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide) 16.8 mg(76.8 μmol)를 넣어서 pH를 5.5 로 맞추고 4 ℃ 에서 30분 동안 교반 시킨다. 30분 후, 증류수 2.4 ml에 녹인 c(RGDYK) 12.0 mg(19.2 μmol)를 상기의 용액에 넣는다. 여기에 NaOH 0.1 M을 첨가하면서 상기의 용액의 pH를 8.5 로 맞춘 후 4 ℃에서 밤새 교반한다. 제조된 RGD-DOTA는 HPLC로 분리하는데, VYDAC C-18 컬럼(10.0 mm × 250 mm)을 이용하여 32분 동안 A용액 (0.1% Trifluoroacetic acid in water) 과 B용액 (0.1% TFA in acetonitrile)을 100 : 0 에서 65 : 35 의 비율로 변화시키면서 분리하였다.After dissolving 96.0 mg (192.0 μmol) of DOTA in 4.0 mL of distilled water, 18.4 mg (96.0 mmol) of EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide) dissolved in 1 ml of distilled water is added and stirred. The pH of the said solution is adjusted to 5.0, adding NaOH 0.1M here. Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) 16.8 mg (76.8 μmol) was added to the solution, the pH was adjusted to 5.5, and stirred at 4 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, 12.0 mg (19.2 μmol) of c (RGDYK) dissolved in 2.4 ml of distilled water was added to the solution. The pH of the solution was adjusted to 8.5 while NaOH 0.1 M was added thereto, followed by stirring overnight at 4 ° C. The prepared RGD-DOTA was separated by HPLC. A solution (0.1% Trifluoroacetic acid in water) and B solution (0.1% TFA in acetonitrile) were dissolved for 32 minutes using a VYDAC C-18 column (10.0 mm × 250 mm). Separation was carried out with a ratio of 100: 0 to 65:35.
상기의 제조예에서 DOTA 대신, DPTA, DO3A를 사용할 수도 있다.In the above preparation, instead of DOTA, DPTA and DO3A may be used.
도 1은 제조된 DOTA-RGD 의 HPLC 이미지이고, 도 2는 제조된 DOTA-RGD 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.1 is an HPLC image of the prepared DOTA-RGD, and FIG. 2 is a MALDI-TOF-MS image of the prepared DOTA-RGD.
(2) (2) GdGd -- DOTADOTA -- RGDRGD
상기에서 제조한 DOTA-RGD 95mg(94.4 μmol)를 증류수 100 mL에 녹인 후, 증류수 100mL에 녹인 GdCl3·6H2O 175.5 mg(472 μmol)를 첨가하여 실온에서 36시간 동안 교반한다. 여기서는 DOTA-RGD와 GdCl3·6H2O의 M농도(mol/L) 비율을 1 : 5로 하여 반응시켰으나, 상기의 M농도(mol/L) 비율은 1 : 1 내지 1 : 6으로 변경할 수 있다. 제조된 Gd-DOTA-RGD는 HPLC로 분리하는데, VYDAC C-18 semi-preparative column (10.0 mm × 250 mm)을 이용한다. 8분 동안에는 0.1% TFA in water와 0.1% TFA in acetonitrile를 92 : 8 의 부피비로 혼합한 용액으로 분리하고, 8분 경과 후 23분까지는 0.1% TFA in water와 0.1% TFA in acetonitrile를 77 ~ 92 : 8 ~ 23의 부피비로 혼합한 용액으로 분리한다. 도 3은 제조된 Gd-DOTA-RGD의 HPLC 이미지이고, 도 4는 제조된 Gd-DOTA-RGD 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.95 mg (94.4 μmol) of DOTA-RGD prepared above was dissolved in 100 mL of distilled water, and then 175.5 mg (472 μmol) of GdCl 3 · 6H 2 O dissolved in 100 mL of distilled water was added thereto, followed by stirring at room temperature for 36 hours. In this case, the reaction was carried out at a ratio of 1: 5 of M concentration (mol / L) of DOTA-RGD and GdCl 3 · 6H 2 O, but the M concentration (mol / L) ratio of 1 to 1 can be changed to 1: 6. have. The prepared Gd-DOTA-RGD was separated by HPLC using a VYDAC C-18 semi-preparative column (10.0 mm × 250 mm). For 8 minutes, 0.1% TFA in water and 0.1% TFA in acetonitrile were separated into a solution in a volume ratio of 92: 8, and after 8 minutes, 0.1% TFA in water and 0.1% TFA in acetonitrile were mixed 77 ~ 92 : Separate into a mixed solution in a volume ratio of 8 to 23. 3 is an HPLC image of the prepared Gd-DOTA-RGD, and FIG. 4 is a MALDI-TOF-MS image of the prepared Gd-DOTA-RGD.
개략적인 화학반응식은 도 5에 나타내었다.A schematic chemical scheme is shown in FIG. 5.
실험예 1 (Gd-DOTA-RGD의 간암 세포에 대한 조영효과) Experimental Example 1 (Contrast effect of Gd-DOTA-RGD on liver cancer cells)
제조예에 따라서 제조한 Gd-DOTA-RGD의 간암 세포에 대한 조영 효과를 보기 위해서, 유전자를 변형하여 간암(hepatocellular carcinoma)을 일으킨 마우스(H-ras 12V transgenic mouse)에서 T1(자기이완시간) 강조영상을 얻었다. MR 영상은 1.5 T 자기공명영상장비(GE Signa Advantage, GE Medical system, USA)에서 T1-강 조 스핌에코 영상법으로 촬영하였다. 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 1.43 mmol/kg 의 Gd-DOTA-RGD를 정맥으로 주입하여 주입 전, 후의 영상을 270분 동안 촬영하였다(도 6). Gd-DOTA-RGD의 주입 전보다 주입 후에 간암(화살표로 표시한 부분)에서 증가된 신호(색깔이 밝아짐)를 관찰할 수 있다.In order to see the contrast effect of Gd-DOTA-RGD on the hepatocellular carcinoma cells prepared according to the preparation example, T 1 (self-relaxation time) in H-ras 12V transgenic mouse, which was genetically modified to cause hepatocellular carcinoma. The highlighted image was obtained. MR images were taken by T1-weighted spim echo imaging on a 1.5 T magnetic resonance imaging apparatus (GE Signa Advantage, GE Medical system, USA). Anesthesia was injected intravenously with 1.43 mmol / kg of Gd-DOTA-RGD through the tail vein of the anesthetized mouse, and images before and after the injection were taken for 270 minutes (FIG. 6). Increased signal (lightening) can be observed in liver cancer (marked with an arrow) after injection than before Gd-DOTA-RGD.
실험예 2 (ανβ3 리셉터에 대한 Gd-DOTA-RGD 의 선택적 특이성) Experimental Example 2 (Selective Specificity of Gd-DOTA-RGD for α ν β 3 Receptor)
간암 세포에서 발현되는 ανβ3 리셉터에 대한 Gd-DOTA-RGD 의 선택적 특이성을 확인하는 실험을 하였다. ανβ3 리셉터를 차단하기 위해 RGD 펩타이드를 주입하였다. 30분 후에 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 1.43 mmol/kg의 Gd-DOTA-RGD를 주입하여 실시예 1과 동일한 방법으로 T1-강조 스핌에코 영상법으로 촬영하였다(도 7). ανβ3 리셉터를 차단한 후에는 간암(화살표로 표시한 부분)에서 증가된 신호(색깔의 변화가 없음)를 관찰할 수 없었다. 즉, Gd-DOTA-RGD가 ανβ3 리셉터에 선택적 특이성이 있음을 확인할 수 있다.Experiments were performed to confirm the selective specificity of Gd-DOTA-RGD to α ν β 3 receptors expressed in liver cancer cells. RGD peptides were injected to block the α v β 3 receptor. After 30 minutes, 1.43 mmol / kg of Gd-DOTA-RGD was injected through the tail vein of the anesthetized mouse and photographed by T1-weighted spim echo imaging in the same manner as in Example 1 (FIG. 7). After blocking the α v β 3 receptor, no increased signal (no color change) was observed in liver cancer (marked with an arrow). That is, it can be seen that Gd-DOTA-RGD has a selective specificity to the α ν β 3 receptor.
비교예 1 (신호의 지속성) Comparative Example 1 (Signal persistence)
제조예에 따라서 제조된 Gd-DOTA-RGD의 간암 세포에 대한 조영 효과를 Omniscan®과 비교하는 실험을 하였다. 1.43 mmol/kg의 Omniscan®을 유전자를 변형하여 간암(hepatocellular carcinoma)을 일으킨 마우스(H-ras 12V transgenic mouse)에 주입하고 실험예 1과 같은 방법으로 주입 후 200분까지 자기공명영상을 얻었다. 도 8는 간암 세포에서의 신호변화를 나타낸 것으로서 Gd-DOTA-RGD와 Omniscan®을 비교한 그래프이다. Gd-DOTA-RGD를 주입한 경우, 70 분까지 신호가 증가하였고, 그 이후로도 270 분까지 신호가 유지되었다. 반면, Omniscan®을 주입한 경우, 70 분까지 신호가 증가하다가, 그 이후로는 신호가 급격히 감소하였다. 이는 Gd-DOTA-RGD가 Omniscan®에 비해 간암 세포에서 더 오래 머물기 때문에 신호가 오래 지속되는 것이다.Experiments comparing the contrast effect of Gd-DOTA-RGD on liver cancer cells prepared according to the preparation example with Omniscan ® were performed. 1.43 mmol / kg of the Omniscan ® modified genes to liver cancer (hepatocellular carcinoma) that caused the mice (H-ras 12V transgenic mouse) injection and after injection in the same way as Experiment 1 to 200 min to obtain the magnetic resonance imaging on. FIG. 8 is a graph comparing Gd-DOTA-RGD and Omniscan ® showing signal changes in liver cancer cells. When Gd-DOTA-RGD was injected, the signal increased up to 70 minutes, and the signal remained thereafter up to 270 minutes. On the other hand, with Omniscan ® , the signal increased up to 70 minutes, after which the signal dropped sharply. This is because the signal lasts longer because Gd-DOTA-RGD stays longer in liver cancer cells than Omniscan ® .
이러한 결과에 의해, 본 발명에 따른 Gd-DOTA-RGD는 암세포에 선택성을 가지면서 암세포를 특이적으로 조영할 수 있음을 확인할 수 있다.As a result, it can be seen that Gd-DOTA-RGD according to the present invention can specifically target cancer cells while having selectivity to cancer cells.
비교예 2 (자기이완율) Comparative Example 2 (Magnetic Relaxation Rate)
제조예에 따라서 제조된 Gd-DOTA-RGD와 Omniscan®과 Dotarem®의 T1, T2(자기이완시간)과 R1, R2(자기이완율)을 측정하였다. T1을 측정하기 위하여 반전 회복(inversion-recovery) 펄스열을 사용하였으며, T2는 CPMG(Carr-Purcell-Meiboon-Gill) 펄스열을 사용하였다. 높은 자기이완율은 자기공명영상에서 매우 중요한 의미를 갖는데, 높은 자기이완율을 갖는 조영제는 상대적으로 적은 양을 투여해도 높은 조영증강 효과를 나타내기 때문이다. 표 1에서 볼 수 있듯이, Gd-DOTA-RGD는 Omniscan®과 Dotarem®에 비해 1.4배 정도의 큰 자기이완율을 가지므로, 좀 더 효과 적으로 신호를 나타낼 수 있는 조영제라고 볼 수 있다.T1, T2 (magnetic relaxation time) and R1, R2 (magnetic relaxation rate) of Gd-DOTA-RGD, Omniscan ® and Dotarem ® prepared according to the preparation examples were measured. In order to measure T1, an inversion-recovery pulse train was used, and T2 was a CPMG (Carr-Purcell-Meiboon-Gill) pulse train. High self-relaxation rate is very important in magnetic resonance imaging, because contrast agent with high self-relaxation rate shows high contrast enhancement effect even when relatively small amount is administered. As can be seen in Table 1, Gd-DOTA-RGD has a 1.4 times greater self-relaxation rate than Omniscan ® and Dotarem ® , which makes it a more effective contrast agent.
비교예 3 (세포독성) Comparative Example 3 (Cytotoxicity)
세포독성도를 조사하기 위하여 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 검색법을 사용하였다. MTT 검색법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 청자색의 비수용성 MTT formazan(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 것이다. 살아있는 세포에 MTT tetrazolium를 처리하게 되면, 미토콘드리아의 리덕타아제(reductase)에 의해 MTT tetrazolium가 환원되어 MTT formazan(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 형성하게 된다. 즉, 어떤 화합물을 농도별로 일정 시간 동안 처리해서 세포의 사멸을 충분히 유도한 뒤에 MTT tetrazolium를 처리하면, 세포독성이 나타나지 않는 낮은 농도에서는 MTT formazan이 형성되고, 세포독성이 나타나는 높은 농도에서는 MTT formazan이 형성되지 않는 것이다. 이러한 화합물을 농도구배 별로 MTT formazan의 형성을 측정하면 세포 생존도를 결정할 수 있다.Tetrazolium-based colorimetric (MTT) screening was used to investigate cytotoxicity. The MTT method is a method of mitochondria that reduces yellow water-soluble MTT tetrazolium to blue-violet water-insoluble MTT formazan (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) by dehydrogenase. Is to use the ability. When MTT tetrazolium is treated in living cells, MTT tetrazolium is reduced by mitochondrial reductase and MTT formazan (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide ). In other words, if MTT tetrazolium is treated after a compound is treated for a certain period of time to induce cell death, MTT formazan is formed at low concentrations without cytotoxicity, and MTT formazan at high concentrations with cytotoxicity. It is not formed. Cell viability can be determined by measuring the formation of MTT formazan by concentration gradient of these compounds.
도 9는 MTT 검사법을 이용하여 Gd-DOTA-RGD와 Omniscan®의 세포독성을 비교한 결과이다. 세포에 아무것도 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, 대조군의 MTT formazan의 형성을 측정하여 세포 생존도 100%로 정하였다. 세포에 다양한 농도의 Gd-DOTA-RGD(0.2 - 0.5μM)를 첨가한 경우, 100% 이상의 세포 생존도를 보여주었고, Omniscan®보다 더 높은 세포 생존도를 나타냈다. 이를 통해서, Gd-DOTA-RGD는 세포독성이 아주 낮아서 조영제로서 사용하기에 유용한 것임을 확인할 수 있다.9 is a result of a comparison of the cytotoxicity of Gd-DOTA-RGD and Omniscan ® using the MTT assay. Nothing was added to the cells as a control, and the formation of MTT formazan in the control was measured to determine cell viability at 100%. When cells were added with various concentrations of Gd-DOTA-RGD (0.2-0.5 μM), they showed cell viability of 100% or higher and showed higher cell viability than Omniscan ® . Through this, it can be seen that Gd-DOTA-RGD is very low cytotoxicity and useful for use as a contrast agent.
본 발명에서 제시하는 방법에 따라 제조된 Gd-DOTA-RGD는 다양한 분야에서 유용하게 적용될 수 있으며, 본 발명은 이들 구체적인 예에 한정되는 것은 아니다.Gd-DOTA-RGD prepared according to the method of the present invention can be usefully applied in various fields, the present invention is not limited to these specific examples.
도 1은 DOTA-RGD 의 HPLC 이미지이다.1 is an HPLC image of DOTA-RGD.
도 2는 DOTA-RGD 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.2 is a MALDI-TOF-MS image of DOTA-RGD.
도 3은 Gd-DOTA-RGD 의 HPLC 이미지이다.3 is an HPLC image of Gd-DOTA-RGD.
도 4는 Gd-DOTA-RGD 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.4 is a MALDI-TOF-MS image of Gd-DOTA-RGD.
도 5는 Gd-DOTA-RGD의 제조를 위한 개략적인 화학반응식을 나타낸 것이다.5 shows a schematic chemical equation for the preparation of Gd-DOTA-RGD.
도 6은 Gd-DOTA-RGD의 주입하기 전과 주입한 후를 비교한 자기공명영상이다.6 is a magnetic resonance image comparing before and after injection of Gd-DOTA-RGD.
도 7은 ανβ3 리셉터를 차단 한 경우로서, Gd-DOTA-RGD의 주입하기 전과 주입한 후를 비교한 자기공명영상이다.7 is a case where the α ν β 3 receptor is blocked, and is a magnetic resonance image comparing before and after injection of Gd-DOTA-RGD.
도 8은 Gd-DOTA-RGD 와 Omniscan®로 처리한 간암 세포에서의 신호변화를 비교한 그래프이다.8 is a graph comparing signal changes in liver cancer cells treated with Gd-DOTA-RGD and Omniscan ® .
도 9는 MTT 검사법을 이용하여 Gd-DOTA-RGD 와 Omniscan®의 세포독성을 비교한 그래프이다.Figure 9 is a graph comparing cytotoxicity of Gd-DOTA-RGD and Omniscan ® using the MTT assay.
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