KR101456233B1 - Aminocyclopentane carboxylic acid-containing cyclo RGD derivatives, a process for the preparation thereof and a MRI contrast agent comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암세포에 대해 선택성이 있는 것으로 알려진 시클로 RGDK 펩티드(cyclo Arg-Gly-Asp-Lys)의 라이신과 아스파르트산 사이에 아미노시클로펜탄 카르복실산(ACP)을 펩티드 결합에 의해 삽입시켜 얻어진 시클로 ACP-RGDK, 시클로 ACP-RGDK를 리간드를 경유하여 Gd와 배위 결합시킨 신규 MRI 조영제 화합물, 그 신규 화합물의 제조 중간제, 이들의 제조방법, 및 그 신규 화합물을 포함하는 MRI 조영제를 제공한다. The present invention relates to a method for producing a cyclic ACP (cyclopentanone) obtained by inserting aminocyclopentanecarboxylic acid (ACP) by peptide bonding between a lysine of a cyclo RGDK peptide (cyclo Arg-Gly-Asp-Lys) and an aspartic acid, -RGDK, a cyclic ACP-RGDK via a ligand to Gd, an intermediate for the preparation of the novel compound, a process for their preparation, and an MRI contrast agent comprising the novel compound.
Description
본 발명은 신규한 암 진단용 MRI(Magnetic Resonance Imaging) 조영제로서 사용될 수 있는 신규 화합물 및 그 제조방법, 그것을 포함하는 MRI조영제에 관한 것이다.The present invention relates to a novel compound which can be used as a novel MRI (Magnetic Resonance Imaging) contrast agent for cancer diagnosis, a preparation method thereof, and an MRI contrast agent containing the same.
자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자장을 발생하는 커다란 자석통 속에 인체를 들어가게 한 후 고주파를 발생시켜 신체부위에 있는 양성자를 공명시켜 각 조직에서 나오는 신호의 차이를 측정하여 컴퓨터를 통해 재구성하여, 영상화하는 기술이다. 이러한 자기공명영상(MR 영상)은 타 영상법에 비해 해상도 및 대조도가 높고 심부장기영상과 3차원 정보 제공이 실시간으로 가능한 장점을 가지고 있다. 상기 MR 영상은 고유한 조직 신호 차이를 다양한 기법으로 생체 영상화 할 수 있지만 조영제를 사용하면 조직 내 물 분자의 자기이완시간을 변화시켜 조직의 대조도를 더욱 증가시킬 수 있다. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is a magnetic resonance imaging (MRI) technique that allows a human body to enter a large magnetic barrel producing a magnetic field and then generates high frequencies to resonate the protons in the body region to measure the difference in signal from each tissue. And is a technique of imaging. These MR images (MR images) have higher resolution and contrast compared to other imaging methods, and have the advantage of providing long-term images and 3D information in real time. Although the MR image can bioimage the unique tissue signal difference using various techniques, contrast agent can be used to change the magnetic relaxation time of the water molecule in the tissue to further increase the contrast of the tissue.
조직 내 물 분자의 자기이완시간을 변화시킬 수 있는 상자성 물질로는 가돌리늄(Gd3+), 망간(Mn2+) 등이 있다. 그러나, 가돌리늄 및 망간 원소 그 자체는 인체 내에서 유독한 물질이므로 독성을 상쇄시키기 위한 목적으로 DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), 또는DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid)와 같은 리간드로 사용하여 착화(chelation) 시켜서 Gd-DTPA, Gd-DOTA, 또는 Gd-DO3A 착물로서 사용될 수 있다. 가돌리늄 원소의 독성은 이 원소가 생체 내에서 생체분자들과 반응할 수 있는 많은 결합 위치를 가지고 있음에 기인하기 때문에, 가돌리늄을 리간드에 착화시켜 가돌리늄이 생체 분자와 반응할 수 있는 결합위치들을 봉쇄하여 독성을 줄이는 것이다. 이렇게 착화된 금속 착화물(metal chelate)은 인체 내에서 화학적 안정성을 유지해야 한다. 여기서 화학적 안정성이란 금속 착화물이 얼마나 오랫동안 분리되지 않고 그 상태를 유지하느냐 여부이다. 만약 상기 Gd-DTPA 등이 인체 밖으로 배설되기 전 가돌리늄과 리간드로 분리된다면 이는 치명적인 결과를 유발하게 될 것이다. 이러한 화학적 안정성 여부는 흔히 열역학적 개념인 안정 상수(stability constant)로 표현된다. 또한, 높은 자기이완율을 갖는 조영제는 상대적으로 적은 양을 투여해도 높은 조영증강효과를 나타내기 때문에, MR 영상에서의 높은 자기이완율은 MRI 조영제의 고효율성을 증명해주는 인자이다. 즉, MRI 조영제는 자기이완율이 높고 열역학적으로 안정한 것이 바람직하다. Examples of paramagnetic materials that can change the magnetic relaxation time of water molecules in the tissue include gadolinium (Gd 3+ ) and manganese (Mn 2+ ). However, since gadolinium and manganese elements themselves are toxic substances in the human body, DTPA (diethylene triamine penta aeetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7, DTPA, Gd-DOTA, or Gd-DOTA by using a ligand such as 10-tetraacetic acid or DO3A (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid) DO3A complex. Since the toxicity of the gadolinium element is attributed to the fact that this element has many bonding sites in the living body to react with biomolecules, it is necessary to complex the gadolinium to the ligand to block the bonding sites at which gadolinium can react with the biomolecule To reduce toxicity. Such complexed metal chelates should maintain chemical stability in the human body. Chemical stability refers to how long a metal complex is not separated and maintained. If Gd-DTPA or the like is separated into gadolinium and ligand before being excreted in the body, this would have a fatal result. Such chemical stability is often expressed as a stability constant, which is a thermodynamic concept. In addition, the high magnetic relaxation rate in MR imaging is a factor that demonstrates the high efficiency of MRI contrast agent because contrast agents with high magnetic relaxation rate exhibit high contrast enhancement effects even with relatively low doses. That is, the MRI contrast agent is preferably thermodynamically stable with a high magnetic relaxation rate.
한편, 상기 Gd에 대한 리간드로서 작용하는 DTPA, DOTA, 또는 DO3A는 암세포에 대한 특이성이 없어 Gd와 상기 리간드가 결합된 조영제는 암세포에 대한 선택성이 결여되어, 암세포에서의 신호가 오랫동안 지속되지 못하여 암 진단에 효과적인 조영제로서 효과적이지 못한 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 상기 리간드에 암세포에 대해 선택적인 RGD(Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 펩티드를 결합시킨 구조의 MRI 조영제가 개발되었다(특허문헌 1).On the other hand, DTPA, DOTA, or DO3A acting as a ligand for Gd has no specificity to cancer cells, and contrast agents in which Gd and the ligand are bound to each other lack selectivity for cancer cells, It is not effective as an effective contrast agent for diagnosis. In order to overcome this disadvantage, an MRI contrast agent having a structure in which a peptide including an RGD (Arg-Gly-Asp) sequence selective for cancer cells is bound to the ligand has been developed (Patent Document 1).
세포의 표면에는 수용체(receptor)가 존재하는데, 세포 외부로부터 전달되는 신호를 세포 안으로 알리는 역할을 담당한다. 세포는 여러 가지 외부 신호에 노출되어 있으며, 그만큼 수용체의 종류도 다양하다. 이런 수용체 종류 중의 하나인 인테그린 단백질은 세포의 고착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α 및 β 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체로서, 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 세포조직의 초기 발달에도 관여하며, 염증이나 혈액 응고, 세포 운동 등에도 인테그린 단백질의 기능이 필요하며 세포에 따라 여러가지 종류가 존재한다. 그중에서도 비트로넥틴 수용체(vitronection receptor)라고 불리는 ανβ3 인테그린은 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암세포의 신생혈관 형성 시에 발현되며 RGD(arg-gly-asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드와 결합하는 특징이 있다 (특허문헌 2). RGD 펩타이드는 종양혈관에 선택적으로 결합을 함으로써 종양 치료에 적용하는 연구가 발표된 바 있다(비특허문헌 1). There is a receptor on the surface of the cell, which is responsible for signaling the signal from outside the cell into the cell. Cells are exposed to a variety of external signals, and the types of receptors vary. Integrin protein, one of these receptor types, is a protein complex composed of α and β subunits involved in cell adhesion or migration, mediating interactions between cells. It is also involved in the early development of cell tissue. In addition, inflammation, blood clotting, cell movement, etc. require the function of integrin protein. Among them, α ν β 3 integrins, which are called vitronection receptors, are not expressed in normal vascular endothelial cells but are expressed at the time of neovascularization of cancer cells and are characterized by binding with peptides having an RGD (arg-gly-asp) sequence (Patent Document 2). RGD peptides have been reported to be applied to tumor therapy by selectively binding to tumor blood vessels (Non-Patent Document 1).
또한, 상기 RGD 펩타이드의 종양에 대한 친화력을 증가시키기 위한 노력으로, cyclic RGD, RGDyK, RGDfK, RGDfV 등으로 아미노산 서열을 다양하게 변화시키거나, 두 개의 RGD 혹은 다수의 RGD를 결합시킨 형태 등의 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 2). Also, in an effort to increase the affinity of the RGD peptide for a tumor, studies on various forms of amino acid sequences such as cyclic RGD, RGDyK, RGDfK, RGDfV, and two RGD or multiple RGD- (Non-Patent Document 2).
본 발명의 목적은 종양에 대한 결합 친화도가 높은 RGD 펩티드 유도체를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide an RGD peptide derivative having high binding affinity for tumors.
본 발명의 다른 목적은 종양에 대한 결합 친화도가 높은 RGD 펩티드 유도체가 결합된 MRI 조영제 화합물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an MRI contrast agent compound to which an RGD peptide derivative having high binding affinity for a tumor is bound.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 MRI 조영제 화합물 제조용 중간체를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide an intermediate for the preparation of the MRI contrast agent compound.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물들의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a process for preparing the above compounds.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 MRI 조영제 화합물을 포함하는 MRI 조영제를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide an MRI contrast agent comprising the MRI contrast agent compound.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a compound of formula 1:
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명의 다른 일 측면은 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다: Another aspect of the present invention provides a compound of formula 2:
[화학식 2](2)
상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 또는 DFOM 이고, Wherein the ligand is DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA,
상기 화학식 1의 화합물에 해당하는 환상의 아미노시클로펜탄 카르복실산-Arg-Gly-Asp-Lys(시클로 ACP-RGDK)의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다. The structure of the cyclic aminocyclopentanecarboxylic acid -Arg-Gly-Asp-Lys (cyclic ACP-RGDK) corresponding to the compound of Formula 1 is amidated with the ligand via lysine.
본 발명의 또 다른 일 측면은 하기 화학식 3의 화합물을 제공한다:Another aspect of the present invention provides a compound of formula 3:
[화학식 3](3)
상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 또는 DFOM 이고, Wherein the ligand is DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA,
상기 Gd는 가돌리늄이며, 상기 리간드에 배위결합되어 있고,Wherein Gd is gadolinium and is coordinately bound to the ligand,
상기 RGDK(Arg-Gly-Asp-Lys) 시퀀스에 아미노시클로펜탄(aminocyclopentane carboxylic acid)을 포함하는 시클릭 펩타이드(시클로 ACP-RGDK)는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.A cyclic peptide (cyclic ACP-RGDK) comprising an aminocyclopentane carboxylic acid in the RGDK sequence is amidated with the ligand via lysine.
본 발명의 또 다른 일 측면은 라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합시키는 것을 포함하는, 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. Another aspect of the present invention relates to a method for producing a compound of formula (I), which comprises subjecting lysine and (1S, 3R) -3-aminocyclopentane-1-carboxylic acid to a peptide coupling reaction by Fmoc solid phase synthesis method and then reacting with Fmoc solid phase A method for producing the compound of formula (1), which comprises peptide bonding by a synthetic method.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 및 DFOM에서 선택된 리간드와 펩티드 결합 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. Yet another aspect of the present invention provides a method for preparing a compound of
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 2의 화합물을 Gd 용액과 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a method for preparing the compound of Formula 3, which comprises reacting the compound of
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 3의 화합물을 포함하는 MRI 조영제를 제공한다. Another aspect of the present invention provides an MRI contrast agent comprising the compound of formula (3).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. In addition, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications referred to in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.
본 발명자들은 종래의 시클로 RGDK 펩티드(cyclo Arg-Gly-Asp-Lys)의 라이신과 아스파르트산 사이에 아미노시클로펜탄 카르복실산(ACP)을 펩티드 결합에 의해 삽입시켜, 시클로 ACP-RGDK를 형성시킬 경우 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체(ανβ3 인테그린)와의 결합력이 현저히 증가하여 암조직에 대한 결합 친화도가 증가한다는 것을 밝혀냈다(실험예 1). 또한, 상기 시클로 ACP-RGDK를 리간드를 경유하여 Gd와 결합시킨 물질은 혈중에서 약 3일 동안 안정하며(실험예 2), 실제 그 물질을 이용하여 종양을 가진 마우스의 MRI 영상을 촬영한 결과 종양 부위에서의 증가된 신호를 관찰할 수 있었다(실험예 4). 또한, cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 다음 MRI 영상을 촬영한 결과, 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타났다(실험예 5). 따라서, 시클로 ACP-RGDK를 결합시킨 Gd 의 경우 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체에 대한 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있었다. The present inventors have found that when cyclocapentanecarboxylic acid (ACP) is inserted between a lysine and an aspartic acid of a conventional cyclo RGDK peptide (cyclo Arg-Gly-Asp-Lys) by peptide bonding to form a cyclic ACP-RGDK (Α ν β 3 integrin) expressed in cancer cells significantly increases the binding affinity to cancer tissues (Experimental Example 1). In addition, the material in which the cyclic ACP-RGDK was bound to Gd via a ligand was stable for about 3 days in the blood (Experimental Example 2), and MRI images of mice having tumors using the substance were actually taken, And increased signal at the site was observed (Experimental Example 4). In addition, cryoginectin receptor was blocked by cRGDyK (cyclo-Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys), and the following MRI images were taken. As a result, (Experimental Example 5). Therefore, the Gd binding to the cyclic ACP-RGDK , It was found that there was a specific selectivity for the bitronectin receptor expressed in cancer cells.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:Thus, in one aspect, the present invention provides a compound of formula 1:
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 명세서에서 상기 화학식 1의 화합물은 시클로 ACP-RGDK 라고 약칭되며, 화학식 1의 시클로 ACP-RGDK는 종래의 시클로 RGDK 종양 선택성 펩티드에 시클로펜탄이 삽입된 구조로서, 종래의 시클로 RGDK 유도체에 비해 종양에 대한 선택성이 현저히 높다.In the present specification, the compound of
상기 화학식 1의 화합물을 Gd와 보다 효율적이고 안정적으로 결합시키기 위해 리간드를 화학식 1에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다: The ligand can be linked to the formula (1) to more efficiently and stably bind the compound of formula (1) with Gd. Accordingly, in another aspect, the invention provides compounds of formula 2:
[화학식 2](2)
상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 또는 DFOM 이고, Wherein the ligand is DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA,
상기 화학식 1의 화합물에 해당하는 시클로 ACP-RGDK의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다. The structure of the cyclic ACP-RGDK corresponding to the compound of formula (1) is amidated with the ligand via lysine.
상기 화학식 2의 화합물은 일 구현예에 따르면, 하기 화학식 2a의 구조를 가질 수 있다:According to one embodiment, the compound of
[화학식 2a](2a)
상기 화학식 2의 화합물의 리간드에 Gd를 배위결합시켜 착물을 형성함으로써, 하기 화학식 3의 화합물을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 하기 화학식 3의 화합물을 제공한다:A compound represented by the following general formula (3) can be prepared by coordinating Gd with a ligand of the compound of the general formula (2) to form a complex. Accordingly, in another aspect the present invention provides a compound of formula 3:
[화학식 3](3)
상기 리간드는 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,Wherein the ligand is as defined in
상기 Gd는 상기 리간드에 배위결합되어 있고,Wherein Gd is coordinately bound to the ligand,
상기 시클로 ACP-RGDK의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.The structure of the cyclic ACP-RGDK is amidated with the ligand via lysine.
본 명세서에서 용어 "착물"은 1 개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자(chelator:킬레이터) 또는 원자단을 리간드(ligand: 배위자)라고 부른다.As used herein, the term "complex" refers to a group of atoms consisting of several different atoms, ions, molecules or atoms centered on one or more atoms or ions in a directionally coordinated manner . Here, atomic ion molecules (chelator) or atomic group coordinated to a central atom or ion are called a ligand.
본 명세서에서 용어 DTPA는 Diethylene triamine penta aeetic acid, DOTA는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DO3A는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, NOTA는 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NODAGA는1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid, TETA는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid, TE3A는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid, TE2A는 1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid, PCTA는 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid의 약어로서 금속 친화성의 리간드 화합물이다. 상기 리간드는 금속 친화성의 리간드로서 작용하여 체내에서 Gd가 유리되지 않도록 할 수 있고, 방사성 물질을 체외로 제거하는 작용이 있어 방사성 물질에 의한 세포독성을 줄일 수 있으므로 방사선 장해에 대한 화학적 방호제로서 작용할 수 있다(Marouan Rami et al., Carbonic anhydrase inhibitors: Gd(III) complexes of DOTA- and TETA-sulfonamide conjugates targeting the tumor associated carbonic anhydrase isozymes IX and XII , New J. Chem., 2010, 34, 2139-2144; Silvio Aime et al., NMR relaxometric studies of Gd(III) complexes with heptadentate macrocyclic ligands, Magnetic Resonance in Chemistry (1998) Volume: 36, Issue: S1, Pages: S200-S208). DTPA is 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DO3A is 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1, DTPA is 1,4,7,10- 4,7-triacetic acid, NOTA is 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NODAGA is 1,4,7-triazacyclononane, 1-glutaric acid-4,7-acetic acid,
본 명세서에서 용어 "시클로 ACP-RGDK"는 Arg-Gly-Asp-Lys의 아미노산 서열이 아미노시클로펜탄 카르복실산과 아스파르트산 및 라이신을 경유한 펩티드 결합에 의해 형성된 환상 구조의 화합물을 의미하며, 상기 화학식 1의 화합물을 의미한다. 상기 화학식 3에서 시클로 ACP-RGDK는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합된다. 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암 세포의 신생혈관형성 시에 발현되는 ανβ3 인테그린은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 갖는 시클로펩티드와 결합하는 특징이 있다. 상기 시클로 ACP-RGDK는 RGD 시클로펩티드에 비해 암세포에 대한 결합친화도가 현저히 높아, 암조직에 대한 타겟팅 효과가 현저히 증가된 MRI 조영제를 형성시킬 수 있다. As used herein, the term "cyclo-ACP-RGDK" means a compound of cyclic structure in which the amino acid sequence of Arg-Gly-Asp-Lys is formed by peptide bonding via aminocyclopentanecarboxylic acid, aspartic acid and lysine, 1 < / RTI > In the above formula (3), the cyclic ACP-RGDK is amide bonded to the ligand via lysine. Α ν β 3 integrin, which is not expressed in normal vascular endothelial cells and expressed during neovascularization of cancer cells, is characterized by binding to a cyclopeptide having an RGD (Arg-Gly-Asp) sequence. The cyclic ACP-RGDK has a significantly higher binding affinity for cancer cells than the RGD cyclopeptide, and thus can form an MRI contrast agent with a significantly increased targeting effect on cancer tissues.
본 명세서에서 "리간드→ Gd"는 상기 리간드에 가돌리늄이 배위결합하여 형성된 착물을 의미한다.In the present specification, "ligand → Gd" means a complex formed by coordinating gadolinium on the ligand.
상기 화학식 3의 화합물은 일 구현예에 따르면 하기 화학식 3a의 화합물일 수 있다:The compound of
[화학식 3a][Chemical Formula 3]
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합시키는 것을 포함하는 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a lysine compound, which comprises subjecting lysine and (1S, 3R) -3-aminocyclopentane-1-carboxylic acid to a peptide coupling reaction by the Fmoc solid phase synthesis method and then subjecting the resulting compound to aseptic acid, glycine and arginine The present invention provides a method for producing a compound represented by the above formula (1), which comprises peptide bonding by Fmoc solid phase synthesis.
Fmoc 고체상 합성법에 의한 펩티드의 제조는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 당업자가 적절한 반응조건을 선택하여 상기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다.The preparation of peptides by the Fmoc solid phase synthesis method is well known in the art, and one skilled in the art can select the appropriate reaction conditions to prepare the compound of
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물을 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 및 DFOM에서 선택된 리간드와 펩티드 결합 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for preparing a compound of formula (I), which comprises reacting a compound of formula (I) with a ligand selected from DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, To provide a compound of formula (2).
상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계에서 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 소량의 DMSO를 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응 시 촉매를 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 촉매는 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 또는 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole) DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DIC(diisopropylcarbodiimide), HBTu(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 리간드 및 화학식 1의 화합물의 혼합물을 용매에 가하고 촉매를 가한 다음, 약 하루동안 반응시킨 다음 추출함으로써 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다. 상기 반응은 실온(room temp)에서 이루어질 수 있으며, 밤새 반응시킴으로써 반응이 완료될 수 있다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 상기 화학식 2의 화합물을 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다. 상기 리간드는 일 구현예에 따르면, DOTA가 사용될 수 있다. In the step of preparing the compound of
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물을 Gd용액과 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for preparing the compound of
상기 방법의 일 구현예는 상기 화학식 2의 화합물의 용액과 GdCl3.6H2O 를 혼합하여 약 40 ~ 60℃ 조건에서 반응시킴으로써, 화학식 3의 화합물을 생성시킬 수 있다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다. In one embodiment of the method, the compound of
상기 본 발명에 따른 화학식 3의 제조방법의 일 구현예를 하기 반응식 1에 나타내었다. An embodiment of the process for preparing the compound of formula (3) according to the present invention is shown in the following reaction formula (1).
[반응식 1][Reaction Scheme 1]
상기 화학식 3의 화합물은 실험 결과 MRI 조영제로서 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. The compound of
따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물을 포함하는 MRI 조영제를 제공한다. Accordingly, the present invention provides, in yet another aspect, an MRI contrast agent comprising the compound of
하기 실험예에 따르면, 상기 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물에 대해 사람의 혈청 내 안정성을 측정한 결과, 3일 이상 화합물이 분해되지 않고 안정한 것으로 나타났다(실험예 2). 또한, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여하고 MRI 영상을 획득하였다. 그 결과, 종양 부위에서 증가된 신호가 관찰되었다(실험예 4). 따라서, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물은 암에 특이적으로 선택적인 MRI 조영제로서 사용될 수 있다. 또한, 종양을 가진 마우스에게 cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 다음 MRI 영상을 촬영한 결과 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타났다(실험예 5). 따라서, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물은 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체에 대한 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있었다. According to the following experimental example, the stability of the compound of formula (3) or (3a) in human serum was measured and it was found that the compound was stable without decomposition for 3 days or more (Experimental Example 2). In addition, the compound of
상기 MRI 조영제는 상기 활성성분인 화학식 1의 화합물을 기준으로 성인에게 0.001 ~ 0.1 mmol Gd/kg 투여할 수 있다. The MRI contrast agent may be administered to an adult in an amount of 0.001 to 0.1 mmol Gd / kg based on the compound of
상기 본 발명에 따른 MRI 조영제는 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 MRI 조영제는 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]). The MRI contrast agent according to the present invention can be formulated as an injectable agent. When formulated into an injection, the non-toxic buffer solution that appears as blood can be included as a diluent, for example, a phosphate buffer solution having a pH of 7.4. The MRI contrast agent may include other diluents or additives in addition to the buffer solution. Excipients and additives that may be added to such injections are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in the following references: Dr. HP Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete "[Encyclopedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 3 또는 3a의 화합물은 비트로넥틴에 대해 결합 친화도가 높은 시클로 RGD 펩티드 유도체를 함유하므로 종래의 MRI 조영제에 비해 암세포에 대해 보다 특이적이면서 안전한 MRI 조영제로서 사용될 수 있다. 따라서, 보다 효과적이고 안전한 암 진단용 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the compound of formula (3) or (3a) according to the present invention contains a cyclo-RGD peptide derivative having high affinity for binding to vitronectin, so that it can be used as a more specific and safe MRI contrast agent for cancer cells . Therefore, it can be usefully used as a more effective and safe cancer diagnostic contrast agent.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK의 HPLC 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA 의 HPLC 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 HPLC 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 7은 U87MG 세포에 대한 시클로 ACP-RGDK-DOTA 의 결합능력을 cRGDyK 와 비교하여 나타낸 그래프 이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 사람 혈청 내에서의 안정성을 시간의 경과에 따라 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd를 종양을 가진 마우스에게 0.1 mmol/kg 주입하기 전 및 후에 촬영한 MRI 영상이다.
도 10은 종양에 있는 수용체를 차단하지 않고 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd를 주입하여 촬영한 MRI 영상(위) 및 cRGDyK 펩타이드를 주입하여 종양에 있는 수용체를 차단한 후 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd를 주입하여 촬영한 MRI 영상(아래)를 비교한 이미지이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is an HPLC image of a cyclic ACP-RGDK prepared in accordance with one embodiment of the present invention.
Figure 2 is a MALDI-TOF-MS image of a cyclic ACP-RGDK prepared according to one embodiment of the present invention.
Figure 3 is an HPLC image of cyclo ACP-RGDK-DOTA prepared according to one embodiment of the present invention.
4 is a MALDI-TOF-MS image of cyclo ACP-RGDK-DOTA prepared according to one embodiment of the present invention.
Figure 5 is an HPLC image of cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared according to one embodiment of the present invention.
Figure 6 is a MALDI-TOF-MS image of cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared according to one embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the binding ability of cyclo ACP-RGDK-DOTA to U87MG cells compared with cRGDyK.
FIG. 8 is a graph showing the stability of cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared in accordance with an embodiment of the present invention in human serum over time.
FIG. 9 is an MRI image taken before and after injection of 0.1 mmol / kg of cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared according to one embodiment of the present invention into a tumor-bearing mouse.
FIG. 10 shows the results obtained by injecting cyclo-ACP-RGDK-DOTA-Gd and MRI images (top) and cRGDyK peptide without blocking the receptors in the tumor to block the receptors in the tumor, The images of the MRI images (below) taken by injecting Gd are compared.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, these examples and experimental examples are provided to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto in any sense.
약어에 대한 정의Abbreviation definitions
DCM : DichloromethaneDCM: Dichloromethane
DMF : N,N-dimethylformamideDMF: N, N-dimethylformamide
ACN : AcetonitrileACN: Acetonitrile
DIEA : DiisopropylethylamineDIEA: Diisopropylethylamine
DOTA :1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acidDOTA: 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid
DIC : diisopropylcarbodiimideDIC: diisopropylcarbodiimide
HOBt : N-hydroxybenzotriazole HOBt: N-hydroxybenzotriazole
HBTu : 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphateHBTu: 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HPLC : High-performance liquid chromatographHPLC: High-performance liquid chromatograph
TFA : Trifluoroacetic acidTFA: Trifluoroacetic acid
시클로 ACP-RGDK : 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK
Cyclo ACP-RGDK: Aminocyclopentanecarboxylic acid-containing cRGDK
실시예 1 : 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK(시클로 ACP-RGDK)의 제조(화학식 1)Example 1: Preparation of aminocyclopentanecarboxylic acid-containing cRGDK (cyclo-ACP-RGDK) (Formula 1)
Fmoc-Lys(Boc)-O-trityl resin을 적절한 반응기에 채운 후 DCM, DMF로 2 회 세척하였다. 20 % 피페리딘/DMF 용매를 이용하여 Fmoc 을 제거한 후 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산 25 mmol, 티로신 25 mmol, HOBT/DIC 2 M을 DMF 용매 조건에서 약 6 시간동안 교반하여 커플링을 진행하였다. 이 과정을 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 반복하였다. 최종 아미노산의 커플링 후, 트리플루오로아세트산 용액을 이용하여 레진 분할(resin cleavage)를 진행하였다. 분할 용액을 필터하여 얻은 후 에테르를 첨가하여 재결정시켰다. 얻어낸 결정을 건조한 후 고리화를 진행하였다. 제조된 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK(시클로 ACP-RGDK)는 HPLC로 분석하였는데, SHIMADZU C-18 분석 칼럼(10.0 mm ㅧ 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA 수용액(A 용액) 과 0.1% TFA의 ACN 용액(B 용액)을 5% B 에서 65% B 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 11.7 분에서 피크를 확인할 수 있었다. Fmoc-Lys (Boc) -O-trityl resin was filled into a suitable reactor and washed twice with DCM and DMF. After removing Fmoc using a 20% piperidine / DMF solvent, 25 mmol of (1S, 3R) -3-aminocyclopentane-1-carboxylic acid, 25 mmol of tyrosine and HOBT / DIC 2 M were dissolved in DMF And the mixture was agitated for 6 hours. This process was repeated in the order of aspartic acid, glycine, and arginine. After coupling of the final amino acid, resin cleavage was performed using trifluoroacetic acid solution. The separated solution was filtered to obtain an ether, which was recrystallized. The resulting crystals were dried and then cyclized. The prepared aminocyclopentanecarboxylic acid-containing cRGDK (cyclic ACP-RGDK) was analyzed by HPLC. Using a 0.1% TFA aqueous solution (A solution) and 0.1% TFA Of ACN solution (B solution) was flowed from 5% B to 65% B composition at a rate of 1 ml / min for 30 minutes, and a peak could be confirmed at RT 11.7 minutes.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK의 HPLC 이미지이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
FIG. 1 is an HPLC image of a cyclic ACP-RGDK prepared according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a MALDI-TOF-MS image of a cyclo ACP-RGDK prepared according to an embodiment of the present invention.
실시예 2 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 제조 (화학식 2)Example 2: Preparation of cyclo ACP-RGDK-DOTA (Formula 2)
실시예 1에서 제조한 시클로 ACP-RGDK 5 mM과 DOTA 10 mM을 반응기에 넣고 DMSO 250 mL로 용해시켰다. 반응기에 HOBt 20 mM, DIC 20 mM 을 넣고 하루동안 교반 시켰다. 반응 완료 후 일부(1 ml 소량)용액을 에테르를 이용하여 추출하였다. 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA는 HPLC로 분석하는데, SHIMADZU C-18 분석컬럼(10.0 mm ㅧ 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA 수용액(A 용액) 과 0.1% TFA의 ACN 용액(B 용액)을 5% B 에서 65% B 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 10.3 분에서 피크를 확인할 수 있었다. 5 mM of the cyclic ACP-RGDK prepared in Example 1 and 10 mM of DOTA were added to the reactor and dissolved in 250 mL of DMSO. 20 mM HOBt and 20 mM DIC were added to the reactor and stirred for one day. After completion of the reaction, some (1 ml) solution was extracted with ether. The prepared ACP-RGDK-DOTA was analyzed by HPLC. An ACN solution (solution B) of 0.1% TFA (solution A) and 0.1% TFA was added to the column using SHIMADZU C-18 analytical column (10.0 mm ㅧ 250 mm) Peaks were observed at RT 10.3 min when flow rate was changed from 5% B to 65% B at 1 ml / min for 30 min.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 HPLC 이미지이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다. FIG. 3 is an HPLC image of a cyclic ACP-RGDK-DOTA prepared according to an embodiment of the present invention, and FIG. 4 is a MALDI-TOF-MS image of a cyclo ACP-RGDK-DOTA prepared according to an embodiment of the present invention to be.
실시예 3 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 제조 (화학식 3)Example 3: Preparation of cyclo-ACP-RGDK-DOTA-Gd (Formula 3)
실시예 2에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA 2.5 mM 에 GdCl3.6H2O 25mM 을 H2O 에 녹인 후 40℃ 조건에서 48 시간동안 교반하였다. 반응 완료 후 일부(1 ml 소량)용액을 에테르를 이용하여 추출하였다. 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA 는 HPLC로 분석하였으며, SHIMADZU C-18 analytical column (10.0 mm ㅧ 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA 수용액(A 용액)과 0.1% TFA의 ACN 용액(B 용액) 을 5% B 에서 65% B 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려준 결과 RT 10.7 분에서 피크를 확인할 수 있었다. Example 2 was dissolved embodiment the cyclo-ACP RGDK-DOTA in 2.5 mM GdCl 3 .6H 2 O 25mM prepared in a H 2 O was stirred at 40 ℃ conditions for 48 hours. After completion of the reaction, some (1 ml) solution was extracted with ether. The prepared ACP-RGDK-DOTA was analyzed by HPLC and an ACN solution (solution B) of 0.1% TFA aqueous solution (A solution) and 0.1% TFA solution was prepared using SHIMADZU C-18 analytical column (10.0 mm ㅧ 250 mm) The peak was observed at RT 10.7 minutes after flowing at a rate of 1 ml / min for 30 minutes from 5% B to 65% B.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 HPLC 이미지이고, 도 6은 그 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
Figure 5 is an HPLC image of a cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared in accordance with an embodiment of the present invention, and Figure 6 is a MALDI-TOF-MS image of the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd.
실험예 1: 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 U87MG 세포결합 어세이(cell binding assay)Experimental Example 1: U87MG cell binding assay of cyclo-ACP-RGDK-DOTA
상기 실시예 2에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 U87MG 세포에 대한 결합능력을 비교하는 실험을 하였다. 대조군으로는 cRGDyK(시클로 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 사용하였다. U87MG세포(2X106)에 0.06 nM 125I-labeled echistatin(NEX439025UC, PerkinElmer Co. MA)와 다양한 농도(1.00-E4~1.00-E13M)의 물질(cRGDyk, 시클로 ACP-RGDK-DOTA)을 인테그린 결합 버퍼에 넣고 실온에서 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 인테그린 결합 버퍼로서 25mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM MnCl2와 0.1% BSA(bovine serum albumin)를 혼합하여 제조한 것을 사용하였다. 반응이 끝난 후 PBS(Phosphate buffed saline)로 2회 수세 후 각 튜브에 남아있는 방사능을 감마 카운터(PerkinElmer Co. MA)로 측정 하였다. IC50 값은 GrasphPad Prism(GraphPad Software, Inc., CA)를 이용하여 비선형회귀법(nonlinear regression)으로 얻었다. The experiment was performed to compare the binding ability of the cyclo ACP-RGDK-DOTA prepared in Example 2 to U87MG cells. As a control group, cRGDyK (cyclo-Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys) was used. (CRGDyk, cyclic ACP-RGDK-DOTA) of 0.06 nM 125 I-labeled echistatin (NEX439025UC, PerkinElmer Co. MA) and various concentrations of 1.00-E4 to 1.00-E13M were added to U87MG cells (2 × 10 6 ) And reacted for 1 hour while stirring at room temperature. As the integrin binding buffer, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MnCl 2 and 0.1% BSA (bovine serum albumin) were used. After the reaction was completed, the radioactivity remaining in each tube was measured with a gamma counter (PerkinElmer Co. MA) after two washes with PBS (Phosphate buffed saline). IC 50 values were obtained by nonlinear regression using GrasphPad Prism (GraphPad Software, Inc., CA).
도 7은 U87MG 세포에 대한 cRGDyK와 시클로 ACP-RGDK-DOTA 의 결합 정도를 나타낸 그래프이다. 도 7의 결과에 따르면, cRGDyK 보다 시클로 ACP-RGDK-DOTA 가 U87MG 세포에 대한 결합 능력이 현저히 크다는 것을 알 수 있다.
7 is a graph showing the degree of binding of cRGDyK and cyclic ACP-RGDK-DOTA to U87MG cells. According to the results in Fig. 7, it can be seen that the ability of the cyclic ACP-RGDK-DOTA to bind to U87MG cells is significantly greater than that of cRGDyK.
실험예 2: 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 in-vitro 혈청 안정성(serum stability) 측정Experimental Example 2: Measurement of in-vitro serum stability of cyclo-ACP-RGDK-DOTA-Gd
실시예 3에서 제조된 화학식 3 의 화합물(시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd)의 사람 혈청 내 안정성을 측정하였다. 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd(10 mM, 0.05 mL)을 사람 혈청(0.95 mL)에 섞고 37℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대(0 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 24 시간, 3 일)에 소량을 덜어내어 에탄올을 가하여 침전시켰다. 원심분리(13200 rpm, 10 분)로 분리한 후 상층액을 덜어내어 필터한 후 HPLC를 실시하였다. HPLC 조건은 Altlantis dC-18 column (3 ㅧ 150 mm)을 이용하여 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액) 과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 0.43 ml/min 속도로 흘려주었다. 시간대별 혈청 내 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 안정성 결과를 도 8에 나타내었다. The stability of the compound of formula 3 (cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd) prepared in Example 3 in human serum was measured. Cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd (10 mM, 0.05 mL) was mixed with human serum (0.95 mL) and cultured at 37 ° C. A small amount was taken out in the time zone (0 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 24 hours, 3 days) to be measured and ethanol was added to precipitate. After centrifugation (13200 rpm, 10 minutes), the supernatant was taken out, filtered and subjected to HPLC. The HPLC conditions were as follows: 0.1% TFA ACN solution (A solution) and 0.1% TFA aqueous solution (B solution) were mixed with 5% A to 40% ml / min. < / RTI > The stability results of the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd in the serum by time frame are shown in FIG.
도 8의 결과에 따르면, 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd는 사람 혈청 내에서 3일 동안 안정함을 알 수 있다.
According to the results in Fig. 8, it can be seen that the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd is stable for 3 days in human serum.
실험예 3 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 자기이완율(Relaxivity) 측정Experimental Example 3: Measurement of Relaxivity of Cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd
실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 자기이완율을 측정하였다. 이완시간은 3T(128 MHz) MRI 장비에서 측정하였다. T1 이완시간을 측정하기 위하여 반전 회복(inversion-recovery) 펄스열을 사용하였으며, T2 이완시간은 CPMG(Carr-Purcell-Meiboon-Gill) 펄스열을 사용하였다. 이완율(R1, R2)은 mM 당 이완시간의 역으로서 계산되었다. 대조군으로서 Dotaremㄾ 을 사용하였다. The magnetic relaxation rate of the cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared in Example 3 was measured. Relaxation time was measured on a 3T (128 MHz) MRI machine. Inversion-recovery pulse train was used to measure T1 relaxation time and Carr-Purcell-Meiboon-Gill (CPMG) pulse train was used for T2 relaxation time. Relaxation rates (R1, R2) were calculated as the inverse of the relaxation time per mM. Dotarem ㄾ was used as a control.
그 결과를 하기 표 1에 나타냈다. The results are shown in Table 1 below.
표 1에 따르면, 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd는 Dotaremㄾ 에 비해 약 2배 정도의 큰 자기이완율을 가지므로, 효과적으로 신호를 나타낼 수 있는 MRI 조영제라고 할 수 있다.According to Table 1, the ACP-RGDK-DOTA-Gd has a large magnetic relaxation rate about twice that of Dotarem ㄾ, so it can be effectively used as an MRI contrast agent.
실험예 4 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 MRI 영상 획득 Experimental Example 4: Acquisition of MRI image of cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd
실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 in vivo 조영효과를 확인하기 위해, 종양을 가진 마우스(nude, 20 g)에서 T1 강조영상을 얻었다.T1-weighted images were obtained in tumor-bearing mice (nude, 20 g) in order to confirm the in vivo imaging effect of the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared in Example 3.
MR 영상은, 3T 자기공명 영상장비(Magnetom Trio Tim, Siemens, Erlangen, Germany)에서 T1 강조 영상법으로 촬영하였다. 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 0.1 mmol/kg의 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd를 주입하여 주입 전, 후의 영상을 촬영하였으며, 그의 결과를 도 9 에 나타냈다. MR images were taken by T1-weighted imaging on a 3T MRI (Magnetom Trio Tim, Siemens, Erlangen, Germany). After injecting 0.1 mmol / kg of cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd through the tail vein of anesthetized mice, images were taken before and after injection, and the results are shown in FIG.
도 9는 종양을 가진 마우스에게 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd를 주입하여 주입 전, 후에 촬영한 MR 영상이다. FIG. 9 shows MR images taken before and after injection of cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd into a tumor-bearing mouse.
도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 를 주입하기 전보다 주입 후에 종양 부위에서 증가된 신호(색이 밝아짐)가 관찰되었다.
As can be seen in Fig. 9, an increased signal (brightening of color) was observed in the tumor site after injection than before injection of cyclo ACP-RGDK-DOTA-Gd.
실험예 5 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 의 종양 선택성 확인Experimental Example 5: Tumor selectivity of cyclo-ACP-RGDK-DOTA-Gd
실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd의 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성을 확인하는 실험을 하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 어께에 피하 주입하여 종양을 만들었다. 먼저 수용체 차단을 위해 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 cRGDyK 펩타이드(10 mg)를 주입하였다. 30분 후에 상기 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd(0.1 mmol/kg)를 주입하여 실험예 4 와 동일한 방법으로 MRI 영상을 획득하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. Experiments were carried out to confirm the selective specificity of the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd prepared in Example 3 on the receptor expressed in tumor cells. U87MG cells, a malignant glioma cell line, were injected subcutaneously into nude mouse shoulders to create tumors. First, cRGDyK peptide (10 mg) was injected through the tail vein of anesthetized mice to block the receptor. After 30 minutes, the cyclic ACP-RGDK-DOTA-Gd (0.1 mmol / kg) was injected to obtain MRI images in the same manner as Experimental Example 4. [ The results are shown in Fig.
도 10 에 따르면, 수용체가 차단되지 않은 종양 부위의 신호에 비해서 수용체가 차단(blocking)된 종양부위의 신호가 더 낮음을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터 시클로 ACP-RGDK-DOTA-Gd 가 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성이 있음을 알 수 있다.According to Fig. 10, it can be seen that the signal of the tumor site where the receptor is blocked is lower than the signal of the tumor site where the receptor is not blocked. These results indicate that cyclo-ACP-RGDK-DOTA-Gd has selective specificity for receptors expressed in tumor cells.
Claims (6)
[화학식 3]
상기 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 또는 DFOM(Deferrioxamine)이고,
상기 Gd는 가돌리늄이며, 상기 리간드에 배위결합되어 있고,
상기 RGDK(Arg-Gly-Asp-Lys) 시퀀스에 아미노시클로펜탄(aminocyclopentane carboxylic acid)을 포함하는 시클릭 펩타이드(시클로 ACP-RGDK)는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다. A compound of formula (3)
(3)
Such ligands include DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA (Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A (1,4,7,10- tetraazacyclododecane- 4,7-triacetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-Triazacyclononane, 1-glutaric acid-4,7- , TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N, N ', N'',N''' - tetraacetic acid), TE3A (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid, TE2A (1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA (3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1,11,13- , 6,9, -triacetic acid, Cyclen, or DFOM (Deferrioxamine)
Wherein Gd is gadolinium and is coordinately bound to the ligand,
A cyclic peptide (cyclic ACP-RGDK) comprising an aminocyclopentane carboxylic acid in the RGDK sequence is amidated with the ligand via lysine.
[화학식 3a]
[Chemical Formula 3]
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌(Cyclen), 또는 DFOM(Deferrioxamine) 이고,
상기 RGDK(Arg-Gly-Asp-Lys) 시퀀스에 아미노시클로펜탄(aminocyclopentane carboxylic acid)을 포함하는 시클릭 펩타이드는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.A process for preparing a compound of formula (3) according to claim 1, comprising reacting a compound of formula (2)
(2)
In Formula 2,
Wherein the ligand is DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, Cyclen, or DFOM (Deferrioxamine)
The cyclic peptide comprising an aminocyclopentane carboxylic acid in the RGDK sequence (Arg-Gly-Asp-Lys) is amidated with the ligand via lysine.
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