KR100981987B1 - 주사튜널링현미경을 이용한 생체분자간의 결합을전기적으로 검출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법에 관한 것이다: (a) 제1 생체분자(first biomolecule)를 금속기판에 고정화시키는 단계; (b) 상기 금속기판에 제2 생체분자(second biomolecule)를 적용하여 제1 생체분자와 제2 생체분자간의 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 금속기판을 STM으로 스캐닝하고 측정되는 전기적 신호에 따라 상기 제1 생체분자와 제2 생체분자 사이의 결합이 발생하였는지 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 STM-기반 전기적 검출 방법에 따르면, 극저농도(예컨대, 100 fg/mL)의 분석물도 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 하나의 측정 시스템(예컨대, 하나의 단백질칩)에서 다수의 분석을 할 수 있다. 한편, 본 발명에 따르면, 종래의 형광 기반 검출방법에 의해서는 분석하기가 어려웠던 나노-크기 어레이에 대하여 성공적으로 분석을 할 수 있도록 하며, Au 나노입자의 실버염색을 통하여 시그널을 증폭함으로써 민감도를 극대화할 수 있다.

STM, 생체분자, 단백질, 항체, 항원, 검출, 단백질칩

Description

주사튜널링현미경을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법{Methods for Electrically Detecting Interactions between Biomolecules Using Scanning Tunneling Microscope}

본 발명은 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

DNA 혼성화, 단백질-단백질 상호작용 및 작은 분자들의 결합과 같은 생물학적 결합 이벤트의 전기적 검출은, 전통적인 색상 검출 및 형광-기반 방법 등의 대체 기술로서 도입되었다(Park et al.,2002; Lasseter et al., 2004; Rawlett et al., 2002). 즉각적인 반응, 비용 절감 및 반도체 기술과의 통합과 같은 이점 때문에, 전기적 검출에 대한 요구가 여전히 확대되고 있다. 이러한 전기적 검출 기술의 진전은, 금속 나노입자-생체분자 복합체, 나노선 및 도전성 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 의해 시작되었다(Willner et al., 2002; Chen et al., 2004; Bunimovich et al 2006; Zheng et al., 2005). 전기적 검출의 전형적인 형태는, 두 개의 전극으로 전기회로를 생셩하는 것이다(Syvanen et al., 2002; Tsai et al., 2006). 리드아웃은 전극 사이의 간극에 위치해 있는 도전성 물질의 전기 저항으로 실시될 수 있다. 그러나, DNA/단백질 결합 이벤트에 대한 종래의 전기적 검출 방법은 멀티플 검출에 대하여은 제한적이며, 그 이유는 장치의 구현이 평면에서 이루어지기 때문이다. 따라서, 전기적 검출 기술에서 극복하여야 할 사항은 멀티플 검출을 가능하게 하는 방법의 개발이다.

Au 나노입자-바이오/유기물질의 하이브리드가, 분자 스위치, 물성 및 다른 전자소자들의 개발을 위하여 연구되었고, 그의 응용성은 더욱 확대되어 생물학적 결합 이벤트의 측정으로 응용되고 있다(Gittins et al., 2000; Csaki et al., 2001; Xiao et al, 2003). Au 나노입자의 작은 레이블 크기, 독특한 광학적 및 전기적 특성, 그리고 실버염색을 통한 시그널 증폭의 용이성 때문에, 이 나노입자는 생물학적 결합 이벤트의 검출에 유용한 도구로 각광을 받고 있다.

현재까지 많은 연구진에 의해 개발되어진 바이오센서의 장단점들을 비교해 보면 다음과 같다. SPR(surface plasmon resonance)은 측정의 재현성, 비특이적 반응의 최소화, 넓은 측정범위, 다성분 측정 가능 등 많은 장점이 있으나 소형화가 어렵다는 단점이 있고, LSPR(localized surface plasmon resonance)의 경우 SPR에 비해 소형화가 유리하나 표면으로부터 검출거리가 짧다는 단점이 있다. Piezoelectric 역시 소형화가 용이하지만 SPR에 비해 거의 1/10 수준만큼 감도가 떨어진다는 단점이 있으며, Nano-FET의 경우 반응이 비특성과 측정 물질의 성질에 영향을 많이 받는다는 점, 표면으로부터 검출 거리가 멀다는 단점이 있다. 한편, 암페로메트(Amperomet)의 경우 범용 적으로 사용이 어렵기 때문에 선택성이 떨어질 수 있다는 단점이 있고, 임피던스(Impedence)의 경우 소형화도 용이하고 감도도 높다는 장점이 있으나 재현성이 떨어지고 비특이적 반응을 갖는다는 단점이 있다. 따라서 초소형 단백질칩 통합분석시스템을 위해 상기 바이오센서들이 갖는 단점들을 보완하고 극복하기 위해서는 새로운 분석시스템을 갖춘 바이오센서가 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생체분자 사이의 결합(interaction 또는 binding) 여부를 전기적으로 그리고 고속으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용하는 경우에는 생체분자 사이의 결합 여부를 보다 편리한 방식으로 그리고 매우 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 제1 생체분자(first biomolecule)를 금속기판에 고정화시키는 단계;

(b) 상기 금속기판에 제2 생체분자(second biomolecule)를 적용하여 제1 생 체분자와 제2 생체분자간의 결합을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 금속기판을 STM으로 스캐닝하고 측정되는 전기적 신호에 따라 상기 제1 생체분자와 제2 생체분자 사이의 결합이 발생하였는지 여부를 결정하는 단계.

본 발명자들은 생체분자 사이의 결합(interaction 또는 binding) 여부를 전기적으로 그리고 고속으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용하는 경우에는 생체분자 사이의 결합 여부를 보다 편리한 방식으로 그리고 매우 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 검출될 수 있는 생체분자는 특별하게 제한되지 않으며, 특이성을 가지고 카운터파트(counterpart)와 결합할 수 있는 능력을 갖는 생체분자를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 DNA, RNA, 단백질 또는 탄수화물이며, 보다 바람직하게는 DNA, RNA 또는 단백질이고, 보다 더 바람직하게는 DNA 또는 단백질이며, 가장 바람직하게는 단백질이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1 생체분자는 항체(다클론 또는 단일클론항체)이다.

예를 들어, 제1 생체분자가 단백질의 일종으로서 항체이고, 제2 생체분자가 단백질의 일종으로서 항원인 경우, 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 특이성을 가지 고 결합한다. 또한, 제1 생체분자가 단백질 수용체(receptor)이고, 제2 생체분자가 단백질 리간드(ligand)인 경우, 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 특이성을 가지고 결합한다. 또 다른 예로서, 제1 생체분자가 DNA이고, 제2 생체분자가 DNA-결합 단백질인 경우, 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 특이성을 가지고 결합한다.

본 발명의 방법은 이러한 생체분자들 사이의 결합을 높은 민감도로 전기적으로 검출할 수 있는 방법이다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 제1 생체분자를 금속기판에 고정화(immobilization)시킨다.

본 발명에서 이용될 수 있는 금속 기판은 전기전도성을 나타내는 한 특별하게 제한되지 않으며, 당업계에서 이용되는 어떠한 금속 기판도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 금속 기판의 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “금속 기판”은 금속, 금속 옥사이드 및 합금의 기판을 모두 포괄하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 금속 기판은, 금, 은, 동, 백금, 알루미늄, 상기 금속의 합금(예컨대, 금과 구리의 합금) 또는 금속 옥사이드 기판을 포함한다.

금속 기판은 금속으로 이루어진 기판뿐만 아니라, 금속이 표면 코팅된 기판도 포함한다.

가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 금속 기판은 금(Au) 기판이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “금 기판”은 금으로 표면 코팅된 기판을 포괄하는 의미를 갖는다.

제1 생체분자를 금속기판에 고정화시키는 것은, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1 생체분자는 단백질이고, 제1 생체분자는 추가적인 티올기(-SH)를 가지며 상기 티올기를 통하여 금속표면에 고정화된다.

단백질은 시스테인 잔기의 R-기를 통하여 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 천연형(wild type) 단백질에 추가적인 티올기를 더 부여한다. 이러한 티올기의 추가는 크게 두 가지 방식으로 통하여 실시할 수 있다.

첫 번째 방법에 따르면, 티올기의 추가는 설파이드(sulfide) 또는 다이설파이드(disulfide) 결합을 가지는 천연형 단백질에 환원제(예컨대, 2-머캅토에틸아민)을 첨가하여 티올기를 형성시킬 수 있다.

두 번째 방법에 따르면, 티올기의 추가는 유전공학적 방법으로 단백질을 제조하는 경우 단백질의 N- 또는 C-말단에 추가적으로 시스테인 잔기를 도입함으로써 실시할 수 있다.

본 발명의 제1 생체분자가 항체인 경우에는 상술한 첫 번째 방법이 바람직하다. 항체인 제1 생체분자에 추가적인 티올기를 도입하기 위하여, 환원제를 처리한 경우 항체는 절편화(fragmentation) 된다. 본 명세서에서 이러한 항체를 용어 “절편 항체”로 표현되어 있다.

이러한 추가적인 티올기를 통한 고정화를 하는 경우의 구체적인 일 실시예는 다음과 같다: 우선, 기판, 바람직하게는 금 기판을 고온에서 어닐링 하고, 피라나 용액을 이용하여 세척한다. 이어, 금 기판에 시스테인 추가적인 티올기를 가지는 단백질을 상기 기판의 표면에 뿌리고 단백질이 기판 상에서 SAM(self-assembled monolayer)을 형성하도록 방치하여 단백질이 고정된 기판을 얻는다.

추가적인 티올기를 통하여 단백질을 금속기판에 고정화하는 경우, (ⅰ) 다른 링커의 도움 없이 단백질 내에 있는 분자를 통하여 단백질이 직접 기판에 고정화될 수 있으며, (ⅱ) 고정화능 또한 주어진 조건에서 최대화할 수 있고, (ⅲ) 단백질이 올바른 배향성(orientation)으로 기판에 고정될 수 있는 장점을 갖는다.

제1 생체분자를 금속기판에 고정화시킨 다음, 금속기판에 고정된 제1 생체분자에 제2 생체분자(second biomolecule)를 적용하여 제1 생체분자와 제2 생체분자간의 결합을 유도한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2 생체분자는 DNA, RNA, 단백질 또는 탄수화물이며, 보다 바람직하게는 DNA, RNA 또는 단백질이고, 보다 더 바람직하게는 DNA 또는 단백질이며, 가장 바람직하게는 단백질이다.

제1 생체분자가 항체인 경우, 제2 생체분자는 항원이다.

제2 생체분자는 단리된 형태(isolated form)이거나 또는 다른 물질들과 혼합되어 있는 형태(mixed form)일 수 있다.

본 발명의 방법은 미지의 시료에 분석 대상의 물질이 포함되어 있는지 여부에 대한 정성적 또는 정량적 분석을 하는 경우에 유용하게 이용될 수 있다. 따라 서, 제2 생체분자는 분석물(analyte) 또는 시료(sample) 형태로 제공될 수 있다.

분석물 또는 시료 내에 분석 대상의 제2 생체분자가 있으면, 제2 생체분자는 제1 생체분자와 결합한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이후에 제2 생체분자에 대하여 친화성(affinity)을 갖는 제3 생체분자(third biomolecule)를 처리하여 상기 제2 생체분자와 제3 생체분자 사이의 결합을 유도한다.

예를 들어, 제2 생체분자가 항원인 경우, 이 항원에 특이적 결합을 하는 항원이 제3 생체분자로서 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제3 생체분자는 전기전도성 금속 나노입자에 결합(conjugation)되어 있다.

제3 생체분자가 결합(conjugation)되는 전기전도성 금속 나노입자는 특별하게 제한되지 않는다. 바람직하게는, 금속 나노입자는 금, 은, 동, 백금, 알루미늄, 상기 금속의 합금(예컨대, 금과 구리의 합금) 또는 금속 옥사이드의 나노입자를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 금속 나노입자는 금(Au) 나노입자이다.

제3 생체분자를 금속 나노입자에 결합시키는 것은, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제3 생체분자는 단백질이고, 제3 생체분자는 추가적인 티올기(-SH)를 가지며 상기 티올기를 통하여 금속 나노입자의 표면에 고정화된다.

상술한 생체분자들 사이의 반응이 완료된 다음, 금속기판을 STM으로 스캐닝 하고 측정되는 전기적 신호에 따라 상기 제1 생체분자와 제2 생체분자 사이의 결합이 발생하였는지 여부를 결정한다.

Au 나노입자에 결합된 제3 생체분자(항체)를 이용하여 본 발명의 방법을 실시하는 경우를 예로 하여, 본 발명의 검출 방법에 대한 기본적인 원리를 설명하면 다음과 같다: STM 팁(또는 프로브)이 고정전류 모드로 Au 나노입자-항체 컨쥬게이트가 있는 기판을 스캐닝 하는 경우, 타겟 분자(즉, 제2 생체분자)에 대하여 친화성을 나타내는 Au 나노입자-항체 컨쥬게이트 및 STM 팁(또는 프로브) 사이의 가장 근접한 위치에 있는 경우 튜널링 전류는 피크-유사 펄스를 나타낸다. 이 경우, 피크-유사 펄스의 빈도수(frequency)는 Au 나노입자-항체 컨쥬게이트의 표면 밀도에 의존하게 되며, 따라서 피크-유사 펄스의 빈도수는 타겟 분자(즉, 제2 생체분자)의 정량적 분석을 가능하게 한다.

또한, STM의 이미지를 통하여, Au 나노입자-항체 컨쥬게이트의 밀도를 유추할 수 있으며, Au 나노입자-항체 컨쥬게이트의 밀도와 전류피크의 빈도는 전체 스캔영역에서 얻어진 전류피크의 주기성(periodicity)과 강도변화의 관찰을 통해 분석될 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함한다: (a) 제1 생체분자(first biomolecule)인 항체를 금(Au) 기판에 고정화시키는 단계; (b) 상기 Au 기판에 제2 생체분자(second biomolecule)인 항원을 적용하여 제1 생체분자와 제2 생체분자간의 결합을 유도하는 단계; 및 (c) 제2 생체분자에 대하여 친화성을 가지며 Au 나노입자에 결합된 제3 생체분자(third biomolecule)인 항체를 처리하여 상기 제2 생체분자와 제3 생체분자 사이의 결합을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 금속기판을 STM으로 스캐닝하고 측정되는 전기적 신호에 따라 상기 제1 생체분자와 제2 생체분자 사이의 결합이 발생하였는지 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 방법은 전체적으로 단백질 어레이(또는 단백질칩) 방식으로 실시될 수 있다. 즉, 제1 생체물질의 고정화를 단백질칩의 기판 상에서 실시하고, 제2 생체물질 및 제3 생체물질의 처리도 모두 단백질칩에서 실시할 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 생체물질 사이의 결합 여부를 전기적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하며, 이는 멀티플 측정 방식으로 실시될 수 있다. 본 발명의 STM-기반 전기적 검출 방법에 따르면, 극저농도(예컨대, 100 fg/mL)의 분석물도 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 하나의 측정 시스템(예컨대, 하나의 단백질칩)에서 다수의 분석을 할 수 있다. 한편, 본 발명에 따르면, 종래의 형광 기반 검출방법에 의해서는 분석하기가 어려웠던 나노-크기 어레이에 대하여 성공적으로 분석을 할 수 있도록 하며, Au 나노입자의 실버염색을 통하여 시그널을 증폭함으로써 민감도를 극대화할 수 있다.

결과적으로, 본 발명은 초소형 단백질 통합분석시스템을 구축하여 향후 대량생산이 가능한 나노 단백질 칩으로의 발전 가능성을 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

HSA(human serum albumin)에 대한 단일클론항체 및 폴리클로날 항체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 2-머캅토에틸아민(MEA) 및 평균 직경 5 nm의 금 나노입자도 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

기판의 제조

Superior (독일)로부터 구입한 0.1 mm 두께의 커버유리 상에, 크롬 및 금 표면을 연속적으로 각각 2 nm 및 43 nm 두께로 형성하였으며, 이 경우 DC 마그네트론 스퍼터링(Kim et al., 1999) 방법을 이용하였다. 스퍼터링된 Au 기판을 피라나(piranha) 용액(황산 70부피분율과 과산화수소 30부피분율로 혼합하여 만든 용액)에 5분간 담가 세척한 후, 에탄올에 30분간, 이후 탈이온수(deionized water)에 2시간 담가 세정작업을 완료하였다(Oh et al., 2004; Lee et al., 2005). 모든 용액은 Millipore (Milli-Q) 물로 제조하였다.

나노입자-항체 컨쥬게이트의 형성 및 확인

항체의 배향성 고정화를 실시하기 위하여, 나노입자-항체 복합체의 컨쥬게이션 및 바이오표면 형성에 금-티올 상호작용을 이용하였다. 면역글로불린 G(IgG) 분자(다클론 항체)의 절편화(fragmentation)을 위하여 2-머캅토에틸아민(MEA)을 항체 용액에 첨가하고 혼합하였다. 37℃에서 90분 동안 반응시킨 다음, 잔여 2-MEA를 투석막으로 5 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 함유하는 PBS-EDTA 완충액(pH 7.4)에 대하여 투석하여 제거하였다. 상기 용액을 Au 나노입자와 증류수를 이용하여 3:6:1의 비율로 섞은 후 2시간 동안 4°C에서 보관하였다. 나노입자-항체 컨쥬게이트의 안정화를 위해 상기 용액에 5%의 카세인을 넣어 1시간 동안 4°C에서 보관하였다. 제조된 나노입자-항체 컨쥬게이트를 초원심분리기를 이용해 4°C에서 1시간 동안 34,000 rpm을 이용해 회수한 후 PBS 용액에 재현탁시켰다. 상기 용액을 UV-vis 스펙트로스코피를 이용하여 컨쥬게이트의 형성 여부를 확인할 수 있었다.

단백질 도입 및 자기조립박막의 형성

HSA에 대한 단일클론항체를 2-머캅토에틸아민(MEA)을 항체 용액에 첨가하고 혼합하였다. 37℃에서 90분 동안 반응시켜 단일클론항체를 절편화시켰다. 상기의 절편화 항체는 절편화에 의해 표면으로 시스테인 잔기가 노출되어 있다. 절편화 항체의 용액에 상기 Au-코팅된 기판을 함침시켜 12시간 보관하여, 기판 상에 항체의 자기조립막(self-assembled monolayer)이 형성되도록 하였다. 절편화 항체 의 노출된 시스테인 잔기를 통하여 항체가 기판에 결합된다. 절편화 항체는 일정한 패턴으로 배향성을 가지고 금 기판에 고정화 되었다.

항원의 도입

상기 기판을 꺼내 고정되지 않은 항체를 PBS/EDTA 용액으로 세척한 후 원하는 농도의 항원(HSA) 용액에 함침시켜 6시간 보관하였다.

나노입자-항체( 다클론 ) 컨쥬게이트의 도입

상기 기판을 꺼내 고정 되지 않은 항원을 세척한 다음, 상기의 나노입자-항체 컨쥬게이트 용액에 함침시켜 6시간 동안 보관하였다.

측정 및 분석

단백질 어레이의 표면 토포그래피 및 전류 파일은, 스캐닝 프로브 마이크로스코피(SPM, XE-100, Park Systems, 한국)를 이용하여 얻었다. 이미지는, I_set = 0.5 nA의 조건에서 얻었고, 이 경우 0.5 V 이상의 전압을 인가하였다.

실험 결과 및 논의 사항

본 발명의 전기적 검출의 원리를 입증하기 위하여, 우선 간단한 시스템으로 실험을 실시하였다. Au 나노입자 및 자기조립 디티올화 유기물질(1,8-옥탄디티 올, 1,8-ODT)을 이용하였다. 5 nm 직경의 Au 나노입자를 1,8-ODT 박막에 고정화 하였다. Au 나노입자의 국소적 결합 이벤트의 관찰 결과는 도 2의 (a) 내지 (c)에 나타나 있다. 1,8-ODT 자기조립박막(SAM)에 고정화된 Au 나노입자의 표면밀도는, 첨가된 Au 나노입자의 농도에 비례하였다. 농도가 임계농도 이상인 경우, 이는 궁극적으로 박막을 형성할 수 있었다. STM 토포그래피를 얻기 위한 전류 프로파일은 주기도분석(periodogram analysis)에 있어서 입력 변수로서 이용될 수 있었다.

제작된 나노구조체 상에서 관찰된 나노입자의 크기 분포는 고정화 과정 중에 비특이적 결합을 막는 블록킹 과정을 거치지 않았기 때문에 부수적으로 형성된 것이나, 도 2에 제시된 STM 의 전체 표면 모양에 따르면 금 입자는 성공적으로 자기조립되어 1,8-ODT 단분자막에 고정된 것을 알 수 있으며, 금 입자의 표면 밀도는 자기조립 단분자막에 도입되는 나노입자의 농도에 따라 변화하는 것을 알 수 있다.

이러한 원리를 샌드위치 타입 면역정량적 분석에 확대하였다(도 4). 이 경우, 표면 쪽에 국소화 되어 있는 결합된 항원 상에 Au 나노입자를 위치시킬 수 있다. 실험 결과에 따르면, Au 나노입자-항체 컨쥬게이트는 Au 표면 상에 국소적으로 위치해 있는 항원-항체 클러스터에 결합하였다(도 3의 패널 b). 표면 상에 Au 나노입자가 존재하는 것은 STM으로 관찰할 수 있었다. 국소화 Au-나노입자-항체 컨쥬게이트의 전류-전압(I-V) 특성(도 3의 패널 c)은, Au 나노입자가 위치하는 시점은 높은 전기저항 및 토폴로지 차이를 갖는다는 것을 보여준다. 이러한 전기적 특성의 국소적 차이에 의해, STM 팁을 표면에 스캐닝 할 때 튜널링 전류의 펄스-유 사 피크를 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 항체-항원 결합 이벤트의 측정에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

타겟 분자의 반-정량적 측정에 대한 가능성을 입증하기 위하여, 주기도(periodogram)의 회귀곡선을, STM 토포그래피의 디스플레이에 대한 전류 파일로부터 얻었다(도 5). 각각의 회귀 곡선은 타겟 분석물의 특정 농도에 해당하는 것이다. Au 나노입자의 표면밀도는, 본 측정 시스템에서 항체-항원 결합 이벤트에 의존하기 때문에, 본 발명자들은 표면에 적용되는 항원(HSA) 농도의 조절을 통하여 Au 나노입자의 표면밀도를 조절할 수 있었다.

단백질 어레이 상의 HSA를 검출하기 위하여, HSA에 대한 단일클론항체 절편의 패턴을 마이크로-접촉 프린팅 방식으로 형성시켰다. HSA 및 Au 나노입자-항체 컨쥬게이트를 표면에 적용하였다. 패턴화된 표면 상의 Au 나노입자 복합체의 특이적 결합 이벤트는 실버 강화로 가시화 하였다(도 6). 비특이적 결합 없이, 패턴화된 항체 절편 상에서 샌드위치 타입 결합 이벤트가 관찰되었다. 로그 곡선으로 주기도곡선이 회귀될 수 있었고, 이는 무차원 세기(dimensionless intensity)의 감소를 나타내었다. p/4 피리어드 이하의 임의점에서, 무차원 세기의 타깃 분석물의 농도와의 연관성이 관찰되었다.

100 fg/mL HSA 보다 낮은 농도의 시료로부터 얻은 주기도곡선과 비교하여, 큰 차이는 없었다. 이러한 실험 결과로부터, 100 fg/mL HSA도 성공적으로 검출할 수 있음을 알 수 있고, 단백질 어레이에서 STM에 기초한 전기적 검출기술의 가능성을 충분히 제시할 수 있다.

결론

본 발명은 단백질 어레이에서 STM으로부터 얻은 전류 프로파일이 정량적 측정을 위하여 이용될 수 있음을 명확히 보여준다. 일정 전류 모드에서 튜널링 전류는 팁-to-시료 분리에 의존하기 때문에, 국소화 Au 나노입자는 이러한 분리를 근접하도록 한다. 이는 STM 전류 프로파일에서 펄스-유사 피크를 형성시킨다. 팁-to-시료 분리에서 변화의 주기는 기판 표면 상에 고정화된 Au 나노입자의 표면 밀도와 관련성을 나타내었다. 얻어진 전류 프로파일의 특성을 주기도분석으로 실시하였다. 표면밀도의 증가에 따라 고정화된 나노입자 사이의 간격이 감소할수록, 짧은 시간에서의 무차원 세기는 Au 나노입자의 양에 따라 상당히 변화 되었다. 본 발명의 방법은 항체-항원 결합 이벤트의 측정에 성공적으로 적용되었다. 검출을 위한 분자의 디메젼이 팁-to-시료 상호작용을 방해할 정도로 크지 않다면, 본 발명의 방법은 DNA, RNA 및 다른 항원들을 측정할 수 있으며, 단일 칩으로 멀티플 검출을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 측정 방법은 단백질 어레이에 형성되는 스팟의 크기에 무관하게 실시될 수 있으며, Au 나노입자의 실버 염색을 통하여 초고감도로 검출할 수 있도록 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 본 발명의 STM에 기반한 단백질의 전기적 검출 시스템의 개략도이다. 패널 B는 기판 표면에 분산되어 있는 금 나노입자의 토포그래피 및 튜널링 전류 프로파일이다.

도 2는 단백질과 나노입자를 이용한 본 발명의 전기적 측정용 박막 제조 과정을 보여 주는 개략도이다.

도 3은 1,8-ODT SAM에 고정화된 Au 나노입자의 토포그래피 STM 이미지이다. Au 나노입자의 농도는 a) 0.01%, b) 0.0001%, c) 0.0001%)이다. 해당하는 STM 이미지에서 얻어진 전류 프로파일의 파워 스펙트럼이다(베어 금을 포함).

도 4는 항체 절편에 기반한 면역분석의 개략도(패널 a), 베어 Au(원형), 항체 절편의 박막(사각형)(패널 b) 및 해당 이미지가 있는 면역복합체(다이아몬드형)(패널 c)의 I-V 특성을 보여 준다.

도 5는 타겟(HSA) 농도에 따른 파워 스펙트럼의 회귀곡선이다. 가장 낮은 부위의 회귀 곡선은 베어 Au의 곡선이다.

도 6은 본 발명의 분석 시스템에 대한 모식도(패널 a), 그리고 실버 강화 후의 분석 시스템에 대한 마이크로사진이다(패널 b).

Claims (10)

1. 다음의 단계를 포함하는 주사튜널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용한 생체분자간의 결합을 전기적으로 검출하는 방법:

   (a) 제1 생체분자(first biomolecule)를 금속기판에 고정화시키는 단계;

   (b) 상기 금속기판에 제2 생체분자(second biomolecule)를 적용하여 제1 생체분자와 제2 생체분자간의 결합을 유도하는 단계;

   (b-1) 상기 제2 생체분자에 대하여 친화성(affinity)을 갖는 제3 생체분자(third biomolecule)를 처리하여 상기 제2 생체분자와 제3 생체분자 사이의 결합을 유도하는 단계; 및

   (c) 상기 금속기판을 STM으로 스캐닝하고 측정되는 전기적 신호에 따라 상기 제1 생체분자와 제2 생체분자 사이의 결합이 발생하였는지 여부를 결정하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 생체분자 및 제2 생체분자는 DNA, RNA, 단백질 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 금속기판은 금(Au) 기판인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 생체분자 또는 제2 생체분자는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 제1 생체분자는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 단백질은 추가적인 티올기(-SH)를 가지며 상기 티올기를 통하여 금속표면에 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 생체분자는 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, 상기 제3 생체분자는 금속 나노입자에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.

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