KR100978055B1

KR100978055B1 - 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도향상 방법

Info

Publication number: KR100978055B1
Application number: KR1020080082804A
Authority: KR
Inventors: 오을식; 유영숙; 송은주; 나비울
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2008-08-25
Publication date: 2010-08-25
Also published as: KR20100024107A

Abstract

본 발명은 pH가 낮은 러닝버퍼를 주입하고, 염기영역을 형성하며, 측정하고자 하는 시료를 주입하고, 러닝버퍼를 재주입하여 전기영동함으로써, 용매의 pH에 따라 전하량이 변하는 시료의 모세관 전기영동의 검출 감도를 향상시키는 방법에 관한 것으로, 모세관 전기영동시 검출기를 지나는 시료의 폭과 농도를 조절하여 검출 감도를 향상시켜, 적은 농도로도 향상된 검출 감도 결과를 얻을 수 있는 바, 종래 모세관 전기영동의 단점을 획기적으로 개선할 수 있는 효과를 제공한다.

모세관 전기영동(CE), 스태킹(stacking), pH, 염기영역, 감도 향상

Description

개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법{Method for enhancing the detection sensitivity of capillary electrophoresis using improved sample injection mode}

본 발명은 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pH가 낮은 러닝버퍼를 주입하고, 염기영역을 형성하며, 측정하고자 하는 시료를 주입하고, 러닝버퍼를 재주입하여 전기영동함으로써, 용매의 pH에 따라 전하량이 변하는 시료의 모세관 전기영동의 검출 감도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

모세관 전기 영동법(Capillary electrophoresis ; CE)은 전기장을 걸어주어 시료성분이 전하와 이동도에 따라 각각 일정한 방향과 속도로 이동하여 시료를 분리해내는 전기 영동법을 모세관에 적용시켜 물질을 분리하는 것이다. 분리기술로서의 전기 영동법은 1937년 Tiselious가 단백질 혼합물을 넣고 전기장을 걸어줌으로써 시료성분이 각각의 전하와 분자량에 따라 분리되는 것을 관찰한 것으로부터 시 작되었으며, 모세관은 1967년 Hjerten이 내경 1～3 mm인 석영관을 사용한 것으로부터 시작되었다. 그 이후 1974년 Virtanen이 200～500 μm 내경을 가진 유리로 된 모세관을 사용하였고, 몇해 후 Mikkers등이 200μm 내경의 테프론 모세관으로 전기영동을 수행하였다. 1980년대 초 Jorgenson과 Lukacs가 내경 75μm 용융 실리카 모세관을 사용하여 분석효율을 높였으며, Polyimide 코팅을 태워 창을 만듦으로 “On-column" 검출법을 처음 사용하며 검출 감도를 높였다.

모세관 전기영동(CE)은 높은 효율, 빠른 분석시간, 적은 시료소요량과 전하에 관계없이 모든 용질을 동시 분석할 수 있는 장점이 있어 생물학적 거대 분자, 아미노산, 키랄약품, 단백질, 탄수화물 등의 분석에 많이 이용되고 있다.

하지만, 모세관의 좁은 내부 지름(20~100 μm)으로 인하여 다른 크로마토그래피 기법에 비하여 감도(sensitivity)가 떨어지는 단점이 있다. 즉, 측정하고자 하는 시료를 모세관에 주입하는 경우, 주입시간이나 주입방법, 또는 주입된 시료의 양에 따라 시료가 모세관 안에서 일정하지 않은 범위에 분포하게 되며, 이에 따라 시료가 감지기를 지나는 시간이 넓어지고, 이 넓은 폭에 따라 다른 물질과 섞이기도 하여 검출 시 낮은 강도를 보이게 된다.

따라서, 모세관 전기영동의 감도를 높이기 위한 시도가 진행되어왔다. 대표적 접근 방법으로 1) 물리적으로 모세관 길이를 증가시키거나 2) 물리화학적 특성을 이용하여 분석하고자 하는 시료를 좁은 영역으로 스태킹(stacking)시키는 방법이 있다.

물리적으로 모세관 길이를 증가시키기 위하여 Z-형태의 셀, 버블 셀, 정사각형 모세관 및 다반사 셀 흡광도(multi reflection cell absorbance)를 이용하는 방법이 있었다. 상기 물리적 방법은 상당히 복잡함에도 수 배의 감도 증가 결과를 얻을 수 있었다.

물리화학적으로 시료를 스태킹하는 방법은 Tiselius가 전기영동에서의 스태킹 현상을 보고한 이후, 다양한 스태킹 방법이 제시된 바 있다. 상기 스태킹 방법은 상대적으로 간단하고, 모세관 전기영동 장치의 변형을 가하지 않고 검출 감도를 수백 배까지 올릴 수 있는 장점이 있다. 구체적으로는 field amplified sample stacking, transient isotachophoresis, pH mediated stacking, sweeping technique 및 large volume sample stacking 등이 있다.

상기 종래 방법들로 인하여 어느 정도 모세관 전기영동의 검출 감도가 향상되었음에도 불구하고, 보다 높은 분해능을 얻기 위한 시도는 계속 진행되고 있다.

본 발명자 역시 모세관 전기영도의 검출 감도를 높이기 위하여 부단한 노력을 거듭한 결과, 시료 주입법 개량으로 용매의 pH에 따라 전하량이 변하는 시료의 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 시료 스태킹에 의한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 낮은 pH의 러닝버퍼를 주입하고, 높은 pH의 염기의 주입으로 염기영역을 형성한 후, 측정하고자 하고자 하는 시료를 주입하고, 러닝버퍼를 재주입하여 전기영동을 수행하는 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법을 제공한다.

본 발명은 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법에 관한 것으로, 모세관 전기영동시 검출기를 지나는 시료의 폭과 농도를 조절하여 검출 감도를 향상시켜, 적은 농도로도 향상된 검출 감도 결과를 얻을 수 있는 바, 종래 모세관 전기영동의 단점을 획기적으로 개선할 수 있는 효과를 제공한다.

모세관에 러닝버퍼를 주입하는 단계(단계 1);

상기 러닝버퍼 주입 후 pH 11.0내지 13.0의 염기를 주입하여 염기 영역을 형 성하는 단계(단계 2);

상기 염기영역 이후 측정하고자 하는 시료를 주입하는 단계(단계 3);

시료 주입 후 단계 1의 러닝버퍼를 재주입하는 단계(단계 4); 및

상기 단계 1부터 단계 4를 거쳐 스태킹된 시료를 검출하는 단계(단계 5)를 포함하는 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 검출 감도 향상 방법을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 상기 단계 1은 모세관에 러닝버퍼를 주입하는 단계이다. 상기 러닝버퍼는 모세관 내의 전체 물질들이 전기적인 힘에 의해 (+)극의 주입구에서 (-)극의 측정부로 이동하게 되는 주요 흐름을 형성하기 위하여 사용된다.

러닝버퍼는 pH 1.8로부터 3.0까지의 완충용액을 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 포름산과 같은 유기산군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 단계 2는 단계 1의 종료 후 염기를 주입하여 염기 영역(base zone)을 형성하는 단계이다. 상기 ‘염기 영역’은 모세관 내에 주입되는 염기가 차지하는 영역을 의미하는 것으로서, ‘염기 마개’라는 용어를 사용할 수 있다.

상기 염기는 제1단계의 러닝버퍼의 흐름을 멈춘 상태에서 유체역학적 방법 (압력)으로 주입하게 된다.

상기 염기는 pH 11.0내지 13.0 인 것이 바람직하며, 구체적으로는 수산화 암모늄과 같은 염기군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 단계 3은 단계 2의 종료 후 측정하고자 하는 시료를 주입하는 단계이다.

상기 측정하고자 하는 시료는 용매의 pH에 따라 전하량이 변하는 시료를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 시료는 단계 2에서 형성된 염기 영역 과 접합하면서 염기 영역의 높은 pH에 의해 시료의 오른쪽 끝 부분이 음전기를 띠는 상태로 바뀌게 된다. 결국 (+)극과 (-)극 사이의 전기장에 의해 음전기를 띠고 있는 염기 영역 부분과 시료의 오른쪽 끝 부분인 음전기를 띠는 접합부가 (+)극으로 동시에 이동하며 시료의 주입된 길이를 줄여 시료들이 있는 영역이 점점 작아지며 시료가 모이게 된다.

본 발명에 따른 상기 단계 4는 단계 3의 종료 후 러닝버퍼를 재주입하는 단계이다. 상기 러닝버퍼와 시료가 접합하면서, 러닝버퍼의 낮은 pH로 인하여 시료의 왼쪽 끝 부분이 양전하를 띠는 상태로 바뀌게 된다. 이에 따라 새로 주입된 러닝버퍼와 시료의 왼쪽 끝 부분인 양전기를 띠는 접합부가 전기장에 의해 (-)의 극으로 이동하게 되어 결국 시료의 왼쪽부분의 길이를 줄이게 된다.

본 발명에 따른 단계 5는 단계 4의 종료 후 전압을 인가하여 전기영동을 하면서 검출기를 통하여 시료를 검출하는 단계이다. 시료의 왼쪽 접합부는 양전하로 대전되어 음극으로 이동하고 음전하로 대전된 접합부는 양극으로 이동하면서 시료의 폭이 줄어들고 이와 동시에 전체 용매의 부피가 줄어듦에 따라 용매 안의 시료의 농도가 증가하여 검출기에 도착할 때에는 시료가 주입될 때보다 양에 비하여 상당히 좁은 범위에 모이므로 검출기에서 검출 시 강한 강도로 짧은 시간에 지나가게 된다. 이로써 검출강도를 향상시킬 수 있게 된다.

검출기는 종래 모세관 전기영동에서 사용될 수 있는 검출기이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 방법 적용시 주위에 다른 신호들이 사라지고 시료의 피크만 높게 검출됨을 알 수 있었다. 또한, 염기영역을 형성하지 않은 종래 방법으로 수행하여 측정한 값과 비교하여 보면, 사용 시료에 따라 달라지기는 하지만, 대략 15배(LE, DA) 및 83배(EN) 정도의 감도가 향상되었음을 알 수 있었다. 나아가 종래 방법에 비해 사용 시료의 양을 약 20배에서 100배 정도로 줄일 수 있음을 알 수 있었다(도 3 참조).

결론적으로, 류신 엔케팔린(LE)의 경우 1450배, 다이노르핀 A(DA)의 경우 1485배, 베타엔도르핀(EN)의 경우 1670배의 향상을 얻음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법 에 의해 모세관 전기영동 수행시 적은 농도로 향상된 감도 결과를 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 개선된 시료주입법(염기영역 형성)에 의한 모세관 전기영동(CE)

단계 1: 러닝버퍼의 주입

모세관 내의 전체 물질들이 전기적인 힘에 의해 (+)극의 주입구에서 (-)극의 측정부로 이동하게 될 주요 흐름을 형성하기 위하여, 모세관에 러닝버퍼(running buffer)로 pH 2.0의 1M의 포름산을 주입하였다(도 1의 단계 1 참조)

단계 2: 염기 영역의 형성

상기 단계 1의 러닝버퍼의 흐름을 멈춘 상태에서 pH 12.58의 1M 수산화암모늄(Ammonium hydroxide)을 유체역학적 방법(압력)으로 주입하여 시료의 흐름을 제어할 염기 영역(base zone)을 형성하게 하였다(도 1의 단계 2 참조).

단계 3: 측정하고자 하는 시료의 주입

상기 단계 2의 염기영역 형성 이후 측정하고자 하는 시료를 주입하였다. 본 실시예에서는 사람의 뇌활동과 관련이 있는 신경성 펩타이드(neuropeptide)인 류신 엔케팔린(Leucine Enkephalin; LE), 메티오닌 엔케팔린(Methionine Enkephalin; ME), 다이노르핀 A(Dynorphin A; DA) 및 베타 엔도르핀(Beta Endorphin; EN)을 각 각 사용하였다.

상기 시료는 사용 용매의 pH에 따라 시료의 전하량이 바뀌는 물질로서, 그 특성에 의해 단계 2에서 먼저 주입된 염기 영역 부분과 접합하는 시료의 가장 오른쪽 끝 부분이 염기 영역 부분의 높은 pH에 의해 그 성질이 음전기를 띠는 상태로 바뀌게 된다. 결국 (+)극과 (-)극 사이의 전기장에 의해 음전기를 띠고 있는 염기 영역과 시료의 오른쪽 끝 부분인 음전기를 띠는 접합부가 (+)극으로 동시에 이동하며 시료의 주입된 길이를 줄여 시료들이 있는 영역이 점점 작아지며 시료가 모이게 된다(도 1의 단계 3 참조).

단계 4: 러닝버퍼의 재주입

시료 주입 후 러닝버퍼(running buffer)인 포름산을 재주입하였다.

상기 러닝버퍼의 주입으로 시료와 재주입된 러닝버퍼의 접합부에서, 러닝버퍼의 낮은 pH로 인하여 시료가 양전하를 띠게 된다. 이에 따라 새로 주입된 러닝버퍼와 시료의 가장 왼쪽의 양으로 대전된 러닝버퍼와의 접합부가 전기장에 의해 (-)의 극으로 이동하게 되며 시료의 왼쪽부분의 길이를 줄이게 된다(도 1의 단계 4 참조).

단계 5: 시료의 검출

상기 단계 4 이후 검출기(detector: UV Diode array detector)를 이용하여 시료를 검출하였다.

상기 단계 4를 통해, 시료의 왼쪽 접합부는 양전하로 대전되어 음극으로 이동하고 음전하로 대전된 접합부는 양극으로 이동하면서 시료의 폭이 줄어든다. 이와 동시에 전체 용매의 부피가 줄어듦에 따라 용매 안의 시료의 농도가 증가하여 검출기에 도착할 때에는 시료가 주입될 때보다 양에 비하여 상당히 좁은 범위에 모이므로 검출기에서 검출 시 강한 강도로 짧은 시간에 지나가게 된다. 이로써 검출강도를 향상시킬 수 있게 된다.

비교예 1: 염기 영역을 형성하지 않은 상태에서의 모세관 전기영동

본 발명의 실시예의 효율성을 비교하기 위하여, 상기 실시예 1에 있어서, 단계 2의 염기영역을 형성하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 모세관 전기영동을 수행하였다(비교예).

실험예 1: 사용한 시료의 용매 pH 에 따른 전하량 변화 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 사용한 시료들을 대상으로 용매 pH에 따른 전하 변하를 살펴보았다.

측정결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 이들의 각각의 등전하점(isoelectric point: pI)은 LE가 5.50, ME이 5.50, DA가 11.69, EN이 9.60으로 다양한 분포를 가지고 있었으며, LE와 ME는 비슷한 양상을 나타내었다. 이러한 측정결과로부터 pH에 따른 신경성 펩타이드의 전하량 변화를 알 수 있었다.

실험예 2: 실시예 1과 비교예 1에 따른 시료 검출 감도 비교 측정

실시예 1과 비교예 1의 방법에 의한 시료 검출 감도를 비교하여 보았다. 측정시료는 LE, DA 및 EN을 이용하였고, 상기 시료의 농도는 도 3에 표시한 농도로 수행하였다. 상기 펩타이드를 녹이기 위한 용매로는 pH 10.0의 50% 아세토니트릴을 사용했으며, 러닝버퍼로는 pH 2.0의 1M의 포름산을 사용했고, 염기영역 형성을 위한 염기로는 수산화암모늄(Ammonium hydroxide)을 사용하였다.

측정결과는 도 3에 나타내었다. 모세관 전기영동 장치에 작동하는 프로그램의 그래프 특성상 그래프에 y축은 절대강도가 아니라 상대 강도로서, 측정할 때 가장 강하게 측정되는 것을 100으로 보고 나머지의 강도를 표현한 것이다. 따라서 비교예와 실시예 그래프의 y축의 최대 강도가 모두 100으로 묘사되어 있으며, 절대 강도를 표현하기 위해 각각의 그림 옆에 절대적인 강도를 표시하였다.

도 3의 비교예 그래프에서 시료의 피크가 높게 검출이 되기는 하나, 주위에 다른 신호들도 잡힘을 알 수 있었다. 따라서 염기영역을 형성하지 않는 경우 시료만을 높은 강도로 검출 할 수 없음을 알 수 있다.

이에 반하여, 도 3의 실시예 그래프에서 염기영역를 이용하면 주위에 다른 신호들이 사라지고 시료의 피크만 높게 검출됨을 알 수 있었다. 한편, 도 3의 실시예 그래프에서 측정된 값을 비교예 그래프에서 측정된 값과 비교하여보면 대략 15배(LE, DA) 및 83배(EN) 정도의 감도가 향상되었음을 알 수 있었다. 또한 각 실험에 사용된 시료의 양이 비교예보다 실시예에서 약 20배에서 100배(LE와 DA의 경우 100㎕/㎖에서 1㎕/㎖, EN의 경우 500㎕/㎖에서 25㎕/㎖) 정도의 적은 농도가 사용됨을 알 수 있다.

상기 결과를 하기 수식과 같이 기존 실험에서의 실험결과의 감도(I₀)와 개선된 실험에서의 강도(I)의 비 또한 기존 실험에 사용된 시료의 농도(M₀)와 개선된 실험에서 사용된 시료의 농도(M)의 비에 곱으로 정의되는 국제적으로 지표인 Sensitivity enhancement factor(SEF_height)의 정의를 따라 개선된 방법의 향상 정도를 수치화해보았다.

SEF_height = (I/I₀)×(M/M₀)

이에 따르면 LE의 경우 1450배, DA의 경우 1485배, EN의 경우 1670배의 향상을 얻음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 모세관 전기영동 수행시 적은 농도로도 향상된 감도 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에 의한 모세관 전기영동 감도 향상 방법을 단계별로 개략적으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 사용한 LE, ME, DA 및 EN 시료의 용매 pH에 따른 전하 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 비교예(염기 영역 형성하지 않은 것)와 실시예(염기 영역 형성)에 의한 검출 분석 결과를 비교한 것이다.

Claims

모세관 전기영동에 있어서,

모세관에 러닝버퍼를 주입하는 단계(단계 1);

상기 러닝버퍼 주입 후 pH 11.0 내지 13.0의 염기를 주입하여 염기 영역을 형성하는 단계(단계 2);

상기 염기영역이 형성된 후 측정하고자 하는 시료를 주입하는 단계(단계 3);

상기 시료 주입 후 단계 1의 러닝버퍼를 재주입하는 단계(단계 4); 및

상기 단계 1 내지 단계 4를 통해 스태킹된 시료를 검출하는 단계(단계 5)를 포함하는 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1의 러닝버퍼는 포름산과 같은 유기산군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2의 염기는 수산화 암모늄과 같은 염기군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3의 시료는 시료가 용해되는 용매의 pH에 따라 전하량이 변하는 시료인 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법.
제1항에 있어서, 상기 모세관 전기영동의 검출 감도 향상은 (+)극과 (-)극 사이의 전기장에 의해 염기영역은 (+)극으로 이동하고, 재주입된 산성도가 낮은 러닝버퍼는 (-)극으로 이동하여 모세관 내에서 주입된 시료의 폭을 줄임으로써 시료의 농도를 증가시켜 검출감도를 향상시키는 것을 특징으로 하는 개선된 시료 주입법을 이용한 모세관 전기영동의 검출 감도 향상 방법.