KR100970195B1 - In vitro micro-organs, and uses in related thereto - Google Patents

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에두아르도 엔. 미트라니
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이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘
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본 발명은 특이적 특징이 있는 분리된 세포 집단을 포함하는 미세기관 배양물을 기술한다. The present invention describes a micro-organ culture comprising a population of cells separated with specific characteristics. 본 발명의 미세기관 배양물의 주요 특징은 비교적 오랜 기간 동안 배양물에 유지되는 능력은 물론, 원료 기관에서 나타나는 것과 유사한 세포-세포 상호작용 및 세포-간질 상호작용 등을 용이하게 하는 기관 미세구조의 보존을 포함한다. The main features of the micro-organ cultures of the present invention is a relatively long-term ability to be maintained in culture as well as, similar to that found in raw organs cell-cell interaction and cell-preservation of organs microstructure that facilitates stromal interactions It includes. 본 발명의 미세기관 배양물은 피검 수용체로의 유전자 산물의 전달 방법, 세포 증식제 및 세포 분화제 동정 방법 및 선조 세포와 줄기 세포의 동정 및 분리 방법에 사용할 수 있다. The micro-organ cultures of the present invention may be used for the gene product of the circuit under test receptor delivery method, the cell proliferation and cell minutes topic identification method and progenitor cells and the identification and isolation of stem cells methods. 또한, 본 발명의 미세기관 배양물은 세포 증식, 세포 분화 및 바이러스 감염성에 대한 억제제를 동정하는 방법에 사용할 수 있다. Further, the micro-organ cultures of the present invention can be used in methods for identifying inhibitors of cell proliferation, cell differentiation and viral infectivity. 다른 양태로서, 본 발명의 미세기관 배양물은 이식에 사용할 수 있다. In another aspect, the micro-organ cultures of the present invention can be used for transplantation.
미세기관 배양물, 체외이식편, 세포증식제, 세포분화제, 선조세포, 줄기세포, 이식 Micro-organ cultures, explants, cell proliferative agents, cell minutes agents, progenitor cells, stem cell transplantation

Description

시험관내 미세기관 및 이에 관련된 용도{IN VITRO MICRO-ORGANS, AND USES IN RELATED THERETO} In vitro micro-organ and related purposes {IN VITRO MICRO-ORGANS, AND USES IN RELATED THERETO}

본 발명은 시험관내 미세기관 및 이 에 관련된 용도에 관한 것이다. The present invention relates to an in vitro micro-organ and application related to this.

진핵세포 배양물이 최초로 수득된 것은 1950년대 초였다. It was early 1950's a eukaryotic cell cultures were first obtained. 그 이후로, 각종 형질전환 세포 및 원시 세포가 각종 배지와 규정 보충물, 예컨대 성장 인자 및 호르몬 등과 미규정 보충물, 예컨대 혈청 및 기타 다른 체내 추출물을 이용하여 배양되었다. Since then, various transformants was cultured transformed cells and native cells using a non-defined supplements, such as sera and other body extract as various kinds of media and defined supplements, such as growth factors and hormones. 예를 들어, 동물의 피부에서 수득한 섬유아세포는 핵형적으로 이배체인 세포로서 다양한 세포 세대를 통해 관례적 방식으로 배양하거나 또는 확립된 세포주로서 관례적 방식으로 무한 배양할 수 있다. For example, the fibroblasts obtained from the skin of the animal may be a a a a a nucleating ever diploid cells through a variety of cell generations in culture customary way or established cell line cultures to infinity by customary methods. 하지만, 상피세포는 섬유아세포와 다른 형태적 성질과 증식성을 보유하여 배양하기가 더 어렵다. However, the epithelial cells are more difficult to culture and have the fibroblasts and other morphological and proliferative properties. 더욱이, 상피세포와 섬유아세포를 동일 배양물에서 증식시키면, 일반적으로 상피세포는 섬유아세포에 비해 과증식한다. Furthermore, when the growth of epithelial cells and fibroblast cells in the same culture, the epithelial cells are generally hyperproliferative compared to fibroblasts.

2차원적 세포 증식은 높은 세포 증식율을 제공하여 배양물 상태로 세포를 준비, 관찰 및 연구하기에 편리한 방법이지만, 생체내 전체 조직의 특징적인 세포-세포 및 세포-간질 상호작용을 알 수는 없다. There is no known epilepsy interaction-cell and cell-two-dimensional cell proliferation characteristic of cells, but a convenient way to provide the preparation, observing and studying cells in the culture conditions to high cell jeungsikyul vivo whole tissue .

이러한 기능적, 형태적 상호작용 연구를 위해 몇몇 연구자들은 콜라겐 겔(Douglas et al., (1980) In Vitro 16:306-312; Yang et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3401; Yang et al. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci. 77:2088-2092; Yang et al.,(1981) Cancer Res. 41:1021-1027); For such functional and morphological interactions studies Some researchers collagen gel (Douglas et al, (1980) In Vitro 16:...... 306-312; Yang et al, (1979) Proc Natl Acad Sci 76: .. 3401; Yang et al (1980) Proc.Natl.Acad.Sci 77: 2088-2092; Yang et al, (1981) Cancer Res 41:.. 1021-1027); 셀룰로스 스폰지 단독형(Leighton et al.,(1951) J. Natl. Cancer Inst. 12:545-561) 또는 콜라겐 코팅형(Leighton et al.,(1968) Cancer Res. 28:286-296); Cellulose sponge, alone type (... Leighton et al, (1951) J. Natl Cancer Inst 12: 545-561) or collagen coated (Leighton et al, (1968) Cancer Res 28: 286-296..); 젤라틴 스폰지, 젤폼형(Sorour et al.,(1975) J.Neurosurg. 43:742-749)과 같은 3차원 기재를 이용하였다. Gelatin sponge, gel pomhyeong: were used for the three-dimensional substrate, such as (Sorour et al, (1975) J.Neurosurg 43.. 742-749).

상피세포를 컴피턴트 클론화 방식으로 증식시키기 위하여 각종 배양 조건을 이용하였다. Various culture conditions were used in order to proliferate the epithelial cells into competent cloned manner. 예를 들어, 상피세포, 구체적으로 피부 상피세포(각질세포)를 치사량의 광조사된 섬유아세포의 영양세포층(Rheinhardt et al. (1975) Cell 6:331-343) 및 반합성 콜라겐 기질(미국 특허 제5,282,859호; 유럽 특허출원번호 0361957) 상에서 배양하였다. For example, epithelial cells, specifically, a feeder layer of irradiated fibroblasts light lethal dose of skin epithelial cells (keratinocytes) (Rheinhardt et al (1975) Cell 6:. 331-343), and semi-synthetic collagen matrix (U.S. Patent No. No. 5,282,859; and incubated on European Patent Application No. 0361957). 몇몇 경우에는 이와 같은 세포의 증식에 사용된 배지에 뇌하수체 추출물과 혈청 등의 생물학적 추출물 및 상피세포 성장 인자, 인슐린 등의 성장 보충물 등을 첨가하여 사용하기도 하였다(Boisseau et al.(1992) J. Dermatol. Sci 3(2): 111-120; 미국 특허 제5,292,655호). In some cases, was also used in this way in the medium used for growth of such cells was added to pituitary extracts and biological extract and epidermal growth factor in the serum, etc., such as insulin, growth supplements, such as (Boisseau et al. (1992) J. . Dermatol Sci 3 (2): 111-120; U.S. Patent No. 5,292,655).

시험관내에서 피부를 증식시키기 위하여 수많은 시도가 수행되었다. Numerous attempts were performed in order to multiply the skin in vitro. 이와 같은 시도들은 일반적으로 상피에 있는 각질세포를 진피에 있는 섬유아세포 및 지방세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. These attempts typically include the step of separating the keratinocytes in the epidermal from fibroblasts and fat cells in the dermis. 분리 후, 각질세포는 일반적으로 층화된 상피를 형성시키는 방식으로 증식시킨다. After separation, the keratinocyte proliferation in a manner that forms a generally stratified epithelium. 하지만, 이와 같은 방식으로 제조된 상 피에는 모낭과 땀샘이 없다. However, there are no hair follicles and sweat glands of the blood prepared in this way. 더욱이 이 세포 배양물에는 상피와 진피 사이의 자연적인 관계가 보존되지 않는다. Moreover, it is not preserved the natural relationship between the cell culture, the dermis and epithelium. 또한, 비생육성 섬유아세포 상에서 각질세포를 증식시키는 방법(Rheinwald wt al.(1975) Cell 6:331-343) 또는 합성된 것이거나 진피와는 다른 근원에서 유래한, 콜라겐과 섬유아세포의 피부 기질 상에 각질세포를 제공하는 방법(Sugihara et al.(1991) Cell.Dev.Biol. 27:142-146; Parenteau et al. (1991) J. Cell Biochem. 45(3): 245-251) 등의 배양 방법들도 수행되었다. In addition, a method of proliferating keratinocytes on bisaeng growing fibroblasts (Rheinwald wt al (1975) Cell 6:. 331-343), or synthetic, or to the dermis and is the one, collagen and skin matrix of fibroblasts derived from different sources a method of providing a keratinocyte:;: such as (Sugihara et al (1991) Cell.Dev.Biol 27.. 245-251 142-146 Parenteau et al (1991) J. cell Biochem 45 (3)..) the culture method was performed. 그러나, 몇몇 경우에는 각질세포 분리가 수행되지 않고 전체 기관이 배양되었다. However, the entire organization was cultured in some cases, not performing the keratinocyte isolation. 기관을 시험관내 배양하는 시도는 혈청함유 배지에서 기관을 배양한 경우만 있었다(Li et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. 88(5):108-112). Attempt to culture in vitro the engine was only when the culturing organ in serum-containing medium (Li et al (1991) Proc.Natl.Acad.Sci 88 (5):.. 108-112).

진피의 시험관내 모델에 존재하는 대부분의 진피에는 모낭, 땀샘 및 피지샘이 없다(상피세포 배양물 검토를 위해 Coulomb et al.(1992) Pathol.Biol.Paris 40(2): 139-146). Most of the dermis present in the in vitro model of the dermis, there is no hair follicles, sweat glands and sebaceous glands (for epithelial cell cultures review Coulomb et al (1992) Pathol.Biol.Paris 40 (2):. 139-146). 예외적으로, 2x5㎟ 및 2.0mm 두께의 크기를 가진 피부 체외이식편이 혈청 함유 배지의 존재하에 수일 동안 생육성을 유지한 겔-지지성 피부 모델이 제시된바 있다(Li et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:8764-8768). There is shown a bar-supporting skin model (Li et al (1992) Proc - exceptionally, 2x5㎟ and 2.0mm skin explants in serum-containing maintaining the viability for several days in the presence of a gel medium having a size of thickness. .. Natl Acad Sci 89:. 8764-8768).

생물반응기 및 기타 다른 포유동물 세포 배양 방법은 세포 손상의 단점 외에도 세포를 본래 유기체에 존재하는 실제 조직의 공간적 3차원 형태와 유사한 조직으로 조합할 수 있는 조건을 마련하기 위한 능력 부족으로 인해 매우 제한적이었다. Bioreactors, and any other mammalian cell culture method has been very limited due to the inability to establish the conditions for addition to the drawbacks of cell damage, be combined in tissue similar to the cells and the spatial three-dimensional form of actual tissues present in the original organism . 이와 같은 이유로, 종래의 조직 배양 방법은 배양된 조직을 포유동물 세포 분화에 중요 요소로 사료되는 기능적으로 고도 세분화되거나 분화된 상태로 발현시키는 능력 및 연구중이며 약학적 당해 물질인 세분화된 생물학적 활성 분자의 분비 등에 한계가 있다. For this reason, in conventional tissue culture method are further expressing in a highly granular or differentiate into which feed the cultured tissue in mammals is important factors in animal cell differentiation functional status capability and research pharmaceutically the materials of fine-grained, biologically active molecules there is a limit such secretion. 미생물과 달리 포유동물과 같은 고등 유기체의 세포는 스스로 고차원의 다세포 조직을 형성한다. Cells of higher organisms, such as mammals, unlike microorganisms are themselves formed a high level of multicellular organization. 이와 같은 자가조립의 정확한 기작은 알려져 있지 않지만, 지금까지 연구된 실례를 보면, 세포의 조직으로의 발달이 세포의 서로(동종 세포 또는 이종 세포)에 대한 배향 또는 다른 고착 기질에 대한 세포의 배향 및/또는 특정 물질(인자), 예컨대 호르몬, 자가분비인자 또는 주변분비인자 등의 존재 또는 부재에 따라 달라지는 것을 알 수 있었다. Such self exact mechanism of the assembly is not known, look at the examples studies to date, the orientation of the cells for orientation or other fixed substrate for the development of in the tissues together (allogeneic cells or heterologous cells) of the cell and / or has been found that certain substances (factors) such that depend on the presence or absence of hormone, autocrine factor or paracrine factor. 이를 요약해보면, 충분히 낮은 전단응력, 충분한 3차원 공간 자유도 및 생체내 조직 구조의 훌륭한 모델링을 허용하기에 충분히 긴 중요 세포 상호작용(세포 상호간 또는 세포와 기질간) 기간을 동시에 달성할 수 있는 종래의 배양 방법은 없다. In summary this end, the prior art can achieve a period sufficiently low shear stress, sufficient 3-dimensional spatial freedom, and in vivo tissue long enough important cellular interactions to allow for fine modeling of the structure (cells or between cells and between the substrate) at the same time there is no way of cultivation.

따라서, 배양물의 세포가 그들 본래의 세포간 관계를 오랜 시간 동안 보존하는 배양물에서 기관 일부를 발생 및 유지시키는 시험관내 방법이 요구된다. Thus, the in vitro method for the generation of water culture cells and maintaining the engine in some cultures to preserve the relationship between the original their cells for a long time is required. 이와 같이 세포 분화, 세포 증식 및 세포 기능이 생체내 전체 기관에서 관찰되는 것과 유사한 조직 및 기관 모델의 이용가능성은 기관이 건강한 상태로 유지되는 기작과 이에 따라 비정상적 과정이 복원될 수 있는 방법을 이해하는데 유용하게 사용될 것이다. Availability of this as differentiated cells, cell growth and cell function is similar to that observed in vivo entire organ tissues and organs models to understand how you can be a mechanism and thus an abnormal process in which organizations maintain healthy recovery It would be useful.

본 발명은 전술한 요구를 해결하는 시험관내 미세기관 배양물(in-vitro micro-organ culture)을 제공한다. The present invention provides a test to solve the foregoing needs in vitro micro-organ culture (in-vitro micro-organ culture). 대상 미세기관 배양물의 주요 특징으로는 비교적 오랜 시간, 예컨대 적어도 약 24시간, 바람직하게는 적어도 7일 이상 동안 배양물에서 유지되는 능력은 물론, 근원 기관에서 나타나는 것과 유사한 세포-세포 상호작용 및 세포-간질 상호작용 등을 용이하게 하는 기관 미세구조의 보존을 포함한다. Subject the main features of the micro-organ culture has a relatively long time, for example at least about 24 hours, preferably at least capable of being maintained in culture for at least 7 days, of course, similar to that found in the source organ cell-cell interaction and cell- include the preservation of organs microstructure that facilitates stromal interactions.

일반적으로, 미세기관 배양물의 세포 집단 중에서 적어도 하나의 세포는 증식성을 가진 것이다. In general, at least one of the cells in micro-organ cultures of water population of cells will have a proliferative. 미세기관 배양물에 존재하는 세포 집단은 전체적으로 평형 상태, 즉 세포 집단 내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 대략 1이거나, 또는 미세기관 배양물 중의 세포가 소실되는 것보다 더 빠른 속도로 증식하여, 즉 예컨대 종양 조직에서 수득되는 세포 집단이나 체외이식편에서 증식하도록 유도된 선조 세포 집단에서와 같이 세포 집단내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1을 초과하는 것일 수 있다. Population of cells present in the micro-organ cultures in the whole state of equilibrium, i.e., proliferation rate faster than the population of cells within or ratio of approximately one-cell proliferation to cell loss, or where the micro-organ cells in the culture chamber, or for example, it may be in excess of the ratio of cell proliferation to cell loss in the population of cells, such as progenitor cells in the population to induce cell proliferation in the group or explants obtained from tumor tissue.

미세기관 배양물의 세포를 분리할 수 있는 바람직한 기관으로는 림프성 기관, 예컨대 흉선 및 비장; The preferred agency for releasing the micro-organ cultures of water cells are lymphoid organs, e.g., thymus and spleen; 소화관 기관, 예컨대 위, 간, 췌장, 담낭 및 담관; Digestive tract organs, e.g., stomach, liver, pancreas, gallbladder and bile duct; 폐; lungs; 생식 기관, 예컨대 전립선 및 자궁; Reproductive organs, e.g., prostate and uterus; 유방, 예컨대 유선; Breast, e.g., mammary gland; 피부; skin; 요로기관, 예컨대 방광 및 신장; Urinary tract organs, e.g., bladder and kidney; 각막; cornea; 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등이 있다. And bone marrow, etc. There is a blood-related organizations. 미세기관 배양물의 분리된 세포 집단은 일 구체예에서는 중합체 장치, 예컨대 세포 또는 세포 산물, 예컨대 유전자 산물을 대상에게 전달하기 위한 장치에 캡슐화할 수 있다. Micro-organ cultures of water the separated cell population is in one embodiment can be encapsulated in the polymeric device, for example, cells or cell products, such as devices for delivering a gene product to a subject. 또한, 본 발명은 본 발명의 미세기관 배양물 유래의 합성 배지에 관한 것이다. The present invention also relates to a synthetic medium of a micro-organ cultures derived from the present invention.

본 발명의 일 구체예에서, 미세기관 배양물은 기관의 절편인 세포의 집단을 포함한다. In one embodiment of the invention, the micro-organ culture includes a population of fragments of the engine cells. 바람직하게는, 미세기관 체외이식편은 상피 및 결합조직 세포를 포함한다. Preferably, the micro-organ explant includes epithelial and connective tissue cells. 본 발명의 일 구체예에서, 기관 체외이식편은 췌장에서 수득한 것으로, 예를 들어 세포 집단의 미세구조는 체외이식편이 유래하는 본래 췌장의 미세구조와 거의 동일하며, 췌장의 상피세포, 예컨대 섬세포 및 췌장의 결합조직 세포를 포함한다. In one embodiment of the invention, the organ explant is to be obtained in the pancreas, e.g., the microstructure of the cell population are almost the same as the microarchitecture of the original pancreas which the explants derived from the pancreas epithelial cells, for example islet and and a combination of the pancreas tissue cells.

본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 체외이식편은 피부에서 수득한 것으로서, 예를 들어 세포 집단의 미세구조는 생체내 피부의 미세구조와 거의 동일하며, 피부 상피세포, 예컨대 표피세포와 피부 결합조직 세포, 예컨대 피부 세포를 포함한다. In another embodiment of the invention, the micro-organ explant is as obtained in the skin, such as cell microstructure of the group are almost the same as the microstructure of the inside skin in vivo, skin epithelial cells, such as epidermal cells, and skin connective tissue cells include, for example, the skin cells. 피부 체외이식편에서 수득되는 미세기관 배양물은 또한 표피 세포를 지지하는 바닥판, 피부 세포를 포함하는 세포외기질 및 적어도 하나의 함입, 예컨대 적어도 하나의 모낭 또는 샘을 포함할 수 있다. Micro-organ explant is obtained from skin cultures it may also include a bottom plate, the outer cells including skin cells and at least one substrate of the constriction, such as at least one hair follicle or spring that supports the epidermis.

본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 배양물은 바이러스, 예컨대 간염바이러스, 구체적으로 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 또는 인간 유두종 바이러스(HPV), 예컨대 HPV-6, HPV-8 또는 HPV-33으로 감염된 세포의 분리된 집단을 포함한다. In another embodiment of the invention, the micro-organ cultures of the virus, such as hepatitis viruses, in particular hepatitis B or hepatitis C virus or human papilloma virus (HPV), e.g., HPV-6, HPV-8, or HPV-33 include a separate group of infected cells. 바이러스 감염시, 미세기관 배양물은 바이러스 감염성의 억제제를 동정하는 방법에 사용할 수 있다. When virus infection, the micro-organ culture can be used in the method for identifying an inhibitor of viral infectivity. 이 방법은 본 발명의 방법에 따라 미세기관 체외이식편을 분리하는 단계를 포함하는데, 여기에서 체외이식편은 바이러스 감염 기관에서 분리 되는 것이거나 또는 시험관내에서 바이러스로 후속적으로 감염되어 바이러스 감염 세포의 집단을 생성하는 것이다. The method comprises the step of separating the micro-organ explant according to the method of the present invention, are herein explants are infected in it or in vitro are isolated from virus-infected organ as a virus and subsequently groups of the virus-infected cells to generate a. 이 체외이식편은 그 다음 후보 제제, 예컨대 항바이러스 활성을 시험하기 위한 제제와 접촉시키고, 이 후보 제제의 존재하에 나타나는 감염성 레벨(예컨대 바이러스 장입량, 신규 감염성 등)을 측정한 뒤 상기 후보 제제의 부재하에 바이러스에 의해 나타나는 감염성 레벨과 비교한다. The explant is under the next candidate agents such as antiviral contact with the agent for testing the activity and the absence of the candidate infectious level appears in the presence of an agent after measuring (e.g. virus jangipryang, new infectivity, etc) wherein the candidate agent It compares the level represented by the infectious virus. 후보 제제의 존재하에 나타나는 바이러스 감염성 레벨의 감소는 바이러스 감염성의 억제제임을 시사하는 것이다. Reduction in virus infectivity level appears in the presence of the candidate agent is to suggest that the infectivity of the virus inhibitor.

또한, 본 발명은 미세기관 배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a method for producing a micro-organ culture. 이 방법은 포유동물 다른 공여자로부터, 적어도 약 24시간 동안 최소 배지에서 유지가능한 것으로서 분리된 세포 집단을 제공하는 크기를 보유한 미세기관 체외이식편을 분리하는 단계를 포함한다. The method comprises the steps of separating mammalian micro-organ explant from different donors, have a size to provide a population of cells separated as possible held in a minimal medium for at least about 24 hours. 그 다음 이 미세기관 체외이식편을 배양물에 주입한다. Then this is injected into the micro-organ explant in the culture. 일반적으로, 상기 체외이식편은 이 체외이식편이 분리된 기관의 미세구조를 보유한 분리된 세포 집단을 포함한다. In general, the explant includes an isolated population of cells held by the microstructure of the isolated organ is explant. 본 발명의 일 구체예에서, 체외이식편의 적어도 하나의 세포는 증식성이 있는 것이다. In one embodiment of the invention, at least one cell of the explant will have proliferative. 본 발명의 미세기관 배양물의 세포는 평형 상태, 즉 세포 집단 내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1이거나, 또는 미세기관 배양물 중의 세포가 소실되는 것보다 더 빠른 속도로 증식하여, 즉 종양 조직에서 수득한 세포 집단 등과 같이 세포 집단내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1을 초과하는 것일 수 있다. Micro-organ cultures of water cell of the invention is the equilibrium state, that is, the population of cells in or a ratio of cell proliferation to cell loss, or a micro-organ cultures to proliferate at a faster rate than in water the cells are destroyed, that is, in the tumor tissue, such as a population of cells obtained may be greater than the ratio of cell proliferation to cell loss in the population of cells.

미세기관 배양물의 세포를 분리할 수 있는 바람직한 기관으로는 림프성 기관, 예컨대 흉선 및 비장; The preferred agency for releasing the micro-organ cultures of water cells are lymphoid organs, e.g., thymus and spleen; 소화관 기관, 예컨대 위, 간, 췌장, 담낭 및 담관; Digestive tract organs, e.g., stomach, liver, pancreas, gallbladder and bile duct; 폐; lungs; 생식 기관, 예컨대 전립선 및 자궁; Reproductive organs, e.g., prostate and uterus; 유방; breast; 피부; skin; 요로기관, 예컨대 방광; Urinary tract organs, e.g., bladder; 신장; kidney; 각막; cornea; 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등이 있다. And bone marrow, etc. There is a blood-related organizations. 이러한 예들에서, 기관의 미세구조는 배양된 체외이식편에서 모두 유지되어야 한다. In such instances, the microstructure of organs are to be maintained both in cultured explants. 이러한 미세기관 배양물은 조직 절편, 예컨대 β섬세포를 포함하는 췌장 조직 절편, 표피 및 진피 세포와 다른 피부 특이적 구조 특징, 예컨대 모낭을 포함하는 피부 조직 절편일 수 있다. These micro-organ culture can be a tissue section, for example skin tissue section which includes the pancreatic tissue sections, the skin and dermal cells and other skin-specific structural features, such as hair follicle, including the β islet.

미세기관 체외이식편에 존재하는 세포는 또한 이 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 발현되거나 발현되지 않을 수 있는 재조합 단백질을 발현하도록 변형시킬 수 있다. The micro-organ cells in the explant can also be modified to express a recombinant protein that the explant is not normally expressed, or expressed in the originating organization. 예를 들어, 췌장에 의해 정상적으로 생산되고 본 유전자도입(transgenic) 방법에 의해 증대(예컨대 결핍증을 보충하기 위함)될 수 있는 유전자 산물로는 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A 2 , 엘라스타제, 아밀라제 등이 있고, 간에서 일반적으로 생산되고 대체 유전자 요법에 의해 보충될 수 있는 유전자 산물로는 혈액 응고 인자, 예컨대 혈액 응고 인자 VIII 및 IX, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소 등이 있고, 흉선에 의해 일반적으로 생산되는 유전자 산물로는 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1이 있다. For example, it is normally produced by the pancreas introducing the gene (transgenic) increased by a method in a gene product which may be (for example, intended to compensate for deficiency) is insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsin trip Sino by Hagen, carboxy peptidase, ribonuclease, deoxy ribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase a 2, elastase, amylase, etc., and is usually produced in the liver replacement gene therapy a gene product, which can be supplement has a blood clotting factor, e.g., blood coagulation factors VIII and IX, UDP-glucuronic a carbonyl trans-flops cyclase, ornithine trans carbamoyl cyclase, cytochrome p450 enzymes, usually by the thymus a gene product that is produced has a serum thymic factor, thymic factor solution, this tie blanket tin, tie thymosin α1.

본 발명의 미세기관 배양물은 다른 수용자에게 유전자 산물을 전달하는 방법에 사용할 수 있다. The micro-organ cultures of the present invention can be used in method of delivering a gene product to a different recipient. 이 방법은 공여자로부터, 세포가 분리되는 기관이나 조직의 미세구조를 보유하고 적어도 약 24시간 이상 동안 최소 배지에서 유지가능한 분리된 세포 집단을 제공하는 표면적 대 부피를 보유한 분리된 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다. The method comprises the steps of holding a fine structure of the organ or tissue is from a donor, the cells are separated to give the separated cell population have a surface area to volume which provides sustainable discrete population of cells in a minimal medium for at least about 24 hours It includes. 그 다음, 이 세포 집단에는 미세기관 체외이식편에서 트랜스제닉 세포 집단, 예컨대 트랜스제닉 체외이식편을 생성시키기 위하여 목적 유전자 산물을 코딩하고 발현 유도하는 재조합 핵산을 도입시킨다. Then, the cell population is then introduced into the recombinant nucleic acid encoding a desired gene product and induced expression in order to generate a transgenic cell population, e.g., a transgenic explant from the micro-organ explant. 그 후, 이 트랜스제닉 체외이식편을 수용자에게 투여할 수 있다. After that, it can be administered to the transgenic explants prisoners. 공여자와 수용자는 동종이거나 이종일 수 있다. Donor and recipient can be homogeneous or yijongil.

본 발명의 미세기관 배양물은 또한 소정 기관의 세포, 예컨대 선조 세포의 증식을 유도하는 제제를 동정하는 방법에 사용할 수도 있다. The micro-organ cultures of the present invention may also be used for the predetermined organ cells, for example, a method for identifying agents which induce proliferation of progenitor cells. 이 방법은 본 발명에 따라서 증식력이 있는 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세기관 체외이식편 배양물을 생산하는 단계를 포함한다. The method according to the present invention comprises the steps of jeungsikryeok the production of at least one micro-organ explant comprising the cell culture with. 이 체외이식편은 배양 후 후보 화합물, 예컨대 세포 증식능을 시험할 화합물과 접촉시킨 다음, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨을 측정한다. The explant is brought into contact with the compound to test the candidate compound after the culture, for example, cell proliferation is measured, and then, the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound. 그 다음 후보 화합물의 부재하에 측정한 세포 증식의 레벨을 후보 화합물의 존재하에 측정한 세포 증식의 레벨과 비교한다. Then it compares the level of cell proliferation measured in the absence of the candidate compound with the level of cell proliferation, measuring the presence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 나타나는 세포 증식 레벨의 증가는 세포증식제임을 시사한다. Cell proliferation increased in level appears in the presence of the candidate compound suggest that cell proliferation James. 세포 증식 억제제도 이와 같은 방식으로 동정할 수 있다. Cell proliferation inhibitors also can be identified in this way. 구체적으로, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 측정된 레벨을 전술한 방법에 따라 측정한 경우, 후보 화합물의 부재하에 세포 증식의 레벨과 비교할 수 있다. Specifically, when measured according to the method described above in the presence of the candidate compound on the measured level of cell proliferation, it can be compared to the level of cell proliferation in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨의 감소는 세포증식 억제제임을 시사한다. In the presence of the candidate compound reduces cell proliferation levels, suggesting that the cell growth inhibitor.

본 발명의 미세기관 배양물을 사용할 수 있는 다른 방법으로는, 소정 기관에 존재하는 1종 이상의 세포 분화를 유도 또는 억제하는 제제, 또는 특정의 분화 상태를 유지(탈분화 방지)하는 제제를 동정하는 방법이 있다. Another way to use the micro-organ cultures of the present invention includes a method of identifying agents that induce or inhibit one or more cellular differentiation present in certain organs, or maintaining a particular differentiation state of the (prevent dedifferentiation) preparation there is. 이 방법은 당해 기관으로부터 미세기관 체외이식편을 제조하는 단계를 포함하며, 이때 체외이식편을 구성하는 세포 집단은 하기 기술되는 바와 같은 상기 기관의 미세구조, 약 1.5mm -1 이상의 알레프를 보유하고, 분화하는 능력을 보유하거나 또는 분화 상태로서 탈분화하는 능력을 보유한 적어도 하나의 세포를 포함한다. The method includes the step of producing a micro-organ explant from that Authority, where the population of cells that make up the explant are have a fine structure, Aleph of at least about 1.5mm -1 of the engine, as described below, the differentiation as retention or the ability to differentiate the status includes at least one of the cells have the ability to dedifferentiation. 배양 상태가 된 즉시 세포 집단은 후보 화합물과 접촉시키고 이 화합물의 존재하에 세포 분화 레벨을 측정한다. The incubation conditions as soon as the cell population measures the level of cell differentiation in the presence of the compound is contacted with a candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 측정된 세포 분화 레벨을 후보 화합물의 부재하에 측정된 세포 분화 레벨과 비교한다. It compares the measured level of cell differentiation in the presence of the candidate compound and cells differentiated levels measured in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 나타나는 세포 분화 레벨의 증가는 세포분화제임을 시사하는 것이다. Cell increase in differentiation level appears in the presence of the candidate compound is to suggest that the cells minutes agent. 세포 분화 억제제도 이와 같은 방식으로 동정할 수 있다. Cell differentiation inhibitors also can be identified in this way. 구체적으로, 후보 화합물의 존재하에 측정된 세포 분화 레벨을 전술한 방법에 따라 측정한 경우, 후보 화합물의 부재하에 측정된 세포 분화 레벨과 비교할 수 있다. Specifically, when measured according to the method described above the cells differentiated levels measured in the presence of a candidate compound, can be compared with the measured level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 레벨의 감소는 후보 화합물이 세포 분화 억제제임을 시사하는 것이다. Reduction in the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is to suggest that the candidate compound cell differentiation inhibitors.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 기관으로부터 줄기 세포 또는 선조세포 집단을 동정 및 분리하는 방법을 제공한다. As a further aspect of the invention, the invention provides a method for identifying and separating the stem cell or progenitor cell population from the engine. 이 방법은 일반적으로 기관으로부터 세포 집단의 체외이식편을 배양물 상태로 분리하는 단계를 포함한다. The method generally includes the step of separating a population of cells of the explant in the culture conditions from the engine. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 체외이식편은 (i) 체외이식편이 유래하는 기관의 미세구조를 배양물 상태에서 유지하는 능력, (ii) 적어도 약 1.55mm -1 이상의 표면적 대 부피 지수(알레프), 및 (iii) 증식능이 있는 적어도 하나의 선조세포 또는 줄기세포를 특징으로 한다. As described herein, the explant is (i) capacity, (ii) at least about 1.55mm -1 or more surface area to volume index (Aleph) to maintain the microstructure of the engine that comes from the explant culture conditions, and (iii) it is characterized by at least one progenitor or stem cell proliferation. 이 체외이식편을 선조 세포 또는 줄기 세포의 증식을 유도하는 제제, 예컨대 성장 인자 또는 다른 유사분열인자와 접촉시켜 체외이식편에 존재하는 분리된 세포 집단을 증폭시킨다. Contacting the explants with agents such as growth factors or other mitotic factor that induces proliferation of the progenitor or stem cells to amplify the isolated population of cells present in the explant. 그 다음, 체외이식편으로부터 증폭된 선조 세포를 분리할 수 있다. That may then separating the progenitor cells from the explant amplification. 이와 같은 체외이식편의 2차 집단은 이 집단의 증식 반응을 통해 확인할 수 있다. In the second group of the same explants it can be found through the proliferation of the population. 다른 구체예로서, 선조세포/줄기세포는 외인성 제제를 첨가하지 않아도 배양물 중에서 자발적으로 증식할 것이다. In another embodiment, the progenitor / stem cells without the addition of exogenous agents will proliferate spontaneously in the culture. 다른 구체예로서, 상기 외인성 제제에 대한 반응으로 증식하는 체외이식편 유래의 선조세포 또는 줄기세포의 분리는 예컨대 체외이식편에서 새로 발생하는 아체(bud)를 직접 기계식 분리하거나 체외이식편 전체 또는 일부를 용해시킨 뒤 증폭된 세포 집단을 분리하는 등의 방법으로 수행할 수 있다. In another embodiment, in which progenitor cells or separation of the stem cells of the explant derived, for example a direct mechanical separation of gemma (bud) newly generated at the explant, or dissolving the whole or part of the explant that proliferate in response to the exogenous agents can be performed after amplifying the population of cells, such as by separation.

본 발명의 미세기관 배양물을 사용할 수 있는 또 다른 방법으로는 수용자의 상처 치유를 촉진시키는 방법이 있다. Another way to use the micro-organ cultures of the present invention is a method for promoting wound healing of the recipient. 이 방법은 공여자로부터 적어도 약 1.5mm -1 이상의 알레프를 보유하는 세포 집단을 분리한 뒤 이 세포 집단을 수용자의 상처에 적용하는 것을 포함한다. The method includes the rear separating the population of cells for holding Aleph of at least about 1.5mm -1 from a donor population of cells applied to the wounds of the prisoner. 공여자와 수용자는 동종이거나 이종일 수 있다. Donor and recipient can be homogeneous or yijongil. 일 구체예에서, 세포가 분리되는 조직은 피부이고 수용자의 상처는 궤양, 예컨대 당뇨병 관련 궤양인 것이다. In one embodiment, the tissue cells are separated skin and wounds of the detainees is an ulcer, such as diabetes-related ulcers.

본 발명의 실시에는 별다른 기재가 없는 한 통상적인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 방법들이 사용될 것이며, 이는 당업자라면 실시가능한 것이다. Embodiments of the present invention there will be employed a conventional cell biology, cell culture, molecular biology, transgenic biology, microbiology, recombinant DNA and immunology methods Unless otherwise described, which one skilled in the art will possible embodiments. 이와 같은 방법들은 문헌에 상세히 설명되어 있다. Such methods are described in detail in the literature. 그 예로서 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. As an example reference can be made to the following literature, such as: Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd Ed, ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II(DNGlover ed., 1985); DNA Cloning, Volumes I and II (. DNGlover ed, 1985); Oligonucleotide Synthesis(MJGait ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis (MJGait ed, 1984.); Mullis et al. Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195호; U.S. Patent No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(BDHames & SJHiggins eds. 1984); Nucleic Acid Hybridization (BDHames & SJHiggins eds 1984.); Transcription And Translation(BDHames & SJHiggins eds. 1984); Transcription And Translation (BDHames & SJHiggins eds 1984.); Culture of Animal Cells(RIFreshney, Alan R. Liss, Inc., NY); Culture of Animal Cells (RIFreshney, Alan R. Liss, Inc., NY); Gene Trasfer Vectors for Mammalian Cells(JHMiller and MPCalos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Gene Trasfer Vectors for Mammalian Cells (JHMiller and MPCalos eds, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory.); Methods in Enzymology, Vols. Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); 154 and 155 (.. Wu et al eds), Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds, Academic Press, London, 1987.); and Handbook of Experimental Imunology, Volumes I-IV(DMWeir and CCBlackwell, eds., 1986). and Handbook of Experimental Imunology, Volumes I-IV (. DMWeir and CCBlackwell, eds, 1986).

본 발명의 다른 특징과 장점은 하기 상세한 설명과 특허청구범위로부터 분명하게 알 수 있을 것이다. Other features and advantages of the invention will be seen clearly from the following detailed description and claims.

본 발명은 3차원 기관 체외이식편 배양 시스템에 관한 것이다. The present invention relates to a three-dimensional organ explant culture system. 이 배양 시스템은 생체내 전체 기관에서 발견되는 것과 거의 유사한 환경에서 시험관내 미세기관 체외이식편의 장기간 증식에 사용할 수 있다. This culture system can be used for long-term growth of the micro-organ explants in vitro in almost similar circumstances to those found in vivo whole institution. 본 명세서에 기술한 배양 시스 템은 생체내 대응 기관과 유사한 구조를 유지하도록 증식 및 적당한 세포 성숙을 제공한다. A culture system described herein provides for proliferation and appropriate cell maturation to maintain a structure that resembles the in vivo response agencies.

본 발명의 미세기관 배양물은 조직 또는 기관 절편을 유지할 수 있고, 그 절편의 기능을 장기간 동안 보존할 수 있는 시험관내 배양 시스템을 제공한다. The micro-organ cultures of the invention can maintain the tissue or organ slices, and provides an in vitro culture systems that can be preserved for a long period of time the function of the fragments. 이와 같은 배양 시스템은 세포 분화, 세포 증식, 세포 기능 및 상기 세포 특징과 기능을 변화시키는 방법을 용이하고 정확하게 시험할 수 있는 시험관내 모델을 제공한다. Such culture system provides an in vitro model that can be easily and accurately test the method of changing the cell differentiation, cell proliferation, cell function, and the cell characteristics and functions. 그 결과 얻어지는 배양물은 생체내 이식에서부터 시험관내에서의 세포독성 화합물 및 약학적 화합물의 선별, "생물반응기"에서 생물학적 활성 분자의 생산 및 조직으로부터 선조세포의 분리에 이르기까지 다양한 용도에 사용할 수 있다. The resultant culture can be used in a variety of down to separate the in vivo from the implant of the in vitro cytotoxic compounds and screening a pharmaceutical compound, "bioreactor" progenitor cells from the production and organization of the biologically active molecule in use .

예를 들어, 본 발명의 특정 구체예로는 (i) 화학치료 요법 동안 파괴될 골수를 대체하는데 사용하는 미세기관 골수배양 이식물; For example, in certain embodiments of the present invention, micro-organ bone marrow culture implants used to replace bone marrow is destroyed during the (i) chemotherapy; (ii) 경화증 환자에서 간 기능을 증대시키는데 사용하는 미세기관 간 이식물; (Ii) micro-organ liver implants used to augment liver function in cirrhosis patients; (iii) 피검 미세기관 배양물에서 증식된 유전자 변형 세포(예컨대 인슐린을 코딩하는 재조합 유전자를 발현하는 췌장 미세기관); (Iii) a test micro-organ of genetically modified cell proliferation in culture (e.g., pancreatic micro-organs which express a recombinant gene encoding insulin); (iv) 구강 점막의 미세기관 배양물에 결합시킨 치과보철물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. (Iv) and that the dental prosthesis coupled to a micro-organ culture of oral mucosa water, but is not limited to this.

또 다른 비제한적 구체예로서, 대상 미세기관 배양물은 다양한 화합물, 예컨대 세포독성 화합물, 성장/조절 인자, 약학적 제제 등을 선별하기 위하여 시험관내에서 사용할 수 있다. As another non-limiting embodiment, the subject micro-organ culture can be used in vitro to screen for a variety of compounds, such as cytotoxic compounds, growth / regulatory factors, pharmaceutical agents and the like. 이 목적을 위해 미세기관 배양물은 시험관내 유지시킨 뒤 시험할 화합물에 노출시킨다. For this purpose, thereby micro-organ cultures was maintained after in vitro exposure to the test compound. 세포독성 화합물의 활성은 예컨대 체외이식편에 존재하는 세포의 손상 또는 사멸 능력을 통해 측정할 수 있다. The cytotoxic activity of the compounds can be measured for example by damaging or killing ability of the cells in the explant.

이 활성은 생생한 염색 기법을 통해 용이하게 평가할 수 있다. This activity can be easily assessed through a vivid dyeing techniques. 성장/조절 인자는 체외이식편의 세포 함유물, 예컨대 총 세포수, 및 분화 세포 수를 분석하여 평가할 수 있다. Growth / regulatory factors may be assessed by analyzing the cellular content of the explant water, for example, the total number of cells, and the number of differentiated cells. 이 평가는 형별 특이적 세포 항원을 규정하는 항체를 이용한 면역세포화학 기법의 사용 등을 포함하는 표준 세포학적 및/또는 조직학적 기법으로 수행할 수 있다. This evaluation may be performed as a standard cytological and / or histological techniques, including such as the use of immunocytochemical techniques with antibodies to define a specific cell antigen typing. 3차원 시스템에서 배양된 정상 세포에 미치는 각종 약물의 효과를 평가할 수 있다. In the three-dimensional system can evaluate the effects of various drugs on normal cells cultured. 예를 들어, 적혈구 형성을 증가시키는 약물은 골수 미세기관 배양물을 가지고 시험할 수 있다. For example, drugs that increase red blood cell formation can be tested with a bone marrow micro-organ cultures. 콜레스테롤 대사에 영향을 미치는 약물(예컨대 콜레스테롤 생산을 저하시킴으로써)은 간 미세기관 배양물을 가지고 시험할 수 있다. (For example by reducing the production of cholesterol) drugs affecting cholesterol metabolism can be tested with a micro-organ culture liver. 이상 조직의 미세기관 배양물 역시 예를 들어 과증식 또는 신생증식 질환 연구의 용이성을 도모하는데 사용할 수 있다. Or more, for example, micro-organ cultures also the organization can be used to promote the ease of start-proliferative or hyperproliferative disease research. 예를 들어, 종양 세포 증식이 일어난 미세기관 체외이식편은 예컨대 항종양제 효능을 시험하기 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있다. For example, the micro-organ explant is tumor cell proliferation takes place can for example be used as a model system to test the anti-tumor efficacy.

본 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에 사용되고 있는 일부 용어들은 편리하게 알 수 있도록 이하에 모아서 설명하였다. A part used in this specification, the examples and the appended claims, terms are described collectively hereinafter the convenience of Al.

"체외이식편"이란 용어는 신체에서 분리하여 합성 배지에서 증식시킨 기관 유래의 세포 집합물을 의미한다. "Explant" refers to the means in which the cell aggregates of the engine derived from proliferation in a synthetic medium, removed from the body. 간질 성분과 상피 성분을 모두 보유하는 기관 유래의 체외이식편이란 일반적으로 상기 기관 유래의 단일 체외이식편에 상기 두 성분을 모두 포함하는 체외이식편을 의미한다. Explants derived from the engine to hold both the stromal and epithelial components ingredient is generally refers to explants which contain both of the two components in a single explant in the engine results.

"조직"이란 용어는 특정 특이 기능을 함께 수행하는 유사하게 세분화된 세포 그룹 또는 층을 의미한다. "Organization" The term refers to a similar granular cell layer or group that performs with a certain specific functionality.

"기관"이란 용어는 미세구조를 형성하기 위하여 세포-세포 및/또는 세포-간질 상호작용의 일부 형태를 유지하는 2종 또는 그 이상의 인접 층으로 이루어진 조직을 의미한다. "Organ" refers to the cell to form a fine structure refers to a tissue composed of two or more adjacent layers to retain some form of epilepsy interaction-cells and / or cells. 따라서, 본 발명에 있어서 미세기관 배양물은 예컨대 포유동물 피부, 포유동물 췌장, 간, 신장, 십이지장, 식도, 방광, 각막, 전립선, 골수, 흉선 및 비장 등의 기관으로부터 제조하였다. Thus, for example, micro-organ cultures were prepared from the mammalian skin, mammalian pancreas, liver, kidney, duodenum, esophagus, bladder, cornea, prostate, bone marrow, thymus and spleen engine such as in the present invention.

"간질"이란 용어는 기관의 지지 조직 또는 기질을 의미한다. "Tickle" the term refers to the supporting tissue or matrix of institutions.

본 명세서에 사용된 "미세기관 배양물"이란 용어는 세포가 분리된 기관 또는 조직의 미세구조를 보유한 분리된 세포 집단, 예컨대 체외이식편을 의미한다. The "micro-organ culture" refers to as used herein, means a discrete population of cells, e.g., explants have a microarchitecture of an organ or tissue cells are separated. 즉, 분리된 세포는 공간 상호작용, 예컨대 세포-세포, 세포-기질 및 세포-간질 상호작용 및 체외이식편이 유래하는 본래 유기체 및 실제 조직의 배향을 모방/유지하는 3차원 구조를 함께 형성한다. That is, separate cells are spatial interactions, e.g., cell-form with a three-dimensional structure imitating / maintain the orientation of the stromal interactions, and the original organism and the actual tissue explant is derived-cell, cell-matrix and cell. 따라서, 간질층과 상피층 사이와 같은 상기 상호작용이 체외이식된 조직에서 보존되어 중요한 세포 상호작용을 통해 예컨대 체외이식편의 생물학적 기능을 유지하는 자가분비인자, 주변분비인자 및 다른 세포외 자극을 구비하고 적당한 영양소와 폐기물 수송이 샘플을 통해 일어나는 조건하에서 장기 생존능을 얻을 수 있다. Thus, the interaction such as between stromal layer and the epithelial layer is provided with an in vitro transplantation of preserved in tissue relevant cells cross the via for example around autocrine factor, that retain the biological function of the explant secretion factor effects and other extracellular stimuli It can get long-term viability under conditions suitable nutrient and waste transport occurs through the sample.

대상 미세기관 배양물은 세포 또는 조직 체외이식편이 분리된 기관 또는 조직의 미세구조를 보유한다. Subject micro-organ culture retains the microstructure of the isolated organ or tissue cells or tissue explants. 본 명세서에 사용된, "미세구조"란 용어는 세포 집단의 세포 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 그 이상의 세포가 생체내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접해있는 적어 도 1종 이상의 세포 물질 또는 비세포 물질과 시험관내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접한 상태를 유지하며 적어도 약 1층, 보다 바람직하게는 적어도 약 5층, 가장 바람직하게는 적어도 약 10층 이상의 세포 배양물을 형성하는, 분리된 세포 집단 또는 조직 체외이식편을 의미한다. The "microstructure" is the term of at least about 50% of the cell population cells, preferably at least about 60%, at least about 70% and more preferably, more preferably from about 80% at least than used herein, most preferably maintained at about 90% or more of the cells are adjacent on the physical and / or write even one kind of cellular material or a non-cellular material in functional contact with the in vivo and in vitro the physical and / or functional state, at least, and at least about one layer, and more preferably it means that at least about 5 layers, and most preferably, a separate population of cells or tissue explant to form a layer of at least about 10 cell culture at least. 바람직하게는, 체외이식편의 세포가 분리된 기관 또는 조직의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 것이 좋다. Preferably, it is a good idea to maintain at least one biological activity of a cell of the explant discrete organ or tissue.

본 명세서에 사용된 "분리된"이란 용어는 유기체 내의 자연 환경에서 분리된 체외이식편을 의미하는 것이다. The "separate" the term as used herein is intended to mean the explants isolated from the natural environment of the organism. 이 용어는 자연 환경으로부터의 전체적인 물리적 분리, 예컨대 공여 동물, 예컨대 인간이나 축소 돼지와 같은 포유동물로부터의 제거를 포함한다. The term includes whole physically separated from the natural environment, e.g., the donor animals, e.g., removed from a mammal such as a human or pig reduced. 예를 들어, "분리된"이란 용어는 체외이식편이거나, 체외이식편의 일부로서 배양되거나 또는 체외이식편의 형태로 이식된 세포 집단을 의미한다. For example, "isolated" refers to or explants, means a population of cells in the form of an implant or explant culture, as part of the explant. 세포 집단을 의미하는 것으로 사용했을 때, "분리된"이란 용어는 본 발명의 미세기관 배양물에서 세포의 증식으로부터 얻어지는 세포 집단을 포함한다. When used herein to mean a population of cells, the "discrete" refers to containing the population of cells obtained from the growth of cells in micro-organ cultures of the present invention.

"외세포층"이란 용어는 배아의 원시 배 3층 중 최외각을 의미하는 것으로서, 이로부터 표피 및 표피 조직, 예컨대 손톱, 머리 및 피부 샘, 신경계, 외부 감각 기관, 구강 및 항문의 점막 등이 유도된다. "Outer cell layer," the term as meaning the outermost part of the source times the third layer of the embryo, from which the epidermis and epidermal tissues such as the nails, hair and skin thumb, the nervous system, external sense organs, the mouth and the induced mucosa such as the rectum do.

"상피"란 용어는 내부 및 외부 체표면(피부, 점막 및 혈청)의 세포 외피 및 이로부터 유도된 샘 및 기타 다른 구조, 예컨대 각막세포, 식도세포, 표피세포 및 모낭 상피세포 등을 포함한다. "Epithelium" The term includes both internal and external body surfaces (skin, mucous membranes and serum), cell cortex, and this from the induced fountains and any other structure, for example, corneal cells, esophageal cells, epidermal cells and follicular epithelial cells. 다른 상피조직의 예로는, 비강의 후각 영역 안에 존재하고 후각 수용체를 함유하는 의사층화된 상피인 후각 상피; Examples of other epithelial tissues, the olfactory epithelium present in the olfactory region of the nasal cavity and the pseudo stratified epithelium containing olfactory receptors; 분비 세포로 구성된 상피를 의미하는 샘 상피; Sam epithelium, which means the epithelium composed of secreting cells; 편평화된 판상 세포로 구성된 상피를 의미하는 편평 상피를 포함한다. Side includes squamous epithelium, which means consists of a plate-like cell peace. 상피란 용어는 또한 수축과 팽창으로 인해 현저한 기계적 변화를 겪는 중공의 기관 안에서 특징적으로 발견되는 전이성 상피, 예컨대 층화된 편평 상피와 원주형 상피 간의 전이를 나타내는 조직을 의미할 수도 있다. The term epithelium can also refer to a tissue showing the transitions between metastatic epithelial, such as stratified squamous epithelium and the columnar epithelium that is characteristically found in a hollow organ experiences a significant mechanical change due to contraction and expansion. "상피화"란 용어는 박피 표면상에서 상피 조직의 성장에 의한 치유를 의미한다. "Epithelialization" the term refers to healing by the growth of epithelial tissue over the peeling surface.

"피부"란 용어는 진피와 표피로 구성된 신체의 외측 보호용 외피를 의미하는 것으로, 땀샘 및 피지샘은 물론 모낭 구조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "Skin" means the term is to mean the outer protective shell of the body, consisting of the dermis and epidermis and should be understood to include the sweat glands and sebaceous glands, as well as hair follicle structures. 본 명세서를 통해 "피부성"이란 용어도 사용하였는데, 이는 이 용어가 사용된 문장에 적절하게 피부의 속성을 나타낸 것으로 이해되어야 한다. Were via the terms "cutaneous" The term is also used, it should be understood that showing the properties of the skin, as appropriate to the sentences of the term is used.

"표피"란 용어는 배아의 외세포층에서 유래된, 피부의 최외각 비혈관계 층을 의미하는 것으로서, 두께가 0.07mm에서부터 1.4mm로 다양하다. "Skin", the term as meaning a, skin outermost non-vascular layer derived from the outer cell layer of embryonic, vary in thickness from 1.4mm 0.07mm. 손바닥 및 발바닥 표면상에서, 표피는 내부로부터 외측으로 5개의 층, 즉 수직 배열된 원주 세포로 이루어진 기저층, 짧은 돌기 또는 가시를 가진 편평화된 다면체 세포로 이루어진 극세포 또는 가시모양 층, 편평화된 과립 세포로 이루어진 과립 층, 핵이 뚜렷하지 않거나 존재하지 않는 투명한 투과 세포의 여러 층으로 이루어진 투명 층, 및 편평화된 각화 비핵 세포로 이루어진 각질 층을 포함한다. On the palm and plantar surface, the epidermis consists of five layers outwardly from the inside, i.e. bipolar or visible shape layer, Pt peace granule cells consisting of a vertical array of cylindrical cells, the basal layer, the polyhedral cells flattened with a short projection or visible consisting of includes a horny layer of a granular, core is made of multiple layers of transparent transmission cell does not exist, does not clear transparent layer, and flattening the non-nuclear cells, it keratinocytes made. 일반적으로 체표면의 표피에는 투명층은 보통 존재하지 않는다. Typically, the skin of the body surface of the transparent layer is usually absent. "표피유사"는 표피와 유사한 세포 또는 조직이지만, 비피부 부위에서 발생하고 표피 인자의 함유로 형성되는 모든 종양을 의미하는데 사용할 수도 있다. "Similar skin" is a cell or tissue, but is similar to the skin, can be used to generate in the non-skin portion, and refers to any tumor formed by inclusion of epidermal factor.

"진피"는 표피 아래에 깊이 존재하는 피부 층을 의미하는 것으로서, 혈관 결합 조직의 치밀한 바탕으로 이루어지고 신경과 감각 말단 기관을 포함한다. "Dermis" 'is the mean skin layer present depth beneath the epidermis, is composed of dense connective tissue on the blood vessel comprises a nerve and sensory end organ. 모근, 피지샘 및 땀샘이 진피 내에 깊이 매립되어 있는 표피의 구조물이다. The hair follicles, sebaceous glands and sweat glands are structures of the epidermis which are deeply embedded in the dermis.

"샘"이란 용어는 정규 대사적 요구에 관계없이 물질을 분비하는 전문적인 세포 집합체를 의미한다. "Sam" the term refers to a collection of specialized cells secrete a substance, regardless of the normal metabolic needs. 예를 들어, "피지샘"은 유상 물질과 피지를 분비하는 진피내의 완전분비 샘이다. For example, "sebaceous glands" are fully secreted fountain in the dermis to secrete the oily substance and sebum. "땀샘"이란 용어는 체표면 상의 관에 의해 열리는, 땀을 분비하고, 진피 또는 피하 조직내에 위치한 샘을 의미한다. The "sweat glands" refers to the body held by the tube on the surface, secretion of sweat, and spring means located in the dermis or subcutaneous tissue. 보통의 샘 또는 외분비땀샘은 체표면의 최외층 상에 분포하여 분비물의 증발로 냉각을 촉진하고; Usually the thumb or exocrine glands, and the distribution on the outermost layer of the body surface to promote cooling by evaporation of the secretion; 아포크린 땀샘은 피부 상에 직접 비워지지 않고 모낭 상부로 비워지고 항문 주위와 겨드랑이내와 같은 특정 신체 영역에서만 발견되는 것이다. Ahpokeurin glands will be emptied directly onto the skin without being emptied into the upper follicles found in certain body areas such as the armpits and around my anus.

"모" (또는 "털")란 용어는 사상 구조, 구체적으로 각질으로 이루어지고 진피내에 함입된 유두에서 발생하며 포유동물에 의해서만 생산되고 그 그룹의 동물에 특징적인 세분화된 표피 구조를 의미한다. "Parent" (or "hair"), the term means from the spirit structure, specifically is composed of dead skin cells occurs in the nipple incorporated in the dermis and is produced only by mammals characteristic broken down of the group animals the skin structure. 이 용어는 또한 이러한 모의 집합물의 의미하기도 한다. This term also means the water this simulation set. "모낭"이란 모를 에워싸는 표피의 관상 함입부의 하나로서, 이로부터 모가 자라난다. "Follicle" is incorporated as a part of tubular skin that surrounds you do not know, Mo grows from it. "모낭 상피세포"란 모낭내의 진피에 의해 둘러싸인 상피 세포, 예컨대 줄기세포, 외근 외장세포, 기질세포 및 내근 외장세포를 의미한다. Means "hair follicle epithelial cells" refers to epithelial cells surrounded by the dermis in the hair follicle, e.g., stem cells, a mobile external cells, stromal cells, and external cells naegeun. 이와 같은 세포는 비악성의 정상 세포이거나 형질전환/무한증식성 세포일 수 있다. Such cells may be normal cells of non-malignant, or transformed / immortalized cells sex.

"탈모증"은 일반적으로 대머리, 예컨대 정상적으로 존재하는 피부 영역에 모가 없는 것을 의미한다. "Alopecia" means generally baldness, for example, no Mo in the skin areas that normally present. 탈모증의 다양한 형태가 당해 기술분야에 알려져 있다. Various forms of alopecia art is known in the art. 예를 들어, 원형탈모증은 보통 수염이나 두피를 포함하는 매우 분명한 영역에서, 보통 가역성인 모발 상실을 의미하는 것이고, 약물성 탈모증이란 약물 섭취로 인한 모발 상실을 의미하며, 남성형 탈모증 또는 남성형 대머리는 유전적으로 결정되고 안드로겐 의존성이며 이마 뒤에서부터 시작하여 대칭적으로 진행하여 모발의 엉성한 주변 둘레만을 최종적으로 남기는 두피 모발의 상실을 의미한다. For example, alopecia areata is very in clear areas, will mean a normal reversibility of hair loss, means hair loss caused by drug intake about properties alopecia Iran and androgenetic alopecia or male pattern baldness oil usually contains a beard or scalp androgen dependent and is determined solely refers to loss of scalp hair from the forehead to the back start proceeds symmetrically around the circumference of the hair, leaving only the loose finally.

본 명세서를 통해 사용된 "증식성 피부 질환"이란 용어는 피부 조직의 불필요한 증식 또는 이상 증식을 특징으로 하는 모든 피부 질환/병을 의미한다. A "proliferative skin disease" is the term used throughout this specification refers to any skin disorder / disease characterized by unwanted proliferation or abnormal proliferation of skin tissue. 이러한 질환들은 일반적으로 표피 세포 증식 또는 불완전 세포 증식을 특징으로 하며, 그 예로는 X-관련 비늘증, 건선, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉 피부염, 표피박리각화과다증 및 지루피부염 등이 있다. Such diseases are typically characterized by epidermal cell proliferation or incomplete cell proliferation. Examples may include associated scales X- syndrome, psoriasis, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis, skin peeling hyperkeratosis and seborrheic dermatitis. 예를 들어, 표피형성이상은 표피의 불완전 발생 형태로서, 일 예로 일반 사마귀 바이러스와 동일한 바이러스 또는 이 바이러스와 근연성이 있는 바이러스에 의한 질환인 "사마귀표피형성이상" 등이 있다. For example, epidermal dysplasia has occurred such as an incomplete form of the epidermis, for example one common wart virus with the same virus or a virus and muscle ductility due to viral infection, which "skin warts than forming". 또 다른 예로는 외상 부위에서 또는 자발적으로 수포 및 물집이 형성된 표피의 느슨한 상태를 의미한다. Another example refers to a loose state of the skin and the blisters formed in the blister in the trauma area, or spontaneously.

본 명세서에 사용된, "건선"이란 용어는 피부 조절 기작을 변화시키는 과증식 피부 질환을 의미한다. The "psoriasis" refers to as used herein, refers to a hyperproliferative skin disease which changes the regulatory mechanism skin. 구체적으로, 표피 증식, 피부의 염증 반응, 림포킨 및 염증성 인자와 같은 조절 분자의 발현의 1차 및 2차적 변화를 수반하는 병변이 형성되는 것이다. Specifically, the disease involving a skin proliferation, inflammatory responses of the skin, the rim pokin and primary and secondary changes in the regulation of inflammatory molecules, such as factor expression is formed. 건선 피부의 형태적 특징은 표피 세포의 증가된 회전율, 표피 비대, 이상 각질화, 진피층으로 염증세포의 침윤, 표피층으로 다형핵 백혈구 침윤과 이에 따른 바닥세포 순환의 증가 등이 있다. The morphological features of psoriatic skin is increased, such as an increased turnover of epidermal cells, epidermal hypertrophy, keratinization above, the infiltration of inflammatory cells, the dermal layer, the skin layer polymorphonuclear leukocyte infiltration and its bottom cell cycle according to. 또한, 각화과다 세포 및 이상각화 세포가 존재하기도 한다. In addition, the keratinocytes may be an over-rich cells, and keratinocytes present.

본 명세서에 사용된 "증식성" 및 "증식"이란 용어는 유사분열을 일으키는 세포를 의미한다. A "proliferative" and "proliferation" refers to as used herein, refers to a cell that causes mitosis.

"선조세포"란 용어는 증식하여 다수의 모세포를 생성하는 능력을 보유한 보다 많은 선조 세포를 발생시킬 수 있는 미분화 세포를 의미하는 것이고, 반면에 상기 모세포는 분화된 또는 분화가능한 딸 세포를 생성시킬 수 있다. "Progenitor cells" term can proliferate and produce a large number of would mean an undifferentiated cell capable of generating more progenitor cells have the capability of generating cell, while the cell is available daughter cells differentiated or differentiation in have. 본 명세서에 사용된 "선조세포"란 용어는 또한 당해 기술분야에서 때로 "줄기세포"라고도 불리는 세포를 포함하는 것이다. The "progenitor cells" is the term used herein to also include the times, also called cells, "stem cells" in the art. 바람직한 구체예에서, "선조세포"란 용어는 그 후손(자손)이 종종 여러 방면으로 분화에 의해, 예컨대 배아 세포 및 조직의 점진적 분화로 나타나는 것처럼 개개의 특성을 완전하게 획득하여 세분화하는 일반화된 모세포를 의미한다. In a preferred embodiment, the "progenitor cells", the term a cell common to subdivide to completely acquire the individual characteristics by differentiating the often many ways, their descendants (progeny), for example, as indicated by the progressive differentiation of embryonic cells and tissues the means. 예를 들어, "조혈 선조세포"(또는 줄기세포)는 골수 및 다른 혈액관련 기관에서 발생하여, 예컨대 적혈구, 림프구, 기타 다른 혈액 세포와 같은 상기 분화된 자손을 발생시키는 선조 세포를 의미한다. For example, the "hematopoietic progenitor cell" (or stem cell) refers to a bone marrow and in the blood associated with other authorities, such as progenitor cells to generate a differentiated progeny, such as the red blood cells, lymphocytes, other blood cells.

본 명세서에 사용된 "형질전환된 세포"는 무제한 증식 상태로 자발적으로 전환된 세포, 즉 배양물에서 분열의 무한 횟수를 통해 증식하는 능력을 획득한 세포를 의미한다. A "transformed cell" as used herein refers to acquired the ability to proliferate over the infinite number of times of division in the cell, that is, the culture spontaneously converted to an unlimited proliferative cell conditions. 형질전환된 세포는 증식 조절의 상실 측면에서 신생, 역형성 및/또는 과다증식과 같은 용어로 특징지을 수 있다. Transformed cells may be characterized in terms of the loss of proliferation control in startup, anaplastic and / or hyperproliferation terms:

본 명세서에 사용된 "무한증식성 세포"란 용어는 세포가 배양물에서 분열의 무한 횟수를 통해 증식하는 능력을 보유할 수 있는 화학적 수단 및/또는 재조합체 수단을 통해 변형시킬 수 있는 세포를 의미한다. The "infinite proliferative cell" as used herein, the term means that the cells can be modified by chemical means which can retain the ability to proliferate over an indefinite number of divisions in culture and / or recombinant means cells do.

"암종"이란 용어는 주위 조직에 침윤하여 전이를 발생시키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성 신규 증식물을 의미한다. And "carcinoma" refers to a malignant new increase plant consisting of epithelial, which tend to result in a transition to infiltrate the surrounding tissue. 암종의 예로는, 드물게 전이하면서 국소 침입 및 파괴의 가능성을 보유한 피부의 상피 종양인 "기저세포 암종"; Examples of the carcinoma is a rare epithelial tumor of the skin have the potential for local invasion and destruction and metastasis, "basal cell carcinoma"; 편 평 상피에서 발생하고 입방형 세포를 보유하는 암종을 의미하는 "편평세포 암종"; Tend to occur in the flat epithelial carcinoma and means to hold the cubic cell, "squamous cell carcinoma"; 암성 조직과 육종성 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 "암육종"; Including malignant tumors composed of cancerous tissues and breeding organizations "carcinosarcoma"; 작은 상피 세포의 망이나 건에 의해 분리되거나 둘러싸인 원주형 또는 밴드형의 유리질 또는 점액 기질로 표시되는 암종으로서 유선, 타액선 및 호흡관의 점액선에서 발생하는 "샘낭암종"; A carcinoma that appears as a glass substrate or the mucous of the columnar or a band-like separated or surrounded by a net or gun of small epithelial cells, occurring in the wire gutter, salivary gland and trachea "saemnang carcinoma"; 표피 세포와 동일한 방식으로 분화하는 경향이 있는, 즉 극세포를 형성하여 각질화를 일으키는 암 세포를 의미하는 "표피모양 암종"; Which tend to differentiate in the same way as the epidermal cells, that means that the cancer cells to form a bipolar causing keratinization "epidermal carcinoma shape"; 코 뒤쪽 공간의 상피 내막에서 발생하는 악성 종양을 의미하는 "코인두암종"; "Two Coins carcinoma", which refers to a malignant tumor arising in the epithelial lining of the space behind the nose; 다양한 배열의 관상 세포로 구성된 신장 실질의 암종에 속하는 "신장 세포 암종" 등이 있다. There are "renal cell carcinoma", etc. belonging to the carcinoma of the renal parenchyma composed of tubular cells in various arrangements. 또 다른 암성 상피 증식으로, 상피 유래의 양성 종양을 의미하며 원인인자로서 유두종바이러스가 있는 "유두종"; In another cancerous epithelial proliferation, it refers to a benign tumor of epithelial origin, and as a cause factor with a papillomavirus "papillomas"; 및 신경 고랑의 폐쇄시에 외배엽 인자의 함입으로 형성된 뇌 또는 수막 종양을 의미하는 "표피종(epidermoidomas)"이 있다. And has a mean brain or meningeal tumor formed by the incorporation of ectodermal factor "skin species (epidermoidomas)" at the time of closure of the neural groove.

본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 동물"이란, 예컨대 1종 이상의 세포가 사람의 개입, 예컨대 당해 기술분야에 공지된 유전자도입 기법을 통해 도입된 이종 핵산을 함유하는 모든 동물, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물, 조류 또는 양서류이다. A "transgenic animal" as used herein is, for example, one or more cells are human intervention, all of the animals, for example, containing a heterologous nucleic acid introduced through a known gene transfer techniques in the art, preferably other than the human mammals are animals, birds or amphibians. 핵산은 미량주사 또는 재조합 바이러스 감염과 같은 계획적인 유전자 조작을 통해 세포 전구체 중으로 도입시켜 세포에 직접 또는 간접적으로 도입시킨다. The nucleic acid is introduced into a precursor cell through deliberate genetic manipulation, such as a small amount of injection or the recombinant virus is introduced, directly or indirectly, to the cell. 유전자 조작이란 용어는 고전적인 이종교배 또는 시험관 수정을 포함하지 않고 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. GM term will not include classical crossbreeding or in vitro fertilization according to the introduction of the recombinant DNA molecule. 이 분자는 염색체에 통합되거나 염색체외에서 복제하는 DNA일 수 있다. This molecule may be integrated or replicated outside the chromosome DNA of the chromosomes. 이 용어는 또한 재조합체 유전자가, 예컨대 당해 기술분야에 기술된 바 있는 FLP 또는 CRE 재조합효소 의존적 작제물로서 침묵성인 트 랜스제닉 동물을 포함하는 것이다. This term also is to include a bar FLP or CRE silence adult agent lance transgenic animal as recombinase dependent constructs described in which a recombinant gene, such as the art. 트랜스제닉 동물에는 또한 구성적 및 조건적 "녹아웃" 동물이 포함되기도 한다. The transgenic animals also are to also include the constitutive and conditional "knock-out" animal. 본 발명의 "인간을 제외한 동물"은 설치류, 인간을 제외한 영장류, 돼지, 양, 개, 소, 병아리, 양서류, 파충류 등의 척추동물을 포함한다. "Non-human animals" of the invention include vertebrates, rodents, primates, non-human, pig, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, reptiles and the like. 인간을 제외한 동물은 축소 돼지 또는 래트와 마우스를 비롯한 설치류 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 가장 바람직한 것은 마우스이다. Non-human animal is preferably selected from the group consisting of rodents, including the reduction pig or rat and mouse, most preferably a mouse. 본 명세서에 사용된 "키메라 동물"이란 용어는 재조합체 유전자가 발견되거나 재조합체가 동물의 전세포는 아니지만 일부 세포에서 발현되는 동물을 의미한다. A "chimeric animal" is the term used herein, whole cells of the recombinant gene is found, or the recombinant animal body, but means that the animal which is expressed in some cells.

I. 미세기관 배양물의 확립 I. establishing micro-organ cultures of water

본 발명에 따른 본 발명의 미세기관 배양물의 주요 특징은 특정 조직의 생체내에서 발견되는 세포 미세환경을 보존하는 능력이다. The main features of the micro-organ cultures of the present invention according to the present invention is the ability to preserve the cellular microenvironment found in vivo for a particular tissue. 본 발명은 부분적으로 소정 환경에서 기관 체외이식편의 상이한 조직 층, 예컨대 중간엽층 및 상피층에 있는 세포의 성장이 활성화하여 배양물에서 증식 및 성숙할 수 있음을 발견한데 기초한 것이다. The present invention is based in part, together with the growth of cells in different tissue layers, such as intermediate laminae and the epithelial layer of the organ explant activation in a given environment found that it is possible to proliferate and mature in culture. 또한, 체외이식편 자체에 제공된 세포-세포 및 세포-간질 상호작용은 세포 항상성, 예컨대 체외이식편 배양물에서 세포의 성숙, 분화 및 분리를 지지하기에 충분하여 연장된 시간 동안 조직의 미세구조 및 기능을 유지한다. Further, the cells provided in the explant itself - the stromal interactions cell homeostasis, such as the fine structure and function of the tissue for an extended time sufficient to support the maturation, differentiation and separation of cells in explant culture-cell and cell maintained.

세포와 비세포 기질(간질) 사이의 물리적 접촉의 일 예는 상피세포와 그 기저층 간의 물리적 접촉이다. An example of physical contact between the cells and the non-cell substrate (epilepsy) is the physical contact between the epithelial cells and their basal layer. 세포와 다른 세포 간의 물리적 접촉의 일 예로는 예컨대 틈새이음부 및 치밀이음부와 같은 세포간 세포 이음부에 의해 유지되는 실제 물리적 접촉을 포함한다. An example of physical contact between the cells and the other cells include, for example, actual physical contact is dense and genital teumsaeyi is held by the cell joints between the cells, such as the vagina. 한 세포와 다른 세포 간의 기능적 접촉의 예로는 세포 간의 전기적 또는 화학적 교통을 포함한다. Examples of functional contact between one cell and another cell includes electrical or chemical communication between cells. 예를 들어, 심근세포는 다른 심근세포 와 전기충격을 통해 교통한다. For example, the cardiomyocytes may transport through other cardiac cells and electric shock. 또한, 많은 세포들은 화학적 통신, 예컨대 국소 확산 호르몬(예컨대 주변분비 신호 및 자가분비 신호 호르몬) 또는 혈관계에 의해 보다 먼 위치로 전달되는 호르몬(내분비 신호 호르몬) 등을 통해 다른 세포와 교통한다. Furthermore, many cells have to communicate with other cells via chemical communication, for example, local diffusion hormone (e.g. paracrine signaling and autocrine signals hormone) or hormone delivered to more distant locations by the vascular system (endocrine hormonal signals), and the like. 세포 사이의 주변분비 신호의 예로는 소화관의 각종 세포(장내분비 세포로도 알려져 있음), 예컨대 근처 유문 위(G) 세포에 의해 가스트린 방출을 억제하는 소마토스타틴을 분비하는 유문 D 세포에 의해 생성되는 신호가 있다. Examples of paracrine signals between cells, signals produced by the pyloric D cells which secrete somatostatin which inhibit the various cells (Chapter endocrine also known as cells), for example, near the pylorus above (G) gastrin release by the cells of the digestive tract a.

본 발명의 미세구조는 최소 배지에서, 예컨대 외래원성 혈청이나 성장인자 없이 최소 배지에서 체외이식편의 유지에 매우 중요할 수 있는데, 그 이유는 체외이식편 내의 특이적인 세포 상호작용의 결과로 주변분비 인자 및 자가분비 인자에 의해 조직이 최소 배지에서 유지될 수 있기 때문이며, 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니다. In the microstructure is a minimal medium of the present invention, for example, may be very important to the maintenance of the explant in minimal media without foreign immunogenic serum or growth factors, because the paracrine as a result of specific cellular interactions within the explant factor and this is because tissue by autocrine factor may be maintained in a minimal medium, it is not to be limited to any particular theory.

또한, "유지, 시험관내, 이들의 물리적 및/또는 기능적 접촉"이란 용어는 적어도 하나의 세포가 생체내에서는 물리적 및/또는 기능적 접촉 상태에 있지 않은 적어도 하나의 세포 또는 비세포성 물질과 물리적 및/또는 기능적 접촉 상태를 형성하는 분리된 세포 집단을 배제한 것은 아니다. In addition, "holding, in vitro, their physical and / or functional contact" refers to the at least one cell with at least one cell in a living body are not in physical and / or functional contact with or Bisei vesicular material and physical and / or not excluding the isolated population of cells to form a functional contact. 이러한 발생의 일 예는 분리된 세포 집단의 적어도 하나의 세포의 증식이다. One example of such occurrence is a proliferation of at least one cell of the isolated population of cells.

바람직한 구체예에서, 체외이식편을 구성하는 세포 집단은 한 세포의 다른 세포에 대한 자연 친화성을 보존하는, 예컨대 체외이식편에 존재하지만 다른 세포 층을 보존하는 방식으로 기관으로부터 분리되어 있다. In a preferred embodiment, the population of cells that make up the explant is to preserve the natural affinity for the other cells of a cell, for example, present in the explants, but is separated from the engine in a manner that preserves the other cell layer. 예를 들어, 피부 미세기관 배양물의 경우에 표피의 각질세포는 간질에 결합된 상태를 유지하고 모낭과 샘을 포함하는 정상 조직 구조를 보존하고 있다. For example, the skin micro-organ cultures of epidermal keratinocytes in the case of water is maintained in a combined state epilepsy and preserve the normal tissue architecture, including hair follicles and glands. 이러한 기본 구조는 모든 기관, 예컨대 상피 성분을 포함하는 모든 기관에 일반적인 것이다. This basic structure is common to all organs, including all organs, e.g., epithelial component. 더욱이, 이러한 결합은 세포간 교통을 용이하게 해준다. Furthermore, this combination facilitates intercellular communication. 동물 세포 중에서는 다양한 유형의 교통이 일어난다. Among animal cells takes place two different types of traffic. 이것은 상호작용이 한 조직 또는 세포(유도)와 다른 조직 또는 세포(반응) 사이의 상호작용을 통해 유도가 일어나는 분화 세포에서 특히 중요한 것인데, 그 결과 반응 세포는 분화 방향으로 변화를 겪게 된다. Geotinde This interaction is particularly in a tissue or cell (induction) and other tissue or cell (reaction) cell differentiation induction occurs through the interaction between the key and, as a result the reaction cell undergoes a change in direction of differentiation. 또한, 유도 상호작용은 배아 세포와 성숙 세포에서도 일어나서 분화 유도뿐만 아니라 형태형성 패턴의 확립 및 유지 작용을 할 수 있다(Gurdon (1992) Cell 68:185-199). In addition, induced interaction can be established and maintained as well as the action of inducing differentiation to get up in the germ cells and mature cell type formation pattern (Gurdon (1992) Cell 68: 185-199).

또한, 본 발명에 따라 제조한 미세기관 배양물은 연장된 기간 동안 배양했을 때에도 정상적인 조직 구조를 보존한다. Moreover, the micro-organ cultures prepared according to the present invention will preserve normal tissue architecture even when cultured for extended periods of time. 여기에는, 생체내 정상적인 발생에 따라 시험관내 피부 미세기관에 모낭, 땀샘 및 피지선의 유지(실시예 VIII 및 도 10A 내지 도 10C) 또는 생체내에서 정상 발생된 췌장내 랑게르한스 섬의 유지가 포함된다(실시예 IV, V 및 VI 참조). There are included in vivo according to the normal occurrence hair follicles in vitro skin micro-organ, keeping the sweat glands and sebaceous glands (Example VIII and FIG. 10A to 10C) or maintenance of the inside islet pancreatic generating normal in vivo ( examples IV, V and VI refer). 이 배양물들은 조절된 균일한 상태로 유지될 수 있고 생체내 조직과 매우 유사하기 때문에, 자연 현상과, 질병, 노화 또는 외상으로부터 발생하는 자연 현상의 혼란을 관찰, 측정 및 조절할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다. Because this can be maintained in a uniform state waters cultured controlled and very similar to the in vivo tissue, observing the chaos of natural phenomena arising from natural phenomena, disease, aging or trauma, measurement, and a unique opportunity to adjust to provide. 또한, 배양물 상의 확인된 부위에서 각 세포를 연구할 수 있는 기술의 신속한 이용가능성은 기관의 각 성분들의 기능과 서로 간의 상호는 물론 전체 기관과의 상호작용을 관찰할 수 있도록 한다. In addition, the rapid availability of techniques to study individual cells at identified sites on the culture makes it possible to observe the interaction with each other, as well as the total engine features between each other and of each component of the engine.

본 발명에 따라 제조된 미세기관 배양물의 예는 이하 실시예에 기술하고 있고, 한 세포의 다른 세포에 대한 자연 친화성을 보존할 수 있도록 복수의 층을 포 함할 수 있는 방식으로 그룹화된 세포 집단을 포함할 수 있다. Micro-organ cultures of water for example prepared according to the present invention can, and described in the following embodiment, a population of cells grouped in a way that it can include a plurality of layers to preserve the natural affinity for the other cells of the cell It can be included. 각 세포 또는 세포 그룹의 증식은 관찰한 뒤 자동방사능사진촬영 또는 면역형광법을 실시할 수 있다. Growth of each cell or cell group can be performed was observed after the automatic photographing radioactive or immunofluorescence.

첨부되는 실시예는 단순히 보다 상세히 설명하기 위한 것으로서, 대상 배양물 시스템이 생리적 상태에 상당하는 시스템 내에서의 시험관내 상피 및 간질 인자의 복제를 제공함을 입증하는 것이다. Embodiment the accompanying examples are merely as illustrating in greater detail, it is to provide a proven in vitro replication of epithelial and stromal factors in the system that the subject culture system corresponds to the physiological state. 중요한 것은, 이 시스템에서 복제한 세포가 정상 표피 및 진피 성분을 형태적 및 조직학적으로 형성하기에 적당하게 이격된다는 점이다. Importantly, the cloned cells, in a system that adequately spaced to form the top epidermis and dermal components in the morphological and histological.

원 조직의 세포-세포, 세포-기질 및 세포-간질 구조를 보유하는 체외이식편을 분리하는 것 외에도 체외이식편의 크기는, 예컨대 미세기관 배양물을 연장된 기간, 예컨대 7 내지 21일 또는 그 이상 동안 유지시키고자 하는 경우에, 함유된 세포의 생존성에 중요하다. Original tissue cell-cell, cell-matrix and cell - in addition to separating the explant to hold the interstitial structure size of the explant is, for example, an extended period of time for the micro-organ culture, for example, for 7 to 21 days or more and if this character, it is important viability of the contained cells. 따라서, 조직 체외이식편의 크기는 적당한 영양소와 가스, 예컨대 O 2 는 3차원 미세기관의 모든 세포로 확산시키고 세포 폐기물은 상기 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관내 폐기물 국재화에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택한다. Thus, the size of the tissue explant is and spread with appropriate nutrients and gas, e.g., O 2 is the three-dimensional all cells of the micro-organ cell waste which is diffused out of the explant, micropores vitro waste localized cytotoxic and thus entails according to select to minimize death. 따라서, 체외이식편의 크기는 특수 전달 구조 또는 합성 기질 없이 각 세포에 대해 접근용이성의 필요한 최소 레벨에 따라 결정한다. Thus, the size of the explant is determined by the minimum level needed for easy access for each cell without any special transfer structures or synthetic substrates. 본 명세서에 기술하였듯이, 이러한 접근용이성은 체외이식편의 두께 및 폭으로부터 계산한 지수인 알레프(Aleph)가 적어도 약 1.5mm -1 보다 크면 유지될 수 있다는 것을 발견하였다. As described herein, this accessibility has been found that there is a factor of Aleph (Aleph) calculated from the thickness and width of the explant can be maintained at least greater than about 1.5mm -1.

본 명세서에 사용한 "알레프"는 화학식 1/x + 1/a≥1.5mm - 1 으로 나타내어지 는 표면적 대 부피비로서, 여기에서 x는 조직 두께(mm)이고 a는 조직의 폭(mm)이다. "Aleph" used herein has the formula 1 / x + 1 / a≥1.5mm - is a surface-area-to-volume ratio is not expressed by 1, in which x is a tissue thickness (mm) and a is the width (mm) of the tissue. 바람직한 구체예에서, 체외이식편의 알레프는 1.5 내지 25mm -1 범위, 보다 바람직하게는 1.5 내지 15mm -1 범위, 보다 더 바람직하게는 1.5 내지 10mm -1 범위인 것이 좋고, 특히 1.5 내지 6.67mm -1 범위, 1.5 내지 3.33mm -1 범위인 것이 좋다. In a preferred embodiment, explant of Aleph 1.5 to 25mm range -1, more preferably from 1.5 to 15mm -1 range, which may be more preferably 1.5 to 10mm -1 range, particularly 1.5 to 6.67mm -1 It may be in the range, 1.5 to 3.33mm -1 range.

따라서, 본 발명은 조직 체외이식편의 표면적 대 부피 지수가 소정 범위 내에서 유지되는 것이다. Accordingly, the present invention is that the surface area to volume index of the tissue explant maintained within a predetermined range. 이러한 소정 범위의 표면적 대 부피 지수는 단층 세포와 유사한 방식으로 확산에 의한 영양소에 대한 세포 접근과 폐기물 처리 수단에 대한 세포 접근을 허용한다. This surface area to volume index of the predetermined range allows the cells access to the access cell and waste disposal means for by diffusion in a manner similar to the single-layer cell nutrients. 이러한 레벨의 접근용이성은 표면적 대 부피 지수(본 명세서에서 "알레프 또는 알레프 지수"라고 표시함)가 적어도 약 1.5mm -1 이상인 경우 달성되어 유지될 수 있다. Accessibility of such a level is a surface area to volume index (also indicated as "Aleph or Aleph index" in this specification) can be maintained is achieved at least not less than about 1.5mm -1. 3차원의 변화는 부피와 표면적의 방사분석 변화를 유발하기 때문에 표면적 대 부피 지수를 측정하는 데에는 무시하였다. Changes in 3-D is ignored There measuring the surface area to volume index because it causes a radiometric changes in volume and surface area. 그러나, 알레프를 측정할 때에는 a와 x는 조직 절편의 가장 작은 두 치수로 제시되어야 한다. However, when a measure Aleph and x must be presented to the two smallest dimensions of the tissue sections.

알레프의 예는 표 I에 제시하였으며, 여기에서 예를 들어 두께가 0.1mm이고 폭이 1mm인 조직은 알레프 지수가 11인 것이다. Examples of Aleph was shown in Table I, in this example, an organization having a thickness of 0.1mm and a width of 1mm is an Aleph index of 11. 실시예 I에서, 알레프가 3.48이 되도록, 조직의 x는 0.3mm, a는 4mm로 하였다. In Example I, x of the tissue, such that Aleph This is 0.3mm 3.48, a was set to 4mm. 실시예 III에서는 x는 변화시키고 a는 4mm로 고정시켰다. In the example embodiment III x is a change and were fixed to 4mm. 도 6에 예시하였듯이, 증식 활성은 체외이식편의 두께가 증가할 때 크게 감소한다. As illustrated in Figure 6, proliferative activity is significantly decreased when increasing the thickness of the explant. 따라서, 미세기관 배양물 내 증식성 세포의 수는 두께가 900㎛ 일 때 두께가 300㎛인 유사 근원 유래의 조직에서보다 약 10배 정도 적었 다. Therefore, the number of micro-organ culture within the hyperplastic cells are wrote about more than 10 times in a similar origin derived 300㎛ thickness when the thickness is 900㎛ organization. 두께가 900㎛인 조직의 알레프 지수는 1.36mm - 1 으로, 본 발명에서 제시한 최소값 보다 적은 값인 반면 두께가 300㎛인 조직의 알레프 지수는 3.58mm - 1 으로, 본 발명에서 제시한 범위에 속하는 것이었다. Aleph of a thickness of 1.36mm 900㎛ organization index - 1, the Aleph index for a tissue having a thickness of a minimum value less than the other hand 300㎛ proposed in the present invention is 3.58mm - fall within the scope set forth in the first invention It was.

표 1 Table 1

a(폭)과 x(두께)(mm -1 )의 함수로서 표면적 대 부피비 지수인 여러 "알레프" 값 a (width) and x (thickness) as a function of a (mm -1) surface area to volume ratio of the index number "Aleph" value

또한, 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 3차원 배양 시스템에 의해 제공되는 많은 인자들은 이 시스템의 성공에 기여할 수 있다: Also, to limit to a particular theory, a number of factors provided by the three-dimensional culture system may contribute to the success of this system:

(a) 예컨대 상기 알레프 계산을 이용하여 선택한 체외이식편 크기의 3차원 기질은 체외이식편의 모든 세포로 영양소를 적당히 확산시킬 수 있고 체외이식편의 모든 세포로부터 세포 폐기물을 적당히 확산시킬 수 있는 적당한 표면적 대 부피비를 제공한다. (A) for example, three-dimensional substrate of the explant size selected using the above Aleph calculations can be appropriately diffusion of nutrients to all cells of the explant, and adequate surface area to volume ratio capable of properly spread the cell waste from all the cells of the explant It provides.

(b) 기질의 3차원성으로 인하여, 각종 세포는, 융합성이 될 때까지 증식하여 접촉 억제를 나타내고 성장과 분열을 중단하는 단층 배양물 중의 세포와 달리 활성적 증식을 지속한다. (B) due to the three-dimensionality of the matrix, various cells, the proliferation until a confluent indicates the contact inhibition and continue to actively proliferating cells in monolayer culture, unlike the water to stop the growth and division. 체외이식편의 세포 복제에 대한 성장 인자와 조절 인자의 기여도는 배양물에서, 예컨대 총 부피면에서 정지상태인 미세기관 배양물에 대해서도 세포 증식 자극과 분화 조절에 부분적인 책임이 있을 수 있다. The contribution of growth factors and regulatory factors on cell replication of the explant may be in part responsible for the culture, for example, stimulates cell proliferation and differentiation regulation also on the micro-organ culture is stopped in the total volume of water surface.

(c) 3차원 기질은 생체내 대응 조직에서 발견되는 것과 거의 유사한 세포 성분의 공간적 분포를 보유한다. (C) 3-dimensional matrix retains a spatial distribution substantially similar to the cellular components to those found in corresponding tissues in vivo.

(d) 세포-세포 및 세포-기질 상호작용은 세포 성숙에 도움이 되는 국소적 미소환경을 확립시킬 수 있다. (D) cell-cell and cell-matrix interaction can be established by local smile environment conducive to cell growth. 분화된 세포 표현형의 유지에는 성장/분화 인자뿐만 아니라 적당한 세포 상호작용이 필요하다는 것이 확인되었다. The maintenance of a differentiated cell phenotype has been confirmed that not only growth / differentiation factors need proper cell interactions. 본 발명은 조직 미소환경을 효과적으로 모방하는 것이다. The present invention is to effectively mimic the smile environmental organizations.

하기 예시적 실시예들에 기술한 바와 같이, 동물(인간 포함) 유래의 미세기관 배양물, 예컨대 피부, 췌장, 간, 신장, 십이지장, 방광, 골수, 흉선 또는 비장 유래의 미세기관 배양물을 분리하여 최고 21일까지 배양물에서 증식시켰다. To as described in the exemplary embodiment, the animal (including human), the micro-organ culture of the derivatives, e.g., skin, pancreas, liver, kidney, duodenum, bladder, bone marrow, thymus or remove the micro-organ cultures of spleen-derived and up to 21 days were grown in culture. 하지만, 21일 이상의 연장된 기간 동안 배양물을 유지하는 것도 본 발명의 영역에 속하는 것이다. But also to maintain the culture for an extended period of time more than 21 days to within the scope of the invention.

II. II. 미세기관 배양물에 사용되는 체외이식편의 근원 Of explant sources used in the micro-organ culture

대상 미세기관 배양물은 예를 들어, 피부 및 점막(예컨대, 구강 점막, 위장 점막, 비측관, 호흡관, 경부 및 각막); Subject micro-organ culture, for example, skin and mucosal (e.g., oral mucosa, gastrointestinal mucosa, the non-bypass, respiratory tract, cervix and cornea); 췌장; Pancreas; 간; liver; 담낭; Gallbladder; 담즙관; Bile duct; 폐; lungs; 전립선; prostate; 자궁; Womb; 유선; cable; 방광 조직; Bladder tissue; 및 흉선, 비장 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등으로부터 분 리한 체외이식편을 사용하여 유도할 수 있다. And convenient minutes from thymus, blood agencies such as the spleen and the bone marrow can be derived using explants. 따라서, 이러한 기관의 시험관내 배양 동등물을 제조할 수 있다. Thus, the equivalent in vitro culture of these bodies can be produced with water. 체외이식편을 형성하는 조직은 질병에 걸린 것이거나 정상(예컨대, 건강한 조직)인 것일 수 있다. Tissue forming the explants can be diseased or that a normal (e.g., healthy tissue). 예를 들어, 본 발명의 미세기관 체외이식편이 분리되는 기관은 과증식 질환, 예컨대 건선 또는 각질증; For example, the micro-organ explant is removed organs of the invention are hyperproliferative diseases, such as psoriasis or keratin increased; 바이러스 감염 세포, 예컨대 간염 바이러스 감염 세포, 또는 유두종 바이러스 감염 세포의 증식; Proliferation of virus-infected cells, e.g., hepatitis virus-infected cells, or HPV-infected cells; 신생증식성 질환, 예컨대 기저 세포 암종, 편평세포 암종, 육종 또는 윌름즈 종양; Start-proliferative diseases, such as basal cell carcinoma, squamous cell carcinomas, sarcomas or Will reumjeu tumor; 또는 섬유증 조직, 예컨대 경화증 간 또는 췌장염이 있는 췌장 유래의 섬유증 조직을 갖고 있는 것일 수 있다. Or a tissue fibrosis, such as liver cirrhosis or fibrosis of the pancreas tissue derived with pancreatitis might be having.

본 발명의 세포를 분리할 수 있는 동물의 예로는 인간 및 다른 영장류, 돼지, 예컨대 완전 동종 번식 또는 부분 동종 번식 돼지(예, 축소 돼지 및 트랜스제닉 돼지), 설치류 등이 있다. Examples of the animal to remove the cells of the present invention include humans and other primates, swine, such as completely or partially inbred inbred swine (e.g., pig reduction and transgenic swine), rodents.

III. III. 성장 배지 Growth medium

동물 유래의 세포를 배양하는데 사용할 수 있는 조직 배양 배지에는 다수가 있다. Tissue culture media that can be used for culturing the cells of animal origin, there are a number. 이 중 몇몇은 복잡하고 일부는 단순하다. Some of these are complex and some are simple. 미세기관 배양물은 복합 배지에서 증식할 수 있을 것으로 예상하지만, 본원에서는 둘베코 최소 필수 배지와 같은 단순 배지에서도 배양물을 유지시킬 수 있음을 확인하였다. Micro-organ culture is expected to multiply in a complex medium, but in the present it was confirmed that even in a simple medium such as Dulbecco's minimum essential medium to maintain the culture. 또한, 혈청이나 다른 생물학적 추출물, 예컨대 뇌하수체 추출물을 함유하는 배지에서 배양물을 증식시킬 수도 있으나, 본원에서는 혈청이나 다른 생물학적 추출물이 필요하지 않은 것을 확인하였다. Further, also possible to multiply the culture in a culture medium containing serum or other biological extracts such as pituitary extract. However, in the present application was confirmed to be that do not require serum or other biological extracts. 또한, 기관 배양물은 연장된 기간 동안 혈청 없이 유지될 수 있다. Further, the organ cultures can be maintained without serum for an extended period of time. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 시험관내 배양물의 유지 동안의 배지에는 성장 인자를 첨가하지 않는다. In a preferred embodiment of the present invention, no addition of growth factors in the culture medium for in vitro culture of water retention.

최소 배지에서의 성장과 관련된 요점은 중요하다. Key points related to the growth in minimal media is important. 현재, 포유동물 세포을 연장하여 성장시키기 위한 대부분의 배지 또는 시스템은 미정의 단백질을 포함하거나 상기 성장을 유지하는데 필요한 단백질을 제공하는 공급 세포를 사용한다. At present, most mammalian culture medium for growing the animal extending sepoeul or system uses the supplied cells to provide proteins necessary to include the crude protein, or maintaining the growth.

본 명세서에 사용된, "최소 배지"란 용어는 세포가 생존하고 배양물에서 증식하는데 필요한 영양소만을 포함하는 화학적 성분이 분명한 배지를 의미한다. The "minimal media" is the term used herein refers to cells that survive and obvious chemical components containing only nutrient required for growth in culture medium. 일반적으로, 최소 배지에는 생물학적 추출물, 예컨대 성장인자, 혈청, 뇌하수체 추출물, 또는 배양물 중의 세포 집단의 생존과 증식을 지원하는데 필요하지 않은 기타 다른 물질이 없다. In general, a minimal medium, there is no other substance biological extracts, for example, are not required to support the growth factors, serum, pituitary extract, or culture viability and proliferation of the cell population in the water. 예를 들어, 최소 배지는 일반적으로 적어도 하나의 아미노산, 적어도 하나의 비타민, 적어도 하나의 염, 적어도 하나의 항생제, 수소 이온 농도 측정에 사용되는 적어도 하나의 지시인자, 예컨대 페놀 레드, 글루코스, 및 세포의 생존과 증식에 필요한 기타 다른 미셀성 성분을 포함한다. For example, the minimal medium is usually at least one amino acid, at least one vitamin, at least one salt, at least one instruction parameters to be used in at least one of the antibiotics, the pH value measurement, such as phenol red, glucose, and cell and the survival and proliferation including other St. Michelle necessary ingredients. 최소 배지는 무혈청성이다. The minimum medium is bloodless rust. 각종 최소 배지는 기브코(Gibco) BRL(미국 매릴랜드주 게터스버그 소재)로부터 최소 필수 배지로서 입수용이한 것이다. Various minimal medium is Gibco (Gibco) is a readily available as a Minimum Essential Medium from BRL (USA Maryland Crab Charters bugs material).

그러나, 성장 인자와 조절 인자는 이 배지에 첨가할 필요는 없으나 이러한 인자들의 첨가 또는 다른 특수 세포의 접종은 배양물내 증식과 세포 성숙을 향상시키거나 변질시키거나 또는 변조시키는데 사용할 수 있다. However, growth factors and regulatory factors need not be added to the culture medium inoculated with the addition of these factors, or other specialized cells may be used to either enhance the culture mulnae proliferation and cell maturation, or altered or modulated. 배양물에서의 세포의 증식과 활성에는 각종 성장 인자, 예컨대 인슐린, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 간 적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 및 간세포 성장 인자가 영향을 미칠 수 있다. Of in the culture cell growth and activity include various growth factors such as insulin, growth hormone, Soma Sat medin, colony stimulating factors, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoietic factor (HEPA Topo The tin), and hepatocyte growth factors which may affect. 증식 및/또는 분화를 조절하는 다른 인자로는 프로스타글란딘, 인터루킨 및 자연 발생의 음성 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 및 형질전환 성장 인자 β군 성분이 있다. In other factors that regulate the proliferation and / or differentiation has a negative growth factor, fibroblast growth factor, and transforming growth factor β group component of the prostaglandin, interleukins and naturally occurring.

미세기관 배양물은 24웰 또는 96웰 미량평판과 같은 적합한 모든 배양 용기에서 유지시킬 수 있으며 37℃, 5% CO 2 하에서 유지될 수 있다. Micro-organ cultures can be maintained in any suitable culture vessel such as 24 well or 96-well plate and a very small amount can be kept under 37 ℃, 5% CO 2. 배양은 호기성 향상을 위해 진탕시킬 수 있는데, 진탕 속도는 예컨대 12 rpm이다. Cultures may be shaken for improved breathable, agitation rate is for example 12 rpm.

대상 미세기관 배양물(경우에 따라)이 위나 안에 제공되는 배양 용기와 관련하여, 바람직한 구체예에서는 이러한 용기가 일반적으로 임의의 재료 및/또는 형태일 수 있음을 유의해야 한다. Subject micro-organ cultures in relation to the culture vessel is provided in the water (as the case may be) it is above or, in the preferred embodiment should be noted that such a container is generally any material and / or be in the form. 용기 형성에 사용할 수 있는 각종 재료들로는 나일론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(예, 폴리비닐클로라이드), 폴리카보네이트(PVC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 테플론), 터마녹스(TPX), 니트로셀룰로스, 면, 폴리글리콜산(PGA), 창자실봉합사, 셀룰로스, 젤라틴, 덱스트란 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. Include any material that can be used for forming the container of nylon (polyamide), dark Ron (polyester), polystyrene, polypropylene, polyacrylates, polyvinyl compounds (e.g., polyvinylchloride), polycarbonate (PVC), polytetramethylene fluoro-ethylene; and the like (PTFE Teflon), teoma Knox (TPX), nitrocellulose, cotton, polyglycolic acid (PGA), intestinal chamber sutures, cellulose, gelatin, dextran, are not limited. 이러한 재료들은 모두 망(mesh)으로 제직될 수 있다. These materials can all be woven with a network (mesh). 미세기관 배양물이 생체내에서 스스로 이식되어야 하는 경우에는 폴리글리콜산, 창자실봉합사 또는 젤라틴 등의 생체분해성 기질을 사용하는 것이 바람직할 것이다. When the micro-organ culture is itself to be implanted in vivo, it may be desirable to use a biodegradable matrix, such as polyglycolic acid, gut suture thread or gelatin. 배양물이 장기간동안 유지되어야 하거나 동결보존되어야 하는 경우에는 비분해성 재료인, 나일론, 다크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 면 등이 바람직할 수 있다. When the culture is to be preserved or frozen to be maintained for a long period of time, there is a non-degradable material, nylon, dark Ron, polystyrene, polyacrylate, polyvinyl, Teflon, surface, etc. may be preferred. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 편리한 나일론 망은 평균 소공 크기 210㎛, 평균 나일론 섬유 직경 90㎛의 나일론 여과 망인 Nitex 이다(#3-210/36, Tetko, Inc. NY). Convenient nylon mesh which can be used according to the invention the average pore size 210㎛, average nylon fiber diameter of the nylon filtration 90㎛ mangin Nitex (# 3-210 / 36, Tetko, Inc. NY). 또 다른 구체예들은 하기에 설명하였다. Another embodiment are described below.

예시적 구체예로서, 랑게르한스 섬을 함유하는 췌장 미세기관은 본 발명의 배양물로서 제조한다. An exemplary embodiment, pancreatic micro-organs containing islets are prepared as cultures of the present invention. 이 배양물을 그 다음 면역거부를 피하기 위하여 캡슐화 형태로 준비한다. Prepare the culture in encapsulated form in order to avoid the immune rejection following. 캡슐화의 일반적(예시적)인 3가지 방법을 사용할 수 있을 것이다. In general (exemplary) of encapsulation would be to use three methods. 첫째는 미세기관 체외이식편을 함유하는 틀에 관형 막을 감는다. First, the tubular film wound on the frame containing the micro-organ explant. 이 막을 중합체 이식편에 연결하고 그 다음 이 장치를 혈관에 연결시킨다. The film is connected to the graft polymer, and thus the following is connected to the device to a blood vessel. 글루코스와 인슐린은 막을 통해 앞뒤로 자유 확산하고 항체와 림프구의 통행은 차단하도록 막 투과성을 조절함으로써, 이 장치로 처리된 췌장절제술을 받은 동물에서 정상혈당이 유지될 수 있다(Sullivan et al.(1991) Science 252:718). Glucose and insulin is the passage of the free diffusion and antibody and lymphocyte back and forth through the membrane is, by controlling the membrane permeable to, the animal received a pancreatic cancer treated with the device normal blood glucose may be maintained off (Sullivan et al. (1991) Science 252: 718).

두 번째 방법으로서, 췌장 체외이식편을 함유하는 중공 섬유를 다당류 알기네이트에 고정(경우에 따라)시킨다. Both as a second method, to secure (as the case may be) the hollow fibers to find polysaccharide carbonate containing the pancreatic explants. 이 장치가 당뇨병 동물의 복강내에 배치되면 혈당 농도가 저하되고 양호한 조직 화합성이 관찰될 수 있다(Lacey et al.(1991) Science 254: 1782; 실시예 VI 참조). This may be when the device is placed intraperitoneally in diabetic animals, blood glucose concentration is reduced, and good tissue Chemistry synthesis was observed (Lacey et al (1991) Science 254: 1782; see Example VI.). 따라서, 섬유를 사전방적한 뒤 이어서 미세기관 체외이식편에 장입시킬 수 있다(Aebischer et al. 미국 특허 제4,892,538호; Aebischer et al. 미국 특허 제5,106,627호; Hoffman et al.(1990) Expt. Neurobiol. 110:39-44; Jaeger et al.(1990) Prog. Brain Res. 82:41-46; 및 Aebischer et al.(1991) J.Biomech Eng. 113:178-183). Therefore, after the fibers in advance spinning can then be loaded into a micro-organ explant (Aebischer et al U.S. Patent No. 4,892,538 arc;. Aebischer et al U.S. Patent No. 5,106,627 arc;... Hoffman et al (1990) Expt Neurobiol. 110: 39-44; Jaeger et al (1990) Prog Brain Res 82:... 41-46; and Aebischer et al (1991) J.Biomech Eng 113:.. 178-183).

셋째, 알기네이트나 폴리아크릴레이트로 구성된 미세캡슐에 미세기관 섬 체외이식편을 주입할 수 있다(예컨대, Lim et al.(1980) Science 210:908; O'Shea et al.(1984) Biochim. Biophys. Acta 840:133; Sugamori et al(1989) Trans Am.Soc. Artif.Intern. Organs 35:791; Levesque et al.(1992) Endocrinology 130:644; 및 Lim et al(1992) Transplantation 53:1180). Third, alginate or poly in microcapsules consisting of acrylates can be injected into the micro-organ explant island (e.g., Lim et al (1980) Science 210:... 908; O'Shea et al (1984) Biochim Biophys . Acta 840: 133; Sugamori et al (1989) Trans Am.Soc Artif.Intern Organs 35:.. 791; Levesque et al (1992) Endocrinology 130:. 644; and Lim et al (1992) Transplantation 53: 1180) .

마지막으로, 본 발명의 미세기관 배양물이 유지되는 배양 배지를 수집하여 합성 배지원으로서 사용할 수 있음을 주지해야 한다. Finally, by collecting the culture medium which is the micro-organ culture is maintained according to the present invention it should be noted that they can be used as a synthesis support ship. "합성 배지"란 용어는 배양된 세포/조직이 없는 상청액을 의미하는 것으로서, 일정 시간 후 그 배지는 세포에 의해 생산되고 배양물에 분비된 특정 주변분비 및/또는 자가분비 인자를 포함하여 변질될 정도로 배양 세포와 접촉시킨다. The term "synthetic medium" means' is the mean free cultured cells / tissue supernatant, after a period of time that the medium is produced by a cell and a particular secreted to the culture paracrine and / or self-be altered to include a secretion factor so it is brought into contact with cultured cells. 이러한 산물의 예로는 인슐린, 각종 성장 인자 및 호르몬이 있다. Examples of such products are insulin, various growth factors, and hormones. 이러한 합성 배지는 다른 종류의 세포 및 조직 배양용 배양 배지로서 사용할 수 있다. The synthetic medium can be used as culture medium for cell and tissue culture of other types. 또는, 합성 배지는 성장 인자와 같은 신규 세포 산물원으로서 이용할 수도 있다. Alternatively, synthetic media may be used as a novel cell products such as a growth factor source. 이러한 산물은 합성 배지로부터 분획화한 뒤 정제하거나 실질적으로 정제할 수 있다. This product can be purified, or substantially purified after fractionation from the synthetic medium.

IV. IV. 미세기관 배양물의 생물학적 성질 측정 Micro-organ culture of biological properties measured

정상 조직에서 얻은 본 발명의 미세기관 배양물은 조직 전체가 성장됨이 없이 구성형 세포의 증식으로 항상성 상태를 유지하는 것으로 관찰되었다. The micro-organ cultures of the present invention derived from normal tissue has been observed to maintain the homeostasis conditions by proliferation of the cell-configuration without the entire tissue being grown.

세포 증식을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 가장 일반적인 방법은 세포 복제의 특징적인 DNA 합성을 측정하는 것이다. Method of measuring cell proliferation are well known in the art, and the most common method is to measure the characteristic of DNA synthesis of cellular replication. DNA 합성을 측정하는 방법으로는 당해 기술분야에 수많은 방법이 공지되어 있으며, 이중 어느 한 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. By measuring DNA synthesis are known a number of methods in the art, any of the dual method can be used in accordance with the present invention. 본 발명의 일 구체예에서, DNA 합성은 방사능 표지( 3 H-티미딘) 또는 표지된 뉴클레오타이드 유사체(BrdU)를 사용하여 면역형광성을 검출함으로써 측정하였다. In one embodiment of the invention, DNA synthesis was measured by detecting the immune fluorescence using a radioactive label (3 H- thymidine) or labeled nucleotide analogues (BrdU).

미세기관 배양물은 성숙 세포의 증식은 물론 전구체 세포, 예컨대 몇몇 경우에는 배아 세포의 활성적 참여를 통해 제조하고 유지시킬 수 있다. Micro-organ cultures may be proliferation of mature cells but also a precursor cell, e.g., in some cases prepared by the active participation of the germ cells and maintain. 이 미세기관 배양물은 상기 전구체 세포를 보존, 동정, 분리하고 자연적 진화를 용이하게 하는 적합한 환경을 제공하는 것으로 확인되었다. The micro-organ cultures was found to provide a suitable environment for facilitating the retention of the precursor cells, identified, isolated and natural evolution. 예를 들어, 기저층의 미성숙 세포는 피부 미세기관 배양물에서 성숙 각질세포가 되는 것으로 관찰되었고, 이와 마찬가지로 배아 췌장 세포는 미세기관 배양물에서 성숙 췌장 상피세포를 제공할 수 있었다. For example, the immature cells of the basal layer have been observed to mature keratinocytes in skin micro-organ cultures, Similarly, embryonic pancreatic cells could provide a mature pancreatic epithelium in micro-organ cultures. 전구체 세포의 성숙과 잇따른 이들의 성숙 세포로서의 기능화는 특정 산물, 예컨대 표피 세포에서의 특정 각질, 췌장 상피에서의 인슐린, Glut2 및 글루카곤, 및 간 미세기관 배양물에서의 알부민 및 VIII 인자 등의 분비를 측정하여 모니터할 수 있다. Functionalized as a precursor cell maturation and subsequent thereof mature cells is the secretion of such specific products, such as specific keratin in the epidermal cells, insulin in the pancreatic epithelium, Glut2 and glucagon, and liver micro-organ albumin in the culture, and VIII factors It can be measured to monitor.

본 발명에 따라 제조한 미세기관 배양물은 생체내에 존재하는 정상 조직 구조를 보존한다. A micro-organ cultures prepared according to the present invention will preserve the normal tissue architecture that is present in vivo. 전술한 바와 같이, 그 예로는 생체내 정상적인 발현에 따르는, 시험관내 피부 미세기관 중의 모낭, 땀샘 및 피지선의 유지 및 췌장 미세기관에 존재하는 글루카곤 분비 세포의 유지를 포함한다. As it described above, and its examples include a living body in accordance with the normal expression, in vitro skin, hair follicles, sweat glands and keep and maintain the secretion of glucagon-cells in the pancreas micro-organ of the sebaceous glands in the micro-organ. 이들 배양물은 조절되는 균일한 조건하에서 유지될 수 있고 생체내 기관의 미세구조와 매우 유사하기 때문에, 자연 현상과 질병, 노화 또는 외상에 의해 발생하는 자연 현상의 혼란을 관찰하고 측정하여 조절할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다. These cultures can be maintained under uniform conditions, which are modulated and which because it is very similar to the microstructure of the in vivo organ, it can be adjusted by observing the confusion of the natural phenomena caused by natural phenomenon and disease, aging or trauma and the measurement It provides a unique opportunity. 또한, 배양물 상의 확인된 부위에서 각 세포를 연구할 수 있는 기술의 신속한 이용가능성은 기관의 각 성분들의 기능과 서로간의 상호은 물론 전체 기관과의 상호작용을 관찰할 수 있도록 한다. In addition, the rapid availability of techniques to study individual cells at identified sites on the culture makes it possible to observe the sanghoeun well as interaction with the overall engine functionality between each other and of each component of the engine.

또한, 대상 미세기관 배양물은 연장된 시간 동안 배양 유지할 수 있다. In addition, the subject micro-organ cultures can be maintained for an extended incubation time. 바람직하게는, 적어도 약 24시간 이상 배양 유지할 수 있고, 보다 바람직하게는 적어도 약 2일 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 5일 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 7일 동안, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 2주 또는 그 이상 동안 배양 유지할 수 있다. Preferably, at least, and can maintain at least about 24 hours of incubation, more preferably, even more preferably for about 2 days, while more preferably about 5 days, at least more, more preferably at least about 7, more than one at least It may maintain the culture for at least about 2 weeks or more. 본 발명의 미세기관 배양물은 일반적으로 적어도 7일 이상 동안 배양 유지되는 것이다. The micro-organ cultures of the present invention is typically maintained in culture for at least seven days. 일 예로서, 인간, 마우스, 기니아 피그 및 래트 피부의 피부 미세기관 배양물은 적어도 약 21일 이상 동안 배양 유지되었다. In one example, the skin micro-organ cultures of the human, mouse, guinea pig and rat skin was maintained in culture for at least about 21 days at least.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "배양 유지가능한"이란 용어는 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 세포가 특정 기간 후 배양물에서 생존성을 유지하는 조직 체외이식편의 세포 집단을 의미한다. As used herein, "culture as possible," the term is at least about 60%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 80% and even more preferably at least about 90%, most preferably refers to a population of cells of a tissue explant of more than 95% or the cells maintain viability in the culture after a certain period of time.

바람직한 구체예에서, 미세기관 배양물 중에 존재하는 세포의 세포 상실, 예컨대 사멸이나 탈피에 의한 세포 상실에 대한 세포 증식의 비는 1과 동일한 것으로서, 즉 상실된 세포 수와 증식 세포 수가 동일하다. In a preferred embodiment, the micro-organ culture exists cell loss of the cells in water, such as the ratio of cell proliferation to cell loss due to death or escape is equal to 1, that is equal to the number of lost cell number and cell proliferation. 본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 배양물에 존재하는 세포의 세포 상실에 대한 세포 증식의 비는 1 보다 큰 것으로서, 상실되는 세포 보다 더 빠른 속도로 세포가 증식한다. In another embodiment of the invention, the ratio of cell proliferation to cell loss of the cells present in the micro-organ culture as is greater than 1, and the cell growth at a faster rate than the loss of cells. 후자의 경우에 미세기관 배양물은 증폭되는 세포 집단을 포함하는 것으로 사료된다. Micro-organ cultures in the latter case is considered to include a population of cells to be amplified.

V. 미세기관 배양물의 적용 V. Application of water micro-organ culture

본 발명의 미세기관 배양물을 이용할 수 있는 적용 예로는 다음과 같은 것이 있다: An example application that may take advantage of a micro-organ cultures of the present invention are explained as follows:

(a) 정상적인 조직과 기관의 항상성에 관여하는 인자의 동정; (A) identification of factors involved in normal homeostasis of tissues and organs;

(b) 영양소 변화를 비롯한 환경 변화 및 잠재적 독성제의 존재에 대한 정상적인 기관의 조직과 세포의 항상성에 미치는 영향 연구; (B) influence the organization of the normal organization of the existence of environmental changes, including changes in nutrients and the potentially toxic and on the study of cell homeostasis;

(c) 발병이나 외상 초기 및 발병이나 외상 중에 야기되는 기관의 조직과 세포에서 나타나는 변화 경로에 대한 이해; (C) understanding the changing paths that appear in the tissues and cells of organs, which is caused during the onset and early onset or trauma or trauma;

(d) 발병이나 외상과 관련된 변화 환경에서의 악영향을 반전시키는 수복 기작의 동정; (D) identification of repair mechanisms that reverse the adverse effects of changes in the environment related to the onset or trauma;

(e) 정상적인 조직의 항상성 동안 분화하는 세포의 발생 조절; (E) the regulation of cells that differentiate during the normal tissue homeostasis;

(f) 모낭과 같은 기관내 존재하는 세분화된 구조의 발생 조절; (F) the regulation of the granular structures present in the organ, such as hair follicles;

(g) 개개인의 기관 일부를 보유하지만 만성 피부 궤양, 각종 형태의 당뇨병 또는 만성 간 손상을 앓고 있는 환자에서 발생하는 것과 같은 손상 조직의 대체 또는 재생에는 불충분한 기관 보충/이식; (G) the individual holds some institutions, but a chronic skin ulcers, replacement or regeneration has insufficient authority supplement / transplantation of tissue damage such as occurs in patients suffering from various forms of diabetes or chronic liver damage;

(h) 약물 선발 및 세포독성 연구를 위한 조직/기관 동등물로서의 용도; (H) use as drug selection and cell tissue / organ equivalents for the toxicity studies;

(i) 증식 질환의 진단 분석용으로서의 용도; (I) for use as a diagnostic analysis of the proliferative disease;

(j) 신규 성장 인자의 근원으로서의 용도; (J) use as a source of novel growth factors;

(k) 줄기/선조세포의 근원으로서의 용도; (K) as a source applications of stem / progenitor cells;

(l) 분자를 유도하는 근원으로서의 용도; (L) use as a source of inducing molecules;

(m) 분자를 유도하는 선발용으로서의 용도; (M) for use as a starter to drive the molecule;

보다 상세히 설명하면, 본 발명의 방법은 피부 동등물을 미세기관 배양물의 형태로 생성하는데 사용할 수 있다. To be more specific, the process of the invention can be used to produce water equal to the skin form micro-organ cultures of water. 배경기술로서, 상처 치료 목적, 특히 화상 치료 목적으로 인간 피부를 모방하는 방식으로 상피 세포를 증식시키기 위한 다수의 시도들이 개시되어 있음은 잘 알고 있을 것이다. As a background, it is disclosed that the purpose of wound healing, in particular, a number of attempts to propagate epithelial cells in a manner that mimics the human skin burn treatment purposes they will be familiar with. 피부는 2종의 조직으로 이루어져 있다. The skin consists of two tissues. 이들은 (1) 신경, 혈관 및 지방 세포뿐만 아니라 고밀도 콜라겐 기질내에 드문드문 분산되어 있는 섬유아세포를 포함하는 간질 또는 표피와, (2) 치밀하게 충전된 활성 증식형 미성숙 상피 세포의 표피 기저층을 포함하는 표피이다. These are (1) the nerves, including a sparse interstitial which includes fibroblasts that dispersion or skin and, (2) epidermal basal layer of tightly filled active proliferative immature epithelial blood vessels and fat cells, as well as in a high density collagen matrix the epidermis. 기저층 세포가 복제하면, 어린 세포 중 일부는 기저층에 그대로 남아있는 반면 다른 세포는 층 밖으로 이동하여 크기가 증가하고 사실상 계면활성제 및 환원제에 대해 내성인 엔벨로프를 형성시킨다. When the base layer replicate the cell, some of the young cells causes other cells increase in size to go out while the layer remains on the base layer, and in fact forms a resistant envelope for the surface active agent and a reducing agent. 인간의 경우, 기저층에서 발생한 세포는 가장자리 또는 외층에 도달하는데 약 2주가 소요되고 그 이후 세포는 사멸하여 탈피된다. In humans, cells generated in the basal layer takes about 2 weeks to reach the edge or outer layer, and after that cells are peeled by apoptosis. 피부는 각종 구조, 예컨대 모낭, 피지선 및 땀샘을 포함한다. The skin contains various structures such as hair follicles, sebaceous glands and sweat glands. 모낭은 표피의 함입이 치밀하게 채워져 있는 각질세포의 분화로부터 생성된다. Hair follicles are produced from the differentiation of keratinocytes, which are densely filled depressions of the epidermis. 이러한 함입으로부터 형성된, 개방 말단형 소포는 분비된 각질을 수집하고 농축하여 털 필라멘트를 생성한다. , The open end type package formed from such a constriction is to collect and concentrate the secreted keratin and a hair filament generation. 또는, 함입을 내면에 채워진 표피 세포는 유체(땀샘) 또는 피지(피지선)를 분비할 수 있다. Alternatively, epidermal cells, the filled depressions on the inner surface may secrete fluids (sweat gland) or sebum (sebaceous gland). 이러한 구조의 형성과 증식의 조절은 알려져 있지 않다. Regulation of formation and proliferation of these structures is unknown. 건강한 피부의 일정한 재생은 신생 세포가 생산되고 노화 세포가 사멸하는 균형있는 공정에 의해 이루어진다. Constant regeneration of healthy skin is achieved by a balanced process that produces a new cell apoptosis and cell aging. 노화 시 발생하고, 또한 이러한 균형을 붕괴시키는 질병과 외상을 통해 나타나는 이상 현상에 대응하기 위해서는 정확한 조절을 실시할 수 있는 방법에 대한 이해가 필요하다. It generated during the aging, and further an understanding of the way to carry out accurate control is required to respond to anomalies that appear through disease and trauma that disrupt this balance.

본 발명의 일 구체예에서, 미세기관 배양물의 미세구조는 생체내 피부의 미 세구조와 유사하거나 거의 동일하여, 예컨대 상피조직/결합조직 구조를 보유한다. In one embodiment of the invention, the micro-organ cultures of water microstructure will have the similar or almost equal to, for example epithelial tissue / connective tissue structure and the fine-structure of the skin in a living body. 예를 들어, 피부 미세기관 배양물에서, 표피의 각질세포는 결합조직에 결합된 상태를 유지하며 모낭을 포함하는 정상 조직 구조가 보존된다. For example, in skin micro-organ cultures, keratinocytes of the epidermis is maintained a state bonded to the connective tissue and the normal tissue is conserved structure, including the hair follicles. 피부 조직 절편에서 수득한 미세기관 배양물은 또한 표피 세포를 지지하는 바닥판, 진피 세포를 포함하는 세포외 기질 및 적어도 하나의 함입, 예컨대 적어도 하나의 모낭을 포함할 수 있다. A micro-organ obtained from skin tissue slice cultures is also a bottom plate for supporting the epidermal cells, an extracellular matrix containing the dermal cells, and at least one of the constriction, such as may include at least one hair follicle. 피부 상피 조직과 피부 결합 조직 사이의 결합은 세포간 교통을 용이하게 해준다. The bond between the skin and the skin epithelial connective tissue facilitates intracellular transport. 더욱이, 전두께의 피부는 공기 계면을 허용하는 각종 방식으로 증식시킬 수 있다. Furthermore, the skin of the entire thickness can be grown in a variety of ways allowing an air interface. 체외이식편의 각질세포가 공기에 노출되면 각질세포의 보다 신속한 분화 및 각질 층의 보다 광범위한 분비가 촉진되며, 이는 피부 투과 연구에 매우 중요할 수 있다. When the keratinocyte explants exposed to air more extensive differentiation and rapid secretion of keratin layer of dead skin cells and stimulate more, which can be very important in skin permeation studies.

마지막으로, 최근 연구들에서는 피부가 면역계의 중요한 활성 요소임이 시사되고 있음을 상기해야 한다(Cooper et al. (1987) The mechanobullous disease. In: Dermatology in General Medicine, 3d. Ed., McGraw Hill, NY(pp. 610-626)). Finally, in the recent study and the skin should be said that is suggested to be a major active component of the immune system (Cooper et al (1987) The mechanobullous disease In:.... Dermatology in General Medicine, 3d Ed, McGraw Hill, NY (pp. 610-626)). 각종 면역 활성에 중요한 피부 중에 존재하는 주요 세포 종류 중 하나는 랑게르한스 세포이다. One of the main cell types present in the relevant skin for various immune activities is the Langerhans cell. 이 세포는 새 피부 샘플에서 준비할 수 있고 3차원 피부 배양물에 첨가하여 면역학적으로 완전한 조직 시스템을 얻을 수 있다. The cells can be can be prepared in a new skin samples were added to the three-dimensional skin culture to obtain a complete organizational system immunological. 이 세포를 배양물 상태로 장시간 동안 증식시키는 것은 종래의 조직 배양 기법으로는 어렵다. To proliferate for a long time for the cells to the culture conditions as it is difficult in a conventional tissue culture techniques. 3차원 시스템에서 이 세포를 증식시킬 수 있는 능력은 주입, 세포독성 및 질환 기작을 비롯한 연구의 모든 양태에서 매우 중요할 것이다. In 3D systems the ability to proliferate these cells will be of great importance in all aspects of study including injection, cytotoxicity, and disease mechanisms. 이러한 유형의 피부 배양 시스템은 직접 또는 간접적인 피부 병발을 보유하는 자가면역 질환(예, 전신홍반성낭창, 수포성 유사천포창 등)과 관련된 연구에 가장 큰 영향을 미칠 것이다. This type of skin culture system is an autoimmune disease that directly or indirectly hold Complicated skin will have the greatest impact on research associated with (eg, jeonsinhong erythematosus, bullous pemphigoid, etc.). 따라서, 본 발명의 미세기관 배양물은 질환의 면역학적 측면이 최소화된 상태에서 증식성/분화성 질환을 연구하는데 사용할 수 있다. Thus, the micro-organ cultures of the present invention can be used to study proliferative / min Mars disease in the immunological aspects of the disease minimized. 또한, 일례로서 과다형성성 상피 세포의 증식을 억제할 수 있는 제제를 동정하기 위하여 건선 피부 체외이식편을 사용하여 약물 선발 분석법을 유도할 수 있다. Further, it is possible to drive the drug selection method using psoriatic skin explants in order to identify as an example of agents that can inhibit the growth of epithelial cell hyperplasia.

피부는 단순히 간질 조직에 의해 지지되고 있는 상피 조직을 보유한 미세기관 배양물로서 증식할 수 있는 조직의 일례이다. The skin is merely an example of an organization that can grow as micro-organ cultures have an epithelial tissue that is supported by the stromal tissue. 상피 조직을 포함하는 다른 조직도 본 발명의 미세기관 배양물로서 증식시킬 수 있다. Other organization, including epithelial tissue can proliferate as a micro-organ cultures of the present invention. 상피 조직은 기관과 환경 사이의 계면이 존재하는 신체의 모든 부분에서 발견되는 것으로서, 상처가 없는 체내에서 지속적으로 순환하여 피부를 비롯한 체내의 모든 유리 표면에 대해 피복 조직을 형성한다. Epithelium forms the covering tissue for all the free surfaces in the body as is found in all parts of the body to the interface between the engine and the environment is present, continuously circulating in the body without a wound, including the skin. 일부 경우에, 예컨대 췌장의 상피세포에는 수많은 함입이 채워져 있고 기관이 기능할 수 있는 개방 공간으로 효소를 분비한다. In some cases, such as the epithelial cells of the pancreas and filled with a number of depressions and secrete enzymes into open spaces that can be organ function. 폐도 고도의 함입을 가진 기관 중 하나로서 폐에 존재하는 각 함입은 상피세포 안에 존재하여 공기를 환경으로부터 체내로 확산시킨다. Waste also as one of the engine with a high degree of incorporation of each constriction is present in the waste air to diffuse into the body from the environment by the presence in the epithelial cells. 이러한 상피세포는 특징적인 성질이다. These epithelial cells are the characteristic properties. 위의 내면도 역시 장벽을 형성할 뿐만 아니라 음식물을 선택적으로 흡수하는 세분화된 구조를 함유하는 특수 상피 세포로 구성되어 있다. The inner surface of the above Figure, too, is not only to form the barrier consists of a special epithelial cells containing the granular structure of selectively absorbing food. 모든 상피세포는 결합 조직에 의해 지지되고 있다. All epithelial cells are supported by connective tissue. 중요한 세포-기질 상호작용을 포함하는 또 다른 기관은 골수이다. Important cells - Another institution that includes a bone marrow stromal interactions.

즉, 본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 췌장 배양물의 미세구조는 생체내 근원 췌장의 구조와 유사하거나 거의 동일한 것으로서, 예컨대 상피조직/결합조직 구조를 하고 있다. That is, in another embodiment of the invention, a micro-organ pancreas culture water microstructure has an in vivo source as similar to the structure of the pancreas, or substantially the same, for example epithelial tissue / connective tissue structure. 예를 들어, 췌장 미세기관 배양물은 췌장 상피 세포, 예컨대 섬 세포를 포함하며, 췌장 결합 조직과 결합 상태를 유지하고 있다. For example, pancreas micro-organ cultures include pancreatic epithelial cells, e.g., islet cells, and maintains the engaged state with the pancreatic connective tissue. 따라서, 췌장 미세기관 배양물에서는 정상 조직 구조가 보존되고 정상 췌장 상피 세포 산물, 예컨대 인슐린 및 글루카곤이 생성된다. Therefore, pancreas micro-organ culture in water is the normal tissue architecture is preserved and the normal pancreatic epithelial cell products, e.g., insulin and glucagon are produced.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 골수 유래의 미세기관 배양물의 생성방법을 제공하며, 여기에서 배양물은 생체내 기관의 미세구조를 보존한다. In yet another embodiment, the present invention provides a micro-organ cultures of bone marrow-derived water generating method, in which the culture is preserved in the microstructure of biological organization. 실시예 XV에 기술한 바와 같이, 골수 미세기관은 생리적 조건에 상당하는 시스템을 유도하기 위하여 배양물에서 분리하였다. Carried out as described in Example XV, bone marrow micro-organs were separated from the culture to derive a system which corresponds to the physiological conditions.

본 발명의 골수 배양물은 건강한 골수 세포를 파괴하거나 이 세포들의 기능적 활성을 억제하는 질환이나 증상을 치료하는데 사용할 수 있다. Bone marrow cultures of the present invention can be used to treat diseases or conditions which destroy or inhibit the functional activity of these cells to healthy bone marrow cells. 본 발명의 미세기관의 이식은 혈액 악성 질환 및 골수를 포함하는 다른 종양의 치료에 효과적일 수 있다. Transplant of a micro-organ of the invention may be effective in the treatment of other tumors, including blood and bone marrow malignancies. 이러한 양태의 본 발명은 골수가 환경적 요인(예컨대, 방사선, 독소 등)에 의해 악화된 환자를 치료하는데 효과적이다. The invention of this embodiment is effective in the treatment of patients with bone marrow is deteriorated by environmental factors (e.g., radiation, toxins, etc.). 환자 자신의 골수에서 유래하는 체외이식편의 재이식이 일반적으로 바람직하지만, 이러한 체외이식편은 동종원성, 예컨대 동종의 다른 구성원 유래이거나 또는 이종원성, 예컨대 다른 유기체 유래일 수도 있다. Reimplantation of explants derived from the patients own marrow are generally preferable, but these explants may be allogeneic immunogenic, for example, derived from different members of the same kind or property or a heteroatom, for example, derived from other organisms. 이종원성 이식편의 일 예는 인간에 이식하기 위한 축소 돼지 유래의 미세기관 배양물일 수 있다. One example of a heteroatom graft may be water micro-organ cultures of the reduction from pigs for implantation in humans.

또한, 필요한 간질 유래의 성장/조절 인자가 제공된다면 인간 조혈 선조세포의 장기간의 증식도 가능하다. Further, if the necessary stromal-derived growth / regulatory factors can also offer long-term growth of human hematopoietic progenitor cells. 이러한 상호작용은 본 발명의 미세기관에 의해 제공되어, 이들 체외이식편을 줄기세포 및 선조세포의 근원이 되게 해준다. This interaction is provided by the micro-organ of the invention, these explants gives be a source of stem cells and progenitor cells. 일반적 으로, 골수의 조혈 선조세포는 골수 미세기관의 간질 기질에서 형성된 천연 패킷(packet)에서 군락을 형성한다("시드(seed)"). In general, hematopoietic progenitor cells of the bone marrow to form a colony from natural packet (packet) formed in the stromal matrix of the bone marrow micro-organ ( "seed (seed)"). 골수 간질 세포의 성장에 주요 속도 제한 요인은 골수 간질 세포 중에 포함된 섬유아세포의 비교적 낮은 유사분열 지수이다. Major rate-limiting factor in the growth of bone marrow stromal cells is the relatively low mitotic index of the fibroblasts contained in bone marrow stromal cells. 따라서, 이들 세포의 성장과 이들 세포에 세포외 기질 성분의 배치를 향상시키고자 하는 경우에는 체외이식편을 하이드로코르티손이나 다른 섬유아세포 성장 인자와 같은 제제와 접촉시키면 된다. Thus, when improving the arrangement of the matrix components in the extracellular growth, the cells of these cells and chairs are in contact when the explants with agents such as hydrocortisone or other fibroblast growth factors.

전이성 질환이나 혈액 악성 질환을 앓고 있는 특정 환자를 치료하고자 하는 목적으로 골수를 배양해야만 한다면 배양에 앞서 환자로부터 수득한 골수로부터 먼저 이상 증식성 세포를 물리적 또는 화학요법적 수단으로 "제거"해야 한다. If you have culturing bone marrow for the purpose of treating certain patients with metastatic disease or blood malignancies should be "removed" more than from bone marrow obtained from a patient prior to incubation before proliferative cells in a physical or chemical required legal means.

본 발명의 골수 미세기관 배양물 유래의 합성 배지는 신규 또는 공지 림포킨의 근원, 예컨대 인터루킨의 근원으로서 사용할 수 있다. Synthetic medium of bone marrow-derived micro-organ cultures of the present invention can be used as a source, such as a source of interleukin of new or known pokin rim.

본 발명은 일 양태로서, 유기체에 이식하기 위한 대상 미세기관 배양물의 용도를 제공한다. The invention In one aspect, there is provided the subject micro-organ cultures of water usage for implantation in an organism. 본 명세서에 사용된, "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"이란 용어는 상호교환적으로 사용할 수 있는 것으로서, 세포를 원하는 부위에 국재화시키는 방법이나 경로를 통해 본 발명의 세포 집단을 대상, 예를 들어 이종원성 또는 동종원성 대상 내에 배치하는 것을 의미한다. "Administering a", as used herein, "introducing" and "transplant" refers to the cell population of the present invention through the localized solidifying method or route on as can be used interchangeably, part cellular desired subject, for example, means that the property or the like arranged in the heteroatom immunogenic target. 세포 집단은 세포의 적어도 일부가 생존성을 유지하는 대상의 원하는 위치에 세포를 전달하는 임의의 적당한 경로를 통해 피검체에 투여할 수 있다. Cell population can be at least a portion of the cells to be via any suitable path for delivering cells to a desired location on the target to maintain the viability of administration to the subject. 대상에 투여 후 세포의 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 적어도 약 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 가장 바람직하게는 적어도 약 50% 또는 그 이상이 생존성을 유지해야 한다. After administration to the subject at least about 5%, preferably at least about 10%, more preferably at least about 20%, more preferably at least about 30%, more preferably at least about 40% of cells, most preferably We must maintain 50% or more of viability, at least. 상기 대상에 투여 후 세포의 생존성 기간은 몇 시간 정도로 짧은 시간, 예컨대 24시간 정도에서부터 몇 일, 수주 내지 수개월 정도로 긴 시간일 수도 있다. Survival period after administration to the target cells may be a short time, e.g., several days, weeks to several months from the time so long as a few hours to 24 hours. 본 발명의 세포 집단을 투여하는 방법은 세포를 내장이나 벽쪽복막, 예컨대 그물막 주머니에 이식하는 방법, 세포를 수용자의 기관, 예컨대 췌장, 간, 비장, 피부 내 또는 위에 이식하는 방법 등이 있다. Method of administering the cell population of the present invention has an internal or byeokjjok peritoneal cells, e.g. geumulmak method to implant in the pocket, in a recipient cell organization, for example, pancreas, liver, spleen, how in or on the skin transplantation and the like. 본 발명의 미세기관은 또한 신장 피막 등의 아래에 이식하여 상기 대상에 투여할 수도 있다. The micro-organ of the invention may also be implanted under the renal film to be administered to the subject.

본 명세서에 사용된 "대상"이란 용어는 포유동물, 예컨대 영장류, 예컨대 인간을 의미한다. The "target" The term as used herein, refers to a mammal, such as primates such as humans. 본 명세서에 사용된 "이종 대상"은 다른 종의 세포가 도입되거나 도입되어야 하는 대상이다. The "two kinds of target" as used herein is a subject that needs to be introduced is introduced into the cell or other species. "동종원성 대상"은 동종의 세포가 도입되거나 도입되어야 하는 대상이다. "Allogeneic immunogenic target" is a subject that should be introduced into the cells of the same type or introduction. 공여자는 배양물에 위치하고(하거나) 수용자에게 이식되어야 하는 세포, 조직 또는 기관을 제공하는 대상이다. Donor is a subject to provide a cell, tissue or organ to be transplanted is located in the culture (or) the recipient. 수용자는 이종원성 또는 동종원성 대상일 수 있다. Prisoners may be a hetero sex or allogeneic immunogenic target. 공여자는 또한 자신에게 재도입시키기 위한, 즉 자가이식을 위한 세포, 조직 또는 기관을 제공할 수 있다. Donors can also provide cells, tissues or organs for, or autograft material for introducing yourself.

숙주에 의해 면역원성 공격을 받기 쉬운, 예컨대 이종 이식이 사용된 경우, 구체적으로 돼지-인간 이식인 경우, 세포 집단의 이식을 용이하게 하기 위하여 미세기관을 재충전가능한 장치 또는 생물분해가능한 장치에 삽입하거나 캡슐화한 다음, 수용자에 이식할 수 있다. When receiving the immunogenic attack by the host and easy, for example, xenograft is used, specifically, a pig-inserted into the human graft is the case, a micro-organ rechargeable device or a biodegradable device to facilitate implantation of the cell population, or encapsulating can be implanted in the following, the recipient. 이와 같은 세포에 의해 생산된 유전자 산물은 예를 들어 단백성 생물약제를 비롯한 화합물, 예컨대 약물의 조절 전달을 위해 고안한 중합체 장치를 통해 전달할 수 있다. Thus the gene product produced by the cells, such as may be passed through a polymer device intended for people, including the stage biopharmaceutical containing compounds, such as drugs in the controlled delivery, for example. 생물분해성 및 비분해성 중합체를 비롯한 각 종 생체화합성 중합체(하이드로겔 포함)를 사용하여 특정 표적 부위에서 본 발명의 세포 집단에 의한 유전자 산물을 지속 방출할 수 있는 이식편을 만들 수 있다. Organisms can make a graft that can be sustained release a gene product by the cell population of the present invention at a particular target site using each species in vivo screen synthetic polymers, including degradable and non-degradable polymers (including hydrogels). 이러한 이식편의 제조에 대해서는 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다. For the production of such grafts it is generally known in the art. 그 예로는 다음과 같은 문헌[Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. Examples include the following documents as [Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. By David Williams(MIT Press: Cambridge, MA, 1990); By David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); 사벨(Sabel) 등, 미국 특허 제4,883,666호; Saber (Sabel), such as, U.S. Patent No. 4,883,666; 아에비셔(Aebischer) 등, 미국 특허 제4,892,538호; Such as O bisyeo (Aebischer) to, U.S. Patent No. 4,892,538; 아에비셔 등, 미국 특허 제5,106,627호; Oh such a bisyeo, U.S. Patent No. 5,106,627; 림(Lim), 미국 특허 제4,391,909호; Rim (Lim), U.S. Patent No. 4,391,909; 및 세프톤(Sefton), 미국 특허 제4,353,888호]이 있다. And Joseph tone (Sefton), there is U.S. Patent No. 4,353,888]. 본 발명의 세포 집단은 약학적 허용성 담체 또는 희석제, 예컨대 멸균 식염수 및 완충 수용액 상태로 투여할 수 있다. Cell population of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, for example, can be administered in sterile saline and buffered aqueous solutions. 이러한 담체 및 희석제의 사용에 대해서는 당해 기술분야에 공지되어 있다. The use of such carriers and diluents is well known in the art the art.

일 구체예에서, 본 발명의 미세기관 배양물은 상처 치유에 이용할 수 있다. In one embodiment, the micro-organ cultures of the present invention may be used for wound healing. 피부 병변부의 수복은 기저부에 있는 결합 조직 유래의 분자 신호에 대한 반응으로 원시상피세포 이동은 물론 상피세포의 복제를 포함하는 매우 복잡한 공정으로 알려져 있다. Repairing parts skin lesions it is known to be a complex process of moving raw epithelial cells in response to molecular signals of connective tissue origin, which at the base, as well as including the replication of epithelial cells. 피부 미세기관 배양물을 상처 치유의 모델로 본 명세서에 기술하였다. Skin micro-organ culture as a model of wound healing were described herein. 조절성 배양 조건하에서 치유를 조절하는 인자를 신중하게 모니터할 수 있다. The factors that regulate the healing under the regulatory culture conditions can be carefully monitored. 또한, 미세기관 배양물을 천연의 혈액 공급원으로부터 분리한 경우에는 복잡성을 추가시키는 혈액계 인자 또는 세포의 고려없이 치유 공정을 분석할 수 있다. Further, when separating the micro-organ cultures from the blood supply of the natural has to analyze blood-based agent or healing process without consideration of the cells of the additional complexity. 정상 표피는 200 내지 300시간 마다 세포를 순환시키는 바 유사분열 활성이 낮다. Normal epidermis has a low mitotic activity bar to circulate the cell every 200 to 300 hours. 하지만, 표피에 상처가 나면 급격한 유사분열 활성이 일어나 세포가 상처의 정도와 증상에 따라 최고 10배 이하의 빠른 속도로 분열하게 된다(Pinkus H.(1951) J.Invest.Dermatol. 16:383-386). However, once you scratch the skin up and rapid mitotic cell division is active at a faster rate than up to 10 times, depending on the severity and symptoms of injury (Pinkus H. (1951) J.Invest.Dermatol 16:. 383- 386).

실시예 II에서 입증되어 있는 바와 같이, 피부 미세기관 배양물은 수일 동안 최고 10배 이하의 증식 증가를 보인다. Embodiment, as is demonstrated in Example II, skin micro-organ cultures show increased proliferation of up to 10 times less than a few days. 이 실시예에서 상처의 가장자리는 미세기관 배양물에 필적하는 것이다. The edges of the wound in this embodiment is comparable to the micro-organ cultures. 이와 같은 증식 증가는 상처와 관련된 사건과 유사하므로, 상처 치유 공정을 연구할 수 있는 고유의 기회를 제공한다. This is because such proliferation increases similar to the events associated with the wound, providing a unique opportunity to study the wound healing process. 더욱이, 후속 실시예들을 통해 생체내 실험으로 입증된 바와 같이 본 발명의 표피 체외이식편은 만성 상처에 적용할 수 있고(실시예 IX) 털을 성장시킬 수 있는 생존성 이식편을 형성할 수 있다(실시예 XI). Moreover, through the subsequent embodiments epidermal explants of the present invention as demonstrated by in vivo tests can form a viable implant capable of be applied to chronic wounds and growing hair (example IX) (prepared example XI).

또한, 본 발명의 표피 미세기관은 화상 환자의 치료에 사용할 수 있다. In addition, the skin micro-organ of the invention may be used in the treatment of burn patients. 화상 환자들에게 피부 대체요법의 필요성은 분명한 것으로서, 미국과 유럽에 있는 여러 연구센터들에서는 화상 상처와 만성 궤양을 영구적으로 피복 할 수 있는 인간 각질세포 타가이식체와 자가이식체의 배양물을 이용한바 있다(Eisinger et al., (1980) Surgery 88:287-293; Green et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5665-5668; Cuono et al.,(1987) Plast. Reconstr. Surg. 80:626-635). The need for skin replacement therapy for burn patients is clear as can the bar with human keratinocytes in Tagaytay corrosion body and jagayi corrosion body culture can be permanently covered with burns wounds and chronic ulcers in a number of research centers in the US and Europe (Eisinger et al, (1980) Surgery 88:...... 287-293; Green et al, (1979) Proc Natl Acad Sci USA 76:.. 5665-5668; Cuono et al, (1987) Plast Reconstr . Surg 80:. 626-635). 이 방법들은 종종 성공을 거두지 못하였고 최근 연구에서는 이식된 표피 층 밑에 형성된 1 이상의 결합 조직 성분의 이상으로 인하여 치유 이식편의 수포성 및/또는 피부 무름성이 나타날 수 있다고 지적하였다(Woodley et al.,(1988) JAMA 6:2566-2571). This method often was not without success Recent studies indicated that could result in more of the above formed under the transplanted skin layers 1 connective tissue components appear bullous and / or skin fragility of the healing implant (Woodley et al., (1988) JAMA 6: 2566-2571). 본 발명의 피부 배양물 시스템은 표피와 진피 모두의 피부 동등물을 제공하여 종래 사용된 각질세포 이식편의 배양물이 특징적으로 나타내는 문제점을 극복하는 것이다. Skin culture system of the present invention to overcome the problems of the prior art the culture of keratinocyte grafts using a characteristic represented by the service water skin equivalent of both epidermis and dermis.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 미세기관 배양물 시스템은 유전자 요법에 사용하기 위하여 유전자 및 유전자 산물을 생체내에 도입시키는 매개체를 제공할 수 있다. In another embodiment, the micro-organ culture system of the present invention can provide a medium for introducing the gene into a living body and the gene products for use in gene therapy. 예를 들어, 재조합 DNA 기법을 사용하여 환자에 결손된 유전자를 바이러스 또는 조직 특이적 프로모터의 조절하에서 배치할 수 있다. For example, using the recombinant DNA techniques it is possible to place a gene defect in a patient under the control of a viral or tissue-specific promoter. 이러한 재조합 DNA 작제물을 사용하면 본 발명의 미세기관 배양물 시스템의 모든 세포 또는 특정 세포만을 형질전환 또는 트랜스펙션시킬 수 있다. Using these recombinant DNA constructs can be transformed micro-organ illustration only all cells or specific cells of the culture system, or the transfection of the present invention. 활성 유전자 산물을 발현하는 미세기관 배양물은 상기 산물이 결손형인 개체에게 이식할 수 있다. The micro-organ expressing an active gene product of the culture may be the product is implanted in the object type defect.

이와 같이 본 발명의 미세기관 배양물을 유전자 요법에 사용하는 방법은 많은 장점이 있다. Thus, the micro-organ cultures of the present invention to use water in gene therapy has a number of advantages. 첫째, 그 배양물이 진핵세포를 포함하므로 유전자 산물은 적절히 발현되어 배양물에서 활성 산물로 가공될 수 것이다. First, it is that the culture is because it contains a eukaryotic cell is properly expressed gene product would be processed in culture to an active product. 둘째, 유전자 요법의 기술들은 트랜스펙션된 세포의 수가 임상적 가치, 관련성 및 유용성이 있을 정도로 실질적으로 증가될 수 있는 경우에만 유용한데, 본 발명의 배양물은 트랜스펙션 세포 수의 팽창 및 증폭을 허용하는 것이다. Second, the technology of gene therapy are transfected cells can clinically valuable, relevant, and if the utility can be increased substantially enough only to useful cultures of the present invention is transfected cells can be expanded and amplification of It would allow.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 트랜스제닉 미세기관 배양물은 유전자 도입의 용이성을 제공하는데 사용할 수 있다. In a further embodiment of the invention, the transgenic micro-organ cultures can be used to provide the ease of gene transfer. 예를 들어, 재조합 바이러스 발현 벡터를 함유하는 미세기관 배양물은 재조합 바이러스를 배양물과 접촉시킨 세포로, 예컨대 이식에 의해 전달하는데 사용할 수 있어서, 생체내 바이러스 전염을 모방할 수 있다. For example, the micro-organ comprising a recombinant virus expression vector, the culture is to be able to be brought into contact with a recombinant virus and culture cells, for example, delivered by the implant, it is possible to mimic the in vivo virus infection. 따라서, 이 시스템은 현재 통용되는 DNA 트랜스펙션의 기법들 보다 효과적으로 유전자 형질도입을 수행할 수 있는 방법이다. Thus, this system is a way to perform gene transduction more effectively to design DNA transfection techniques are currently available.

따라서, 본 발명의 미세기관 배양물의 세포는 유전자 산물을 발현하기 위해 변형시킬 수 있다. Thus, the micro-organ cultures of water cell of the invention can be modified to express a gene product. 본 명세서에 사용된, "유전자 산물"이란 용어는 단백질, 펩타이드 및 기능성 RNA 분자를 의미한다. The "gene product" is the term used herein, refers to proteins, peptides and functional RNA molecules. 일반적으로, 핵산 분자에 의해 코딩된 유전자 산물은 대상에게 공급할 목적 유전자 산물이다. Generally, the gene product encoded by the nucleic acid molecule is the desired gene product supply to a subject. 이러한 유전자 산물의 예로는 수용자의 기관에서 정상적으로 생산되는 단백질, 펩타이드, 당단백질 및 지단백질이 있다. An example of such a gene product is a protein, peptide, protein and lipoprotein sugar is normally produced in the recipient organ. 예를 들어, 췌장에 존재하는 결손성 기관에 대한 유전자 대체로 공급할 수 있는 유전자 산물로는 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티아제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A 2 , 엘라스타제 및 아밀라제가 있고; For example, a gene product that can supply substantially gene for the defect sex organs present in the pancreas include insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsin trypsinogen, carboxy peptidase thiazol claim, ribonuclease, having the oxy ribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase a 2, elastase, and amylase, and; 간에서 정상적으로 생산되는 유전자 산물에는 혈액응고인자, 예컨대 혈액응고인자 VIII 및 IX, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바노일라제 및 사이토크롬 p450 효소, 및 혈청 아데노신의 가공이나 저밀도 지단백질의 세포이물흡수를 위한 아데노신 데아미나제가 있으며; Gene products that are normally produced by the liver include blood clotting factors such as blood clotting factors VIII and IX, UDP-glucuronic a carbonyl trans-flops cyclase, ornithine trans carboxylic Ascension ILA agents and cytochrome p450 enzymes, and serum processing or low-density lipoproteins of adenosine I adenosine deaminase for water absorption and sepoyi; 흉선에서 생산되는 유전자 산물에는 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴 및 타이모신 α1이 있으며; Gene products produced by the thymus include serum thymic factor, and this, thymic factor solution, tie blanket The tin and tie thymosin α1; 소화관 세포에서 생산되는 유전자 산물에는 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴 및 물질-P가 있다. Gene products produced by the digestive tract cells include a gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin, and substance -P. 또는, 코딩된 유전자 산물은 세포에 의한 목적 유전자 산물의 발현을 유도하는 것이다(예컨대, 대상에게 공급할 유전자 산물의 전사를 유도하는 전사 인자를 코딩하는 유전자 물질). Alternatively, the coded gene product is to induce expression of the desired gene product by the cells (e.g., genetic material encoding a transcription factor which induces the transcription of a gene product supply to a subject). 또 다른 구체예에서, 재조합 유전자는 이종 단백질, 예컨대 발현되는 세포에 대해 천연물이 아닌 것을 제공할 수 있다. In another embodiment, the recombinant gene may provide that non-natural products for the cell in which a recombinant protein, such as expression. 예를 들어, 인간 수용체 내의 주입을 지원하기 위하여 비인간의 미세기관에 각종 인간 MHC 성분을 제공할 수도 있다. For example, it is also possible to provide various human MHC components in the non-human micro-organs to support the implantation in the human receptor. 또는, 트랜스제닉 유전자는 미세기관 체외이식편에서 정상적으로 발현되는 공여 MHC 유전자 산물의 발현이나 작용을 억제하는 것이기도 하다. Alternatively, the transgenic gene will also be of inhibiting expression or function of the donor MHC gene products that are normally expressed in the micro-organ explant.

세포에 도입되는 핵산 분자는 그 핵산에 의해 코딩된 유전자 산물이 세포에서 발현되기에 적합한 형태이어야 한다. The nucleic acid molecule introduced into the cell is to be a form suitable to a gene product encoded by the nucleic acid expression in the cell. 따라서, 핵산 분자는 유전자(또는 그 일부) 전사에 필요한 암호 및 조절 서열을 포함해야 하고, 또한 유전자 산물이 단백질이나 펩타이드인 경우에는 핵산 분자의 해독에는 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 시그널은 물론 코딩된 단백질이나 펩타이드를 수송하는데 필요한 서열, 예컨대 단백질이나 펩타이드를 세포 표면으로 수송하거나 또는 분비를 위한 N-말단 시그널 서열을 포함해야 한다. Thus, the nucleic acid molecule must contain a password and a regulatory sequence required for the transfer genes (or portions thereof), and also when the gene product is a protein or peptide, the transcription of the nucleic acid molecule is a promoter, enhancer and polyadenylation signals, as well as coding a is a sequence, for example a protein or peptide required for transporting the protein or peptide must contain an N- terminal signal sequence for secretion or transport, or to the cell surface.

유전자 산물의 발현을 조절하는 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 프로모터 및 인헨서 서열)은 그 유전자 산물이 발현되어야 하는 세포 종류와 유전자 산물의 필요한 발현율에 따라 선택한다. Nucleotide sequences to regulate the expression of a gene product (e.g., promoter and enhancer sequences) are selected according to the required expression in the cell type and the gene product to be expressed is the gene product. 예를 들어, 프로모터에 결합된 유전자를 세포종류마다 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 프로모터를 사용할 수 있다. For example, it is possible to use a known promoter by a gene coupled to a promoter specifically expressed by each cell type. 예컨대, 근육모세포 유전자 발현에 특이적인 프로모터는 그 유전자 산물이 근육에서만 특이적으로 발현할 수 있도록 당해 유전자에 결합시킬 수 있다. For example, the muscle cell specific promoter, the gene expression may be coupled to the gene to be specifically expressed only in the muscle that gene product. 당해 기술분야에 공지된 근육 특이성이 있는 조절 인자로는 디스트로핀 유전자 유래의 상류 영역(Klamut et al.,(1989) Mol.Cell Biol. 9:2396), 크레아틴 키나제 유전자(Buskin and Hauschka, (1989) Mol.Cell Biol. 9:2627), 및 트로포닌 유전자(Mar and Ordahl, (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 85:6404) 유래의 업스트림 영역을 포함한다. A regulator that has a known muscle-specific in the art is the upstream region of the dystrophin gene derived (Klamut et al, (1989) Mol.Cell Biol 9:.. 2396), the creatine kinase gene (Buskin and Hauschka, (1989) Mol.Cell Biol 9:. 2627), and the troponin gene (Mar and Ordahl, (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:.. 6404) includes the upstream region of origin. 각 질 유전자에 존재하는 음성 반응 인자는 전사 억제를 매개한다(Jho Sh et al.,(2001). J.Biol.Chem). Negative factors existing in the Keratin gene mediates the transcriptional repression (Jho Sh et al., (2001). J.Biol.Chem). 다른 세포 종류에 특이성이 있는 조절 인자는 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, 간 특이적 발현에는 알부민 인헨서; 췌장섬 세포 특이적 발현에는 인슐린 조절 인자; 각종 신경 세포 특이적 조절 인자, 예컨대 신경 디스트로핀, 신경 에놀라제 및 A4 아밀로이드 프로모터). There regulator with specificity for other cell types are known in the art (e.g., liver-specific expression, the albumin enhancer; pancreatic islet cell-specific expression, the insulin regulatory elements; various neural cell-specific regulatory elements, for example, nerve dystrophin, the surprise and A4 amyloid promoters to care). 또는, 각종의 여러 세포 종류에서 구성적 유전자 발현을 유도할 수 있는 조절 인자, 예컨대 바이러스 조절 인자를 사용할 수도 있다. Alternatively, it is also possible to use regulators, for example viral regulatory factor capable of inducing constitutive gene expression in many cell types of various. 유전자 발현 유도에 일반적으로 사용되는 바이러스 프로모터의 예로는 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 사이토메가로바이러스 및 시미안 바이러스 40 유래의 프로모터와 레트로바이러스 LTR이 있다. Examples of viral promoters commonly used to induce gene expression is a polyoma virus, adenovirus 2, and simian virus 40 promoter of virus origin and a Saito Mega retroviral LTR. 또는, 결합된 유전자의 유도성 발현을 허용하는 조절 인자를 사용할 수도 있다 유도성 조절 인자(예컨대 유도성 프로모터)의 사용으로, 세포내에서 유전자 산물의 생산을 조절할 수 있다. Or, by the use of regulatory elements may also be used to allow inducible expression of the associated gene inducible regulatory elements (e.g., inducible promoter) can be adjusted in the production of gene products in the cell. 진핵 세포에 사용할 수 있는 매우 유용한 유도성 조절 시스템의 예로는 호르몬 조절성 인자(예, Mader, S. and White, JH(1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5603-5607), 합성 리간드 조절성 인자(예, Spencer, DM et al., 1993) Science 262:1019-1024) 및 이온화 방사선 조절성 인자(예, Manome, Y. et al.(1993) Biochemistry 32:10607-0613; Datta, R. et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:1014-10153)가 있다. Examples of useful inductive control system that can be used in eukaryotic cells are hormone regulatable factor (e.g., Mader, S. and White, JH (1993), Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:. 5603-5607), synthetic ligand regulatory factors (eg, Spencer, DM et al, 1993) Science 262: 1019-1024) and ionizing radiation-regulatable factor (eg, Manome, Y. et al (1993) Biochemistry 32: 10607-0613; Datta, R. et al (1992) Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:.. there are 1,014 to 10,153). 또 다른 개발가능한 조직 특이성 또는 유도성 조절 시스템도 본 발명에 따라 사용할 수 있다. In other exploitation tissue specificity or inducible regulation system can be used in accordance with the present invention.

본 발명의 세포 변형에 사용할 수 있는, 유전자 물질을 세포로 도입시키는 방법은 당해 기술분야에 다수가 공지되어 있다. A method of introducing, the genetic material that is available on the cell strain of the invention into cells are many of which are known in the art. 일 구체예에서, 핵산은 나출형 핵 산 분자 형태일 수 있다. In one embodiment, the nucleic acid can be a naked nucleic acid molecule type form. 이때, 변형될 세포에 도입할 핵산 분자는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 필수 조절인자으로만 구성한다. In this case, the nucleic acid molecule to be introduced into the modified cells constitute only a nucleic acid with the necessary regulatory elements encoding a gene product. 또한, 유전자 산물을 코딩하는 핵산(필수 조절 인자를 포함하는)은 플라스미드 벡터에 포함되기도 한다. In addition, nucleic acid (including the necessary regulatory elements) encoding the gene product is also included in a plasmid vector. 플라스미드 발현 벡터의 예로는 CDM8(Seed, B.(1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al.(1987) EMBO J. 6:187-195)이 있다. Examples of plasmid expression vectors include CDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC: there is a (Kaufman et al (1987) EMBO J. 6. 187-195). 또 다른 구체예에서, 세포로 도입할 핵산 분자는 바이러스 벡터에 포함되기도 한다. In still other embodiments, the nucleic acid molecule to be introduced into the cells, can contain the viral vector. 이때, 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 바이러스 게놈(또는 부분 바이러스 게놈)에 삽입되어 있다. In this case, the nucleic acid encoding the gene product is inserted into the viral genome (or partial viral genome). 유전자 산물의 발현을 유도하는 조절 인자는 핵산과 함께 바이러스 게놈에 삽입되어 포함되거나(즉, 바이러스 게놈에 삽입된 유전자에 결합) 또는 바이러스 게놈 자체가 공급하는 것일 수 있다. Regulatory elements that drive expression of the gene product may be one that contains the insertion into the viral genome with a nucleic acid or a (i. E., Coupled to the gene inserted into the viral genome) or viral genome itself supplied.

나출형 핵산은 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주입 및 수용체 매개 흡수를 이용하여 세포에 도입시킬 수 있다. Naked nucleic acid may be by using a calcium phosphate-mediated transfection, DEAE- dextran mediated transfection, electroporation, liposome-mediated transfection, direct injection, and receptor-mediated uptake to be introduced into the cell.

나출형 핵산, 예컨대 DNA는 핵산과 인산칼슘을 함유하는 침전물을 형성시켜 세포에 도입시킬 수 있다. Naked nucleic acid, e.g., DNA can be introduced into cells by forming a precipitate containing the nucleic acid and calcium phosphate. 예를 들어, HEPES 완충화된 식염수 용액을 염화칼슘과 핵산을 함유하는 용액과 혼합하여 침전물을 형성시키고, 이 침전물을 그 다음 세포와 배양시킨다. For example, a HEPES-buffered saline solution to form a precipitate by mixing with a solution containing calcium chloride and nucleic acid, and incubated with the precipitate and then the cell. 특정 세포에 의해 흡수되는 핵산의 양을 증가시키기 위하여 글리세롤이나 디메틸설폭사이드 쇼크 단계를 첨가할 수도 있다. It is also possible to add glycerol or dimethyl sulfoxide shock step to increase the amount of nucleic acid that is taken up by specific cells. 세포를 안정적으로(또는 일시적으로) 트랜스펙션시키기 위하여 CaPO 4 매개 트랜스펙션법을 사용할 수 있 으며, 이 방법은 세포의 시험관내 변형에만 적용할 수 있다. The cells were stably can use the CaPO 4 mediated transfection syeonbeop order to design (or temporarily) transfection, the method can only be applied to in vitro modification of cells. CaPO 4 매개 트랜스펙션법의 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.1 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. CaPO 4 mediated transfection protocol specification syeonbeop the following literature like, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel , FM et al (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.1 , and Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd Edition , Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.32-16.40 이나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), can be found in Sections 16.32-16.40 or other standard test stand.

나출형 핵산은 핵산과 DEAE-덱스트란의 혼합물을 형성시키고 이 혼합물을 세포와 배양함으로써 세포에 도입시킬 수 있다. Naked nucleic acid may be formed of a mixture of nucleic acids and DEAE- Dextran and introduced into cells by incubating the mixture with the cells. 핵산 흡수량을 증가시키기 위하여 디메틸설폭사이드 또는 클로로퀸 쇼크 단계를 첨가할 수도 있다. It may be added to dimethylsulfoxide or chloroquine shock step to increase nucleic acid uptake. DEAE-덱스트란 트랜스펙션법은 시험관내 세포 변형법에만 적용가능하며, DNA를 세포에 일시적으로 도입시키는데 사용할 수 있어서 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 작제하는데에는 바람직하지 않다. DEAE- dextran transfection syeonbeop is not desirable to have constructed a cell in vitro and is applicable only modification method, a method be used to temporarily introduced into the DNA in the cell design stably transfected cells. 따라서, 이 방법은 유전자 산물을 단기간 생산하는데 사용할 수 있고, 유전자 산물의 장기간 생산을 위해서는 최선의 방법이 아니다. Thus, this method can be used for short-term production of a gene product, it is not the best way to long-term production of a gene product. DEAE-덱스트란 매개의 트랜스펙션의 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.2 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Protocol for transfection of DEAE- dextran mediated following literature, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.2, and Molecular Cloning:. A Laboratory Manual , 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.41-16.46 이나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), can be found in Sections 16.41-16.46 or other standard test stand.

나출형 핵산은 또한 세포와 핵산을 적당한 완충액에서 함께 항온배양하고 세 포를 고전압 전기 펄스로 처리함으로써 세포에 도입시킬 수 있다. Naked nucleic acid may also be introduced to the cells by incubation with the cells and the nucleic acid in an appropriate buffer and processes the cells in high-voltage electric pulse. 전기천공에 의해 핵산이 세포로 도입되는 효율은 인가된 전기장, 전기 펄스의 길이, 온도, DNA의 형태와 농도 및 매질의 이온 조성 등에 의해 영향받는다. Efficiency of nucleic acid by electroporation is introduced into the cell is influenced by ion composition of the applied electric field, the length of the electric pulse, the temperature, the type and concentration of the DNA and the medium. 전기천공은 각종 세포 종류를 안정적으로(또는 일시적으로) 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. Electroporation may be used to transfection of various cell types to stably (or transiently). 세포에 전기천공시키는데 유용한 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.3 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Useful protocols sikineunde electroporation the cells are as follows literature like, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al (. Eds) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.3, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.54-16.55 나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), can be found in Sections 16.54-16.55 or other standard test stand.

나출형 핵산을 세포로 도입시킬 수 있는 다른 방법으로는 리포좀 매개 트랜스펙션법(리포펙션)이 있다. Alternatively, naked nucleic acid can be introduced into cells, liposomes have mediated transfection syeonbeop (repo peksyeon). 이때, 핵산은 양이온 지질을 함유하는 리포좀 현탁액과 혼합한다. In this case, the nucleic acid is mixed with a liposome suspension containing cationic lipids. 이 DNA/리포좀 혼합물을 그 다음 세포와 항온배양한다. This DNA / liposome mixture that is then incubated with cells. 리포좀 매개 트랜스펙션법은 시험관내 배양물 중의 세포를 안정적(또는 일시적)으로 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. Liposome mediated transfection can be used to syeonbeop transfection the cells in in vitro culture of stably (or transiently). 이 프로토콜은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.4 및 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. This protocol can be found in the literature, (. Eds) Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al. Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.4 and other standard laboratory stand. 또한, 생체내 유전자 전달법을 리포좀을 이용하여 수행하기도 하였다. In addition, it also carried out using liposomes for in vivo gene transfer method. 예컨대 문헌[Nicolau et al.(1987) Meth. For example, the literature [Nicolau et al. (1987) Meth. Enz. Enz. 149:157-176; 149: 157-176; Wang and Huang(1987) Proc. Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci.USA. Sci.USA. 84:7851-7855; 84: 7851-7855; Brigham et al.(1989) Am. Brigham et al. (1989) Am. J. Med. J. Med. Sci. Sci. 298:278; 298: 278; 및 Gould-Fogerite et al.(1989) Gene 84:429-438]을 참조할 수 있다. And Gould-Fogerite et al (1989) Gene 84:. It is possible to refer to the 429-438].

나출형 핵산은 또한 이 핵산을 세포에 직접 주사하여 세포에 도입시킬 수 있다. Naked nucleic acid may also be introduced into the cell by injection of a nucleic acid directly to the cells. 세포의 시험관내 배양물인 경우, DNA를 미세주사로 도입시킬 수 있다. If the test is water in the cell culture in vitro, it is possible to introduce DNA into a fine scan. 각 세포를 각각 미세주사하므로 이 시도는 다수의 세포를 변형시킬 때에는 매우 노동집약적인 방법이다. Since the fine scan is attempted for each cell respectively, is a very labor-intensive method to deform when the plurality of cells. 그러나, 트랜스제닉 동물의 제조에는 미세주사가 최선의 방법이다(이하에 상세히 설명됨). However, the production of transgenic animals is the microinjection best way (as described in detail below). 이와 같은 경우에, DNA는 동물로 발달할 수 있는 수정된 난모세포에 안정적으로 도입된다. In such cases, the, DNA is modified, I can develop a reliable animal is introduced into the cells. 그 결과 얻어지는 동물은 난모세포에 도입된 DNA를 운반하는 세포를 함유하게 된다. The resultant animals are I is containing the cells carrying the DNA introduced into the cell. 또한, 직접 주사법은 나출형 DNA를 생체내 세포에 직접 도입시키는 데에도 사용되었다(예컨대, Acsadi et al.(1991) Nature 332: 815-818; Wolff et al.(1990) Science 247:1465-1468). In addition, the direct scanning method was also used for introducing directly a naked type DNA in cells in vivo (e. G., Acsadi et al (1991) Nature 332:.. 815-818; Wolff et al (1990) Science 247: 1465-1468 ). 생체내에서 세포에 DNA를 주사하기 위하여 전달 장치(예컨대, "유전자 총")를 사용할 수 있다. The delivery apparatus (e.g., a "gene gun") for injecting DNA into cells in vivo can be used. 이러한 장치는 시중에서 입수용이하다(예, 바이오래드 제품). These devices are easily available on the market (for example, Bio-Rad Ltd.).

나출형 핵산은 수용체 매개의 세포이물흡수에 의해 흡수되는 세포-표면 수용체의 리간드에 결합되는 양이온, 예컨대 폴리리신과 복합체를 형성시킬 수 있다(예컨대, Wu, G. and Wu, CH(1988), J.Biol.Chem. 263:14621; Wilson et al.(1992) J.Biol.Chem. 267:963-967 및 미국 특허 제5,166,320호). Naked nucleic acid is a cell that is absorbed by the water absorption of the receptor mediated sepoyi - can form a cation, such as polylysine and the complex bonded to a ligand of a surface receptor (e. G., Wu, G. and Wu, CH (1988), J.Biol.Chem 263:. 14621; Wilson et al (1992) J.Biol.Chem 267:.. 963-967 and U.S. Patent No. 5.16632 million) 수용체에 대한 핵산-리간드 복합체의 결합은 수용체 매개의 세포이물흡수에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 한다. The nucleic acid of the receptor-bound ligand complex facilitates the uptake of DNA by the receptor-mediated uptake of water sepoyi. 세포내 리포좀에 의한 상기 복합체의 분해를 피하기 위하여, 천연적으로 엔도좀을 붕괴시켜 세포질에 물질을 방출시키는 아데노바이러스 캡시드에 결합된 DNA-리간드 복합체를 사용할 수 있다(예컨대, Curiel et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 88:8850; Cristiano et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:2122-2126). In order to avoid degradation of the complex by intracellular liposomes, it can make use of the DNA- ligand conjugate bound to adenovirus capsids which disrupt endosomes to naturally discharge the material in the cytoplasm (e. G., Curiel et al. (1991 ) Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:.... 8850; Cristiano et al (1993) Proc.Natl.Acad.Sci USA 90: 2122-2126). 수용체 매개의 DNA 흡수는 시험관내 또는 생체내에서 DNA를 세포에 도입시키는데 사용할 수 있으며, 부가적으로 당해의 표적 세포에서만 선택적으로 발현되는 수용체에 결합하는 리간드를 사용함으로써 DNA가 특정 세포 종류만을 표적으로 선택할 수 있다는 특징도 있다. DNA absorbs the receptor-mediated by the test can be used for introducing the DNA in vitro or in vivo in the cells, using a ligand binding to the receptor is additionally selectively expressed only in the art a target cell of a DNA is the only target specific cell types Features that may be selected.

일반적으로, 나출형 DNA를 배양물 중의 세포에 도입시키는 경우(예컨대 전술한 트랜스펙션 기법 중 하나를 사용하여)에, 세포의 소량(10 5 개 중에서 약 1개)만이 일반적으로 트랜스펙션된 DNA를 자신의 게놈내로 통합시킨다(즉, DNA는 세포에서 에피좀으로 유지된다). The design generally, naked type case for introducing DNA into cells in culture (for example the above-described transfected using one of the techniques), only (about 1 out of 10 5) a small amount of cells generally transfected integrate the DNA into their genomes (i.e., DNA is maintained in cells as a bit-epi). 따라서, 이종 DNA를 흡수한 세포를 확인하기 위해서는 당해의 핵산과 함께 선택성 마커를 코딩하는 핵산을 세포에 트랜스펙션시키는 것이 유리하다. Therefore, it is advantageous to check the absorption cell to a heterologous DNA transfection of nucleic acid encoding a selectable marker together with the nucleic acid of that cell. 바람직한 선택가능한 마커로는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 등의 약물에 대해 내성을 부여하는 것이 있다. Preferred selectable markers include those that confer resistance to the drugs, such as G418, hygromycin and methotrexate. 선택가능한 마커는 당해 유전자와 같은 플라스미드를 통해 도입하거나 별도의 플라스미드를 통해 도입시킬 수 있다. Selectable markers may be introduced or introduced via a separate plasmid from the plasmid, such as the gene.

유전자 산물을 코딩하는 핵산을 세포로 도입시키는 방법 중 바람직한 것은 유전자 산물을 코딩하는 핵산, 예컨대 cDNA를 함유하는 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. A preferred method of introducing the nucleic acid encoding the gene product into the cell is to use a viral vector containing nucleic acid, for example, cDNA encoding a gene product. 바이러스 벡터를 이용한 세포의 감염은 다량의 세포가 핵산을 수용할 수 있어서, 핵산이 수용된 세포를 선발할 필요가 없다는 장점이 있다. Infection of cells with a viral vector has the advantage of a large amount of cells can be accommodated in the nucleic acid does not need to be selected cell nucleic acids contained. 또한, 바이러스 벡터 내에서 코딩된 분자, 예컨대 바이러스 벡터에 함유된 cDNA는 바이러스 벡터 핵산을 흡수한 세포에서 효과적으로 발현되는 바, 바이러스 벡터 시스템은 시험 관내 또는 생체내에서 사용할 수 있다. Further, the coding molecule in the viral vector, e.g., a cDNA contained in the viral vector is a bar, a viral vector system that is effectively expressed in the cell absorb the viral vector nucleic acid can be used either in vitro or in vivo.

결손형 레트로바이러스가 유전자 요법 목적의 유전자 전달에 유용하다는 것은 충분히 규명되어 있다(Miller, AD(1990) Blood 76:271). It is a deficiency-type retrovirus is useful in gene delivery gene therapy purposes are fully identified (Miller, AD (1990) Blood 76: 271). 재조합 레트로바이러스는 당해 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 레트로바이러스 게놈에 삽입시켜 제작할 수 있다. Recombinant retroviruses can be produced by inserting a nucleic acid encoding the gene product to the retrovirus genome. 또한, 레트로바이러스에 복제 결손성을 부여하기 위하여 레트로바이러스 게놈의 일부를 제거할 수도 있다. It is also possible to remove part of the retroviral genome in order to confer replication chipping resistance to retrovirus. 이러한 복제 결손형 레트로바이러스는 표준 기법에 따라 헬퍼 바이러스의 사용으로 표적 세포를 감염시키는데 사용할 수 있는 비리온으로 팩키징한다. This replication-defective type retroviruses are packaged into virions which can be used to infect a target cell through the use of a helper virus in accordance with standard techniques. 재조합 바이러스 제작과 이 바이러스를 이용한 생체내 또는 시험관내 세포 감염 방법에 대해서는 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.10-9.14 및 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. Recombinant virus production and for the in vivo or in vitro cell infected with the virus methods literature, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM et al. (Eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.10-9.14 and other It can be found in standard laboratory stand. 적합한 레트로바이러스의 예로는 당해 기술분야에 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM이 있다. Examples of suitable retroviruses are a known pLJ, pZIP, pWE and pEM in the art. 적합한 팩키징 바이러스 세포주의 예로는 ψCrip, ψ2 및 ψAm이 있다. Examples of suitable packaging virus cell lines have ψCrip, ψ2 and ψAm. 레트로바이러스는 시험관내 및/또는 생체내에서 상피세포, 내피세포, 림프구, 근육모세포, 간세포, 골수세포 등의 다양한 여러 종류의 세포에 각종 유전자를 도입시키는데 사용되어왔다(예컨대, Eglitis et al.(1985) Science 230:1395-1398; Danosand Mulligan(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8039-8043; Feri et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al.(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 7640-7644; Kay et al.(1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al.(1993) J.Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 제4,868,116호; 미국 특허 4,980,286호; PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출 Retroviruses have been used to introduce a variety of genes into epithelial cells, endothelial cells, lymphocytes, muscle cells, liver cells, a variety of different types of cells such as bone marrow cells, in vitro and / or in vivo (e.g., Eglitis et al. ( 1985) Science 230: 1395-1398; Danosand Mulligan (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:. 6460-6464; Wilson et al (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:.. 3014-3018 ; Armentano et al, (1990) Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:.. 6141-6145; Huber et al (1991) Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:.. 8039-8043; Feri et al. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al (1991) Science 254:.... 1802-1805; van Beusechem et al (1992) Proc.Natl.Acad.Sci USA 89 :. 7640-7644; Kay et al (1992) Human Gene Therapy 3:.. 641-647; Dai et al (1992) Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:. 10892-10895; Hwu et al (1993) . J.Immunol 150: 4104-4115; U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Pat. No. 4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/05345; and PCT Ex WO 92/07573). WO 92/07573). 레트로바이러스 벡터는 핵산을 세포에 안정적으로 도입시키기 위하여 레트로바이러스 게놈( 및 여기에 삽입된 이종 핵산)이 숙주 게놈에 통합되도록 표적 세포의 분열을 필요로 한다. Retroviral vector is a retroviral genome (and the heterologous nucleic acid insertion herein) requires a division of the target cell to be integrated into the host genome to stably introduce nucleic acid into the cell. 따라서, 표적 세포의 복제를 자극할 필요가 있을 수 있다. Therefore, it may be necessary to stimulate replication of the target cells.

아데노바이러스의 게놈은 당해 유전자 산물을 코딩하여 발현하지만, 정상적인 용균 바이러스 생활환으로 복제하는 능력 면에서는 불활성화되도록 조작할 수 있다. The genome of adenovirus is the ability to code side to the expression, but reproduced in a normal lytic viral life cycle of the gene product may be engineered to inactivate. 예를 들어, 문헌[Berkner et al.(1988) BioTechniques 6:616; See, e.g., [Berkner et al (1988) BioTechniques 6: 616;. Rosenfeld et al.(1991) Science 252:431-434; . Rosenfeld et al (1991) Science 252: 431-434; 및 Rosenfeld et al.(1992) Cell 68:143-155]을 참조할 수 있다. And Rosenfeld et al (1992) Cell 68:. It is possible to refer to the 143-155]. 아데노바이러스 균주 Ad 타입 5 dl324 또는 다른 아데노바이러스 균주(예, Ad2, Ad3, Ad7 등) 유래의 적합한 아데노바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다. Adenovirus strain Ad type 5 dl324 or other adenovirus strains (e.g., Ad2, Ad3, Ad7 etc.) Suitable adenoviral vectors derived are known in the art. 재조합 아데노바이러스는 유전자 전달 매개체로서의 효과를 높이기 위하여 분열 세포를 필요로 하지 않아서 다양한 세포 종류, 예컨대 기도 상피(Rosenfeld et al. (1992) 상기 인용문헌), 내피세포(Lemarchand et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6482-6486), 간세포(Herz and Gerard (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816) 및 근육 세포(Quantin et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:2581-2584)를 감염시키는데 사용할 수 있다는 장점이 있다. Recombinant adenoviruses are a variety of cell types did not require dividing cells to increase the effectiveness as gene transfer vectors, for example, airway epithelium (Rosenfeld et al. (1992), the cited references), endothelial cells (Lemarchand et al. (1992) Proc .Natl.Acad.Sci USA 89:. 6482-6486), hepatocytes (Herz and Gerard (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 2812-2816) and muscle cells (Quantin et al (1992.) Proc .Natl.Acad.Sci USA 89:. has the advantage of 2581-2584), the number used to infect. 또한, 도입된 아데노바이러스 DNA( 및 이종 DNA 함유물)는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 에피좀 상태를 유지하여, 도입된 DNA가 숙주 게놈에 통합되기 시작하는 상황에서 삽입성 돌연변이유발의 결과로서 발생할 수 있는 잠재적 문제점(예컨대, 레트로바이러스 DNA)을 피할 수 있다. In addition, the introduced adenoviral DNA (and heterologous DNA-containing material) is not integrated into the genome of the host cell to maintain some state-epi, the introduced DNA is as a result of the intercalating mutagenesis in situations where the start integrating in the host genome potential problems that may arise can be avoided (eg, retroviral DNA).

또한, 이종 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 운반 용량은 다른 유전자 전달 벡터에 비하여 상당히 크다(최고 8 킬로베이스)(Berkner et al. 상기 인용문헌; Haj-Ahmand and Graham(1986) J.Virol. 57:267). In addition, the carrying capacity of the adenovirus genome for heterologous DNA is significantly greater than the other gene delivery vectors (up to 8 kilobases) (Berkner et al cited above; Haj-Ahmand and Graham (1986) J.Virol 57..: 267). 현재 사용되고 있는 대부분의 복제 결손형 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자 전부 또는 일부가 결실되고 아데노바이러스 유전자 물질 중 80% 정도는 보유하는 것이다. Most replication-defective type adenoviral vectors currently in use is a virus E1 and E3 genes deleted in whole or in part, is to hold 80 percent of the adenoviral genetic material.

아데노 관련 바이러스(AAV)는 효율적인 복제와 생산성 생활환을 위해 헬퍼 바이러스로서 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등과 같은 다른 바이러스를 필요로 하는 자연발생의 결손형 바이러스이다(Muzyczka et al. Curr. Topics In Micro. And Immunol. (1992) 158:97-129). Adeno-associated virus (AAV) is a defective virus of the naturally-occurring that a helper virus for efficient replication and a productive life cycle requires another virus, such as adenovirus or herpes virus (Muzyczka et al. Curr. Topics In Micro. And Immunol (1992) 158:. 97-129). 또한, 자신의 DNA를 비분열성 세포에 통합시킬 수 있는 몇 안되는 바이러스 중 하나로서, 높은 안정된 통합율을 나타낸다(예컨대, Flotte et al.(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al.(1989) J.Virol. 63:3822-3828; 및 McLaughlin et al.(1989) J. Virol. 63:1963-1973). Further, as one of their DNA non-disruptive of the few viruses that may integrate into the cell shows a high rate of stable integration (for example, Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7 : 349-356; Samulski et al (1989) J.Virol 63:.. 3822-3828; and McLaughlin et al (1989) J. Virol 63:.. 1963-1973). AAV 300 염기쌍 정도만을 함유하는 벡터는 팩키징되어 통합될 수 있다. Vector containing the AAV 300 bp only may be packaged is integrated. 이종 DNA를 위한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. Space for heterologous DNA is limited to about 4.5kb. 문헌[Tratschin et al.(1985) Mol. Document [Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Cell. Biol. Biol. 5:3251-3260]에 기술된 바와 같은 AAV 벡터는 DNA를 세포로 도입시키는데 사용할 수 있다. 5: 3251-3260] the AAV vector as described can be used to introduce DNA into cells. AAV 벡터를 이용하여 각종 핵산을 여러 세포 종류에 도입시킨바 있다(예컨대, Hermonat et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al.(1985) Mol. Cell Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al.(1988) Mol. Endocrinol.2:32-39; Tratscin et al.(1984) J.Virol. 51:611-619; 및 Flotte et al.(1993) J.Biol.Chem. 268:3781-3790). There was introduced into a variety of nucleic acids in various cell types by the use of AAV vectors (for example, Hermonat et al (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:...... 6466-6470; Tratschin et al (1985) Mol. . Cell Biol 4: 2072-2081; Wondisford et al (1988) Mol Endocrinol.2: 32-39; Tratscin et al (1984) J.Virol 51:..... 611-619; and Flotte et al (1993 ) J.Biol.Chem 268:. 3781-3790).

특정 발현 벡터 시스템의 효율과 핵산을 세포에 도입시키는 방법은 당해 기술분야에 통상적으로 사용되는 표준 기법으로 평가할 수 있다. A method of introducing a nucleic acid and efficiency of a particular expression vector system, the cells can be assessed by standard techniques commonly used in the art. 예를 들어, 세포에 도입된 DNA는 필터 하이브리드화 기법(예컨대, 서던 블롯팅)으로 검출할 수 있고, 도입된 DNA의 전사에 의해 생산된 RNA는 예컨대 노던 블로팅, RNase 차단 또는 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 등으로 검출할 수 있다. For example, DNA introduced into a cell filter hybridization techniques may be detected (e. G., Southern blotting), produced by transcription of introduced DNA RNA, for example, Northern blotting, RNase block or reverse transcriptase-polymerase It can be detected by chain reaction (RT-PCR) and the like. 유전자 산물은 적당한 분석법, 예컨대 생산된 단백질을 특이적 항체 등을 이용한 면역학적 검출, 또는 유전자 산물의 기능적 활성을 측정하는 기능적 분석법, 예컨대 효소적 분석법으로 측정할 수 있다. Gene product can be determined by functional assays, such as enzymatic assay that measures the appropriate assays, for example the specific production of the antibody protein, such as immuno-detection using the, or functional activity of the gene product. 세포에 의해 발현될 수 있도록 한 당해 유전자 산물이 용이하게 분석할 수 없는 것이라면, 발현 시스템을 먼저 사용되는 조절 인자와 벡터에 리포터 유전자를 결합시켜 최적화할 수 있다. If this can not be one the gene product to be expressed by the cell easily analysis, by combining the reporter gene, the regulatory elements and vector to be used for the expression system can first be optimized. 리포터 유전자는 쉽게 검출할 수 있는 유전자 산물을 코딩하는바 이 시스템의 효능을 평가하는데 사용할 수 있다. Reporter gene is the bar gene encoding a product that is easily detected may be used to evaluate the efficacy of the system. 당해 기술분야에 사용되는 표준 리포터 유전자로는 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제, 루시퍼라제, GFP/EGFP 및 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자가 있다. A standard reporter gene used in the art is a gene β- galactosidase, chloramphenicol acetyl trans-flops cyclase, luciferase, encoding the GFP / EGFP and human growth hormone.

세포 집단에 핵산을 도입시키는데 사용한 방법이 대부분의 세포를 변형시켜 서 그 세포에 의해 유전자 산물이 효율적으로 발현되도록 한다면(예컨대, 바이러스 발현 벡터를 사용하는 경우에 흔히 나타나듯이) 변형된 세포 집단은 그 집단에 존재하는 각 세포의 추가 분리 또는 2차 클로닝 없이 그대로 사용할 수 있다. If the method used to introduce the nucleic acid in the population of cells up to transform a majority of cells that efficiently express the gene product by the cells, the cell population modified (e.g., as commonly displayed in the case of using a viral expression vector) are those It can be used as it is without further isolation or cloning of the respective secondary cells in the group. 즉, 세포의 추가 분리가 필요하지 않을 정도로 상기 세포 집단에 의해 유전자 산물이 충분히 생성될 수 있다. That is, by the population of cells so further separation of cells is not required, can be produced enough gene products. 또는, 유전자 산물을 효율적으로 발현하는 세포를 분리하기 위하여, 변형된 단일 세포를 동일 변형을 가진 동종 세포 집단으로 증식시키는 바람직한 경우도 있다. Alternatively, it is also to separate the cells which efficiently express the gene product, if desired propagating a homogeneous population of cells having the same cell a modified single strain. 이와 같은 균일 세포 집단은 변형된 단일 세포를 한계희석클로닝법으로 분리한 뒤 배양물 중의 단세포를 표준 기법에 따라 클론성 세포 집단으로 팽창시킴으로써 제조할 수 있다. Such a uniform population of cells can be produced by expanding a clonal population of cells along a single cell in then separating the single modified cell by limiting dilution cloning method cultures in standard techniques.

본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 세포"란 용어는 삽입 또는 도입되는 세포에 대해 부분적 또는 전적으로 이종성, 예컨대 외래성인 핵산 서열이 삽입 또는 도입되어 있는 세포를 의미한다. The "transgenic cell" is the term used herein, refers to the insertion or partially or for a cell to be introduced entirely heterologous cells, e.g., adult is a foreign nucleic acid sequence inserted or introduced. 트랜스제닉 세포는 또한 이 세포의 내인성 유전자와 상동성인 핵산이 삽입되어 있는 세포일 수 있다. The transgenic cells may also be cells that are inserted into the endogenous gene and the homologous nucleic acids of the cells. 이와 같은 경우에, 상동성 핵산은 이것이 삽입되는 세포의 게놈을 변형시킬 수 있는 방식으로 세포 게놈에 삽입하거나 삽입되도록 디자인한다. Thus, homologous nucleic acid if the same is designed to be inserted or inserted in the cell genome in a manner that can modify the genome of the cells, this is to be inserted. 예를 들어, 상동성 핵산은 천연 유전자의 추이와 상이한 삽입하거나 또는 특정 표현형을 녹아웃시키도록 상동성 핵산을 삽입시킨다. For example, the homologous nucleic acid is inserted by homologous nucleic acids so as to knock out the different insertion or specific phenotype and transition of the natural gene. 세포에 삽입된 핵산은 선발한 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 1 또는 그 이상의 전사 조절 서열 및 기타 다른 핵산, 예컨대 인트론을 포함할 수 있다. The nucleic acid inserted into the cells can include one or more control transfer that might be required for optimal expression of a selected nucleic acid sequence and any other nucleic acid, such as introns.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 미세기관 배양물은 악성 질환과 질병을 진단 및 치료하는데 도움을 주기 위해 사용할 수 있다. As a further aspect of the invention, micro-organ cultures of the present invention may be used to aid in the diagnosis and treatment of malignancies and diseases. 예를 들어, 기관의 생검(예컨대, 피부, 신장, 간 등)을 과증식 또는 신생증식 질환이 의심되는 환자로부터 채취할 수 있다. For example, biopsies of organs (e.g., skin, kidney, liver, etc.) may be collected from the patient is new or hyperproliferative proliferative disease is suspected. 생검 체외이식편을 본 발명의 방법에 따라 배양하면 체외이식편의 증식성 세포는 배양동안 클론적으로 팽창한다. If the biopsy explant culture according to the method of the present invention, proliferative cells of the explant are expanded in culture for clone ever. 이에 따라 상기 질환을 조사할 수 있는 기회가 증가하여 진단의 정확성을 증가시킬 수 있다. This is an opportunity to investigate the disease can be increased to increase the accuracy of the diagnosis according to. 또한, 환자의 미세기관 배양물은 시험관내에서 세포독성 화합물 및/또는 약학적 화합물을 선발하는데 사용할 수 있고, 이에 따라 가장 효능이 높은 화합물, 즉 악성 세포 또는 질병 세포를 죽이지만 정상 세포에는 영향을 미치지 않는 화합물을 동정할 수 있다. Further, the micro-organ cultures of the patient may be used for selection of cytotoxic compounds and / or pharmaceutical compounds in vitro, so that the highest potency compound, that is, influence it to kill the malignant cells or disease cells, normal cells a compound that does not can be identified.

본 발명의 또 다른 양태는 세포독성 화합물 성장/조절 인자, 약학적 제제 등의 각종 화합물을 선발하기 위한 목적에 본 발명의 미세기관 배양물을 사용하는 방법을 제공한다. Another aspect of the invention provides the use of the micro-organ cultures of the present invention for purposes of selecting a variety of compounds, such as cytotoxic compounds growth / regulatory factors, pharmaceutical agents. 예를 들면, 잠재적으로 독성 가능성이 있는 화합물에 대한 철저한 시험의 필요성은 보편적으로 인식하는 것으로서, 약물, 화장품, 식품 첨가제 및 살충제를 평가할 수 있는 민감하고 재현성있는 단기 시험관내 분석법의 개발 필요성은 자명한 것이다. For example, as to the necessity of a thorough test on which a potentially toxic potential compounds are universally recognized as, drugs, cosmetics, and sensitive to evaluate food additives and pesticides and reproducibility necessary development of short-term in vitro assays which are self-evident will be. 본 명세서에 설명된 미세기관 배양물은 조직 동등물을 분석 기질로서 사용가능케 하며 생체내 상태와 매우 유사한 시스템으로 정상 세포 상호작용의 장점을 제공한다. Enabling use of a micro-organ cultures are described herein as a water equivalent tissue analysis substrates and provides the advantages of normal cell interactions in much the same system with the in vivo state.

이와 같은 목적을 위해, 배양물을 시험관내 유지시킨 후 시험 화합물에 노출시킨다. For this purpose, after the maintenance in vitro the culture exposed to the test compound. 세포독성 화합물의 활성은 체외이식편에 존재하는 세포의 표현형(예컨대 사멸)을 변조시키는 능력을 통해 측정할 수 있다. The cytotoxic activity of the compounds can be measured through its ability to modulate the phenotype (e.g., apoptosis) of cells in the explant. 이와 같은 측정에는 생생한 염색 기법, 마커 발현 등을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다 예를 들어, 성장/조절 인자의 효과는 배양물의 세포 함유물, 예컨대 총세포수 및 분화세포수를 분석하여 평가할 수 있다. Such measurements can be carried out easily by using a bright staining techniques, a marker expressed, for example, growth / regulatory factors of the effect of containing water cultured cells with water, for example, be evaluated by analyzing the total number of cells and differentiated cells have. 이 분석에는 형별 특이성 세포 항원을 규정하는 항체를 이용하는 면역세포화학 기법을 비롯한 표준 세포학적 및/또는 조직학적 기법을 이용하여 수행할 수 있다. This analysis can be carried out using standard cytological and / or histological techniques including the immunocytochemistry technique using an antibody that defines a typing cell antigen specificity. 본 발명의 시스템에서 배양한 정상 세포에 미치는 각종 약물의 효과를 평가할 수도 있다. It may evaluate the effectiveness of various drugs on normal cells cultured in the system of the present invention. 예를 들어, 건선 조직의 증식을 감소시키는 약물을 확인할 수 있다. For example, you can see the drug to reduce the proliferation of psoriatic tissue.

체외이식편에 있는 세포의 증식을 자극하는 제제의 검출을 위해 유도된 본 방법의 예시적 구체예로서, 본 방법은 대상으로부터 조직 체외이식편을 분리하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 체외이식편의 세포 집단은 이 체외이식편이 분리된 기관이나 조직의 미세구조를 보유하는 것으로서, 예컨대 체외이식편은 적어도 약 1.5mm -1 이상의 알레프를 특징으로 하고 증식하는 능력을 보유한 적어도 하나의 세포를 포함하는 것이다. As the exemplary embodiment of the method derived for the detection of agents that stimulate proliferation of cells in the explant, the method comprises the population of cells of the explant in, and here includes the step of separating the tissue explant from a subject is as to hold the fine structure of the isolated organ or tissue the explant, e.g., the explant is to include at least one of the cells have the ability to proliferate and characterized by Aleph of at least about 1.5mm -1. 이 체외이식편을 배양하여 후보 화합물과 접촉시킨다. Culturing the explant is contacted with a candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨을 측정하고, 후보 화합물의 부재하에 측정한 세포 증식의 레벨과 비교한다. Measuring the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound, and comparing the level of cell proliferation measured in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨의 통계적으로 유의적인 증가는 세포 증식제로서 사용할 수 있음을 시사하는 것이다. Statistically significant increase in the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is to suggest that they can be used as a cell proliferation agent.

본 명세서에 사용된 "후보 화합물" 또는 "후보제"란 용어는 증식, 항증식, 분화, 항분화 또는 항바이러스 활성에 대해 시험하거나 시험할 제제를 의미하는 것이다. The "candidate compound" or "candidate No." is the term used herein is intended to mean an agent to be tested, or tested for proliferative, anti-proliferative, differentiating, anti-differentiating, or anti-viral activity. 이와 같은 제제는 예를 들어 작은 유기 분자, 생물학적 추출물 및 재조합 산물이나 조성물일 수 있다. Such formulations may be, for example, small organic molecules, biological extracts, and recombinant products or compositions.

세포 증식을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 가장 일반적인 방법은 세포 복제시의 특징인 DNA 합성을 측정하는 것을 포함한다. Method of measuring cell proliferation are well known in the art and is the most common method involves measuring the DNA synthesis characteristic of cell replication upon. DNA 합성을 측정하는 방법에는 당해 기술분야에 공지된 수많은 방법이 있고, 이 중 어느 한 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. Method of measuring the DNA synthesis may be used in accordance with the present invention this and, the one of which method a number of methods known in the art. 본 발명의 일 구체예에서는, DNA 합성의 측정을 위해 방사능 표지 ( 3 H-티미딘) 또는 표지된 뉴클레오타이드 유사체(BrdU)를 이용한 면역형광성 검출을 사용하였다. In one embodiment of the invention, an immune fluorescence detection using a radioactive label (3 H- thymidine) or labeled nucleotide analogues (BrdU) it was used for the measurement of DNA synthesis.

또 다른 구체예에서는 세포 증식 억제제를 동정하는 방법을 제공한다. In yet another embodiment provides a method for identifying a cell proliferation inhibitor. 이 방법은 전술한 바와 같은 조직 체외이식편을 제공하는 단계, 이 체외이식편을 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다. The method comprises the steps of measuring the level of cell proliferation in the presence of the steps of: providing a tissue explant as described above, comprising the explant into contact with a candidate compound, the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨이 통계학상 유의적으로 감소한다는 것은 세포 증식 억제제임을 시사하는 것이다. Mean that the presence of the candidate compound is a level of cell proliferation statistically significantly decreased to suggest that the cell growth inhibitor.

예시적 구체예에서는, 세포 증식의 증강제 및 억제제(본 명세서에서는 항증식제라고도 부름)를, 예컨대 목적 효과에 따라 털의 성장을 제어하는데 사용할 수 있다. In the exemplary embodiment, the enhancers and inhibitors of cell proliferation can be used to control the growth of hair in accordance with the, for example, desired effect (herein also referred to as anti-proliferative agents).

울(wool)과 털 같은 경질 각질 섬유의 성장은 표피집세포의 증식에 따라 달라진다. Wool (wool) and wool growth of hard keratin fibers such is dependent on the growth of epidermal cells home. 집의 모낭 줄기 세포는 매우 활성적이어서 빠른 증식과 복잡한 분화를 통해 모섬유를 발생시킨다. Home hair follicle stem cells to generate a very active moseomyu have come through the rapid proliferation and differentiation complex. 이러한 털 순환에는 뚜렷한 3단계가 있다: 성장기(증식), 퇴행기(퇴화) 및 휴지기(휴식). The hair cycle is a clear Step 3: growing (growth), catagen (involution) and telogen (resting). 모낭의 표피 줄기세포는 휴지기 후반 중에 표피 유두에 의해 활성화된다. Epidermal stem cells in the hair follicles are activated by epidermal papillae during the second half of resting. 이를 "돌출 활성화"라 한다. This is referred to as "projecting activation". 또한, 이와 같은 줄기세포는 털 및 모낭 구조는 물론 피지선 및 표피도 발생시키는 다능성 줄기세포로 사료된다. In addition, these stem cells are thought to be pluripotent stem cells of hair follicles and sebaceous glands, as well as the structure and the skin also occurs. 세포증식제와 세포증식 억제제는 털 성장 순환의 동태를 변화시키는 수단으로서, 예컨대 모낭 세포, 구체적으로 모낭의 줄기세포의 증식을 정지시킨다. As the cell proliferation and cell proliferation inhibitors include means for changing the dynamics of the hair growth cycle, for example, hair follicle cells, thereby specifically stop the growth of the hair follicle stem cells.

모낭 세포 증식의 억제제는 절단, 면도 또는 털뽑기 등에 의한 통상적인 제거방식과는 다르게 인간의 털 성장을 감소시킬 수 있는 방법으로서 사용할 수 있다. Inhibitors of hair follicle cell proliferation can be used as a way to alternatively with conventional ablative caused by cutting, shaving or hair pulling reducing human hair growth. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 확인된 모낭세포 억제제는 털의 급속 또는 치밀한 이상 성장을 특징으로 하는 털증, 예컨대 털과다증의 치료에 사용할 수 있다. For example, the hair follicle cells inhibitor identified according to the method of the invention can be used in the teoljeung, for example, treatment of the fur hyperplasia characterized by rapid or dense growth of hair over. 예시적 구체예에 있어서, 이러한 억제제는 이상 털증으로 표시되는 질환인 다모증을 치료하는데 사용할 수 있다. In the illustrative embodiment, such inhibitors can be used to treat diseases of hirsutism represented by the above teoljeung. 이러한 억제제의 사용은 탈모 기간을 연장시키는 방법을 제공할 수 있다. The use of such inhibitors may provide a method to extend the period of hair loss.

모낭 세포 증식의 억제제는 또한 세포 주기의 S기로 진행되어야 효능을 발휘하는 세포독성제로부터 모낭 세포를 보호하는데 사용할 수 있다. Inhibitors of hair follicle cell proliferation can also be used to protect hair follicle cells from cytotoxic agent that yields efficacy should proceed group S of the cell cycle. 이러한 억제제로의 처리는 모낭 세포를 정지기로 유도하여 보호작용을 제공하는데, 예를 들어 세포가 S기로 진행되지 않도록 억제하여 모낭세포의 유사분열 파국 또는 예정세포사멸을 방지하는 것이다. Treatment with these inhibitors provides a protective effect to induce follicular cell groups stop, so that, for instance, by inhibiting the cells are not proceed groups S to prevent mitotic catastrophe or apoptosis will of hair follicle cells. 예를 들어, 모낭 세포증식의 억제제는 통상적으로 탈모를 초래하는 화학치료법이나 방사선요법을 받는 환자에게 사용할 수 있다. For example, inhibitors of the hair follicle cell proliferation can be typically used for patients undergoing chemotherapy or radiation therapy, which results in hair loss. 억제제 처리는 이러한 치료 중에 세포 순환의 진행을 억제함으로써, 세포 사멸 프로그램의 활성화로 나타날 수 있는 사멸로부터 모낭세포를 보호할 수 있다. Inhibitor treatment can protect hair follicle cells from death, which may receive the activation by inhibiting the progression of the cell cycle during this treatment, cell death program. 치료가 종결된 후에는 모낭 세포 증식을 억제할 필요가 없으므로 억제제 처리도 없앨 수 있다. After the treatment is terminated it can also remove inhibitors process since it is not necessary to suppress hair follicle cell proliferation.

하지만, 털 성장 조절에 근본적인 분자 기작을 규명하고자 개시하고 털에 영향을 미치는 잠재적 약물을 시험하기 위하여 털 성장의 시험관내 모델이 필요하다. However, this in vitro model of hair growth is needed to initiate to investigate the molecular mechanisms underlying the hair growth regulation and to test potential drugs that affect the hair. 본 발명의 일 양태로서, 본 방법은 모낭의 미세구조를 보유하는, 예컨대 모낭의 상피층과 모낭의 기질 성분(표피 유두), 예컨대 줄기 세포, 외근집세포, 간질 세포 및 내근집세포 중 하나 이상 사이의 상호작용을 보유하는 모낭 미세기관 체외이식편을 제조하는데 사용한다. In one aspect of the invention, between the present method the substrate components of, for example, the hair follicle that holds the micro-structure of the hair follicle epithelial layer and hair follicles (skin nipple), such as stem cells, a mobile home cells, stromal cells and naegeun least one of the home cell for use in preparing the cross-hair follicle micro-organ explant having an action. 후속되는 실시예에서 입증되듯이, 털 성장은 혈청의 부재하에서도, 예컨대 최소 배지에서도 상기 미세기관 배양물에서 관찰된다. As will be demonstrated in the subsequent embodiment examples, hair growth is observed under the serum member as well, such as in the micro-organ cultures in minimal medium. 중요한 것은, 본 발명이 실질적으로 휴지기, 예컨대 휴식 상태에 있는 모낭을 제공하는 모낭 배양물을 제공한다는 점이다. The important thing is that the present invention is substantially discontinuous, for example, provides a hair follicle culture which provide the hair follicles in the resting state. 이하에서 입증되는 같이, 휴지기 모낭 체외이식편은 시험관내 배양물에서 증식성인 성장기 모낭으로 활성화될 수 있고, 특정 구체예에서는 동조적 방식으로 활성화될 수 있다. As demonstrated below, the telogen hair follicle explants can be activated to proliferation adult follicular growth in vitro culture, and in certain embodiments can be activated by tuning manner. 일시 증식 초기의 모낭의 표피 줄기세포는 예를 들어 모낭 기관의 각종 조직에서 생산되는 주변분비 인자 및/또는 자가분비 인자들에 매개되는 것과 같은 성장기의 활성화를 이해할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다. Of suspended growth early follicular epidermal stem cells, for example, provides a unique opportunity to understand the activation of growth such as that mediated the paracrine factors and / or autocrine factors produced in various tissues of the hair follicle institutions.

또한, 본 발명의 미세기관 배양물은 모낭의 활성화 또는 불활성화를 변조시키는 제제를 동정할 수 있는, 예컨대 털 성장을 촉진 또는 억제할 수 있는 제제를 동정하는 시스템을 공급한다. Further, the micro-organ cultures of the present invention is to supply a system for identifying an agent that can, for example, to promote or inhibit hair growth that can identify agents which modulate the activation or inactivation of the hair follicle. 일 구체예로서, 하기 실시예 XVIII에 기술된 바와 같은 휴지기(휴식 상태) 모낭 체외이식편을 각종 시험 제제와 접촉시킨 후, 모낭의 자극 레벨을 측정한다. After contacting the telogen (resting state), follicle explants, such as one specific example, described in Example XVIII with various test agents, and measure the level of stimulation of the hair follicles. 예를 들어, 모낭 줄기세포의 휴지기에서 성장기로의 전이는 모낭 세포의 유사분열 지수를 관찰하거나 또는 증식을 측정할 수 있는 다른 유사한 방법을 사용하여 모니터할 수 있다. For example, the transition from the resting stage of the hair follicle stem cells to growth can be monitored by using other similar methods which can be observed or measured the mitotic index proliferation of hair follicle cells. 일 예로서, 도 17은 체외이식편에 존재하는 줄기세포 활성화의 상대적 레벨을 시험 화합물(이 도면에서는 FGF)의 존재 또 는 부재 하에 측정하기 위하여 티미딘 병입률을 사용할 수 있고 증식 증가가 털 성장 촉진 활성이 있는 시험 제제임을 시사한다는 것을 보여주는 것이다. In one example, the promotion 17 is test the relative levels of stem cell activation present in the explant compound available thymidine feed rate to the presence or measuring the absence of the (in this figure, FGF), and growth increasing hair growth to demonstrate that suggest that the test agent that is active.

역 분석에서, 예를 들어, 첨부된 실시예에 기재된 활성화된 센카(Sencar) 체외이식편 또는 성장 인자 자극된 체외이식편(예를 들어, FGF 자극됨)와 같은 성장기 미세기관 체외이식편은 배양물로 제공된다. In reverse engineer, for example, activated senka (Sencar) explants or growth factor stimulated explants growing micro-organ, such as (e.g., FGF stimulated search) explants described in the appended examples are available in the culture do. 예를 들어, 비처리된 모발성장 체외이식편에 상대적으로 모낭 줄기 세포의 성장을 억제하는 시험 제제가 추가로 모발 성장을 방해하는, 휴지기(telogenic) 제제용으로서 고려될 수 있다. For example, it may be considered as for the untreated hair growth relative to the follicular test agent to inhibit the growth of stem cells to interfere with hair growth by adding, resting (telogenic) formulation in the explant.

여전히 또 다른 양태에서, 대상 분석에 의해 동정된 세포 증식(예를 들어, 종양 형성 및 성장)의 억제제를 사용하여 신생 또는 과다증식 세포의 성장을 억제할 수 있다. Still it may be in a further aspect, using inhibitors of cell proliferation (e.g., tumor formation and growth) identified by the analysis target inhibit the growth of new cells or hyperproliferation. 본 발명의 바람직한 양태는 상피 종양 형성 및 성장의 억제에 관한 것이다[문헌참조: 1995년 2월 7일자로 출원된 미국 특허원 제08/385,185호]. A preferred aspect of the invention relates to inhibition of epithelial tumor formation and growth [Reference: filed on the date 7 February 1995 US Patent Application No. 08/385 185 call. 세포 증식의 조절이 변화되고 세포와 이들 주변 세포간의 상호작용으로 인해 침투 및 전이를 유발하는 장애의 결과로서 종양이 형성된다. The tumors are formed as a result of the failure to cause the invasion and metastasis is the regulation of cell growth is changed due to the interaction between cells and their surrounding cells. 세포 분열로 부터 비롯되는 세포 수의 증가와 분화 또는 세포 사멸로 인한 세포 주기로 부터의 이탈간의 상호관계의 파괴가 세포 증식의 조절을 방해한다. The destruction of the interrelationships between the exit from the cell cycle due to the increase in cell number and differentiation or cell death that results from a cell division to interfere with the regulation of cell proliferation. 정상적인 조직에서, 항상성은, 각각의 줄기 세포가 분열함으로써 2개의 딸 세포중 하나만이 줄기 세포 구획부에 유지되고 또 다른 하나의 딸 세포는 분화 경로를 거치도록 보장됨에 의해 유지된다[문헌참조: Cairns, J.(1975)Nature 255:197-200]. In normal tissues, homeostasis is, by each stem cell divides two daughter cells is only one stem cell is held in the compartment and the other daughter cell of which is held by the guaranteed to go through the differentiation path [Reference: Cairns , J. (1975) Nature 255: 197-200]. 따라서, 세포 증식의 조절은 이들 과정에 영향을 주는 시그날에 의한 것이다. Accordingly, regulation of cell growth is due to the signals that affect these processes. 이들 시그날은 양성 또는 음성일 수 있고 종양원성은 이들 조절 지점에 영향을 주는 유전학적 변화에 의해 획득된다. The signal may be a positive or negative oncogenic is obtained by genetic changes that affect these control points.

실시예 IX에 기술되고 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 피부 미세기관 배양물이 세포 증식 제제 및 세포 증식의 억제제를 동정하기 위해 사용되었다. Example IX As shown in Figure 12 described and on, the skin micro-organ cultures of the present invention was used to identify inhibitors of cell proliferation agents and cell proliferation. 실시예 IX에 기재된 바와 같이, TGF-β가 시험되었고 세포 증식의 억제제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. As described in Example IX, it was found that TGF-β action has been tested as an inhibitor of cell proliferation. TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원인 액티빈 단백질은 또한 상피 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. The liquid protein activin members of the TGF-β superfamily was also shown to inhibit the growth of epithelial cells. 이들 결과는 상피 세포의 증식을 억제하는 데 관여하는 TGF-β 패밀리의 또 다른 구성인이 존재할 수 있음을 지적한다. These results indicated that the TGF-β family which is involved in inhibiting the proliferation of epithelial cells, yet another configuration of this can be present. 당해 데이타는 상피 항상성의 중요한 조절인자로서 및 생체내 상피 종양 형성 및 성장을 억제하는데 있어서 TGF-β 패밀리의 단백질에 대한 역할을 제안한다. Art data suggest a role for the proteins of the TGF-β family according to inhibit an important regulator of epidermal homeostasis and in vivo epithelial tumor formation and growth.

본 발명의 또 다른 측면은 세포 분화 제제, 즉, 세포 분화를 유발하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the invention relates to cell differentiation agents, that is, a method for identifying a compound to induce cell differentiation. 당해 방법은 세포 집단이 세포가 분리되는 기관 또는 조직의 미세 구조를 갖고 표면적 대 부피 지수가 약 1.5mm -1 이상인 세포 집단을 대상으로부터 분리시킴을 포함하고 분화 능력을 갖는 하나 이상의 세포를 포함한다. The method is a population of cells comprising at least one cell having an engine including Sikkim or the microstructure of surface area to volume index of the tissue has separated from the target cell population is at least about 1.5mm -1 and differentiation capacity which the cells are separated. 이어서, 세포는 약 24 시간 이상동안 배양물에 부가하고 후보 화합물과 접촉시킨다. Then, the cells are then added to the culture for at least about 24 hours in contact with the candidate compound. 이어서, 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 수준을 측정하고 후보 화합물의 부재하의 세포 분화 수준과 비교한다. Then, the measured level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 통계학적으로 상당한 세포 분화 수준의 증가는 후보 화합물이 세포 분화 제제임을 암시한다. Increase of the candidate compound substantial cell statistically differentiated levels in the presence of a candidate compound suggests that the formulation cell differentiation. 본원에 기재된 바와 같은 분화는 세포가 고유적으로 소유한 형태 및 기능뿐만 아니라 또는 이들과는 상이한 획득된 형태 및/또는 기능을 갖는 세포를 언급한다. Differentiation as described herein, as well as the form and functions of cells are owned inherently thereof and refers to a cell having a different form obtained and / or function. 전형적으로 이들 형태 및 기능은 성숙한 세포의 특징이다. Typically these forms and functions are characteristic of mature cells. 본 발명의 세포 집단의 분화는 특정 세포 생성물의 생성 및/또는 분비를 측정하여 모니터할 수 있다. Differentiation of the cell population of the invention can be monitored by measuring production and / or secretion of certain cellular products.

유사한 방식으로, 본 발명은 또한 세포 분화의 억제제를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. In a similar manner, the present invention also relates to a method for identifying an inhibitor of cell differentiation. 상기한 바와 같은 동일한 프로토콜에 따라, 후보 화합물의 존재하에 세포 분화의 수준을 측정하고 후보 화합물의 부재하의 세포 분화 수준과 비교한다. According to the same protocol as described above, to measure the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 수준의 통계학적으로 상당한 감소는 세포 분화의 억제제임을 암시한다. In the presence of the candidate compound statistically significant reduction in the level of cell differentiation suggests that an inhibitor of cell differentiation.

또 다른 양태에서, 대상 배양물은 바이러스 감염에 대한 시험관내 모델을 확립할 수 있게 한다. In another embodiment, the subject culture will be able to establish in vitro models for viral infection. 예를 들어, 상피 또는 편평 조직은 분리될 수 있고 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1, 헤르페스 심플렉스 바이러스 2와 같은 헤르페스 바이러스; For example, epidermal or squamous tissue can be isolated and, for example, herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2, herpes virus, such as Rex; 바리셀라-조스터 바이러스 또는 사람 파필로마 바이러스, 예를 들어, 사람 파필로마 바이러스 1-58, 예를 들어, HPV-6 또는 HPV-8과 같은 사람 파필로마 바이러스에 감염될 수 있다. Varicella-zoster virus or human papilloma virus, for example, a person papilloma virus 1-58, for example, may be infected with the human papilloma virus, such as HPV-6 or HPV-8. 유사하게, 간 모델은 간염에 대해, 예를 들어, 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스로 감염된 체외이식편으로서 제공될 수 있다. Similarly, inter-model for the hepatitis, e.g., hepatitis virus, for example, be provided as an explant infected with hepatitis A, B hepatitis or hepatitis C virus. 바이러스로 감염된 조직 체외이식편을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 바이러스 감염 능력의 억제제를 동정할 수 있다. By the method of the present invention using tissue explants infected with a virus it can identify inhibitors of viral infectivity. 상기한 바와 같이, 특정 미세기관 배양물이 제공되고 세포를 감염시켜 바이러스 감염된 세포 집단을 생성하는 바이러스와 임의로 접촉시킨다. , It is brought into contact to provide the particular micro-organ culture and infection of cells with virus to produce a virus infected cell population, optionally as described above. 이어서 바이러스 감염된 세포는 후보 화합물과 접촉시키고 후보 화합물의 존재하에 바이러스 감염 능력의 수준을 측정한다. Then the virus-infected cells is measured the level of viral infectivity in the presence of the candidate compound and in contact with the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 바이러스 감염 능력의 측정된 수준은 후보 화합물의 부재하의 바이러스 감염 능력의 수준과 비교한다. In the presence of the candidate compound measured level of viral infectivity is compared to the level of viral infectivity in the absence of the candidate compound. 후보 화합물의 존재하에 바이러스의 감염 능력 수준의 통계학적 상당한 감소는 바이러스 감염 능력의 억제제임을 암시한다. Statistically significant reduction of the candidate compound the level of viral infectivity in the presence of a suggests that inhibitors of viral infectivity.

바이러스 감염 능력을 측정하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 사용되는 바이러스 유형에 따라 다양하다. Method of measuring the viral infectivity will vary depending on the type of virus to be used are known in the art. 예를 들어, 바이러스 감염 능력 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 하나의 방법은 미세기관 배양물의 감염된 세포 또는 시험될 특정 바이러스에 특이적인 유전자 생성물을 갖는 미세기관 배양 배지에서의 생성 수준을 측정하는 방법이다. For example, one method that can be used to measure viral infectivity levels is to measure the production level of the micro-organ culture medium having a specific gene product in the micro-organ culture of water-infected cells or a particular virus to be tested . 예를 들어, 미세기관 배양물내의 세포에 대한 B형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스의 감염 능력의 수준을 측정하기 위해, 간염 단백질의 생성 및 간염 DNA를 정량할 수 있다. For example, the micro-organ culture in order to measure the level of infectivity of hepatitis virus such as hepatitis B virus for the cells in water, hepatitis can be generated and the amount of DNA hepatitis protein. 일반적으로, 미세기관 배양물 배지는 선택된 바이러스 단백질 및 SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ELISA상에서 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 분석된 면역반응성 단백질에 대한 항체와 항온처리할 수 있다. In general, micro-organ culture medium can be incubated with antibodies against a selected viral protein and SDS- polyacrylamide gel and immunoreactive proteins analyzed by a variety of methods known in the art on the ELISA. 예를 들어, B형 간염 바이러스 표면 항원의 생성을 측정하기 위해, B형 간염 바이러스와 이전에 항온처리된 미세기관 기원의 미세기관 배양 배지를 매일 일정 간격으로 샘플 채취하여 제조업자가 기재한 바와 같은 ELISA(Abbott) 방법에 의해 표면 항원에 대해 분석할 수 있다. For example, to measure production of hepatitis B surface antigen, were collected micro-organ sample in the culture medium in every predetermined interval of the constant-temperature-treated micro-organ origin of the hepatitis B virus as previously described by the manufacturer described ELISA (Abbott) by the method can be analyzed for the surface antigen. 정량을 위한 당해 방법은 연속 희석된 표준 표면 항원(CalBiochem)을 사용하여 변형될 수 있다. The method for quantification can be modified using a series of diluted standard surface antigen (CalBiochem). 배양 배지내 B형 간염 바이러스 표면 항원의 축적에 있어서 통계학적으로 상당한 감소는 시험된 후보 화합물이 간염 바이러스 감염 능력에 대한 억제제임을 지적한다. In the accumulation of the culture within the hepatitis B virus surface antigen medium statistically significant reduction is noted that the tested candidate compound hepatitis viral infectivity inhibitor for.

미세기관 배양 배지내 HBsAg의 수준을 측정하는 것뿐만 아니라, 미세기관 배양물 기원의 세포 추출물로부터 새롭게 합성된 B형 간염 바이러스 DNA를 DNA의 PCR 증폭에 이어서 프로브로서 HBV pre-S(HBsAg 코딩) 영역내 표지된 프라이머 쌍을 사용한 서던 블롯 분석에 의해 검출하고 정량할 수 있다[문헌참조: Sambrook, J. Et al.(1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., vol. As well as to measure the level of micro-organ culture medium HBsAg, micro-organ cultures of the hepatitis B virus DNA synthesized newly from the cell extract of the water originating in the PCR amplification of the DNA followed by HBV pre-S (HBsAg encoding) region as probes it with labeled primers can be detected and quantified by Southern blot analysis [reference:.. Sambrook, J. Et al (1989) Molecular Cloning - a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed, vol. 2, pp. 2, pp. 10.14-10.15]. From 10.14 to 10.15. 점도 측정기에 의해 상대적으로 정량화될 수 있고 상응하는 밴드의 섬광 계수에 의해 확인될 수 있다. The viscosity can be relatively quantified by the instrument and can be confirmed by scintillation counting of corresponding bands. 새롭게 합성된 바이러스 DNA의 감소는 시험된 후보 화합물이 간염 바이러스 감염 능력의 억제제임을 지적한다. Reduction in newly synthesized viral DNA is pointed out that the test compound is a candidate inhibitor of hepatitis virus infectivity.

또 다른 예에서, 레트로바이러스, 예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 gag, pol 및 env 단백질 생성물은 또한 상기된 기술 및 당해 기술 분야에 공지된 기타 표준 기술에 의해 측정할 수 있다. In another example, for retroviruses, for example, gag, pol, and env protein products of the human immunodeficiency virus (HIV) may also be measured by any other standard technique known in the above-described, and those skilled in the art. 예를 들어, HIV로 감염된 미세기관 배양물의 세포내 pol 단백질 발현은 세포 추출물을 항 pol 항체 또는 수거된 AIDS 환자 혈청 및 SDS/폴리아크릴아마이드 겔상에서 분석된 면역반응 단백질로 항온처리함에 의해 측정할 수 있다. For example, micro-organ cultures of water intracellular pol protein expression infected with HIV can be measured By incubating a cell extract, wherein a pol antibodies or collected AIDS patient serum and SDS / poly immune response proteins analyzed on acrylamide gel have. 본 발명의 미세기관 배양물내에서 헤르페스 바이러스, 예를 들어, 엡스타인/바르 바이러스(EBV)의 감염 능력을 측정하기 위해, EBV DNA 및 EBV-유도된 핵 항원 생산은 본원에 기재된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. To measure infectivity of herpes virus, e.g., Epstein / Barr virus (EBV) in the micro-organ culture mulnae of the present invention, EBV DNA and EBV- induced nuclear antigen production can be analyzed using the methods described herein can.

본 발명의 미세기관 배양물을 또한 사용하여 대상내 상처 치유를 촉진시킬 수 있다. And also using the micro-organ cultures of the present invention can promote wound healing in a subject. 따라서, 본 발명은 추가로, 수용자내 상처 치유를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. Accordingly, the invention further relates to methods for promoting wound healing in a recipient subject. 당해 방법은 공여자로부터 표면적 대 부피 지수가 약 1.5mm -1 이상인 세포 집단을 분리시킴을 포함한다. The method includes from the donor surface area to volume index of Sikkim remove the population of cells greater than or equal to about 1.5mm -1. 전형적으로, 세포 집단은 약 24시간이상 동안 배양물내 부가한다. Typically, the cell population is cultured add mulnae for more than about 24 hours. 이어서, 세포 집단은 수용자의 상처에 적용될 수 있다. Then, the cell population may be applied to the wound of the recipient. 한 양태에서, 상처 또는 병변은 느린 치유 또는 만성 상처, 예를 들어, 당뇨병과 연관된 상처, 예를 들어, 화상, 예를 들어, 궤양이다. In one embodiment, the wound or lesion, for slow-healing or chronic wounds, for example, for wound associated with diabetes, for example, for an image, for example, an ulcer. 실시예 X 및 XI에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 피부 미세기관 배양물은 미소 체외이식편으로서 사용되어 만성 상처(실시예 X)에 적용될 수 있고 모발을 성장시킬 수 있는 생존 이식체(실시예 XI)를 형성할 수 있다. Examples As demonstrated in the X and XI, chronic wounds according to the present invention, skin micro-organ culture is used as a smile explant embodiment (embodiment X) can be applied to and survive transplantation to grow hair material (such as XI ) it can be formed.

여전히, 또 다른 양태에서, 대상 미세기관 체외이식편은 세포독성 또는 자극에 대한 시험 분석에 제공된다. Still, in another embodiment, the subject micro-organ explant is provided to the testing and analysis of the cytotoxic or irritation. 예시적인 양태에서, 대상 방법은 시각 및 표피 자극제에 관한 시험관내 시험 기술을 제공한다. In an exemplary embodiment, the subject method provides a technique for in vitro testing the visual and skin irritants. 상기한 바와 매우 유사한 방법은 액체, 고체 과립 또는 겔형 물질(예를 들어, 화장제)를 본 발명의 미세기관 배양물에 국소 적용함에 이어서 배양물내 생성된 효과를 검출하는 단계를 포함한다. Very similar to the method described above is followed by a step of detecting a generated effect mulnae culture as liquids, solids or granules (e.g., the make-up), the gel material topical application to the micro-organ cultures of the present invention.

현재, 많은 화학물질, 가정용 세정 제품, 화장품, 페인트 및 기타 물질의 잠재적인 안구 및 피부 자극은 동물 또는 인간 대상에 직접 적용하여 평가된다. Currently, many chemicals, household cleaning products, cosmetics, eye and skin irritation potential of paint and other materials are valued by applying directly to the animal or human subject. 그러나, 산업 분야에서 대부분 평가되는 바와 같이, 당해 방법은 압도적으로 대중의 호응에 부적합하다. However, as will be most evaluated in the industry, the process is unsuitable for the mass overwhelmingly response. 본 발명의 방법은 동물의 희생 또는 영구적인 상해를 입힐 필요가 없는 또 다른 분석법을 제공하고 또한 목적하는 포맷으로 데이타를 제공한다. The method of the invention provides another method that does not require sacrifice or cause permanent injury to the animal and also provides data in a desired format. 예시적인 양태에서, 피부 미세기관 배양물은 본 발명에 따라 유도된다. In an illustrative embodiment, skin micro-organ cultures are derived according to the invention. 배양된 체외이식편은 화장품 제제와 같은 시험 제제와 접촉시키고 세포 생존력은 노출 후 몇몇 시점에서 평가한다. The cultured explants are contacted with the test agent, such as cosmetic preparations cell viability is assessed at some time after the exposure. 바람직한 양태에서, MTT 분석(기능적인 미토콘드리아에 의한 테트라졸륨 감소를 기준으로 함)을 사용하여 생존력에 대해 점수를 매긴다. In a preferred embodiment, by using the MTT assay (based on reduction of a tetrazolium by functional mitochondria) ranks score for viability.

본 원의 미세기관 배양물은 추가로 조직 및 세포의 정상적인 항상성에 관여하는 인자를 동정하고 영양물의 변화 및 잠재적으로 독성인 제제의 존재를 포함하는 세포의 환경에서 변화에 대해 조직 및 세포의 정상적인 항상성에 대한 효과를 연구하고 병리 또는 외상의 초기 및 진행 동안에 유발되는 조직 및 세포내 변화 경로를 연구하고 병리 또는 외상과 연관된 변화된 환경에서 역효과를 역전시키는 복구 기작을 동정하고 조직의 정상적인 항상성 동안에 분화하는 세포의 발육 조절 및 조직내 특정 구조(예를 들어, 모낭)의 발육 조절 및 개인 기관의 일부가 보존되지만 만성 피부 궤양을 갖거나 부적합한 혈액 공급에 의해 유도되는 치유 결핍을 갖거나 국소 피부가 당뇨병 I형 또는 II형으로서 공지된 증상에서와 같이 치유 불가능한 환자에서 발생하는 Normal homeostasis of the original micro-organ culture is added to tissue and the factors identified involved in normal homeostasis of the cells and to changes in including the presence of the formulation to changes in nutrients and potentially toxic cellular environment tissues and cells in the study the effects of, and identification of recovery mechanisms for studying the tissues and cells change path caused during the early and progression of pathology or trauma, and to reverse the adverse effects from the changed environment associated with the pathology or trauma, and cell differentiation during normal homeostasis of the organization of a particular structure growth control and tissue is part of the growth control and individual organ preservation (e.g., hair follicles), but has the healing deficit induced by have chronic skin ulcers or inappropriate blood supply, or topical skin and diabetes type I or that occur in patients with non-healing, as in the well-known symptoms as type II 바와 같은 손상된 조직을 대체하거나 복원시키는데 불충분한 기관 보충에 관한 연구를 수행하는데 사용될 수 있다. Sikineunde replace damaged tissue, such as insufficient or restore may be used to perform the study of organ replacement.

개괄적으로 기재된 본 발명은 지금부터, 본 발명의 특정 측면 및 양태를 단지 설명할 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하고자는 하는 것이 아닌 하기의 실시예를 참조로 용이하게 이해될 것이다. The present invention described in general are from now on, to limit the present invention and included for purposes of illustration only and the particular aspects and embodiments of the invention will be readily understood with reference to the following examples, not to.

성인 사람 피부, 마우스, 기니아 피그 및 래트 피부를 포함하는 동물 기원의 미세기관 배양물을 분리하고 21일 이하동안 배양하여 성장시킨다. Remove the adult human skin, mouse, guinea pig and rat micro-organ cultures of animal origin, including the skin and by cultures grown for up to 21 days. 그러나, 21일을 초과하는 배양 기간을 유지하는 것은 본 발명의 범위내에 있다. However, maintaining the culture period exceeding 21 days is within the scope of the invention.

추가로, 광범위한 동물로부터 미세기관 배양물을 형성하는 것은 본 발명의 범위내에 있다. In addition, the formation of micro-organ cultures from a wide range of animals within the scope of the invention. 다양한 동물은 단지 예시적인 것이고 하기에 제공된 샘플에 제한 되지 않는다. Variety of animals is not limited to the samples provided to merely exemplary.

첨부된 실시예에서 기재된 바와 같이, 미세기관 배양물은 피부로부터 또한 포유동물 췌장, 간, 신장, 십이지장, 식도 및 방광을 포함하는 기관으로부터 제조된다. As described in the appended examples, micro-organ cultures are prepared from the engine, which also includes the mammalian pancreas, liver, kidney, duodenum, esophagus and bladder from the skin. 유사하게, 포유동물 각막, 신장, 유방 조직 및 다양한 내장 유래의 조직뿐만 아니라 장 및 결장과 같은 식도 기원의 상피의 미세기관 배양물은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. Similarly, mammalian animal cornea, micro-organ cultures of the epithelial origin of the esophagus such as kidney, breast tissue and the colon and the field as well as the organization of the various internal origin may also be prepared using the method of the present invention. 실질적으로, 체내의 식도/간질 구조를 포함하는 임의의 부위로부터 미세기관 배양물을 분리하고 유지시키는 것은 본 발명의 범위내에 있다. It is to substantially separate the micro-organ cultures from any site, including the esophagus / interstitial structure of the body and held within the scope of the invention.

상기에도 불구하고, 대상 미세기관 배양 기술은 특정 림프 조직, 예를 들어, 흉선 및 비장 체외이식편와 같은 식도/간질 구조를 갖지 않는 조직 기원의 장기 배양에서 조직 체외이식편을 보존하는데 사용되어 왔다. In spite of the above, and the subject micro-organ culture technique has been used to preserve certain lymphoid tissue, e.g., thymus and spleen explants in organ culture in vitro yisikpyeonwa tissue of the same tissue origin not having esophageal / stromal architecture.

실시예 I Example I

표피의 미세기관 배양물의 제조 Preparation of the micro-organ culture of the skin

신선한 피부를 수술 후 수득하고 하부 지방 조직으로부터 세정하고 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 수단을 사용하여 0.4 x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 최종 조직 절편의 차원이 폭이 4mm이고 두께가 0.3mm이 되도록 멸균 조건하에서 300㎛ 분획으로 가로로 절단한다(도 1 참조). Obtaining a fresh skin after surgery, cleaned from underlying fat tissue and tissue chopper or other suitable cutting means cut using a 0.4 x 5cm flap and then the dimensions of the final tissue slice width 4mm, and under sterile conditions so that the thickness is 0.3mm a 300㎛ fraction is cut in the horizontal (see Fig. 1). 이들 마이크로그랜스를 1일 내지 8일 기간동안 12rpm에서 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 5% CO 2 하에, 무혈청하에 DMEM 400㎕중의 24웰 미량평판중에 놓는다. Place these in a micro that the lance under 1 days to 8 days while constantly shaken at 12rpm 5% at 37 ℃ CO 2, 24-well plate in DMEM trace 400㎕ reaching a bloodless. 20개의 미세 체외이식편을 웰당 성장시킨다. Grown per well with 20 micro-explant.

실시예 II Example II

마우스, 기니아 피그 및 사람 표피 미세기관 배양물의 증식 측정 Mouse, guinea pig and human skin micro-organ cultures of water proliferation measured

미세기관 배양물을 실시예 I에 따라 제조하고 세포 증식은 하기와 같이 DNA 합성 양을 분석하여 측정한다. The micro-organ cultures prepared according to Example I, and cell proliferation is measured by analyzing the amount of DNA synthesis as follows. 마우스 피부 및 기니아 피그 피부를 2일동안 성장시키고 사람 피부를 4일동안 성장시킨 후, BrdU를 배지에 최종 농도가 3시간동안 100μM이 되도록 배지에 첨가함에 이어서 4% 포름알데하이드 중에서 세포를 고정화시킨다. As growth Mouse skin and guinea pig skin for two days and man after skin grown for four days, addition of BrdU to the medium to have a final concentration in the medium to be 100μM for three hours and then immobilized the cells in 4% formaldehyde. 고정화 후, 배양물을 염소 항-BrdU 항체에 이어서 항 염소 FICT 표지된 IgG로 염색한다. After fixation, followed by the culture to the goat anti -BrdU antibodies, stained with goat anti-FICT labeled IgG. 조직학적 제제는 하기의 고정화에서 4% 포름알데하이드중에 매립시키고 3㎛의 조각으로 절단하고 메틸렌 블루로 염색시킨다. Histological preparations are embedded in 4% formaldehyde in immobilization of the to and thereby cutting into pieces of 3㎛ and stained with methylene blue.

배양한 지 2일 내지 4일 후에 시험관내에서 DNA를 합성할 수 있는 세포 분획이 생체내에서 관찰되는 값과 비교하여 10배까지 증가하였고 이후에, DNA 합성 속도는 점진적으로 감소되었지만 배양물내에서 10일 이하 동안 높게 유지되었다(도 2, 3 및 4A 내지 4D 참조). After it increased by this that can synthesize DNA in vitro after two to four days if a cultured cell fraction compared to the value observed in vivo up to 10 times, DNA synthesis rate is 10 in the culture mulnae was gradually reduced It remained high during the day or less (see Figs. 2, 3 and 4A to 4D). 심지어 배양 6일째에, 세포는 안정한 상태의 증식 및 분화를 유지하여 조직 구조가 보존되었다[도 5A 내지 5C 참조]. Even in the culture on day 6, cells are organized structure was preserved by keeping the proliferation and differentiation of a stable state [see Fig. 5A to 5C].

실시예 III Example III

미세기관 배양물내 다양한 크기의 세포 증식 Mulnae micro-organ cultures of various sizes of cell proliferation

기니아 피그 미세기관은 실시예 I에 따라 제조한다. Guinea pig micro-organ is prepared according to Example I. 폭이 4mm인 전체 두께 피부 스트립을, 두께가 300, 450, 600, 700, 900, 1200 및 3000㎛인 조각을 포함하는 다양한 두께의 체외이식편으로 절단한다. A full-thickness skin strips of a width of 4mm, then cut into explants of varying thickness including the thickness of the pieces 300, 450, 600, 700, 900, 1200 and 3000㎛. 이들 조각은 각각 2일동안 무혈청 배지를 포함하는 웰에 각각 첨가한다. These pieces are respectively added to the wells containing serum-free medium for 2 days, respectively. BrdU는 최종 농도 100μM에서 종결하기전에 4시간동안 첨가한다. BrdU was added for four hours before termination at a final concentration of 100μM. 체외이식편을 이어서 4% 포름알데하이드중에서 고정화하고 BrdU에 대한 염소 항체로 염색시킴에 이어서 항 염소 IgG FITC 표지된 2차 항체 제제로 염색시킨다. In the explant Sikkim then immobilized in 4% formaldehyde and stained with goat antibodies to BrdU are then stained with secondary antibody anti-goat IgG FITC labeled preparation. 당해 실험의 결과는 도 6에서 설명한다. Results of the experiment are described in FIG. 세포/유니트 조직의 수의 함수로서 BrdU 병입양은 체외이식편의 두께가 증가함으로써 상당히 감소한다. As a function of the number of cells / unit tissue it is significantly reduced BrdU bottle adopted by increasing the thickness of the explant.

실시예 IV Example IV

췌장 미세기관 배양물의 제조 및 세포 증식의 측정 Pancreas micro-organ cultures of water produced and the measurement of cell proliferation

기니아 피그 췌장을 제거함에 이어서 두께가 300㎛이고 폭이 4mm이고 깊이가 2mm인 절편으로 적합한 조직 절단기를 사용하여 췌장 미세구조가 유지되는 방식으로 절단한다. Using the appropriate tissue chopper in the guinea pig pancreas was then removed in a thickness of 300㎛ and a width of 4mm depth is 2mm sections will be cut in such a way that the microstructure of the pancreas is held. 미세 체외이식편은 2 내지 18일의 여러 기간동안 배양물에서 성장시킨다. Fine explant was grown in culture for various periods of 2 to 18 days. 7개의 미세기관을 12rpm의 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO 2 하에 무혈청 DMEM 150㎕중에서 플레이트의 96웰 각각에 부가한다. Seven micro-organs is added to serum-free 96-well plate each from 150㎕ DMEM under 5% CO 2 at 37 ℃ under constant shaking of 12rpm. BrdU를 최종 농도 100μM에서 종료하기 3시간 전에 첨가하고 이어서 체외이식편을 4% 포름알데하이드중에 고정화시키고 BrdU에 대한 염소 항체로 염색시킴에 이어서 항 염소 FITC 표지된 IgG로 염색시킨다. In Sikkim to terminate at a final concentration of 100μM BrdU was added prior to 3 hours and then the explants immobilized in 4% formaldehyde and stained with goat antibodies to BrdU are then stained with FITC-labeled anti-goat IgG. 도 7A 내지 7B는 췌장 유래된 미세기관내의 세포가 활성적으로 증 식하고 있음을 도시한다. Figure 7A-7B shows that the micropores of the pancreatic-derived cells in vitro that are actively increased expression.

실시예 V Example V

췌장 미세기관 배양물의 제조 및 배양 배지로의 인슐린 분비의 측정 Pancreas micro-organ cultures measurement of insulin secretion in the culture medium, and produced water

성체의 피그 췌장 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. Of adult pig pancreas micro-organ cultures were prepared as in earlier embodiments of the skin. 췌장을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 길이로 절단하고 두께가 300㎛이고 폭이 4mm인 절편으로 조각낸다. And removing the pancreas produces cut to the appropriate length with scissors, and a piece of 2mm into sections having a thickness of 300㎛ and a width of 4mm. 미세기관 배양물을 무혈청 배지에서 14일동안 성장시킨다. The micro-organ cultures were grown in serum-free medium for 14 days. 2일 마다, 배지를 제거하고 신선한 배지를 첨가한다. Every two days, the medium is removed and fresh medium added. 수거된 배지는 표준 방사선면역분석 방법을 사용하여 인슐린 함량에 대해 분석한다. The collected culture medium using standard radioimmunoassay analysis and analyzed for insulin content.

실시예 VI Example VI

피그 췌장 미세기관의 이종 대상으로의 이식 Transplantation of the two kinds of targets in the pig pancreas micro-organ

성체의 피그 췌장 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. Of adult pig pancreas micro-organ cultures were prepared as in earlier embodiments of the skin. 췌장을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 길이로 절단하고 두께가 300㎛이고 폭이 4mm인 절편으로 조각낸다. And removing the pancreas produces cut to the appropriate length with scissors, and a piece of 2mm into sections having a thickness of 300㎛ and a width of 4mm. 이어서 미세기관 배양물을 무혈청 배지에서 0 내지 5일의 상이한 시점동안 성장시키고 배양한 후, 췌장 미세기관을 배양물로부터 제거하고 래트 숙주의 내장 및 산 분비 중배엽 둘 다로 이식한다. Is then the micro-organ culture in serum-free medium grown for different times of 0-5 days and the culture then removed the pancreas micro-organ from the culture and transplanted into both the internal and acid secretion of the rat Mullerian host. 미세기관은 1개월 이상 생체내 생존하고 널리 혈관화된다. Fine institutions are angry survive in vivo for one month or more vessels and widely. 생체내 3일, 5일, 7일 및 14일 후, 광범위한 세포 증식을 검출할 수 있다. Within three days in vivo, 5 days, 7 days and after 14 days, it is possible to detect a wide range of cellular proliferation. 더욱이, 양성 인슐린 염색이 이식 후, 4일, 7일 및 30일 후에 생체내에서 관찰된다. Moreover, positive insulin staining after the transplantation, the observed in vivo after 4 days, 7 days and 30 days.

실시예 VII Example VII

간, 신장, 십이지장, 식도 및 방광 미세기관 배양물의 제조 및 미세기관 배양물에서 세포 증식의 측정 Liver, prepared kidney, duodenum, esophagus and bladder micro-organ cultures of water and micro-organ cultures measurement of cell proliferation in the water

여러 상피 조직 함유 기관으로부터의 기니아 피그 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. Guinea pig micro-organ cultures from several epithelial tissue containing organ is prepared as in the previous embodiment to the skin. 기관을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 폭, 3mm의 길이로 절단하고 300㎛의 두께의 절편으로 조각낸다. Removing the organ was cut with scissors to the proper width and length of 3mm and a 2mm produce pieces into sections of 300㎛ thickness. 미소 배양물을 무혈청 배지에서 3일, 4일 및 6일동안 배양한다. 3 days smile culture in serum-free medium, and cultured for 4 days and 6 days. 실험을 종료하기 12시간 전에, 3 H-티미딘을 체외이식편의 배양물에 첨가한다. To terminate the test before 12 hours, and the addition of 3 H- thymidine in culture of explants. 종료시에, 조직을 고정화하고 여러 번 세정하고 섬광 계수기로 계수한다. At the end, the fixed tissue was washed several times and counted in a scintillation counter. 당해 실험의 결과는 도 9에 도시되어 있다. Results of the experiment are shown in Fig. 도 9에서 나타낸 바와 같이, 모든 조직은 활성적인 증식을 나타내고 3 H-티미딘의 흡수에 의해 결정되는 바와 같이 6일동안 계속된다. As shown in Figure 9, all tissues are continued for six days as is shown the activity of proliferation determined by the uptake of 3 H- thymidine.

실시예 VIII Example VIII

미세기관 배양물에서 모낭의 증식 Proliferation of hair follicles in the micro-organ culture

피부 미세기관 배양물은 실시예 I에 따라 제조하고 2일동안 배양한다. Skin micro-organ cultures prepared according to Example I and incubated for two days. BrdU를 배양 종료 3시간 전에 첨가한다. BrdU was added to the culture before you shut down for 3 hours. 세포를 4% 포름알데하이드중에 고정화시키고 염소 항 BrdU 항체에 이어서 항 염소 FITC 표지된 IgG로 염색한다. Immobilizing the cells in 4% formaldehyde and then a goat anti-BrdU antibody and stained with FITC-labeled anti-goat IgG. 정상적인 주변 여건하에서 생체내에 존재하는 온전한 모낭은 정확하게 조절되는 배양 조건하에서 유지할 수 있고 혈정 또는 임의의 기타 외인성 인자를 첨가할 필요가 없다. Under normal ambient conditions can be maintained under culture conditions which are exactly adjusted intact hair follicles present in the living body and does not need to be added to the serum or any other exogenous factor. 이들 미세기관에서 모낭 세포는 대다수의 모낭 세포가 BrdU를 병입함에 의해 지적되는 바와 같이 본 발명의 방법의 조건하에서 몇일동안 왕성하게 증식하는 것으로 밝혀졌다[도 10A 내지 10C). In these micro-organ hair follicle cells it has been shown to proliferate for several days vigorously under way in terms of the invention as pointed out by the majority of the hair follicle cells as a feed for BrdU [Figs. 10A to 10C). 미세기관 기니아 피그 배양물의 시간 제로에서 및 2주 후에 모간의 크기 분포는 도 11에 도시되어 있다. In the micro-organ guinea pig culture of water-time and two weeks after the hair shaft size distribution is shown in FIG. 2일마다 배지를 교환하다. The medium is replaced every two days. 모간 크기는 임의대로 소형, 중형 및 대형으로 분류한다. Hair shaft size is categorized as small, medium, and large as any. 배양 9일 후에, 명백하게 크기 분포가 전환되어 소형 모발의 %가 64%에서 28%로 감소된 반면 배양 초기에 존재하지 않았던 대형 줄기가 줄기 집단의 30%를 차지하였다. 9 days after the culture, apparently it has been converted, the size distribution, accounting for a large stem% of small hairs, but was not present in the initial culture while reduced from 64% to 28% to 30% of the trunk group.

실시예 IX Example IX

세포 증식에 대한 후보 화합물의 효과를 측정하기 위한 분석 준비 Analysis prepared to determine the effect of candidate compounds on cell proliferation

배양물은 실시예 I에 기재된 바와 유사한 성장 조건에서 합성 배지에서 제조하고 유지한다. A culture is prepared and maintained in synthetic medium in similar growth conditions as described in Example I. 대조군 샘플은 면역조직화학에 의해 분석하여 미세기관 배양물이 생체내에서 발생하는 것과 유사하는 방식으로 유지됨을 결정한다. Control sample is determined maintained in a manner that is similar to the micro-organ cultures generated in vivo by analysis by immunohistochemistry.

피부 미소 배양물의 2중 샘플을 2.5ng/ml의 TGF-β로 처리한다. In the culture water skin smile 2 processes the samples to the TGF-β of 2.5ng / ml. BrdU 표지된 세포/체외이식편의 수의 정량적인 분석은 실시예 II에 따라 수행한다. Quantitative analysis of the number of BrdU labeled cells / explant was performed according to Example II. 90% 초과의 DNA 합성의 억제가 대조군과 비교하여 TGF-β의 존재하에 관찰된다(도 12). Of DNA synthesis of more than 90% inhibition compared to the control it is observed in the presence of TGF-β (Fig. 12).

실시예 X Example X

만성 비치유 피부 궤양의 치유를 촉진시키는 방법 How to promote the healing of chronic non-healing skin ulcers

본 방법에 따라, 정상적인 비관여 피부 이식체의 적은 면적을 환자로부터 제거하고 두꺼운 폭이 4mm이고 두께가 0.3mm인 미소 체외이식편을 실시예 I에 기재된 바와 같이 제조한다. According to the present method, prepared as removing a small area of ​​the normal non-involved skin, the implant from the patient and according to the width of 4mm thick and smile explant having a thickness of 0.3mm to Example I. 그러나, 당해 제제는, 0.3mm의 조각으로 절단이 고의로 불완전하여 일편의 절편이 도 13에 지적된 바와 같이 함께 유지되고 있고 상단 상피 층은 간질층을 포함하고 있다는 점에서 실시예 I와는 상이하다. However, the preparations are, by cutting the intentionally incomplete as a piece of 0.3mm and held together as indicated in Figure 13. The fragment of one piece and the upper epithelial layer is different from the embodiment I in that it contains the stromal layer. 이식체의 디자인은 영양물이 모든 세포에 도달할 수 있지만 조직 조각이 조작 가능한 포맷으로 유지될 수 있도록 지향된다. The design of the implant is oriented to allow nutrients to reach the cells, but all the pieces of tissue can be maintained in operable format. 환자의 상처를 세정하고 주변 피부 가장자리를 제거한다. Cleaning the wounds of patients, and remove the skin around the edges. 이어서 피부가 없는 영역은 미소 체외이식편으로 덮고 이는 비 절편된 가장 자리가 상향되고 반대 절편 조각이 상처내 유체내에 매달리도록 상처에 위치한다. Then the skin area that is covered with a smile explant which is a non-intercept edge upward and is positioned on the opposite flap pieces are wound wounds hanging in the fluid. 충분한 미소 체외이식편을 제조하여 모든 상처 영역을 실질적으로 덮는다. It covers substantially all of the scars region to prepare a full smile explant. 이어서 처리된 영역을 적합한 드레싱으로 덮고 치유되도록 방치한다. It is then allowed to cure in a suitable dressing covering the treated area.

실시예 XI Example XI

생체내 모낭의 증식 Proliferation of hair follicles in vivo

피부의 1cm 2 영역이 마우스로부터 제거되고 불완전하게 미세 절편되어 전체 피부 영역의 각질이 상기된 바와 같이 잔류하는 생체내 동물 실험을 수행한다. A 1cm 2 area of the skin removed from mouse and fine fragments incompletely to the keratin of the total skin area, performing in vivo animal models which remain as described above. 미세기관을 봉합된 마우스내 본래 위치로 재이식하고 치유되도록 방치한다. And it allowed to re-implant and healing the micro-organ to its original position in the mouse stitched. 이식체는 생존 상태를 유지하고 동물 조직으로 병입되고 신규 모간이 배양한 지 1 내지 2주 후에 이식체로부터 성장한다(도 14 참조). The implant maintains the alive and feeding into the animal tissue and new hair shaft is not growing a culture from one to two weeks after transplantation body (see Fig. 14).

실시예 XII Example XII

사람 건선 피부 미세기관 배양물 People with psoriasis skin micro-organ culture

82세 노년 환자 기원의 분할 두께의 건선성 피부를 피부절단기를 사용한 해부후 수득한다. 82 years to obtain the psoriatic skin of Split Thickness of elderly patients with anatomical origin after cutting the skin. 이어서 피부를 0.5 x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 이것은 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치를 사용하여 300㎛의 절편으로 가로로 절단한다. Then cutting the skin with 0.5 x 5cm flap, and then cutting it horizontally by 300㎛ fragment of using a tissue chopper or other suitable cutting device. 이들 미세기관 절편을 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO 2 하에 무혈청 DMEM하에 미량평판에 부가한다. These micro-organ is a fragment at 37 ℃ under constant shaking for 1 to 14 days under 5% CO 2 under serum-free DMEM added to the trace amount of the plate. 몇몇 경우에, 성장 인자를 배양 배지에 첨가한다. In some cases, the addition of growth factors to the culture medium. 배지를 2일 마다 갈아준다. It gives a badge to wear every two days. 사람 건선성 피부를 미세기관 배양물로서 광범위하게 증식시킨다. Caller then widespread proliferation of psoriatic skin, as the micro-organ culture.

실시예 XIII Example XIII

간염 바이러스로 감염된 간 미세기관 배양물 Micro-organ cultures infected with the liver virus hepatitis

사람, 래트, 마우스 및 기니아 피그 간을 절단하고 미세기관 배양물로서 실시예 VII에서 기재한 바와 같이 배양한다. Cutting the man, rat, mouse and guinea pig liver and cultured as described in Example VII a micro-organ culture. 이들 미세기관 배양물중의 활성 증식을 본원에 기재된 바와 같은 BrdU 병입을 사용하여 검출한다. The proliferative activity of these micro-organ cultures is detected using BrdU feed as described herein. 이들 미세기관 배양물에서 간세포는 배양한 지 14일 이상 후에 우레아(Sigma Chemical, 우레아 검출 키트) 및 알부민 생산(ELISA)에 대한 분석에 의해 측정된 바와 같이 기능적인 것으로 결정되었다. In these micro-organ cultures of hepatocytes it was determined as described above after 14 days incubation as determined by analysis of urea (Sigma Chemical, urea detection kit) and albumin production (ELISA) function.

상기 제조된 사람 간 미세기관 배양물을 B형 간염 바이러스 및 C 형 간염 바이러스에 대해 양성인 환자 기원의 혈청과 항온처리한다. The patient serum and incubated origin positive for the micro-organ cultures prepared above between a person with hepatitis B virus and hepatitis C virus. 24시간 후에, 배지를 제거하고 10%의 정상적인 태아 소 혈청(FCS)의 존재 및 부재하에 신선한 DMEM을 첨가한다. After 24 hours, the medium is removed and fresh DMEM was added in the presence and absence of 10% normal fetal calf serum (FCS). 2일 마다, 배양 배지를 신선한 배지로 교환하고 조건화된 배지를 바이러스 단백질 HB에 대한 항체를 사용하여 바이러스 입자에 대해 시험한다. Every two days, by replacing the culture medium with fresh medium, and using an antibody against the viral protein in the culture medium of conditioned HB tested for viral particles. 상당한 수의 바이러스 입자의 증가는 FCS의 존재하에 당해 미세기관 배양물에서 4일 후 검출된다. Significant increase in the number of virus particles is detected after 4 days in micro-organ cultures of the art in the presence of FCS.

실시예 XIV Example XIV

흉선 및 비장 미세기관 배양물 Thymus and spleen, the micro-organ culture

흉선 및 비장 기원의 마우스 및 래트 미세기관 배양물은 필수적으로 피부에 대해 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. Mouse and rat micro-organ of the thymus and spleen culture of origin is essentially made of, as in the previous embodiment to the skin. 기관을 제거하고 가위로 폭이 2mm이고 길이가 3mm이 되도록 절단한다. Removing the engine, and a width of 2mm, and then cut with scissors to the length of 3mm. 이어서, 이들 샘플을 적당한 조직 절단기를 사용하여 기관의 필수 미세구조를 보존하는 방식으로 대략적으로 300㎛의 두께를 갖는 체외이식편으로 조각낸다. Subsequently, the explants produce pieces having a thickness of approximately 300㎛ in these samples in a manner that preserves the required microstructure of the engine using an appropriate tissue chopper. 이어서 미세기관은 무혈청 배지에서 1, 3, 5 및 10일동안 배양한다. Then the micro-organ are non-incubated in serum-free medium 1, 3, 5 and 10 days. 이들 미세기관 배양물중에서의 활성 증식은 본원에 기재된 바와 같이 BrdU 병입을 사용하여 검출한다. Among these active proliferation of micro-organ cultures it was detected using BrdU feed as described herein.

실시예 XV Example XV

골수 미세기관 배양물 Bone marrow micro-organ culture

골수 기원의 미세기관 배양물은 래트 및 마우스의 대퇴부로부터 온전하게 골수를 주의깊게 제거하여 제조한다. The micro-organ culture of bone marrow origin was prepared by carefully removing bone marrow from the femur intact rats and mice. 당해 생체외이식편에서 골수의 직경은 단지 약 1 내지 2mm이기 때문에, 골수는 직접 조직 절단기를 사용하여 두께가 300㎛인 미세기관 체외이식편으로 조각낸다. Art vivo in the bone marrow explants diameter just because about 1 to 2mm, the bone marrow is to directly use the tissue cutting produces pieces as micro-organ explant of 300㎛ thick. 당해 방법은 골수의 미세구조가 보존되는 동시에 장기 배양에 따르는 표면/부피 지수를 유지하도록 보장한다. The method ensures at the same time that the microstructure of the bone marrow preserved to maintain a surface / volume index according to the long-term culture. 이들 미세기관 배양물에서 골수 세포의 활성 증식은 본원에 기재한 바와 같이 BrdU 병입을 사용하여 검출한다. In these micro-organ cultures of the active proliferation of bone marrow cells it is detected using BrdU feed as described herein.

실시예 XVI Example XVI

유전자 생성물의 피부 미세기관 배양물로의 전달 Transfer to the skin micro-organ cultures of the gene product

본 발명의 미세기관 배양물에 고유적인 높은 표면적 대 부피은 다양한 유전자 전달 기술을 위해 용이하게 접근할 수 있는 방법을 허용한다. Unique high surface area of ​​the micro-organ cultures of the present invention allows for bupieun a way to be easily accessible for a variety of gene transfer techniques. 본 실시예에서, 미세기관 배양물은 전기 천공 및 리포펙션을 사용하여 외래 유전자로 트랜스펙션시킨다. In this embodiment, the micro-organ culture is then transfected with foreign genes using electroporation and the Lipoic peksyeon. 미세기관 배양물은 동물에게 이식될 수 있고 약 30일 이상동안 생체내에서 생존하고 혈관화된다. The micro-organ culture is screen can be implanted in animals and survive and blood vessels in the body for at least about 30 days. 이것은 생체외 유전자 치료 프로토콜에서 조직의 MC 배양물을 사용하는 가능성을 입증한다. This demonstrates the possibility of using the MC culture of the organization in ex vivo gene therapy protocols. MC 배양물의 추가의 잇점은 체내의 한정된 위치로 이식될 수 있어 필요에 따라 후에 쉽게 제거될 수 있다. Additional advantage of the MC culture is water can be implanted in a limited location in the body can easily be removed after, if necessary. 이것은 세포가 이동할 수 있거나 정상 조직에서 상실되는 체내로의 세포 현탁액의 이식과는 대조적이다. This is in contrast with the implantation of the cell suspension into the body, or that the cell number is moved from the normal tissue loss.

기니아 피그 피부를 절개하고 폭이 2mm이고 두께가 300㎛인 절편으로 조각낸다. Incising the skin guinea pigs and produces pieces of slice width is 2mm and the thickness 300㎛. 피부를, 페니실린 및 스트렙토마이신을 제조업자의 추천된 농도로 함유하는 무혈청 듈베코 최소 필수 배지에서 미세기관으로서 배양한다. The skin, is cultured as a micro-organ in serum-free module Beko minimal essential medium containing penicillin and streptomycin to the manufacturer's recommended concentration. 37℃에서 및 5% CO 2 에서 1일 배양한 후, 피부 미세기관 배양물을, 항생제 없이 DMEM으로 세정하고 0.4cm 갭 1회용 전기 천공 큐벳에 빙상에서 배지 500㎕를 첨가한다. After incubating at 37 ℃ and in 5% CO 2 1 day to wash the skin micro-organ cultures, with DMEM without antibiotics and added to the culture medium 500㎕ in 0.4cm gap disposable electroporation cuvette on ice.

지적된 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA 10㎍을 나타낸 바와 같이 첨가한다(각각의 플라스미드는 β-갈락토시다제(대조군) 또는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 구동시키는 사이토메갈로바이러스 프로모터를 갖는다). It is added as indicated for plasmid DNA containing the indicated reporter genes 10㎍ (Each plasmid has the cytomegalovirus promoter to drive the β- galactosidase (control) or expression of the luciferase reporter gene). 루시퍼라제 플라스미드 골격은 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 프레임과 융합되는 pRC-CMV(Invitrogen)이다. Luciferase plasmid backbone is pRC-CMV (Invitrogen) fused in frame with the firefly luciferase gene.

샘플을 도 15에 나타낸 바와 같이 220mV 및 다양한 전기용량(고 = 900μF, 중 = 500μF, 저 = 250μF)에서 전기천공한다. The sample as shown in Fig. 15 220mV and various electric capacity (high = 900μF, of = 500μF, low = 250μF) and electroporation in. NIH3T3을 바이오-래드 전기천공 장치로 250μF에서 처리한다. Treated at a 250μF Rad electroporation device - the NIH3T3 Bio. 이어서 샘플을 추가로 10% 태아 소 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루탐산을 함유하는 DMEM으로 24웰 배양 플레이트에서 2일동안 항온처리한다. It is then incubated for two days in 24-well culture plates with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin and DMEM containing glutamic acid in addition to the sample. 배지를 제거하고 샘플을 세포 배양 용해 시약(Promega) 약 700 ㎕중에 현탁시킨다. The medium is removed and the sample was suspended in the cell culture lysis reagent (Promega) about 700 ㎕. 조직 단편을 균질화하고 이어서 20㎕를 루시퍼라제 분석 시약(Promega) 100㎕에 첨가하고 팩카드 탑카운트로 3회 발광을 검출한다. And homogenizing the tissue fragments, followed by the addition of 20㎕ the luciferase assay reagent (Promega) 100㎕ detects the three times of emissions in Packard TopCount. 양성 대조군으로서, 75cm 배양 플라스크 기원의 NIH3T3 세포를 트립신 처리하고 동일하게 미세기관 배양물도 처리한다. As a positive control, NIH3T3 cells from a 75cm and trypsinized culture flasks origin and treated in the same manner the micro-organ culture water. 도 15에 도시된 바와 같이, 중(500μF) 및 저(250μF) 전기용량 셋팅에서 상당한 루시퍼라제 활성이 검출된다. The significant luciferase activity in, of (500μF), and low (250μF) capacitance settings, as shown in Figure 15 is detected. 비교를 위해, 유사한 양의 NIH3T3 불멸의 배양 세포를 250μF에서 동일한 플라스미드로 전기천공한다. For comparison, a similar amount of NIH3T3 immortal cultured cells and electroporation of the same plasmid in 250μF.

또 다른 실험에서, 미세기관 체외이식편의 트랜스펙션은 리포펙션에 의해 성취되고 이것은 전기천공보다 효율적인 것으로 관찰된다. In another experiment, transfection of the micro-organ explant is achieved by Lippo peksyeon It is observed that efficient than electroporation. 특히, 기니아 피그 피부, 신생 마우스 피부 및 래트 폐 기원의 미세기관 배양물은 루시퍼라제 리포터를 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. In particular, the illustration micro-organ cultures are transfected with a plasmid containing the luciferase reporter in the guinea pig skin, newborn mouse skin, and rat lung origin. 간략하게, 미세기관 배양물은 트랜스펙션 1일 전에 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEN중에서 5.5% CO 2 의 37℃에서 성장시킨다. Briefly, the micro-organ culture is grown at 37 ℃ of 5.5% CO 2 in DMEN containing 1% penicillin / streptomycin and 1% L- glutamine, one day before transfection. 체외이식편을 웰당 20개의 체외이식편 및 400㎕의 배지를 함유한 24웰 플레이트상에 분주한다. Pipette the explant on a 24-well plate containing medium per well of 20 explants and 400㎕. 트랜스펙션을 위해, 미세기관 배양물을 오프티멤으로 2회 세정하고 리포펙틴 10㎕(Gibco BRL) + DNA 2㎍ + 오프티멤을 각각의 웰에 최종 부피이 500㎕가 되도록 첨가한다. For transfection, the micro-organ culture as timem off, washed twice, and then added to a final bupiyi 500㎕ the Lipoic pectin 10㎕ (Gibco BRL) + DNA + 2㎍ off timem to each well. 오프티멤/리포펙틴/DNA 용액을 리포펙틴 제조업자의 지시에 따라 제조한다. Off timem / lipoic pectin / DNA solution was prepared according to the instructions of lipoic pectin manufacturers. 이어서 배양물을 5.5% CO 2 에서 37℃에서 5 내지 6시간동안 제조한다. It was then prepared from the culture in 5.5% CO 2 for 37 ℃ 5 to 6 hours. 오프티멤/리포펙틴/DNA 배지를 이어서 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민 및 10% FCS를 함유한 DMEN 400㎕로 대체하고 배양물을 5.5% CO 2 에서 37℃에서 밤새 배양한다. Off timem / lipoic pectin / DNA media followed by 1% penicillin / streptomycin, 1% L- glutamine, and replaced by a DMEN 400㎕ containing 10% FCS and incubated overnight culture at 37 ℃ in 5.5% CO 2. 다음날 아침, 미세기관 배양물을 제거하고 1 X PBS로 2회 세척하고 수 작업 유리 분쇄기로 1 X 세포 배양 용해 완충액(Promega) 750㎕중에서 분쇄한다. The next morning, remove the micro-organ cultures, and triturated in 2 times wash, and can work 1 X cell culture lysis buffer (Promega) 750㎕ glass grinder in 1 X PBS. 형질전화 유전자 기원의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 사용하여 검출하고 당해 결과는 도 18에 나타낸다. The luciferase activity of the transfected telephone gene origin detection using the luciferase assay system (Promega), and the art The results are given in Fig.

실시예 XVII Example XVII

유전자 생성물의 미소간 배양물로의 전달 Delivery to the cultures between the gene product smile

8주된 암컷 루위스 래트 기원의 폐 및 흉선을 절개하고 실시예 XV에 기재된 바와 같이 미세기관 배양으로 가공처리한다. 8 cutting the lung and thymus of the main female Lewis rat origin and processed in the micro-organ cultures as described in Example XV. 미세기관 배양물을 배양 웰에 가하고 37℃에서 항온처리하면서 5 내지 6시간동안 플라스미드 DNA 복합체를 코딩하는 양이온 지질/루시퍼라제로 트랜스펙션시킨다. The micro-organ cultures were added to the culture wells thereby illustration and incubated at 37 ℃ 5 to 6 hours plasmid DNA complexes cationic lipid / luciferase encoding for transfection. 양이온 지질/플라스미드 DNA 용액을 흡입하고 이어서 배양물을 2일동안 배지 + 10% 혈청에서 항온처리함에 이어서 루시퍼라제 리포터 유전자 발현(임의의 광 유니트로 표시함)에 대해 분석한다. The analysis of the cationic lipid / plasmid DNA solution, followed by the inhalation (as represented in any of the optical units) of the culture was then incubated as luciferase reporter gene expression two days in culture medium + 10% serum. 당해 실험의 결과는 도 16에 도시한다. Results of the experiment are shown in Fig. 도 16에서 입증된 바와 같이, 폐는 당해 조건하에서 트랜스펙션된 루시퍼라제 유전자를 발현하지만 흉선에서는 그렇지 않다. As demonstrated in Figure 16, lung express the luciferase gene transfection under the conditions the art, but not in thymus. 예상된 바와 같이, 음성 대조군 β-갈락토시다제 트랜스펙션된 폐 미세기관 배양물(10㎕의 양이온성 지질 농축물)은 광 발생(23 광 유니트)을 위한 기계 배경 근처에 있다. As expected, the negative control β- -galactosidase transfected lung micro-organ culture (cation of 10㎕ St. lipid concentrate) is near machine background for light-generating (23 light units).

실시예 XVIII Example XVIII

시험관내 모간 성장 Morgan vitro growth

신생 마우스 피부를 수술 후 수득하고, 하부 지방 조직으로부터 세정하고 0.4 cm x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치를 사용하여 300㎛의 절편으로 가로로 절단한다. Newborn mouse skin obtained after surgery, washed from the underlying fat tissue and cut into 0.4 cm x 5cm flap and cut into transverse sections of the 300㎛ to then use a tissue chopper or other suitable cutting device. 미세기관을 혈청 부재하에 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO 2 하에 DMEM중에 미량평판에 부가한다. The micro-organ under serum members for 1 to 14 days and added to a small amount of plate in the DMEM under 5% CO 2 at 37 ℃ under constant shaking. 특정 미세기관 생체외이식편은 배양 배지에 첨가되는 성장 인자, 예를 들어, FGF와 접촉시킨다. Specific micro-organ explants in vitro, for a growth factor, for example, be added to the culture medium, it is brought into contact with FGF. 배지는 2일 마다 교환한다. The medium is replaced every two days.

신생 "모발 부재" 피부는 MC 배양물에서 성장하는 경우, 모간을 생산하기 위해 유도될 수 있다. When growing in a new "hair member" skin MC cultures can be induced to produce the hair shaft. 1ng/ml의 EGF의 존재하에 3일동안 미세기관 배양물에서 성장한 30시간된 마우스 기원의 피부에 대한 마이크로그래프는 배양 초기에 성장되지 않는 생체외이식편에서 모간의 발육을 나타낸다. Micrographs of the skin of a mouse origin 30 hours grown for 3 days in the presence of 1ng / ml EGF micro-organ cultures show the development of the hair shaft in the in vitro explants that are not growing in the culture initially.

또 다른 세트의 실험에서, 휴지기 모낭의 활성화가 관찰된다. In another set of experiments the activation of dormant follicles is observed. 센카 마우스는 모낭 활성화 연구를 위해 유용한 모델을 제공하는데 그 이유는 당해 모낭이 매우 동일 크기로 분포되어 있고 주기 단계가 널리 특징화되어 있기 때문이다. Senka mice, because the reason is angry art follicles are distributed in much the same size and are widely characterized cycle stage to provide a useful model for the study follicle activation. 센카 마우스는 항원 활성화를 위한 생체내 모델을 제공한다. Senka mouse provides a model for in vivo antigen-activated. 휴지기 모낭으로부터 클럽의 제거는 새로운 모발 형성을 유도할 수 있고 이의 첫 징조는 널리 특징화되어 있다. Removal of the club from a telogen follicle can induce new hair formation first sign thereof is widely screen features. 성체의 센카 마우스 기원의 피부는 수술 후 수득하고 하부 지방 조직으로부터 제거하고 0.4 x 5 cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치로 300㎕의 절편으로 가로로 절단한다. Senka skin of mouse origin of the magnetic material is obtained after the surgery and removed from the lower fat tissue and cut into 0.4 x 5 cm flaps, and then cut horizontally into sections of 300㎕ a tissue chopper or other suitable cutting device. 미세기관을 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO 2 에서 혈청 부재하에 DMEM중의 미세 플레이트에 부가한다. For 1 to 14 days the micro-organ is added to the microplate in DMEM serum under member in a 5% CO 2 at 37 ℃ under constant shaking. 클럽 제거 또는 성장 인자 처리에 의해 유도되는지 간에 휴지기 모낭의 활성화는 모낭 줄기 세포의 증식에 의해 확대된다. Activation of telogen follicles between whether induced by club removal or growth factor treatment is extended by the proliferation of follicle stem cells. 도 17은 티미딘 병입에 의해 검출되는 바와 같이 휴지기 생체외이식편의 활성화를 도시한다. Figure 17 illustrates the activation of resting vitro explant, as detected by the feed-thymidine.

실시예 IXX Example IXX

이식을 위한 췌장섬의 제조 Preparation of pancreatic islets for transplantation

다양한 포유동물 공급원으로부터 대량으로 섬 세포를 제조하기 위한 다양한 기술이 개발되었는데 그 이유는 이들이 확립된 당뇨병 I형을 치료하기 위해 잠재적으로 이식가능한 β세포 매쓰를 차지하기 때문이다. Were various techniques for producing the islet cells in large quantities from various mammalian source development because it occupies a potentially implantable β cells in Mathematica to treat type I diabetes, which they are established. 2개의 주요 결점이 지금까지 나타났다. The two main drawbacks appeared so far. 베타 세포를 제조하기 위한 재현 신뢰 가능한 방법을 수득하기가 어려운 것으로 입증되었다. A reproduction reliable method for the production of beta cells has proven to be difficult to obtain. 부분적으로, 제1 이유 및 부분적으로 β세포 대부분이 정상 췌장에서 섬 세포 하부에 있는 간질로부터의 지지체를 요구한다는 사실에 기인한다. In part, the first reason and in part due to the fact that β cells mostly require support from the stroma in the normal pancreatic islet cells from the bottom. 췌장 기관을 생체외에 유지하는데 있어서 일련의 시도가 지금까지 성공적이지 못하였다. In addition to maintaining the pancreas organs in vivo it did not have a series of successful attempts so far. 본원에 기재된 MC 배양물의 기술을 사용하여 시험관내 마우스, 래트, 기니아 피그 및 피그 췌장의 미세기관 배양물을 합성 배양 배지내에 확립하는데에 성공을 거두었다. Using the MC culture technology described herein, water and succeeded in establishing an in vitro mouse, micro-organ cultures of the rat, guinea pig and pig pancreas in a synthetic culture medium with water.

췌장 미세기관 배양물은 현재 1개월 이하의 기간동안 시험관내에서 성장시킨다. Pancreas micro-organ cultures are then grown in vitro for a period of less than the current month. 배양물내에, 생체외이식편은 이의 조직 미세 구조를 유지하고 특정 세포 아집단은 BrdU 병입 및 표지에 의해 결정되는 바와 같이 활성적으로 증식한다. In culture, in vitro graft maintains its organization and microstructure of a particular cell subset is proliferate actively as determined by BrdU bottling and labeling. 추가로, 섬 세포는 시험관내 배양 1개월 후에도 인슐린을 배지로 분비한다. In addition, the islet cells secrete insulin into the medium after one month in vitro culture.

피그 미세기관 췌장 배양물이 래트 숙주의 내장 및 산분비 중배엽 모두로 이식되는 이식 실험을 수행하였다. Pig micro-organ pancreas cultures have been implanted to perform transplantation experiments all rats are embedded in the host, and acid secretion mesoderm. 생체외이식편은 몇일 내지 1개월 이하 생체내에서 다양한 기간동안 유지된다. In vitro explant it is maintained for various time periods in the following days to 1 months in vivo. 생체외이식편은 널리 혈관화되고 조직 숙주로 병입된다. In vitro explant are well vascularized and the feed-in to the host tissue.

실시예 XX Example XX

사람 건선성 피부 미세기관 배양물의 제조 From psoriatic skin micro-organ culture preparation of

환자로부터 분할된 두께의 건선성 피부를 표피 절단기를 사용하여 해부 후 수득한다. In psoriatic skin thickness of the segmented from the patient s skin using the cutter, to obtain after dissection. 피부를 0.4cm x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기로 300㎛의 두께로 가로로 절단한다. Cutting the skin flap 5cm x 0.4cm and was then cut horizontally into 300㎛ thickness of a tissue chopper. 이들 미세기관 생체외이식편은 1일 내지 14일동안 37℃ 및 5% CO 2 에서 미량평판에서 DMEM(무혈청)에서 배양한다. The other micro-organs in vivo explants are cultured in DMEM (serum-free), a very small amount in the plate at 37 ℃ and 5% CO 2 for 1 to 14 days. 다양한 시점에서 미세기관 생체외이식편의 조사는 생체외이식편의 세포가 생존상태로 유지되고 증식함을 지적한다. Investigation of the micro-organ explants in vitro at various time points out that the cells were maintained in proliferative status of graft survival in vitro.

상기 인용된 모든 참조문헌 및 공보는 본원에 참조로서 인용된다. All references and publications cited above are incorporated herein by reference.

등가물 Equivalents

당업자의 기술자는 통상의 실험, 본원에 기재된 특정 분석 및 시약에 대한 수많은 등가물을 사용할 수 있음을 인지하거나 확신할 수 있다. Those skilled in the descriptor may be aware of the availability of a number of equivalents to the conventional tests, the specific assay and reagents described herein or to be sure. 당해 등가물은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려되고 하기의 청구항에 의해 보호된다. Art equivalents, are protected by the following claims is considered to be included within the scope of the invention.

도 1은 알레프(Aleph)를 측정하는 치수를 나타낸 미세기관의 개략적 도면이다(여기에서 x는 조직의 두께이고 a는 조직의 폭이다). 1 is a schematic diagram of a micro-organ showing the dimension measuring the Aleph (Aleph) (where x is the thickness of the tissue and a is the width of the tissue).

도 2는 기니이 피그 미세기관 배양물에서의 세포 증식을 여러 시간 동안 항온배양한 후 BrdU 표지화하여 나타낸 막대그래프이다. Figure 2 is a bar graph showing the labeling after incubation for several hours in a cell proliferation giniyi pig micro-organ culture BrdU.

도 3은 인간 등 피부 미세기관 배양물에서의 세포증식을 1 내지 8일 동안 배양한 후 BrdU 표지화하여 측정한 막대그래프이다. Figure 3 is a bar graph measured with the human skin, such as micro-organ during cell proliferation of 1 to 8 days in culture, after culture BrdU labeling.

도 4A 내지 도 4D는 마우스 피부(50배율)(도 4A), 기니아 피그 피부(75배율)(도 4B), 인간 포피(50배율)(도 4C) 및 인간 포피(75배율)(도 4D)의 복제 세포 각각의 면역형광성을 나타내는 현미경사진이다. To Fig. 4A 4D is mouse skin (50 scale) (FIG. 4A), guinea pig skin (75 scale) (FIG. 4B), the human foreskin (50 scale) (Figure 4C) and human foreskin (75 magnification) (Fig. 4D) replication of the cell is a microscopic photograph showing the respective immune fluorescence.

도 5A 내지 도 5C는 배양 0일(도 5A), 3일(도 5B) 및 6일(도 5C)째의 조직 미세구조를 나타내는 인간 표피 미세기관 체외이식편(75배율)의 횡단면도이다. 5A to 5C are cross-sectional views of incubation 0 (Fig. 5A), 3 days (Fig. 5B) and 6 (Fig. 5C) of the second tissue human epidermal micro-organ explant (75 magnification) showing the microstructure.

도 6은 (a)는 4mm로 일정하게 유지시키고 기니아 피그 미세기관 배양물의 두께(x)는 변화시켜 BrdU 병입을 통해 측정한 표피 증식의 효과를 나타낸 막대그래프이다. Figure 6 (a) is a histogram remains constant in a 4mm and guinea pig micro-organ cultures thickness (x) of water is indicated by changing the effect of epidermal proliferation as measured by BrdU the feed.

도 7A 및 도 7B는 췌장 유래의 미세기관 배양물에 존재하는 증식성 세포에 상응하는 면역형광성을 나타내는 현미경사진이다(75배율). 7A and 7B are micrographs showing the immune fluorescence corresponding to the proliferative cells in the pancreas-derived micro-organ cultures of the water (75 magnification).

도 8은 성숙한 돼지 췌장의 미세기관 배양물에서 방출된 인슐린 양을 나타내는 막대그래프이다. Figure 8 is a bar graph showing the amount of insulin released from the micro-organ cultures of adult pig pancreatic water.

도 9는 배양 3일, 4일 및 6일째 결장, 간, 신장, 십이지장 및 식도의 미세기 관 배양물에 존재하는 증식성 세포의 1 H-티미딘 병입율을 나타내는 막대그래프이다. Figure 9 is a bar graph showing the 1 H- thymidine feed rate of proliferative cells present in culture 3 days, 4 days and 6 days after the colon, liver, kidney, duodenum and esophagus micropores tube culture of water.

도 10A 내지 도 10C는 미세기관 배양물에서 모낭의 활성 증식을 면역형광성으로 측정하여 나타낸 현미경사진이다. 10A to 10C is a microscope photograph showing the measurement of active proliferation of hair follicles in the immune fluorescence in the micro-organ culture. 배율은 40x(도 10A), 40x(도 10B) 및 75x(도 10C)이다. Magnification is 40x (Figure 10A), 40x (Figure 10B), and 75x (Figure 10C).

도 11은 미세배양 초기와 말기에 털줄기의 크기 분포를 나타내는 막대그래프이다. Figure 11 is a bar graph showing the size distribution of the fine hair stem culture beginning and end.

도 12는 TGF-β 2.5ng/ml 첨가된 기니아 피그 피부 배양시에 미세기관 배양물의 유사분열원성 억제를 나타내는 막대그래프이다. Figure 12 is a bar graph showing the micro-organ culture mitotic inhibitors immunogenic upon TGF-β 2.5ng / ml was added guinea pig skin cultures.

도 13은 생체내에서 용이하게 처리할 수 있는 구조를 유지하기 위한 조직 절편의 불완전 분획을 나타내는 만성 피부 궤양을 치료하기 위한 미세기관 체외이식편의 개략적 모식도이다. 13 is a schematic typical view of a micro-organ explant for treatment of chronic skin ulcers showing incomplete fraction of the tissue section to maintain a structure that can be easily processed in vivo.

도 14는 정상 피부 일부를 미세기관 배양물로 대체한 후 나타나는 마우스 표면의 사진으로서, 치유, 이식편에 새로운 털줄기의 생성 및 정상 마우스 피부에 이식편의 병입을 관찰할 수 있다(10배율). 14 can observe a picture of the mouse surface that appears after replacing the normal skin part in the micro-organ culture, healing, generation of new hair on the stem implant and the feed-in of the implant in the normal mouse skin (10 magnification).

도 15는 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 플라스미드를 이용한 배양물의 트랜스펙션 후 기니아 피그의 피부 미세기관 배양물에서 나타나는 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 도시한 그래프이다. 15 is a graph showing the luciferase reporter gene expression found in skin micro-organ cultures of the guinea pigs after water illustration culture transfected with a plasmid encoding the luciferase reporter gene.

도 16은 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 플라스미드와 래트 폐 및 흉선 미세기관 배양물의 양이온 지질 매개의 트랜스펙션 후 상기 배양물에서 나타나 는 루시퍼라제 유전자 발현을 도시한 그래프이다. Figure 16 after illustration of the luciferase reporter gene plasmid and the lipid mediated rat lung and thymus micro-organ cultures of water cations encoding the transfected appeared in the cultures is a graph showing the luciferase gene expression.

도 17은 본 발명의 미세기관 배양물에서 FGF 처리시 휴지기 모낭의 활성화를 도시한 그래프이다. Figure 17 is a graph showing the activation of telogen follicles upon treatment FGF in micro-organ cultures of the present invention graph.

도 18은 본 발명의 미세기관 체외이식편에 존재하는 트랜스제닉 루시퍼라제 유전자의 발현을 도시한 그래프이다. Figure 18 is a graph showing the expression of a transgenic luciferase gene in micro-organ explants of the present invention graph.

Claims (62)

  1. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편으로서, 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 수용체에게 전달하기 위해 사용되는 미세기관 체외이식편이며, The micro-organ explant is a micro-organ explant expressing the gene of the recombinant gene product of at least one variant, comprising a population of cells and used to deliver a recombinant gene product of the at least one kind of a receptor,
    상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조(microarchitecture)를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편은 식 1/x + 1/a > 1.5 ㎜ -1 (식 중, 'x'는 조직 두께이고, 'a'는 이 조직의 폭(mm)임)로 특징지어지는 표면적 대 부피 지수를 가지며, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물은 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분 Is to have the micro-organ, at least some cells of the population of cells of the explant express the recombinant gene product of at least one kind, while the micro-organ explant maintaining the organ original microstructure (microarchitecture) in which the micro-organ explant derived , appropriate nutrients and gases at the same time diffused into the micro-organ explant cells and cell waste to minimize the death that micro-organ diffuses out of the explant, the micro-organ explant in insufficient involves cytotoxic and thus according to a nutrient and waste accumulation will be selected having a size so that the micro-organ explant is a formula 1 / x + 1 / a> and 1.5 ㎜ -1 (in the formula, 'x' is a tissue thickness, 'a' is a width (mm of tissue) Lim) characterized by having a surface area to volume index to be built, the at least one kind of recombinant gene product is a recombinant protein and a recombinant functional RNA minutes 자로 이루어진 군에서 선택되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 수용체에게 투여되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. Will be selected from the group consisting of character, the micro-organ explant would have to be administered to the receptor, the transgenic micro-organ explant.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein said recombinant protein is of, genetically modified micro-organ explant is normally generated by the engine in which the micro-organ explant is derived.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래 하는 기관에서 정상적으로 생성되지 않는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein said recombinant protein is of, genetically modified micro-organ explant is not generated normally in the organ in which the micro-organ explant is derived.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 마커 단백질인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1 wherein the recombinant protein is a marker protein, genetically modified micro-organ explant.
  5. 제 1 항에 있어서, 재조합 단백질이 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A 2 , 엘라스타제, 아밀라제, 혈액 응고 인자, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소, 아데노신 데아미나제, 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 적혈구생성인자, 표피 성장 인자, 간적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 음성 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장인자 β군, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴, 물질-P, 및 전사 인자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유 The method of claim 1, wherein the recombinant protein is insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsin trypsinogen, carboxy peptidase, ribonuclease, deoxy ribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase lipase a 2, elastase, amylase, a blood clotting factor, UDP-glucuronic a carbonyl trans-flops cyclase, ornithine trans carbamoyl cyclase, cytochrome p450 enzyme, adenosine deaminase, serum thymic factor, thymic fluid factor, tie blanket The tin, tie thymosin α1, growth hormone, Soma Sat medin, colony stimulating factors, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoietic factor (HEPA Topo The tin), hepatocyte growth factor, interleukin, negative growth factor, fibroblast would growth factor, transforming growth factor β group, gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin, substance -P, and is selected from the group consisting of a transcription factor, u 자 변형된 미세기관 체외이식편. Here modified micro-organ explant.
  6. 제 1 항에 있어서, 24시간 이상 동안 배양물에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein the time 24 is possible maintenance in culture for more than, genetically modified micro-organ explant on.
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  8. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 림프 기관, 췌장, 간, 담낭, 신장, 소화관 기관, 호흡관 기관, 생식 기관, 피부, 요로 기관, 혈액 관련 기관, 흉선, 및 비장으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, being that the engine is selected in the lymphoid organs, pancreas, liver, gallbladder, kidney, gastrointestinal tract organs, the respiratory tract organs, reproductive organs, skin, urinary tract organ, a blood-related organ, the thymus, and the group consisting of spleen of, genetically modified micro-organ explant.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편을 수득한 기관의 미세구조와 유사한 미세구조로 배열된 상피 조직 세포 및 결합 조직 세포를 포함하는, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein, genetically modified micro-organ explant comprising the epithelial cells and connective tissue cells, arranged in a microstructure similar to the microstructure of the engine to give the explant on.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 췌장이고, 상기 세포 집단이 랑게르한스섬을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1, wherein the organ is the pancreas, that is, genetically modified micro-organ explant of said population of cells contains islets.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 피부이고, 상기 체외이식편이 적어도 하나의 모낭 및 샘을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1, wherein the organ is skin, which, genetically modified micro-organ explant in which the explant includes at least one hair follicle and gland.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 병에 걸린 피부이고, 상기 체외이식편이 병에 걸린 피부 유래의 과증식 세포 또는 신생증식 세포의 집단을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1, wherein the organ is a diseased skin, is, genetically modified micro-organ explant comprising a population of hyperproliferative cells or new growth of said cells derived from skin explants are diseased.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편이 최소 배지에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein said explant is possible maintained in a minimal medium, a genetically modified micro-organ explant.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편이 보유하는 미세구조가, 상기 체외이식편을 분리한 기관의 2종 이상의 조직 사이에 나타나는 세포-세포 배향 및 세포-기질 배향 중 하나 이상을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1, wherein the microstructure in which the explant reserve cells appears between two or more tissues of the explants the engine separating-cell orientation and cell-in comprises one or more of the alignment substrate, the gene modified micro-organ explant.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 상기 재조합 유전자 산물을 코딩하는 재조합 유전자를 운반하는 재조합 바이러스로 감염된 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. According to claim 1, wherein at least a portion, which was infected with a recombinant virus carrying a recombinant gene encoding said recombinant gene product, the micro-organ explants of the genetically modified cell population to.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 재조합 간염 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노관련 바이러스, 재조합 유두종 바이러스, 재조합 헤르페스 바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 사이토메갈로바이러스 및 재조합 시미안 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 15, wherein the recombinant virus is made of a recombinant hepatitis virus, a recombinant adenovirus, a recombinant adeno-associated virus, a recombinant papilloma virus, a recombinant herpes virus, a recombinant lentivirus, a recombinant retrovirus, a recombinant cytomegalovirus and a recombinant simian virus which is selected from the group, genetically modified micro-organ explant.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공(electroporation), 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주사, 및 수용체 매개 흡수로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환법을 통해 이종 핵산 서열에 의해 형질전환된 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편. The method of claim 1, wherein in at least a portion of the population of cells, calcium phosphate mediated transfection, DEAE- dextran mediated transfection, electroporation (electroporation), liposome mediated transfection, direct injection, and receptor-mediated uptake through transformation method is selected from the group consisting transformed by the heterologous nucleic acid sequence is switched to, genetically modified micro-organ explant.
  18. 제 1 항에 따른 유전자 변형된 미세기관 체외이식편에 의해 조성되고 상기 재조합 유전자 산물을 함유하는 합성 배지. And the composition by a genetically modified micro-organ explant according to one of the preceding claims synthetic medium containing said recombinant gene product.
  19. 제 1 항에 따른 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 함유하는 약학적 제제로서, 탈모증, 건선, 피부궤양 또는 이들의 조합을 치료하는 데에 효과적인 약학적 제제. As pharmaceutical preparations containing the micro-organ explant of genetically modified according to claim 1, wherein the effective pharmaceutical agents to treat alopecia, psoriasis, skin ulcers, or a combination thereof.
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  62. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 캡슐화하는 중합체성 장치를 포함하는 의료용 장치로서, 상기 미세기관 체외이식편은 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 수용체에게 전달하는 데에 사용되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 A medical device comprising a polymeric device encapsulating the micro-organ explant of genetically modified to express a recombinant gene product of at least one, the micro-organ explant includes a population of cells, and the recombinant gene product of said at least one member a will be used to transfer to the receptor, the micro-organ are at least some cells of the population of cells of the explant is to express a recombinant gene product of at least one kind of the micro-organ explant is that the micro-organ explant derived while maintaining the original organ microstructures, at the same time adequate nutrients and gases are spread into the micro-organ explant cells and cell wastes to spread out micro-organ explant, micro-organ explant in insufficient nutrients and cells of the waste accumulated toxicity and it can minimize the death associated thereto 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편은 식 1/x + 1/a > 1.5 ㎜ -1 (식 중, 'x'는 조직 두께이고, 'a'는 이 조직의 폭(mm)임)로 특징지어지는 표면적 대 부피 지수를 가지며, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물은 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 수용체에게 투여되는 것인, 의료용 장치. So will having a selected size, the micro-organ explant is a formula 1 / x + 1 / a> 1.5 ㎜ -1 ( In the formula, and 'x' is a tissue thickness, 'a' being the width (mm) of the tissue a) a feature having a surface area to volume index to be built, the recombinant gene product of said at least one member will be selected from the group consisting of a recombinant protein and a recombinant functional RNA molecule, to the micro-organ explant is to be administered to the receptor, medical devices.
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