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JP5340564B2 - Artificial skin and a manufacturing method thereof - Google Patents

Artificial skin and a manufacturing method thereof

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JP5340564B2
JP5340564B2 JP2007177249A JP2007177249A JP5340564B2 JP 5340564 B2 JP5340564 B2 JP 5340564B2 JP 2007177249 A JP2007177249 A JP 2007177249A JP 2007177249 A JP2007177249 A JP 2007177249A JP 5340564 B2 JP5340564 B2 JP 5340564B2
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裕子 山田
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Description

本発明は人工皮膚およびその製造方法に関し、詳しくは、皮膚付属器を有し、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用、育毛剤および育毛有効成分の試験用として有用な人工皮膚およびその製造法に関するものである。 The present invention relates to artificial skin and a manufacturing method thereof, particularly, has a skin appendages, for skin grafts material, for alternative testing human skin, useful artificial skin and its preparation for the testing of hair growth agents and hair growth active ingredient it relates to the law.

従来、人工皮膚の製造方法としては、線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに包埋して培養し、その上層に表皮角化細胞を播種することによりシャーレ内にて三次元的に培養皮膚を製造する方法が一般的に用いられている(非特許文献1)。 As a conventional method for producing artificial skin, the fibroblasts were cultured and embedded in collagen gel, to produce a three-dimensionally cultured skin in the dish by seeding epidermal keratinocytes thereon the method is generally used (non-patent Document 1). また、シャーレ内ではなく、非ヒト動物の皮膚切開部に細胞を播種することにより培養皮膚を製造する方法についても報告されている(非特許文献2、特許文献1)。 Further, it not in the Petri dish, has also been reported a method of producing a cultured skin by the skin incision nonhuman animal seeding cells (Non-Patent Document 2, Patent Document 1). また、細胞材料として線維芽細胞と表皮角化細胞の他に毛乳頭細胞を用いて人工皮膚を製造する方法も報告されている(特許文献2) A method of producing an artificial skin with hair papilla cells in addition to fibroblasts and epidermal keratinocytes as cell material has also been reported (Patent Document 2)

特開2004−344506号公報 JP 2004-344506 JP 特開2005−305177号公報 JP 2005-305177 JP

しかし、上記従来の方法で製造される組織には、毛包、皮脂腺、汗腺などの皮膚付属器は存在しない。 However, above the tissue to be produced in a conventional manner, hair follicles, sebaceous glands, skin appendages such as sweat glands do not exist. また、特開2005−305177号公報(特許文献2)で得られる人工組織は組織付属器官様構造体を含むとされているものの、文献中の実施例の結果の細胞像において毛包細胞塊として示されている箇所は別の組織である可能性が高く、実証はなされていないと推測される。 Although there is a is obtained artificial tissue JP 2005-305177 (Patent Document 2) comprises a tissue ancillary organ-like structures, as hair follicle cell mass in the results of the cell image examples in the literature the indicated locations are likely to be another organization, demonstrated is estimated to be not performed. 生体皮膚組織中の毛包の毛球部では間葉系細胞の周囲を上皮系細胞が取り囲む構造をしているものであるが、特開2005−305177号の図1、2はそのような構造をとっておらず、単なる上皮細胞の塊である。 Although the hair bulb of hair follicles biological skin tissue is intended that the structure surrounding the mesenchymal cells epithelial cells, Figure 1 and 2 of JP 2005-305177 is such structures not taking, a mass of mere epithelial cells. また図3、4で毛包様細胞塊と呼ばれている構造物についても間葉系細胞とのコンタクトは見られない。 The contacts are not seen in the mesenchymal cells also structures are called hair follicle-like cell mass in FIGS. 更に、毛包原基であるならば表皮と真皮の接触面に位置するはずであるが、この構造物は表皮中に存在するため明らかに毛包ではない。 Furthermore, although it should be located on the contact surface of the epidermis and dermis If there hair TsutsumiHara Motode, this structure is not clearly follicles to present in the epidermis. 従って、組織付属器を有する人工皮膚をつくる技術はこれまでに報告されていなかった。 Accordingly, technology to make artificial skin having a tissue appendage has not been reported so far.

このため、現在火傷などで皮膚を損傷した患者の治療に利用される人工皮膚は、「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」であったが、水分や脂質の蒸散などの機能面や皮膚の外見面から「皮膚付属器の存在する人工皮膚」を作成する技術の開発が切望されていた。 Thus, the artificial skin to be used to treat patients who have damaged the skin with the current burns, etc., but was "artificial skin in the absence of skin appendages", the functional or skin, such as evaporation of water and lipid appearance the development of technology to create a "presence of artificial skin of skin appendages" has been desired from the surface. すなわち、本発明の目的は、皮膚付属器の存在する人工皮膚を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an artificial skin in the presence of skin appendages.

発明者は従来からある人工皮膚形成法(非特許文献2)を参考にし、非ヒト動物の皮膚切除部位にヒト線維芽細胞及び表皮角化細胞を播種し人工皮膚を作成した。 Inventor artificial skin forming method with conventional (non-patent document 2) in reference to prepare a artificial skin was seeded with human fibroblasts and epidermal keratinocytes in skin excision site of the non-human animal. 本皮膚は表面が滑らかでヒトの生体皮膚に近い外観をしており表皮及び真皮構造を有していたが、毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は有していなかった。 Although the skin surface had an epidermis and dermis structure has a smooth appearance near the human living body skin, hair follicles, skin appendages, such as sebaceous glands did not have.

線維芽細胞及び、角化細胞を用いた既存の方法において皮膚付属器が形成されない理由は「既に分化の方向性が決定している細胞を用いていること」ではないかと発明者は考えた。 Fibroblasts and, why skin appendages are not formed in the existing method using keratinocytes inventors that it is a "that using cells which determines the direction of the already differentiated" thought. そこで発明者は、人工皮膚の構築にあたっての未分化な細胞の利用に着目した。 Therefore, the inventors have paid attention to the use of undifferentiated cells for construction of the artificial skin. 近年、脂肪組織に成体幹細胞が多く含まれることが発見されていること、また皮下脂肪より比較的容易に吸引脂肪液を得ることができる簡便性から、脂肪由来幹細胞を用いた「皮膚付属器の存在する人工皮膚」の形成を試みた。 Recently, it can contain many adult stem cells in adipose tissue has been found, also the simplicity of being able to obtain a relatively easily aspirated fat solution than subcutaneous fat, using adipose-derived stem cells "skin appendages of I tried to formation of artificial skin "that exist. その結果、脂肪由来幹細胞、表皮細胞、および真皮細胞を用いることにより皮膚付属器形成能を有する人工皮膚を製造することが可能であることを見出した。 As a result, it has been found that it is possible to manufacture the artificial skin having a skin appendages forming ability by using adipose-derived stem cells, epidermal cells and dermal cells. 本発明は係る知見に基づくものである。 The present invention is based on the finding.

本発明は以下の発明を提供するものである。 The present invention provides the following inventions.
〔1〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含む、皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。 [1] adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts, cultured cell mass with a skin appendages forming ability.
〔2〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含み、皮膚付属器を有する人工皮膚。 (2) comprises adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes and fibroblasts, artificial skin having a skin appendages.
〔3〕 皮膚移植用材料である、〔2〕に記載の人工皮膚。 [3] a skin implant, artificial skin according to [2].
〔4〕 ヒト皮膚の代替試験用である、〔2〕に記載の人工皮膚。 [4] which is used for alternative testing human skin, artificial skin according to [2].
〔5〕 育毛剤および育毛有効成分の試験用である、〔2〕に記載の人工皮膚。 [5], which is used for testing of the hair restorer and hair growth active ingredient, artificial skin according to [2].
〔6〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を共培養することを特徴とする、皮膚付属器を有する人工皮膚の製造方法。 [6] adipose-derived stem cells, characterized by co-culturing the epidermal keratinocytes and fibroblasts, production method of artificial skin having a skin appendages.
〔7〕 前記共培養は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁して行う、〔6〕に記載の人工皮膚の製造方法。 [7] The co-culture, adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts performed were suspended in a collagen gel, producing an artificial skin according to [6].
〔8〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を懸濁させたコラーゲン・ゲルをヒト以外の動物の皮膚切除部位に注入することにより共培養する、〔6〕または〔7〕に記載の人工皮膚の製造方法。 [8] adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts collagen gel suspended co-culturing by implanting the skin excision site of non-human animals, as described in [6] or [7] process for producing an artificial skin.

本発明によれば、皮膚付属器形成能を有し、人工皮膚の調製に適した培養細胞塊が提供される。 According to the present invention has a skin appendages forming ability, cultured cell mass suitable for the preparation of artificial skin is provided. また、皮膚付属器を有する人工皮膚、および皮膚付属器を有する人工皮膚を効率よく製造するための方法も提供される。 Moreover, the artificial skin having a skin appendages, and a method for efficiently producing artificial skin having a skin appendages are provided.

従って、本発明によれば、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用材料、育毛剤および育毛有効成分の試験用としての人工皮膚が提供される。 Therefore, according to the present invention, a skin implant, for alternative testing human skin material, artificial skin for the testing of hair growth agents and hair growth active ingredient is provided. 更には、自身の細胞を用いて構築した皮膚付属器を有する人工皮膚を用い、育毛試験や皮膚の保湿試験を行い、自身に適した育毛剤や保湿剤などを選択できるオーダーメイド医療への応用も可能である。 Furthermore, using the artificial skin having a skin appendages constructed using own cells, subjected to moisturizing test hair growth test and skin, application to personalized medicine which can be selected, such as hair tonic and moisturizing agents suitable for itself it is also possible.

また皮膚刺激性試験、薬剤経皮吸収性試験に現行の「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」が使われているが、より生体皮膚に近い条件の備わった人工皮膚を用いることにより現実に近い試験が期待できる。 The skin irritation test, the "nonexistent artificial skin of skin appendages" current to the drug percutaneous absorption test are used, realistic by using an artificial skin provided the conditions closer to the living body skin test can be expected.

〔培養細胞塊〕 [Cultured cell mass]
本発明の培養細胞塊は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含むことを特徴とする。 Cultured cell mass of the present invention is characterized in that it comprises adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes and fibroblasts.

本発明における脂肪由来幹細胞とは、脂肪組織に含まれる幹細胞である。 The adipose-derived stem cells in the present invention are stem cells contained in the adipose tissue.

幹細胞とは、多分化能を有する細胞を意味する。 The stem cells, refers to cells having pluripotency. 例えば骨組織、軟骨組織、筋肉組織などの各組織を構成する細胞への分化能をも保持するものを挙げることができる。 Such as bone tissue, cartilage tissue, it may be mentioned those that also holds the ability to differentiate into cells that constitute the respective tissues such as muscle tissue. これらの各組織を構成する細胞への分化の確認は、各種組織化学的染色法、例えば、Von Kossa染色、アルシアンブルー染色、ミオシン抗体染色法、MyoD1抗体染色などにより行うことができる。 Confirmation of differentiation to cells that constitute each of these tissues, various staining methods, for example, Von Kossa staining, alcian blue staining, myosin antibody staining, can be carried out by MyoD1 antibody staining.

脂肪組織とは、脂肪細胞により構成される生体組織の一種である。 The adipose tissue is a kind of constituted biological tissue by adipocytes. 脂肪組織の生物由来は特に限定されず、ヒトのほかマウス、ラットなどの実験動物等の非ヒト動物であってもよい。 Biological adipose tissue is not particularly limited, other human mouse, may be a non-human animal, such as experimental animals such as rats. また、生物の年齢、性別は特に限定されない。 In addition, the age of the organism, sex is not particularly limited. また、脂肪組織の部位も特に限定されないが、皮下に位置する脂肪組織(皮下脂肪)が好ましく用いられる。 Although not particularly limited portion of adipose tissue, adipose tissue located subcutaneously (subcutaneous fat) is preferably used.

脂肪組織の調製方法は特に限定されず、美容整形の際の脂肪吸引手術により吸引される組織片や、外科手術などの際に生体から切除される組織に含まれる切除脂肪組織から調製することができる。 Process for the preparation of adipose tissue is not particularly limited, tissue pieces and, be prepared from excised adipose tissue contained in tissue to be excised from the living body during such surgery is sucked by liposuction surgery during cosmetic surgery it can. 脂肪由来幹細胞は太い血管の周囲に存在するため脂肪吸引液よりも切除脂肪組織から多く得ることができる。 Adipose-derived stem cells can be obtained much from excised adipose tissue than liposuction solution for existing around the large vessels. 一方、脂肪吸引液から幹細胞を調製したほうが、手術跡が小さく済みドナーの負担が小さい。 Meanwhile, better to prepare the stem cells from liposuction solution, a small burden on the donor requires small surgical scar.

脂肪由来幹細胞は、脂肪組織から調製することができる。 Adipose-derived stem cells can be prepared from adipose tissue. 例えば脂肪吸引液からの脂肪由来幹細胞の調製は、以下のようにして行うことができる。 For example the preparation of adipose derived stem cells from liposuction solution can be carried out as follows. 脂肪吸引液に10%のウシ胎児血清を含むDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、F12などの培地を添加して希釈することによりコラゲナーゼ活性を中和する。 Dulbecco containing 10% fetal bovine serum liposuction fluid's modified Eagle's medium (DMEM), to neutralize the collagenase activity by diluting by adding to a medium, such as F12. その後、遠心して上清を除去し、除去後得られるペレットに上記の培地を加えて再懸濁した後、更に遠心して上清を除去する。 Thereafter, centrifugation to remove the supernatant, after resuspension by the addition of culture medium of the pellet obtained after removal, further removing the supernatant by centrifugation. 同様の洗浄操作をもう一度繰り返す。 Once again the same cleaning operation. この洗浄操作により非接着性の赤血球細胞を除き、脂肪由来幹細胞を得ることができる。 Except for non-adherent red blood cells by this washing operation, it is possible to obtain adipose derived stem cells. また、こうして得られた幹細胞は抗生物質/抗菌剤および10%のウシ胎児血清を含むDMEMまたはF12培地に懸濁し、37℃、5%CO 条件下にて培養することができる。 Moreover, stem cells thus obtained can be suspended in DMEM or F12 medium containing an antibiotic / antimicrobial agents and 10% fetal bovine serum, and cultured at 37 ℃, 5% CO 2 conditions.

一方、上述の方法と同様にコラゲナーゼ活性を中和した後の遠心操作後に、最上部に浮遊した細胞を採取し、新生仔牛血清を10%含むDMEMまたはF12培地を利用した天井培養に供しても、脂肪由来幹細胞を得ることができる。 On the other hand, after centrifugation after neutralizing collagenase activity similar to the above-described method, it is subjected to a ceiling culture floating cells on top were collected, using DMEM or F12 medium containing newborn calf serum 10% , it is possible to obtain adipose derived stem cells.
本方法は既に報告されている方法(Proliferation of unilocular fat cells in the primary culture,Journal of Lipid Research,Hajime Sugihara,1987, vol28,p1038−1045、日本再生医療学会雑誌,2006,vol.5,No.1,加野浩一郎 他、など。)であり、広く脂肪細胞研究者に用いられている方法である。 The present method has already been reported (Proliferation of unilocular fat cells in the primary culture, Journal of Lipid Research, Hajime Sugihara, 1987, vol28, p1038-1045, Japan Regenerative Medicine Journal, 2006, vol.5, No. 1, Kano Kouichirou other is like.), a method that is widely used in fat cells researchers.

皮膚は、表皮および真皮と皮膚付属器とから構成される。 Skin is composed of the epidermis and dermis and skin appendages. 表皮ケラチノサイト(表皮角化細胞)とは表皮を構成する主たる細胞であり、線維芽細胞とは真皮を構成する主たる細胞である。 The epidermal keratinocytes (epidermal keratinocytes) and main cells constituting the epidermis, the fibroblasts is a primary cell that constitute the dermis.

上記表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の生物由来は特に限定されず、ヒトでなくともマウス、ラットなど実験動物等の非ヒト動物であってもよい。 Biobased the epidermal keratinocytes and fibroblasts are not particularly limited, mice without human, or may be a non-human animal, such as such as laboratory animals rats.

表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の調製方法は特に限定されず、例えば形成外科、皮膚科、外科手術等の余剰皮膚などの皮膚切除片から初代培養して用いてもよく、またそれぞれの細胞を純化して用いてもよい。 Process for the preparation of epidermal keratinocytes and fibroblasts are not particularly limited, for example plastic surgery, dermatology, may be used in primary cultured from skin punch pieces, such as excess skin surgery etc., also to purify the respective cells it may be used Te. さらに、継代培養して増殖させたものを使用することも出来る。 Furthermore, it is also possible to use those which were grown and subcultured. 継代培養する場合には、60〜80%コンフルエント未満で継代する。 When subculture are passaged less than 60-80% confluent. また6回以上の継代培養は、細胞の毛包誘導能が低下するため好ましくない。 The subculture of more than 6 times is not preferable because the hair follicle inducibility of the cells decreases. 表皮ケラチノサイトを調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば0.25%トリプシン中で4℃、24時間処理した後に遠心操作を行うことにより表皮からケラチノサイトを分離することが出来る。 When preparing epidermal keratinocytes after cutting if necessary to a suitable size for skin punch pieces, for example 4 ° C. with 0.25% trypsin, keratinocytes from the epidermis by performing centrifugation after 24 h treatment it can be separated. 分離した表皮ケラチノサイトは無血清・低カルシウム濃度を特徴とするKGM(Keratinocyte Growth Medium)、もしくは市販のHumedia KG2培地(TOYOBO)等を用いて37℃、5%CO の存在下で培養して調製することができる。 Separated epidermal keratinocytes 37 ° C. with serum-free, low calcium concentrations, characterized in KGM (Keratinocyte Growth Medium), or a commercially available Humedia KG2 medium (TOYOBO) and the like, prepared by culturing in the presence of 5% CO 2 can do. また、線維芽細胞を調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば培養シャーレに固定後、10%FBS添加DMEM培地を静かに加え、37℃、5%CO の存在下でインキュベートをする。 Also, when preparing the fibroblasts, optionally after cutting the skin punch pieces into an appropriate size, for example after fixation to the culture dish, gently added 10% FBS added DMEM medium, 37 ° C., 5% the incubation in the presence of CO 2. 培養開始4日から7日目頃より皮膚片の周囲より線維芽細胞が増殖することが確認でき、こうして線維芽細胞を調製することができる。 Fibroblasts than the surrounding skin pieces from around 7 days from the start of 4 days of culture can be confirmed that the growth, thus it is possible to prepare the fibroblast cells.

本発明の培養細胞塊は、上述した脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、皮膚付属器形成能を害しない範囲でその他の細胞を含むものであってもよい。 Cultured cell mass of the present invention, adipose-derived stem cells described above, as long as it contains fibroblasts and epidermal keratinocytes, may include other cells within a range not impair the skin appendages forming ability.

本発明の培養細胞塊は、上記の脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、その調製方法は特に限定されない。 Cultured cell mass of the present invention, the adipose-derived stem cells, as long as it contains fibroblasts and epidermal keratinocytes, the preparation method is not particularly limited. 例えば、これらの細胞を適当な培地、例えばコラーゲン・ゲルなどの上に播種して調製され得る。 For example, it may be prepared by seeding onto such these cells suitable medium, such as collagen gel. ここでコラーゲン・ゲルとは、コラーゲンを主成分とするゲル状の物質を意味する。 Here, the collagen gel is meant a gel-like substance composed mainly of collagen. コラーゲンはI〜VIII型まで様々なタイプがあるが、コラーゲンIもしくはコラーゲンIVがこのましい。 Collagen There are various types to I~VIII type, collagen I or collagen IV is preferred. コラーゲン・ゲルとしては、組織培養用などのコラーゲンの市販品(例えば、新田ゼラチン社製のCellmatrix TypeIP、Cellmatrix TypeIAなど)を用いることができる。 The collagen gel, commercially available collagen, such as for tissue culture (e.g., Nitta Gelatin Co. Cellmatrix TypeIP, etc. Cellmatrix TypeIA) can be used.

本発明の培養細胞塊は、皮膚付属器形成能を有する。 Cultured cell mass of the present invention have a skin appendages forming ability. すなわち、例えば培養細胞塊を生体に移植することなどにより、将来的に皮膚付属器を形成する能力を有していればよく、皮膚付属器が形成されていなくともよい。 That is, for example, by transplanting a cultured cell mass vivo sufficient to have the ability to form future skin appendages may not have skin appendages are formed. ここで皮膚付属器とは、皮膚を構成する表皮層と真皮層に付属している器官を意味し、毛包、汗腺、皮脂腺、爪などを挙げることができる。 Here, the skin appendages, means organs that comes with the epidermal layer and dermal layer of the skin, it may be mentioned hair follicles, sweat glands, sebaceous glands, nails and the like. これらの皮膚付属器は、水分や皮脂を分泌して皮膚に潤いを与える、体温を調節する、外部から皮膚を保護するといった役割を担う。 These skin appendages is to secrete moisture and sebum moisturize the skin, to adjust the temperature, responsible like to protect the skin from the outside. 本発明の培養細胞塊は、上記皮膚付属器のうち毛包、汗腺、および皮脂腺の形成能を有することが好ましい。 Cultured cell mass of the present invention, hair follicles of the skin appendages, have sweat glands, and the forming ability of the sebaceous glands preferred.

〔人工皮膚〕 [Artificial skin]
本発明の人工皮膚は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むことを特徴とし、皮膚付属器を有するものである。 Artificial skin of the present invention is characterized in that it comprises adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes, and has a skin appendages.

脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の培養細胞塊の説明欄において前述した通りである。 Adipose-derived stem cells, the fibroblasts, and epidermal keratinocytes, is as described above in the description column of cultured cell mass of the present invention. これらの細胞のうち、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の人工皮膚の使用目的に応じて自家の細胞(被験者の細胞)または市販の細胞を用いることができる。 Among these cells, the fibroblasts, and epidermal keratinocytes, may be used autologous cells (a cell of a subject) or commercially available cell according to the intended use of the artificial skin of the present invention. 例えば、人工皮膚の使用目的が薬剤刺激性試験、経皮吸収性試験の場合には、自家の細胞を使用する必要はなく、メーカーより販売されている線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを購入して用いることができる。 For example, the intended use of the artificial skin drug irritation test, in the case of transdermal absorbability test, it is not necessary to use autologous cells used to purchase fibroblasts and epidermal keratinocytes sold by the manufacturer be able to.

本発明の人工皮膚は、各種用途に用いることができ、例えば外科手術、美容形成手術などの際の皮膚移植用材料として用いることができる。 Artificial skin of the present invention can be used in various applications, for example surgery, it can be used as a skin graft material during such cosmetic plastic surgery. また、経皮薬、化粧品などの薬効性試験、安全性試験などの際のヒト皮膚の代替試験用に用いることができる。 Further, it is possible to use transdermal drug, efficacy testing of cosmetics, for alternative testing human skin during safety testing. 本発明の人工皮膚は、毛包などの皮膚付属器官を有することから、特に育毛剤や、育毛有効成分の薬効性試験、安全性試験などの試験用に好ましく用いることができる。 Artificial skin of the present invention has a skin appendages such as hair follicles, in particular and hair tonic, efficacy testing of hair growth active ingredient, it can be preferably used for testing the safety tests.

〔人工皮膚の製造方法〕 [Method of manufacturing the artificial skin]
上記本発明の人工皮膚の製造方法は特に限定されないが、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを共培養して調製される。 Process for producing an artificial skin of the present invention is not particularly limited, it is prepared by co-culturing the adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes.

共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁して行うことが望ましい。 Co-culture is preferably carried out by suspending adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes to the collagen gel. コラーゲン・ゲルについては、前記した本発明の培養細胞塊の項で既に述べたとおりである。 The collagen gel, which as already stated in the cultured cell mass of the present invention described above. コラーゲン・ゲルに対し、懸濁させる脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトの量は、各細胞の継代数や形質などの諸条件により適宜調整すべきであり、細胞数や細胞比を数値範囲として限定することは困難である。 To collagen gel, adipose-derived stem cells are suspended, the amount of fibroblasts and epidermal keratinocytes should be appropriately adjusted depending on various conditions such as the passage number and phenotype of each cell, the numerical cell numbers and cell ratio range it is difficult to limit as. 一例を挙げると、コラーゲン・ゲル混合溶液100μlに対し脂肪由来幹細胞、皮膚細胞(線維芽細胞と表皮ケラチノサイト)の細胞数合計で5.0×10 〜1.0×10 であり、好ましくは5.0×10 〜1.0×10 の範囲で定めることができる。 As an example, adipose-derived stem cells to the collagen gel mixed solution 100 [mu] l, was 5.0 × 10 4 ~1.0 × 10 8 in the cell total number of skin cells (fibroblasts and epidermal keratinocytes), preferably it can be determined in a range of 5.0 × 10 5 ~1.0 × 10 7 . また脂肪由来幹細胞と皮膚細胞の細胞比も、目安としては50:1〜1:1000で混合することが好ましく、特に10:1〜1:100で混合することが好ましく、中でも1:1〜1:100で懸濁(混合)することが最も好ましい。 The cell ratio of adipose-derived stem cells and skin cells also as the guide 50: 1 to 1: preferably mixed in 1000, in particular 10: 1 to 1: preferably mixed at 100, among others 1: 1 to 1 : it is most preferred that the suspension with 100 (mixing). 尚、コラーゲン・ゲル混合溶液に細胞を懸濁する際には氷上にて行い、ゲルを泡立てないように静かに混合する。 Incidentally, performed when the cells are suspended in a collagen gel mixed solution on ice, mixed gently so as not bubbled gel.

上記共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。 The co-culture, adipose-derived stem cells, it is preferable that the fibroblasts and epidermal keratinocytes were injected into the skin excision site of the non-human animal culture. 特に脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁させた状態で動物(好ましくは、非ヒト動物(ヒト以外の動物))の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。 Particularly adipose-derived stem cells, an animal (preferably, a non-human animal (non-human animal)) in a state in which the fibroblasts and epidermal keratinocytes were suspended in a collagen gel is preferably to inject cultured skin excision site. これにより、非ヒト動物の皮膚切除部位に人工皮膚が形成される。 Thus, the artificial skin is formed on the skin excision site of the non-human animal.

非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモットなどの実験動物等を用いることができる。 As the non-human animal, it can be used mouse, rat, experiments such as guinea pig animal like. 非ヒト動物の中でも免疫不全非ヒト動物が好ましい。 Immunodeficient non-human animal among the non-human animal is preferred. また、非ヒト動物の皮膚組織であれば特に切除する部位は限定されないが、例えばラット等の実験動物の場合には処置の容易さから背部の皮膚組織が好ましい。 Also, sites specifically cut if the non-human animal skin tissue is not limited, for example, ease of treatment, in the case of experimental animals and rats dorsal skin tissue is preferred.

脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位において共培養する際には、表面の乾燥を防ぎ異物の混入を防ぐために蓋付の小型培養チャンバーを皮膚切除部位に固定してなされることが好ましい。 When co-cultured adipose derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes in the skin excision site of the non-human animal, a small-sized culture chamber Futazuke to prevent contamination of foreign substances prevent drying of the surface was fixed to the skin excision site it is preferably made Te. チャンバーは、湿度を保てる構造のものであり、動物が足で触れたり口で舐めることができないようになっており、床敷きなどの異物が混入しないようなものであればよく、移植用の細胞を保持する空隙部分と、移植用の細胞導入口および皮膚組織への開口部とを有する構造のものを用いることができる。 Chamber is of the structure capable of maintaining humidity, animals are adapted to not be able to lick the mouth touching feet, as long as such foreign matter such as bedding is not mixed, cells for transplantation it can be used and the gap portion for holding, with structures having an opening into the cell inlet and skin tissue for transplantation. 例えば、皮膚組織への開口部周辺につば状の突出部を有するチャンバーは、皮膚組織中につば部分を挿入してチャンバーを固定することができるので好ましく用いられる。 For example, a chamber having a flange-like protrusion around the opening to the skin tissue is preferably used since it is possible to fix the chamber by inserting the collar portion into the skin tissue. チャンバーの材質は特に制限されるものではなく、例えばポリプロピレン、シリコン製のものが使用できる。 The material of the chamber is not particularly limited, for example polypropylene, is made of silicon can be used. チャンバーの大きさも特に制限されるものではない。 The size of the chamber is not particularly limited.

体表面へのチャンバーの固定の例を挙げると以下の通りである。 Is as example the following fixed chamber to the body surface. 移植対象の動物の皮膚をチャンバーのサイズに合わせて切除し、周囲の皮膚表面をつまみ、皮膚下にチャンバーのつばを挿入し、チャンバーの周辺部の皮膚を縫合または医療用クリップ、医療用接着剤を用いてチャンバーを固定することができる。 Skin transplant subject animal was excised to fit the size of the chamber, squeeze the surrounding skin surface, by inserting the flange of the chamber under the skin, suture or medical skin periphery of the chamber clips, medical adhesive it can be fixed to the chamber using.

チャンバーを用いて細胞を播種する際、面積当たりの細胞数が少ないと人工皮膚中の毛包構造の形成に不十分であり、反対に面積当たりの細胞数が多すぎても細胞死が起きたり、チャンバー内でのケラチノサイトの正常な角化を妨げてしまうため好ましくない。 When seeding cells using a chamber is insufficient for the formation of the hair follicle structure in artificial skin and a small number of cells per area, you experience cell death is too large, the number of cells per area on the opposite , undesirably hinders the normal cornification of keratinocytes in the chamber. チャンバーの大きさは非ヒト動物の体の大きさにより様々なものを用いることが出来るため特に規定されないが、大きすぎると皮膚切除部位への固定が困難である。 It not particularly limited since it is possible to use a variety of the size of the magnitude of the non-human animal body of the chamber, but it is difficult to fixation to too large skin excision site. 従って、作成したい人工皮膚の大きさに合わせてチャンバーと非ヒト動物を選択することが好ましい。 Therefore, it is preferable to select a chamber and a non-human animal according to the size of the artificial skin to be created. チャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により自然に脱離するが、固定の度合いが強く自然に脱離されない場合は固定に用いた器具を外すことによりチャンバーを脱離させても良い。 Chamber, naturally desorption Suruga by the wound healing effect of the skin, if the degree of fixation is strong not naturally desorbed may be desorbed chamber by removing the instrument used for fixation.

非ヒト動物の皮膚切除部位に形成された人工皮膚は、そのままヒト皮膚の代替試験用、特に育毛剤や育毛有効成分の試験用に用いることができる。 Artificial skin formed in the skin excision site of the non-human animal can be used as it is for the alternate test of human skin, in particular for testing the hair growth agent or a hair growth active ingredient. また、皮膚移植用材料として、動物から組織を採取してヒトなど他の個体に移植することも可能である。 Further, as a skin transplant material, it is also possible to tissues from animals were taken to port to other individuals, such as humans.

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。 It will be specifically described by the present invention through examples. 尚、実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明を限定するものではない。 Incidentally, examples are illustrative of the present invention, not to limit the present invention.

実施例1〜3および比較例1〜3 Examples 1-3 and Comparative Examples 1-3
[脂肪由来幹細胞の調製]調製例1 [Preparation of adipose derived stem cells] Preparation Example 1
32歳、BMI値22kg/m の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。 32 years old, to obtain a liposuction liquid by the suction operation of abdominal subcutaneous fat female BMI value 22 kg / m 2. まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を200cc吸引した。 First epinephrine to minimize contamination of peripheral blood was administered to the abdominal subcutaneous fat, and then 200cc aspirated adipose tissue. PBSバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、0.075%コラゲナーゼ中にて37℃、30分間インキュベートした。 After washing aspirated tissue with PBS buffer, 37 ° C. at 0.075% collagenase and incubated for 30 min. ここに10% FBSを含むDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ150μmのメッシュを用いてろ過した。 After neutralization collagenase activity by adding Dulbecco's modified eq Eagle's medium with (DMEM) containing here 10% FBS, it was filtered through a mesh having a pore size of 150 [mu] m. このろ液を1200×gにて10分間遠心後、上清を除き、ペレットを10% FBSを含むDMEMに再懸濁した。 After the filtrate centrifuged 10 min at 1200 × g, the supernatant was removed, the pellet was resuspended in DMEM containing 10% FBS. これを再び1200×gにて10分間遠心し、上清を除いた。 This was centrifuged for 10 minutes at again 1200 × g, the supernatant was removed. 得られたペレットを10% FBS、1% antibiotic/antimycotic solutionを含むDMEMに再懸濁し、60mm dishに播種して37℃、5%CO 存在下にて一晩培養した。 The resulting pellet was resuspended in DMEM containing 10% FBS, 1% antibiotic / antimycotic solution, and plated in 60 mm dish 37 ° C., and cultured overnight at the presence of 5% CO 2. 翌日、PBSバッファーを用いてプレートを洗浄することにより非接着性の赤血球細胞を除いた。 The following day, except for the non-adherent red blood cells by washing the plate with PBS buffer. こうして得られた細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した(Von Kossa stain,Alcian Blue stain,Myosin抗体染色、MyoD1抗体染色により確認)。 The resulting cells thus differentiated bone tissue not only adipose tissue, cartilage tissue, muscle tissue confirmed, that was confirmed to be the adult stem cells (Von Kossa stain, Alcian Blue stain, Myosin antibody staining, the MyoD1 antibody staining ).

[線維芽細胞の調製] [Preparation of fibroblasts]
ヒト皮膚の線維芽細胞は以下に示す一般的な手法により調製した。 Human dermal fibroblasts were prepared by a general method shown below. 無菌的手法により得たヒト皮膚片(形成外科・皮膚科・外科手術での余剰皮膚など)を抗生物質含有のPBS(−)中にて洗浄した後、メスを用いて1.5〜2cm角の小片とした。 Human skin pieces obtained by aseptic technique (such as excess skin in plastic surgery, dermatology, surgery) antibiotic-containing PBS (-) was washed with in, 1.5 to 2 cm angle using a scalpel It was of small pieces. この皮膚小片を培養シャーレに固定し、培地(10%FBSを含むDMEM)を静かに加え、インキュベータ内(37℃、5%CO )にて培養を開始した。 The skin pieces were fixed to culture dishes, gently added to the culture medium (DMEM containing 10% FBS), in an incubator (37 ℃, 5% CO 2 ) was initiated cultured at. 培地交換は週に2回行った。 The medium was exchanged twice a week. 培養開始3日〜7日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。 Cell proliferation was observed from the surrounding skin pieces from around the start of culture 3 days to 7 days. 細胞は60〜80%コンフルエントで回収した。 The cells were collected at 60-80% confluence.

[表皮ケラチノサイトの調製] [Preparation of epidermal keratinocytes]
ヒト皮膚の表皮ケラチノサイトは以下に示す一般的な手法により調製した。 Epidermal keratinocytes human skin was prepared by a general method shown below. 無菌的手法により得たヒト皮膚片を抗生物質含有のPBS(−)中にて洗浄した後、メスを用いて1〜2cm角の小片とした。 Aseptic technique by obtained human skin pieces antibiotic-containing PBS (-) was washed with in, and a small piece of 1~2cm angle using a scalpel. これらは1000U/mLディスパーゼ中にて4℃、24時間処理した。 These 4 ° C. C. in 1000 U / mL dispase and treated 24 hours. その後、DMEM培地に浸して軽く洗浄し、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。 Then washed gently immersed in DMEM medium were detached epidermis from the dermis with forceps. こうして得られた表皮を0.1%トリプシン溶液10mL中にて37℃、3分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。 37 ° C. The epidermis thus obtained with 0.1% trypsin solution 10mL in, dropped epidermal keratinocytes in solution by shaking 3 minutes. トリプシンインヒビターを2mg含有するDMEM培地10mL加え、遠心により細胞を回収後、KGM培地を用いて細胞を播種した。 The trypsin inhibitor was added DMEM medium 10mL containing 2 mg, the cells were harvested by centrifugation, cells were seeded with KGM media. インキュベータ内(37℃、5%CO )にて培養を開始し、培地交換は2日に1回行った。 Incubator (37 ℃, 5% CO 2 ) to start the culture in the medium was exchanged once every 2 days. こうして培養した表皮ケラチノサイトは60〜80%コンフルエントで回収した。 Thus cultured epidermal keratinocytes were collected at 60-80% confluence.

[細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製] [Preparation of cell suspension collagen gel mixed solution]
新田ゼラチン社製のCellmatrix TypeIPを用いて添付のプロトコルを参考にコラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。 It was prepared collagen gel mixed solution with reference to the attached protocol using Cellmatrix TypeIP manufactured by Nitta Gelatin Inc.. 脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および表皮ケラチノサイトを、コラーゲン・ゲル混合溶液100μlに対し、表1に示した細胞数になるように細胞を懸濁した。 Adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes, with respect to the collagen gel mixed solution 100 [mu] l, the cells were suspended so that the number of cells shown in Table 1. これらの作業は氷上で行った。 These operations were carried out on ice. また、本試験で用いた脂肪由来幹細胞は人工皮膚中でその局在を検出できるようにQtracker 525 cell labeling kit(Invitrogen社製)を用いてQ−dot525標識したものを用いた。 Furthermore, adipose derived stem cells used in this study was used as the Q-dot525 labeled using Qtracker 525 cell labeling kit (Invitrogen Corporation) so as to detect the localization in the artificial skin.

[ヌードマウスへの細胞播種] [Cell seeding into nude mice]
ポリプロピレン製の内径10mmのつば付き円筒の上部に蓋を付着したチャンバーAを用いた(図4)。 With chamber A adhering the lid to the top of a polypropylene having an inner diameter of 10mm collar with a cylindrical (Fig. 4). ヌードマウスの背部皮膚から直径12mmの円状に皮膚を切除し、切除部位にチャンバーを設置し、それぞれ医療用クリップを用いて固定した。 Excised skin from the back skin of nude mice in a circle with a diameter of 12 mm, was placed a chamber excision site, respectively fixed with medical clip. チャンバーAの蓋1には18ゲージの注射針を用いて穴を開け、細胞液の注入口2とした。 The lid 1 of the chamber A pierced with a needle of 18 gauge, and an inlet 2 of the cell solution. チャンバーAの注入口2から、表1に示した細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を1mlサイズのシリンジと24Gサイズの注射針(ともにテルモ社製)を用いて100μlずつ注入した。 From the inlet 2 of the chamber A, it was injected by 100μl using a cell suspension collagen gel mixed solution shown in Table 1 needle syringe and 24G size 1ml size (both manufactured by Terumo Corporation). 細胞注入に用いたチャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により、設置から7日後に自然に外れた。 Chamber used for cell implantation, the wound healing effect of skin off spontaneously 7 days after installation.

[形成した人工皮膚における皮膚付属器の有無の確認] [Checking for skin appendages in the formed artificial skin]
細胞播種28日後に播種部位を切除し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、HE染色により組織学的検討を行った。 Excised the seeding site after cell seeding 28 days, formalin-fixed, embedded in paraffin, were histological examination by HE staining. その結果、脂肪由来幹細胞を播種した実施例1(図1)、実施例2(図5)、実施例3(図6)では細胞移植部位に毛包、皮脂腺が形成されていることが確認できた。 As a result, Example seeded with adipose derived stem cells 1 (Fig. 1), Example 2 (Fig. 5), Example 3 (FIG. 6) in the hair follicle cell transplantation site, confirmed that the sebaceous gland is formed It was. また形成された毛包にはQ−dot標識された細胞が検出されたことから、脂肪由来幹細胞が毛包細胞に分化したことが確認できた(実施例1の例:図2)。 Also since the hair follicles formed was detected Q-dot-labeled cells, adipose-derived stem cells was confirmed that differentiated into hair follicle cells (Example 1 Example: Figure 2). 一方、脂肪由来幹細胞を播種していないほかは実施例1と同じように行った例を比較例1に示した。 Meanwhile, except that unseeded adipose-derived stem cells showed an example of performing the same manner as in Example 1 to Comparative Example 1. また、線維芽細胞を使用しない例を比較例2に、表皮ケラチノサイトを使用しない例を比較例3に示した。 Further, an example that does not use the fibroblasts to Comparative Example 2, an example that does not use the epidermal keratinocytes Comparative Example 3. 比較例1では細胞移植部位に毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は確認できなかった(図3)ほか、比較例2、3においても、皮膚付属器はほとんど形成されなかった。 Comparative Example 1 In the hair follicle cell transplantation site, skin appendages, such as sebaceous glands was not confirmed (Fig. 3) In addition, in Comparative Examples 2 and 3, the skin adnexa were hardly formed.

従って、人工皮膚中に皮膚付属器を形成させるには脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および皮膚ケラチノサイトを共に培養することが必須であることを発見した。 Therefore, in order to form the skin appendages in the artificial skin it has been found that it is essential to both cultured adipose derived stem cells, fibroblasts, and skin keratinocytes.

実施例4 Example 4
前述の実施例1〜実施例3、及び比較例1〜比較例3に示した脂肪由来幹細胞は前記調整例1で調製しているが、他の方法で調製した脂肪由来幹細胞についても同様の皮膚付属器形成能を有するかどうかについて検討した。 Although Examples 1 to 3, and Comparative Examples 1 to adipose-derived stem cells as shown in 3 above are prepared in the above Preparation Example 1, the same skin also adipose-derived stem cells prepared by other methods It was examined whether it has appendages forming ability.

[脂肪由来幹細胞の調製]調製例2 [Preparation of adipose derived stem cells] Preparation Example 2
上記調製例1の方法以外にも脂肪吸引液、または脂肪組織の酵素処理液から得られる成熟脂肪細胞を用いて幹細胞を得ることが出来、以下に方法を示した。 With mature adipocytes obtained from the enzyme treatment solution also liposuction solution, or adipose tissue in addition to the method of Preparation Example 1 can be obtained stem cells showed how below. 43歳、BMI値25kg/m の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。 43 years old, to obtain a liposuction liquid by the suction operation of the female abdominal subcutaneous fat of BMI values 25 kg / m 2. まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を200cc吸引した。 First epinephrine to minimize contamination of peripheral blood was administered to the abdominal subcutaneous fat, and then 200cc aspirated adipose tissue. PBSバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、0.075%コラゲナーゼ中にて37℃、30分間インキュベートした。 After washing aspirated tissue with PBS buffer, 37 ° C. at 0.075% collagenase and incubated for 30 min. ここに10% FBSを含むDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ150μmのメッシュを用いてろ過後、1200×gにて10分間遠心した。 After neutralization collagenase activity by adding an equal volume of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing here 10% FBS, filtered using a mesh having a pore size of 150 [mu] m, centrifuged 10 min at 1200 × g did. 遠心操作により最上部に浮遊した細胞をパスツールピペットで丁寧に採取し、PBSバッファーに再懸濁した。 Carefully collect cells suspended at the top by centrifugation with a Pasteur pipette and resuspended in PBS buffer. 同様に再び遠心洗浄し、浮遊する細胞をパスツールピペットで採取した。 Similarly centrifuged again washed and collected floating cellular Pasteur pipette. こうして得た浮遊細胞を以下に示す天井培養に用いた。 The floating cells obtained in this way was used in the ceiling culture below. 天井培養とは液中で浮遊するために通常の接着培養が困難である細胞を、培養液を満たしたフラスコに植え込むことにより天井面に付着させ培養する方法である。 Cells that are difficult to normal adherent culture for the ceiling culture suspended in a liquid, a method of culturing is adhered to the ceiling surface by implanting into a flask filled with medium. 培養フラスコに新生仔牛血清を10%添加したF12培地を満たし、フラスコを立てたまま調製した浮遊細胞を入れ、栓をし、フラスコの底面を上にして37℃、5%CO 存在下にて10日間培養した。 Satisfy the F12 medium and newborn calf serum was added 10% culture flasks, placed floating cells prepared while making a flask, stoppered, 37 ° C. and above the bottom of the flask, at the presence of 5% CO 2 They were cultured for 10 days. 顕微鏡下にて細胞が天井面へ接着していることを確認した後、培地を除き、新生仔牛血清を10%添加したF12培地を加えフラスコの天地を静かに逆にして通常のフラスコ培養としてさらに7日間培養した。 After confirming that the cells under a microscope is adhered to the ceiling surface, the medium was removed, the newborn calf serum in the gently reverse the top and bottom of the flask was added the F12 medium supplemented with 10% more as an ordinary flask cultures They were cultured for 7 days. こうして得られた接着細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した(Von Kossa stain,Alcian Blue stain,Myosin抗体染色、MyoD1抗体染色により確認)。 Adherent cells so obtained bone tissue not only adipose tissue, cartilage tissue, differentiating into muscle tissue, i.e. it was confirmed that the adult stem cells (Von Kossa stain, Alcian Blue stain, Myosin antibody staining, the MyoD1 antibody staining Confirmation).

上述の調製例2で調製した脂肪由来幹細胞(細胞数:1.5×10 cells)と皮膚細胞(線維芽細胞の細胞数:7.5×10 cells、表皮ケラチノサイトの細胞数:7.5×10 cells)の細胞比を1:10、全細胞数合計を1650000cellsとしたほかは、実施例1と同様にして作成した人工皮膚を図7に示した。 Adipose-derived stem cells prepared in the above Preparation Example 2 (cell count: 1.5 × 10 5 cells) and skin cells (cell number of fibroblasts: 7.5 × 10 5 cells, cell numbers of epidermal keratinocytes: 7. 5 × 10 5 cells) cell ratios 1:10, except that the 1650000cells whole cell total number showed artificial skin was produced in the same manner as in example 1 in FIG. 毛包、皮脂腺、汗腺といった皮膚付属器の形成が確認でき、皮膚組織切片長10mmあたりの毛包数は10本以上であった。 Hair follicles, sebaceous glands, sweat glands such confirmed formation of skin appendages, hair follicles per skin tissue intercept length 10mm was more than ten.

実施例5〜実施例8(育毛有効成分試験) Examples 5 to 8 (hair growth active ingredient Test)
43歳女性の頭部皮膚片(外科手術での余剰皮膚、1.0cm×3.0cmの大きさ)を抗生物質含有のPBS(−)中にて洗浄した後、メスを用いて0.3cm幅の短冊状にカットした。 Head piece of skin of 43-year-old woman (excess skin surgery, of 1.0 cm × 3.0 cm size) antibiotic-containing PBS (-) was washed with in, using a scalpel 0.3cm It was cut to a width strip. これらの皮膚片は1000U/mLディスパーゼ中にて4℃、24時間処理した。 These skin strips 4 ° C. C. in 1000 U / mL dispase and treated 24 hours. その後、DMEM培地に浸して軽く洗浄した後、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。 Then, after being washed lightly immersed in DMEM medium were detached epidermis from the dermis with forceps. 表皮は表皮角化細胞の培養に、真皮は線維芽細胞の培養に供した。 Epidermis in culture of epidermal keratinocytes, dermal were subjected to culture fibroblasts.

表皮角化細胞の調製法を以下に示した。 The preparation of epidermal keratinocytes are shown below. 表皮を0.1%トリプシン溶液10mL中にて37℃、3分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。 37 ° C. The epidermis with 0.1% trypsin solution 10mL in, dropped epidermal keratinocytes in solution by shaking 3 minutes. トリプシンインヒビターを2mg含有するDMEM培地10mLを加え、遠心により細胞を回収後、KGM培地を用いて細胞を播種した。 DMEM medium 10mL of a trypsin inhibitor containing 2mg addition, the cells were harvested by centrifugation, cells were seeded with KGM media. インキュベータ内(37℃、5%CO )にて培養を開始し、培地交換は2日に1回行った。 Incubator (37 ℃, 5% CO 2 ) to start the culture in the medium was exchanged once every 2 days. こうして培養した表皮ケラチノサイトは60〜80%コンフルエントで回収した。 Thus cultured epidermal keratinocytes were collected at 60-80% confluence.

線維芽細胞の調製法を以下に示した。 Preparation of fibroblasts are shown below. 真皮をメスを用いて1cm幅にカットし、この小片を培養シャーレに接着させた。 The dermis with a scalpel cut into 1cm wide was adhered to the small pieces in a culture dish. ここに培地(10%FBSを含むDMEM)を静かに加え、インキュベータ内(37℃、5%CO )にて培養を開始した。 Here the medium gently added (DMEM containing 10% FBS), in an incubator (37 ℃, 5% CO 2 ) was initiated cultured at. 培地交換は週に2回行った。 The medium was exchanged twice a week. 培養開始3日〜7日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。 Cell proliferation was observed from the surrounding skin pieces from around the start of culture 3 days to 7 days. 細胞は60〜80%コンフルエントで回収した。 The cells were collected at 60-80% confluence.

こうして得られた表皮ケラチノサイトと線維芽細胞を上述の調製例2で得られた脂肪由来幹細胞と混合して、細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。 Epidermal keratinocytes and fibroblasts thus obtained was mixed with adipose-derived stem cells obtained in Preparation Example 2 above, was prepared cell suspension collagen gel mixed solution. 細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製は、細胞数、細胞比を表2の実施例5〜実施例8に記載した通りとしたほかは、実施例1と同様とした。 Preparation of cell suspension collagen gel mixed solution, cell number, except that were as described cell ratios in Examples 5 to 8 in Table 2, were the same as in Example 1. このようにして調製した細胞混合液に何も添加しないで(実施例5)、或いは細胞混合液に既に育毛効果の知られているタンパクであるephrin−A3(実施例6)、shh(実施例7)、EGF(実施例8)を、それぞれ表2に示す量加えてヌードマウスの皮膚切除部位に播種し、育毛促進効果が得られるか検討した。 Thus nothing cell mixture prepared without the addition of (Example 5), or ephrin-A3 (Example 6) is a protein that is already known of hair growth effect on cell mixture, shh (Example 7), EGF (example 8), in addition each amount shown in table 2 were inoculated into the skin excision site in nude mice, was investigated whether hair growth promoting effect. ヌードマウスへの細胞播種、形成した人工皮膚における皮膚付属器有無の確認については実施例1と同様にして行った。 Cell seeding into nude mice, the confirmation of the skin appendages presence in the formed artificial skin was made in the same manner as in Example 1.

各タンパク質を添加して培養した場合と、無添加の場合とで、毛包などの皮膚付属器の分化の程度を比較した。 And when cultured with the addition of each protein, in a case of no addition, to compare the degree of differentiation of skin appendages such as hair follicles. その結果、各タンパク質のいずれを添加した場合にも、無添加の場合と比較して毛包が形成され、組織において毛が生えたことが肉眼でも明らかであり、育毛効果も確認できた。 As a result, even in the case of adding any of the proteins, the hair follicle is formed as compared with the case of no addition, the hair grew in tissue are apparent to the naked eye, it was also confirmed hair growth effect. 中でもephrin−A3を加えた場合(実施例6:図9)と無添加の場合(実施例5:図8)との間の毛包数の増加および育毛効果は、他のタンパク質の場合と比べて顕著であった。 Above all if the addition of ephrin-A3 (Example 6: 9) When the no addition (Example 5: 8) increases and hair growth effects of the hair follicle number between as compared to the case of other proteins Te was remarkable. つまり評価した本人に適した育毛有効成分はephrin−A3であることが分かった。 That hair growth active ingredient suitable for the person who evaluated were found to be ephrin-A3.

このことから、本発明人工皮膚は育毛剤および育毛有効成分の試験に使用することができることが明らかとなった。 Therefore, the present invention the artificial skin became clear that it can be used to test hair tonic and hair growth active ingredient. すなわち、育毛試験をしたい本人の皮膚細胞から調製した人工皮膚を試験に用いることができるため、本人に合った育毛剤や育毛有効成分を選択することが可能となる。 That is, it is possible to use the test artificial skin prepared from his skin cells to be hair growth test, it is possible to select a hair growth agent or a hair growth active ingredient suitable for the person. 従って、従来の動物試験による育毛評価よりも個人に合った育毛評価が出来る。 Therefore, individuals in suits hair growth evaluation can be than the hair growth evaluation by conventional animal studies.

図1は、実施例1において形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 1 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in Example 1. 図2は、実施例1において形成した人工皮膚中の毛包における、脂肪由来幹細胞部分の断面図である。 2, in the hair follicles of the artificial skin formed in Example 1 is a cross-sectional view of adipose-derived stem cell parts. 図3は、比較例1のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 3 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of Comparative Example 1. 図4は、移植用チャンバーの一例を示す斜視図である。 Figure 4 is a perspective view showing an example of a graft chamber. 図5は、実施例2のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 5 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of Example 2. 図6は、実施例3のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 6 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of the third embodiment. 図7は、実施例4のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 7 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of Example 4. 図8は、実施例5のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 8 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of Example 5. 図9は、実施例6のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。 Figure 9 is a cross-sectional view of the tissue sections of artificial skin formed in the chamber of Example 6.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

A チャンバー1 蓋2 注入口 A chamber 1 the lid 2 inlet

Claims (8)

  1. 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁した状態で含み、 Comprises adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts in a state suspended in a collagen gel,
    脂肪由来幹細胞の細胞数と、表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の数を合計した皮膚細胞の細胞数との比が50:1〜1:1000である、 The ratio of the cell number of adipose-derived stem cells, the cell number of skin cells which is the sum of the number of epidermal keratinocytes and fibroblasts 50: 1 to 1: 1000,
    皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。 Cultured cell mass with a skin appendages forming ability.
  2. 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含み、皮膚付属器を有する人工皮膚。 It comprises adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes and fibroblasts, artificial skin having a skin appendages.
  3. 皮膚移植用材料である、請求項2に記載の人工皮膚。 A skin implant, artificial skin according to claim 2.
  4. ヒト皮膚の代替試験用である、請求項2に記載の人工皮膚。 It is for alternative testing human skin, artificial skin according to claim 2.
  5. 育毛剤および育毛有効成分の試験用である、請求項2に記載の人工皮膚。 It is a test of the hair growth agents and hair growth active ingredient, artificial skin according to claim 2.
  6. 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を共培養することを特徴とする、皮膚付属器を有する人工皮膚の製造方法(但し、ヒトの生体で実施される方法を除く。) Wherein the co-culturing adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes and fibroblasts, production method of artificial skin having a skin appendages (excluding the method implemented in the human organism.).
  7. 前記共培養は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁して行う、請求項6に記載の人工皮膚の製造方法。 The co-culture is carried out by adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes and fibroblasts were suspended in a collagen gel, producing an artificial skin according to claim 6.
  8. 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を懸濁させたコラーゲン・ゲルをヒト以外の動物の皮膚切除部位に注入することにより共培養する、請求項6または7に記載の人工皮膚の製造方法。 Co-culturing by injecting adipose derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts were suspended collagen gel to the skin excision site in animals other than humans, the production method of the artificial skin according to claim 6 or 7 .
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