KR100956328B1

KR100956328B1 - Ｈｃｖｎｓ５ｂ 의존적인 앱타자임 및 이를 이용한ｈｃｖ의 진단 방법

Info

Publication number: KR100956328B1
Application number: KR1020080027525A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 이창호
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2010-05-10
Also published as: KR20090102225A

Abstract

본 발명은 HCV NS5B 의존적인 앱타자임 및 이를 이용한 HCV의 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HCV NS5B 단백질 존재시에만 특이적으로 자가-절단되도록 고안된 NS5B 의존적인 앱타자임, 이의 제조 방법, 이를 이용한 HCV의 진단 방법 및 HCV 진단 조성물에 관한 것이다.

Description

ＨＣＶＮＳ５Ｂ 의존적인 앱타자임 및 이를 이용한 ＨＣＶ의 진단 방법{HCV NS5B DEPENDENT APTAZYME AND DIAGNOSIS METHOD OF HCV USING SAME}

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviridae 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로, non-A, non-B 간염을 일으키고(Kuo, G., et al., 1989. Science 244, 362-364), 만성으로 진행되면 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다(Saito, I., et al., 1990. Proc . Natl Acad. Sci . USA 87, 6547-6549). 전 세계 인구의 1~2%가 이 바이러스에 감염되어 있지만, 바이러스는 매우 낮은 역가(titer)로 생체 내에 존재하고 있기 때문에 진단하기가 매우 힘들다. 최근 서브게놈 HCV 레플리콘(subgenomic HCV replicon)이 개발되어 세포 내에서의 HCV 복제 기전 및 항-HCV 제제의 스크리닝 또는 항-바이러스 효과를 시험할 수 있는 중요한 시스템으로 이용되고 있다(Lohmann, V., et al., 1999. Science 285, 110-113). 그러나 아직 HCV 바이러스에 대한 효과적인 치료제나 백신이 없는 상태이다.

HCV 게놈은 약 9.5 kb의 크기로, 3,010 내지 3,030개의 아미노산으로 이루어진, 하나의 복합 단백질이다(Choo, Q.L., et al., 1989. Science 244, 359-362). 복합 단백질은 이후에 숙주와 바이러스의 프로테이즈에 의해, C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B 등과 같은 증식에 필요한 조절 단백질이 된다(Hahm, B., et al., 1995. J. Virol . 69, 2534 - 2539). HCV 바이러스 복제에 5'UTR(untranslate region)과 3'UTR이 매우 중요한 역할을 할 것으로 예상되는데, 5'UTR에는 HCV 균주들 간에 매우 보존적인 IRES가 있어 캡-비의존적(cap-independent)으로 번역 과정이 이루어지며(Ali N. and A. Siddiqui. 1995. J. Virol. 69, 6367 - 6375.; Kolykhalov, A.A., et al., 2000. J. Virol . 74, 2046 - 2051), 3'UTR은 짧고 비보존적인 다양한 염기서열과 다양한 길이의 폴리피리미딘 트랙 및 3'X라고 하는 96개의 염기서열로 구성되어 있어, 여기에 복제 복합체가 결합하여 RNA 게놈을 합성할 것으로 예상되고 있다(Anwar, A., et al., 2000. J. Biol. Chem . 275, 34231-34235.).

현재 HCV 증식을 억제하여 HCV로 인한 질병에 어느 정도 효과를 보이는 α-인터페론을 이용하는 방법과 리바비린(ribavirin)을 동시에 투여하는 방법이 있지만, 이 방법은 바이러스의 균주마다 그 효과가 다르게 보고되어 있으며, 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 지속적인 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Hino, K., et al., 1994. J Med Virol, 42,: 299-305; Pagliaro, L., et al., 1994. Hepatology 19, 820-828).

새로운 항-HCV 제제로서 최근 활발히 개발되고 있는 산물로서 siRNA(Chevalier, et al., 2007. Mol . Ther . 15, 1452-1462.; Kapadia, S.B., et al., 2003. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100, 2014-2018), RNA 앱타머(Biroccio, A., et al., 2002. J. Virol. 76, 3688-3696; Hwang, B., et al., 2004. RNA 10, 1277-1290), 안티센스 올리고뉴클레오티드(Hanecak, R., et al., 1996. J. Virol. 70, 5203-5212), 리보자임(Macejak, D.G., et al., 2000. Hepatology 31, 769-776; Ryu, K.J., et al., 2003. Mol . Ther . 7, 386-395; Sakamoto, N., et al., 1996. J. Clin . Invest. 98, 2720-2728) 등의 RNA 분자를 기반으로 한 저해제가 있다. 특히, RNA 분자는 매우 특이적으로 표적 분자와 반응할 수 있으므로, 부작용 또는 HCV 돌연변이들의 출현 등을 억제할 수 있고, 세포 내에서의 발현시 RNA 자체에 대한 면역반응은 아직 보고된 바 없는 장점들을 갖고 있다. 또한, RNA는 화학적 합성 및 변형이 용이하고, 세포내 과발현이 용이한 장점이 있다. 그러나, 각각의 방법을 단독으로만 이용할 경우에는 그 특이성과 효능에 있어 한계가 있어, 보다 특이적이며 효과적인 항-HCV 제제를 발굴하기 위해선 HCV가 감염된 경우에서만 효과적으로 HCV 증식을 억제할 수 있도록 상기의 유전산물의 기능이 결합된 새로운 산물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명은 HCV NS5B 단백 질에 의해 활성화되어 특이적인 자가-절단을 보이는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 HCV NS5B 단백질에 의해 활성화되어 특이적인 자가-절단을 보이는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임(aptazyme)의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 이용한 HCV의 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

(a) 서열번호 9의 RNA 서열을 포함하는 HCV NS5B 단백질에 대한 앱타머;

(b) 해머헤드 리보자임; 및

(c) NS5B 앱타머에 NS5B 단백질이 결합되면 해머헤드 리보자임의 자가-절단 활성을 활성화시키는 교류 모듈(communication module)

을 포함하는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 제조 방법을 제공한다:

(a) 교류 모듈에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트(5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCC ATATTGTGAGGGGCGCG-3' 및 3' 프 라이머: 5'-ACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNN NNNCGCGCCCCTCACAAT-3', N은 G, A, T, C가 동수로 포함됨) 및 EX taq로 PCR을 수행하는 단계;

(b) 단계 (a)의 PCR 산물에, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트(5'-GGTAATACG ACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTG GTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3')와 EX taq을 첨가하여, PCR을 수행하는 단계;

(c) 단계 (b)의 PCR 산물을 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 RNA로 전사하여, HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 제작하는 단계;

(d) 상기 HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 이외의 단백질 및/또는 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 이외의 단백질 존재하에서는 특이적 자가-절단을 보이지 않지만 NS5B 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절단을 보이는 RNA 풀을 수득하는 단계;

(e) 수득한 앱타자임 RNA 풀 각각을 RT-PCR하여 DNA를 수득하고, 각 염기서열을 확인하는 단계; 및

(f) 염기서열을 동정한 각 앱타자임 RNA를 표지한 다음, NS5B 단백질 이외의 단백질 및/또는 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 존재하에서만 특이적인 자가-절단을 보이는 앱타자임을 선별하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Mg² ⁺의 존재하에, 상기 방법에 따라 제조된 HCV NS5B 의존 적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단용 조성물과 HCV 감염 의심 샘플을 접촉시키는 단계; 및 HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응을 확인하는 단계를 포함하며, HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응이 확인되면, 상기 샘플을 HCV 양성으로 진단하는 것을 특징으로 하는, HCV 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 따라, HCV 비구조 단백질인 NS5B의 존재시에만 특이적인 자가-절단 활성을 나타내도록 고안된 앱타머에 의해 생체 샘플내 바이러스 감염 여부를 판단함으로써, 인간에 대한 HCV 진단을 쉽고 간단하게 수행할 수 있다. 또한, RNA는 구조적으로 다이나믹한 특성을 함유하고 있으므로, 항- HCV를 위한 RNA 기반 억제제들을 융합하여 새로운 구조적 특성, 나아가 새로운 기능을 가진 새로운 유전 산물을 개발할 수 있으며, 이로써 기존의 문제점들을 극복할 수 있는 새로운 항-HCV 제제를 개발할 수 있다.

본 발명자들은 새로운 개념의 RNA 분자를 개발하기 위해, 해머헤드 리보자임을 HCV NS5B 단백질에 특이적으로 결합하는 NS5B 앱타머(aptamer)와 결합시키고, 앱타머와 NS5B 단백질의 결합에 의해 알로스테릭한(allosteric) 방식으로 해머헤드 리보자임의 활성을 활성화시킬 수 있는 교류 모듈 염기서열을 시험관내 선별 방법을 통해 선별함으로써, NS5B 단백질이 존재할 경우에서만 자가-절단 활성이 활성화되는 알로스테릭 리보자임을 개발하였다.

알로스테릭 리보자임은 리보자임의 기질 결합 부위 및 촉매 코어 부위에 앱 타머와 같이 특정 리간드와 결합하는 부위를 연결하는 경우, 특정 리간드의 결합에 의해 리보자임의 구조적 변이가 발생되어, 리보자임 활성이 알로스테릭하게 증가 또는 저해될 수 있는 분자이다. 여기에 착안하여, 본 발명에서는 HCV의 조절 단백질인 NS5B에 대한 앱타머를 해머헤드 리보자임의 촉매 코어 부위에 접합시켜, NS5B 단백질에 의해 활성이 조절되는 알로스테릭 리보자임을 개발하였다. 본 발명에 따른 알로스테릭 리보자임은 앱타머의 가역적인 표적 결합 능력과 해머헤드 리보자임의 비가역적인 표적 RNA에 대한 절단 활성이 더해진 새로운 개념의 항-HCV 억제제로서도 사용가능할 것이다.

본 발명의 알로스테릭 리보자임은 이하, 앱타자임(aptazyme) 또는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임이라고도 한다.

본 발명의 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은, (a) NS5B 단백질에 대한 앱타머; (b) 해머헤드 리보자임; 및 (c) NS5B 앱타머에 NS5B 단백질이 결합되면 해머헤드 리보자임의 자가-절단 활성을 활성화시키는 교류 모듈을 포함하는 서열을 포함한다. 바람직하기로는 상기 앱타자임은 RNA 서열로 표시되며, 이의 DNA 서열도 본 발명에 포함된다.

상기 (a) NS5B 단백질에 대한 앱타머는, NS5B 단백질, 즉 HCV 바이러스의 RNA 의존적인 RNA 중합효소에 높은 결합력으로 결합하여 그 기능을 저해하는 물질로서, SELEX 방법(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment, 시험관 내 선별방법)을 이용하여 본 발명자들이 발굴한 분자이다. 상기 부위에 대한 앱타머의 RNA 서열 및 DNA 서열은 하기 서열을 포함한다:

앱타머 RNA 서열(서열번호 9) :

GGGACAUUGUGAGGGGCUCAGGUGGAUCGCAUG GCCGUGUCCAUAACCCAGAGGUCGAU

앱타머 DNA 서열(서열번호 10):

GGGACATTGTGAGGGGCTCAGGTGGATCGCATG GCCGTGTCCATAACCCAGAGGTCGAT

상기 (b) 해머헤드 리보자임은 당업자에게 공지된 서열로, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 검색, 입수 및 변형을 가할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 바람직한 해머헤드 리보자임은 하기 RNA 서열을 포함하지만, 하기 서열로 한정되는 것은 아니다.

해머헤드 리보자임의 RNA 서열(서열번호 11):

GGGUUGGUGUCUGAUGAGGCCUUUAGGCCGAAACAUUUGGGAAACCAAACGUAACACCAA

해머헤드 리보자임의 DNA 서열(서열번호 12):

GGGTTGGTGTCTGATGAGGCCTTTAGGCCGAAACATTTGGGAAACCAAACGTAACACCAA

본 발명의 (c) NS5B 앱타머에 NS5B 단백질이 결합하며, 알로스테릭한 구조 변형에 의해 해머헤드 리보자임의 자가-절단 활성이 활성화되도록 전환시키는 교류 모듈은, 시험관내 선별 방법을 통해 선별한다. 구체적으로는, 교류 모듈을 NNNNN으로 두고 각각의 N에 A, T, C, G가 동수로 포함되는 랜덤 서열을 조합하여, (a) NS5B 단백질에 대한 앱타머, (b) 해머헤드 리보자임 및 (c) 교류 모듈을 포함하는 앱타자임 라이브러리를 제조한 다음, 앱타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 이외의 단백질 및/또는 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 이외의 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절단을 보이지 않지만 NS5B 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절 단을 보이는 RNA 풀을 수득하고, 수득된 RNA 풀의 교류 모듈의 서열을 확인함으로써, 확보할 수 있다. 이러한 방법으로 수득한 교류 모듈은 본 발명에서 수득한 앱타자임에 따라 차이가 있었지만, 바람직하기로는 5' 모듈 서열은 'CCTCT'이고, 3' 모듈 서열은 'CACAC', 'TCCAC' 또는 'TCACC'이다. 따라서, 본 발명의 교류 서열은 5' 모듈 서열로 CCUCU를 포함하고, 3' 모듈 서열로 CACAC, UCCAC 또는 UCACC를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 예에 있어서, HCV NS5B 의존적인 앱타자임은 서열번호 1 내지 4로 기재된 RNA 서열 중에서 선택되며, 하기에 구체적으로 나타내었다. 하기 서열에서 밑줄 부분이 교류 모듈이고, 이탤릭체로 기재된 서열은 HCV NS5B에 대한 앱타머 서열이다.

서열번호 1(클론9):

RNA 서열: GGGUUGGUGUCUGAUGAGCCUCU CGCGGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA CACACCGAAAC

AUUUGGGAAACCAAACGUAACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

DNA 서열: GGGTTGGTGTCTGATGAGCCTCT CGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCA CACACCGAAAC

ATTTGGGAAACCAAACGTAACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

서열번호 2(클론10):

RNA 서열: GGGUUGGUGUCUGAUGAGCCUCU CGCGAUAUUGUGAGGGGCGCG UCACCCGAAAC

UUUGGGAAACCAAACGUACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

DNA 서열: GGGTTGGTGTCTGATGAGCCTCT CGCGATATTGTGAGGGGCGCG TCACCCGAAAC

TTTGGGAAACCAAACGTACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

서열번호 3(클론11):

RNA 서열: GGGUUGGUGUCUGAUGAGCCUCU CGCGUCAUAUUGUGAGGGGCGCG UCCACCG

AAACAUUUGGGAAACCAACGUAACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

DNA 서열: GGGTTGGTGTCTGATGAGCCTCT CGCGTCATATTGTGAGGGGCGCG TCCACCG

AAACATTTGGGAAACCAACGTAACACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

서열번호 4(클론17):

RNA 서열: GGGUUGGUGUCUGAUGAGCCUCU CGCACCAUAUUGUGAGGGGCGCG UCCACCGAAAC

AUUUGGGAAACCAAACGUAACACCAAAAAAAAAAAAAAAA

DNA 서열: GGGTTGGTGTCTGATGAGCCTCT CGCACCATATTGTGAGGGGCGCG TCCACCGAAAC

ATTTGGGAAACCAAACGTAACACCAAAAAAAAAAAAAAAA

일 예에 있어, 본 발명의 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은

(1) 해머헤드 서열의 내부에 앱타머를 포함하며, 헤머헤드 서열과 앱타머가 접하는 앱타머의 5' 말단에 5' 교류 모듈이 있으며, 앱타머의 3' 말단에 3' 교류 모듈이 있는 앱타자임 DNA 라이브러리를 제조하는 단계; (2) 상기 앱타자임 DNA 라이브러리를 시험관내에서 RNA로 전사하여, HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 제작하는 단계; (3) 상기 HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 이외의 단백질 및/또는 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 이외의 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절단을 보이지 않지만 NS5B 단백질 존재하에서는 특이적 자가-절단을 보이는 RNA 풀을 수득하는 단계; (4) 수득한 앱타자임 RNA 풀 각각을 RT-PCR하여 DNA를 수득하고, 각 염기서열을 확인하는 단계; 및 (5) 염기서열을 동 정한 각 앱타자임 RNA를 표지한 다음, NS5B 단백질 이외의 단백질 및/또는 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절단을 보이는 앱타자임을 선별하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.

상기 (1) 단계는, 구체적으로, (a) 교류 모듈에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트(5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCC ATATTGTGAGGGGCGCG-3' 및 3' 프라이머: 5'-ACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNN NNNCGCGCCCCTCACAAT-3', N은 G, A, T, C가 동수로 포함됨) 및 EX taq로 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물에, (b) 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트(5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTG GTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3')와 EX taq을 첨가하여, PCR을 수행하는 단계를 포함할 수 있으며, 구체적인 반응 조건은 본 발명이 속하는 당업자이라면 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

상기 방법에 의해 제조되는 HCV NS5B 단백질의 존재시에 자가-절단 특성을 보이는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은, 본 발명의 HCV 진단용 조성물로 이용가능하다.

본 발명의 HCV 진단용 조성물은 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 활성 성분으로 포함하며, 부가적으로 Mg² ⁺, 예컨대 Mg² ⁺를 포함하는 완충액을 포함한다. 본 발명의 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은 NS5B의 결합에 의해 앱타자임의 구조에 변화가 생기며, 변형된 구조에 Mg² ⁺가 결합함으로써, 알로스테릭 리보자임의 정확한 구조 형성 및 활성이 달성되어, 자가-절단이 이루어진다. 상기 완충액의 예로는 해머헤드 반응 완충액(100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 4 mM DTT)이 있으나, 이는 일 예에 불과하며 이로 한정되는 것은 아니다.

아울러, 상기 HCV 진단용 조성물은 활성 성분인 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 0.0005 μM 내지 0.3 μM로 포함할 수 있지만, 검출 샘플의 종류에 따라 변형될 수 있으며, 또한 통상적인 진단용 조성물에 사용되는 반응 시약, 부형제, 보강제, 비히클, 희석제 등을 더 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명은 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 이용한 HCV 진단 방법을 제공한다. 바람직한 HCV 진단 방법은, Mg² ⁺의 존재하에, HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단용 조성물과 HCV 감염 의심 샘플을 접촉시키는 단계; 및 HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응을 확인하는 단계를 포함하며, HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응이 확인되면, 상기 샘플을 HCV 양성으로 진단한다.

상기 HCV 감염 의심 샘플은 생물학적 샘플일 수 있으며, 예컨대 인간 또는 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 기니아피그 등의 동물로부터 채취한 모든 생체 시료일 수 있다. 구체적으로는, 상기 샘플로는 혈액과 그 구성성분, 예컨대 혈장, 혈소판, 세부적인 혈액 세포 집단 등; 신장, 간, 심장, 폐 등과 같은 기관; 골수 및 그 구성 성분; 및 염수, 덱스트로스 등과 같이 환자에 주입되는 그외 유체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

HCV 진단을 보다 용이하게 하기 위해, HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 미리 표지 물질로 표지해 둘 수도 있다. 이용가능한 표지 물질로는 ³²P 등의 방사성 동위원소, 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 텍사스 레드 등의 형광 물질이 있으며, 표지 방법은 알칼리 포스파타아제 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용한 5' 말단 표지법, T4 DNA 폴리머라아제 또는 Klenow 단편을 이용한 3' 말단 표지법, 닉 트랜슬레이션(nick translation)법, 랜덤 프라이머법(참조: Molecular Cloning, 3판, 제9장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 등을 예시할 수 있으나, 이로 한정되진 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면, 앱타자임에 이용가능한 표지 물질과 구체적인 표지 방법을 인지하거나, 또는 공지된 문헌을 참조하여 실시할 수 있을 것이다.

앱타자임의 자가-절단 반응은 당업계에서 통상적으로 사용되는 겔 전기영동, 서열분석 및 크로마토그래피 등을 이용하여 용이하게 실시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은 HCV NS5B 단백질에 대한 저해제를 스크리닝하기 위한 경쟁자(competitor)로도 사용가능하며, 앱타머의 NS5B 단백질 결합에 의해서도 HCV 복제를 감소시킬 수 있어 하나의 분자를 사용한 치료법보다 더 뛰어난 효과를 볼 수 있다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 해머헤드 리보자임의 제작

HCV IRES는 복잡한 2차 구조(도 1)를 가지고 있어, 어느 부위가 해머헤드 리보자임에 가장 접근성이 용이한 부위인지를 확인하고자 하였다. 이에, 도 1에서 195, 199, 326 및 382번째 뉴클레오티드가 접근성이 용이할 것으로 생각되어, 이를 표적으로 하는 헤머헤드 리보자임을 제작하고자 하였다.

1-1. HCV IRES RNA 준비

먼저, HCV IRES RNA를 제작하기 위하여, HCV IRES의 +18 뉴클레오티드(nt) 부위에서 +402 nt 부위를 포함하고 있는 DNA[pSK(-) 18 - 402 IRES CAT] 플라스미드를 BamHI으로 선형화한 다음, T7 RNA 중합효소(Takara, Otsu, 일본)와 37 ℃에서 3시간 반응시켜, 시험관내 전사 반응을 수행하였다. 이때, [α-³²P] UTP를 이용하여 제작된 RNA를 방사선 동위원소로 표지한 후 정제 및 정량하였다.

1-2. 해머헤드 리보자임 제작

HCV IRES의 +195 nt, +199 nt, +326 nt 및 +382 nt 부위를 표적하는 해머헤드 리보자임들(각각 Rib195, Rib199, Rib326, Rib382로 명기)을 제작하기 위하여, 하기 프라이머 세트 각각을 이용하여 PCR을 수행한 후 증폭된 산물과 T7 RNA 중합효소를 37 ℃에서 3시간 동안 반응하여 시험관내 전사 반응을 수행하였다.

Rib195: 5' 프라이머, 5'-GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTCCAAGACTGATGAG;

3' 프라이머, 5'-GGGTCCTTTCGGCCTAACGGCCTCATCAGTCTTGGA

Rib199: 5' 프라이머, 5'-GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGTTAATCCCTGATG;

3' 프라이머, 5'-CCTTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGATTAACCT

Rib326:5' 프라이머, 5'-GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCACGGTCTACGACTGATG;

3' 프라이머, 5'-GCCCCGGGAGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTCGTAGAC

Rib382: 5' 프라이머, 5'-ACGCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGTTGGTGTCTGATG;

3' 프라이머, 5'-CCAAACGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACACCAACC

1-3. 시험관내 트랜스-절단 분석을 통한 HCV IRES에서 접근성이 용이한 부위 선정

이후, 상기에서 제작한 해머헤드 리보자임과 방사성 동위원소로 표지된 IRES를 이용하여 시험관내 트랜스-절단 분석을 수행하여, 접근성이 용이한 부위를 확인하였다.

10 mM Tris-Cl(pH7.5)에 200 fmole의 해머헤드 리보자임을 각각 혼합하고, 95 ℃에서 1분 30초간 변성시킨 다음, 37 ℃에서 15분간 구조를 재형성시켰다. 각 리보자임과 20 fmole의 [알파-³²P]UTP로 표지된 HCV IRES RNA 및 10 mM MgCl₂를 혼합하여, 37 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 종결 후, RNA 로딩 염료를 혼합하여, 95 ℃에서 변성한 다음, 7 M 유레아-6% 폴리아크릴아미드 겔에서 180V로 1시간 전기영동한 후, X-선 필름에 노출시켜 현상하였다.

그 결과는 도 2에 나타낸다. 도 2는 HCV IRES RNA에 대한 기질 RNA(레인 I), IRES 195 nt-타겟 리보자임(레인 1, Rib195), 199 nt-타겟 리보자임(레인 2, Rib199), 326 nt-타겟 리보자임(레인 3, Rib326), 및 382 nt-타겟 리보자임(레인 4, Rib382)의 시험관내 트랜스-절단 분석 결과를 나타낸 것으로, 활성형의 리보자임이 레인 4, 즉 382 nt-타겟 리보자임이 HCV IRES RNA를 절단시켜 접근성이 가장 용이함을 알 수 있었다.

이에, HCV IRES 타겟 부위를 382 nt로 선정하였다.

실시예 2: NS5B 의존성 알로스테릭 리보자임의 제작

HCV IRES의 382번째 뉴클레오티드를 인지하는 해머헤드 리보자임을 기본 골격으로 한 알로스테릭 리보자임을 선별하고자 하였다. 이를 위해 해머헤드 리보자임의 촉매 코어 부위인 스템(stem) II 부위에 교류 모듈(communication module)을 통해 NS5B 앱타머를 결합시킴으로써, NS5B 단백질의 앱타머 결합이 리보자임의 촉매 작용을 조절할 수 있는 리보자임을 시험관내 선별 방법을 통하여 발굴하였다.

2-1. NS5B 의존적인 앱타자임 ( aptazyme ) 라이브러리 제작

먼저, 하기의 방법에 따라 무작위의 10 mer로 구성된 교류 모듈을 NS5B에 대한 앱타머와 해머헤드 리보자임 사이에 삽입하여 NS5B 의존성 자가-절단 알로스테릭 앱타자임 라이브러리를 제작하였다(도 3).

NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 제작하기 위해, 교류 모듈(communication module)에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCC ATATTGTGAGGGGCGCG-3'와 3' 프라이머: 5'-ACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNN NNNCGCGCCCCTCACAAT-3'을 제작하였다. 이때, N에는 G, A, T, C가 동수로 포함되게 하였다.

상기 프라이머 한 쌍과 EX taq (takara)을 사용하여 PCR(63℃에서 30초간 어 닐링/30회 반복)을 수행하였다. PCR 산물 20 ng을 다시 5'-GGTAATACG ACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTG GTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3' 프라이머 한 쌍과 EX taq(takara)을 사용하여, PCR(58℃에서 30초간 어닐링/30회 반복)을 수행하였다. PCR을 통해 수득한 산물인 라이브러리 DNA를 T7 중합효소를 이용하여 시험관내 전사 반응을 3시간 수행함으로써, NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 제작하였다.

2-2. HCV IRES 단백질 준비

pcp11-NS5B 세포주를 5 ㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 16 - 18시간 배양하였다. 종 배양액 5 ㎖를 배지 500 ㎖ 다시 접종하여 OD 값이 0.6에서 0.8이 될 때까지 37℃에서 3시간 배양하였다. 이후, 최종 농도 0.2 mM로 IPTG를 첨가하여, 다시 37℃에서 3시간 배양하고, 세포의 용해 과정과 초음파 분해 과정을 수행한 다음, Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen)에 결합시킨 후 5시간 동안 4℃에서 NS5B 단백질과 결합시켰다. 이후, 이미다졸 농도를 조절하면서, Ni-NTA 아가로스 비드에 결합된 NS5B 단백질을 용출시켰다. 용출물을 농축한 다음 브래드포드 분석으로 정량하였다.

2-3. 시험관내 선별을 이용한 NS5B 의존적인 앱타자임 의 선별

2-1에서 제조한 라이브러리를 도 4의 전략에 따라 NS5B 의존적인 앱타자임의 선별하였다.

먼저, NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 BSA 단백질과 반응시켜 절단되지 않은 RNA를 선별함으로써, 비특이적으로 절단되는 RNA pool을 제거하였다. 이 를 위해, 라이브러리 RNA 30 pmole을 95 ℃에서 1분 30초 동안 변성시킨 후, 37 ℃에서 15분간 구조를 재형성시켰다. 여기에 2x 해머헤드 반응 완충액(100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 4 mM DTT)와 BSA를 넣고 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응물을 7M 유레아-10% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하고, EtBr 염색을 통해 절단되지 않는 RNA를 확인하였다. 비특이적 절단이 없는 것으로 확인된 RNA는 용리한 후, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3' 프라이머를 이용한 역전사 반응과 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 프라이머와 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3' 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통하여 증폭시킨다. 증폭된 DNA는 다시 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 전사하여 수득하였다. 이렇게 얻어진 RNA 30 pmole을 BSA 대신 NS5B를 넣고 상기 단계와 동일하게 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 전기 영동을 통해 절단되는 RNA를 선별하였다. 이를 RT-PCR 과정을 거쳐 두 번째 선별 과정을 거칠 pool을 제작하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다.

상기 과정에 따라 수행하여 수득한 2차 pool 및 3차 pool NS5B 의존적인 앱타자임와 최초 라이브러리의 특이적 자가-절단을 확인한 결과는 도 5에 나타낸다. 도 5에서, 1은 단백질을 무첨가한 반응 결과물이고, 2는 BSA를 첨가한 반응 결과이고, 3은 NS5B 단백질을 첨가한 반응 결과로, 3차 pool 앱타자임이 BSA와 반응시켰을 때 잘리지 않고, NS5B 단백질과 반응시켰을 때만 특이적으로 잘리는 것을 확인할 수 있었다.

2-4. 선별된 NS5B 의존적인 앱타자임의 서열 확인

상기 3차 선별과정으로 획득한 앱타자임 pool을 RT-PCR하여 DNA를 수득하였고, 이를 pGEM T 이지 시스템(promega)에 연결한 다음 Escherichia coli(Top10)에 열 충격 방법으로 형질전환하였다. 균주는 암피실린(sigma) 항생제가 함유된 아가 플레이트에서 37 ℃에서 16시간 동안 배양하고, 배양된 클로니들 중 수십 개를 선택하여 DNA를 정제하였다. 이후 EcoRⅠ효소(Roche)로 삽입된 DNA가 있는 클론 24개를 확인하였고, 각 클론 DNA에 5x 서열분석 완충액, 터미네이터 레디 반응물, 3.2 pmole M13 정방향 프라이머를 혼합하여, 96 ℃, 10초 -> 50℃, 5초 -> 60℃, 4초의 조건으로 25 회 사이클의 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 에탄올 침전한 후 주형 억제 반응시약(template suppression reagent)을 첨가하고, 변성 과정을 거쳐 염기 서열 분석기(ABI PRISM)에서 염기 서열을 결정하였다. 24개의 클론의 염기 서열 분석 결과는 도 6에 나타낸다.

염기 서열이 결정된 24개의 클론들은 각 위치별로 점수를 매겨서 각 위치에서 가장 많은 뉴클레오티드를 조합한 서열이 클론 내에 있는지 확인하였다. 그 결과 가장 많이 나온 5' 모듈 서열은 'CCTCT'인 것으로 확인되었으며, 24개의 클론들 중 8개의 클론이 이 서열을 가지고 있었다. 이 8개의 클론들의 3' 모듈도 동일한 방법으로 점수를 매겼을 때 그 빈도가 가장 많은 ‘TCCAC' , ' TCACC'를 3' 모듈로 가지고 있었다. 이 중에서 다른 종류의 3' 모듈을 가지고 있는 클론 4개를 선정 하였으며(9, 10, 11번 클론), NS5B 앱타머의 스템 부위에 생긴 돌연변이의 영향을 보기 위해 클론 1개(17번 클론)도 선택하여, 다음 실험을 진행하였다.

선별한 총 4종의 앱타자임의 DNA 서열은 도 7로 나타낸다.

2-5. NS5B 앱타자임의 2차 구조

앱타자임의 2차 구조 분석을 위하여 mfold program(http://www.bioinfo.rpi.edu)을 이용하여 2차 구조를 예측하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다. 선정된 4개의 클론들은 3' 모듈 서열의 차이에도 불구하고 비슷한 2차 구조를 가지고 있었다.

실시예 3: NS5B 의존적인 앱타자임 의 특이성 및 효율 검증

선별된 각각의 NS5B 의존적인 앱타자임의 특이성을 확인하기 위해, 앱타자임을 방사성 동위원소로 표지한 다음, BSA 또는 NS5B 단백질과 반응시켰다.

3-1. [α- ³² P] UTP를 이용한 앱타자임 RNA의 표지

DNA 주형(200 ng)을 이용하여 [α-³²P] UTP(hot):cold UTP의 비율을 1:4로 총 20 ㎕ 부피로 진행하였으며, 0.1 mM ATP, CTP, GTP, 10x 전사 완충액, 10 mM DTT, 40 U RNase 저해제, T7 RNA 중합효소를 넣고, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 여기에, 1.5 U DNaseⅠ(promega)를 넣어 37 ℃에서 30분간 더 처리한 다음 DNA 주형을 완전히 제거하였다.

3-2. NS5B 의존적인 앱타자임의 특이성 검증

선별된 앱타자임의 특이성을 보기 위해, [α-³²P] UTP로 표지된 20 fmole의 앱타자임 RNA를 3.2 pmole의 BSA 단백질과 NS5B 단백질을 첨가하여 반응시켰다.

20 fmole의 앱타자임을 95 ℃에서 1분 30초 동안 변성시킨 후, 37 ℃에서 15 분 동안 구조를 재형성시켰다. 여기에 2x 해머헤드 반응 완충액과 3.2 pmole의 단백질을 넣어 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 앱타자임에 의한 절단이 단백질에 의한 비특이적 분해가 아님을 확인하기 위해, 해머헤드 리보자임 활성의 보고인자인 Mg² ⁺가 무첨가된 완충액 조건에서도 상기와 동일한 실험을 수행하였다. 반응이 끝난 RNA는 RNA 로딩 염료와 혼합하고 95 ℃에서 변성시켜 7M-10% 폴리아트릴아미드 겔에서 180V로 1시간 동안 전기영동하였다. 이를 X-선 필름에 3-24시간 노출하여 현상하였다.

도 9는 본 발명에서 수득한 총 4종의 NS5B 의존적인 앱타자임의 NS5B 특이적인 자가 절단 특이성을 나타낸 것으로, 1은 단백질을 무첨가한 음성 대조군이고, 2는 BSA를 첨가한 것이고, 3은 NS5B 단백질을 첨가한 반응물이다. 도 9에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 NS5B 의존적인 앱타자임 모두 NS5B 단백질 존재시에만 특이적으로 자가-절단되었다.

또한, 이러한 절단이 NS5B 단백질에 의한 비-특이적 분해가 아님을 검증하기 위해 동일한 반응을 Mg² ⁺가 없는 조건에서도 실행해 본 결과, NS5B만 존재할 경우 특이적 절단 부위가 아닌 비-특이적 절단 부위에서 절단되었다(도 10). 이러한 결과는, 앱타자임의 활성화에 Mg² ⁺와 NS5B 단백질이 모두 필수적임을 시사한다.

3-3. 앱타자임 의 효율성 검증

효율성을 검증하기 위해, NS5B 단백질의 농도별, 시간 경과에 따른 앱타자임의 활성을 확인하였다.

20 fmole의 [α-³²P] UTP로 표지된 앱타자임을 다양한 비율의 BSA 또는 NS5B 단백질을 3-2와 동일한 방법으로 반응시켰다. 또한, 20 fmole의 [α-³²P] UTP로 표지된 앱타자임을 160배의 BSA, NS5B 단백질과 각각 반응시킨 후, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120분에 각각 동일한 양을 취하고, 여기에 10 mM EDTA 첨가하여 반응을 종료시켰다. 반응이 끝난 RNA는 RNA 로딩 염료와 혼합하고 95 ℃에서 변성시켜 7M-10% 폴리아트릴아미드 겔에서 180V로 1시간 동안 전기영동하였다. 이를 X-선 필름에 3-24시간 노출하여 현상하였으며, 정량적 분석을 위해 typhoon 8600을 사용하여 이미지를 얻었으며, Imagequant TL v2500 program(GE healthcare)을 사용하였다.

NS5B 의존적인 앱타자임의 NS5B 농도 의존적인 활성 양상 및 시간 경과에 따른 활성 양상 결과는 각각 도 11 및 12에 나타낸다.

도 11에서, 모든 앱타자임은 NS5B의 농도 의존적인 양상으로 시그모이드 곡선 형태로 그 활성이 증가되었음을 알 수 있었고, 절단 효율은 최대 50~60%까지 증가하였다. 그러나, BSA의 경우는 모든 앱타자임들이 단백질 농도에 상관없이 절단은 이루어지지 않았다.

도 12에서, 모든 앱타자임들이 NS5B 단백질과 반응시켰을 때 60분 - 80 분 사이에서 절단 활성이 포화되었으며, 속도 상수는 약 0.13 min^- ¹ 이었다. 그러나 BSA와의 반응시에는 시간에 상관없이 절단은 이루어지지 않았다.

도 1은 HCV IRES의 2차 구조를 나타낸 것이다.

도 2는 HCV IRES RNA에 대한 기질 RNA(레인 I), IRES 195 nt-타겟 리보자임(레인 1, Rib195), 199 nt-타겟 리보자임(레인 2, Rib199), 326 nt-타겟 리보자임(레인 3, Rib326), 및 382 nt-타겟 리보자임(레인 4, Rib382)의 시험관내 트랜스-절단 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 NS5B 의존성 자가-절단 알로스테릭 앱타자임의 구조도이다.

도 4는 NS5B 의존적인 앱타자임의 제조 전략을 개략화한 것이다.

도 5는 본 발명에 따라 수득한 최초 앱타자임 라이브러리, 2차 선별한 pool 및 3차 선별한 pool의 NS5B 의존적인 앱타자임의 특이적 자가-절단을 확인한 결과이다.

도 6은 선별된 총 24개의 클론에서 확인된 NS5B 의존적인 앱타자임 서열이다.

도 7은 NS5B 의존적인 앱타자임 4종(9, 10, 11번, 17번 클론)의 염기 서열을 나타낸 것이다.

도 8은 NS5B 의존적인 앱타자임 4종(9, 10, 11번, 17번 클론)의 이차 구조를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명에서 수득한 총 4종의 NS5B 의존적인 앱타자임의 NS5B 특이적인 자가 절단 특이성을 나타낸 것이다.

도 10은 NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단이 NS5B 단백질에 의한 비-특이적 분해가 아님을 검증하기 위해 동일한 반응을 Mg² ⁺가 없는 조건에서도 실행해 본 결과를 나타낸 것으로, NS5B만 존재할 경우 특이적 절단 부위가 아닌 비-특이적 절단 부위에서 절단되었다.

도 11은 NS5B 의존적인 앱타자임의 NS5B 농도 의존적인 활성 패턴을 나타낸 것이다.

도 12는 NS5B 의존적인 앱타자임의 시간 경과에 따른 활성 패턴을 나타낸 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> HCV NS5B DEPENDENT APTAZYME AND DIAGNOSIS METHOD OF HCV USING SAME <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptazyme <400> 1 ggguuggugu cugaugagcc ucucgcggca auauugugag gggcgcacac accgaaacau 60 uugggaaacc aaacguaaca ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 101 <210> 2 <211> 95 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptazyme <400> 2 ggguuggugu cugaugagcc ucucgcgaua uugugagggg cgcgucaccc gaaacuuugg 60 gaaaccaaac guacaccaaa aaaaaaaaaa aaaaa 95 <210> 3 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptazyme <400> 3 ggguuggugu cugaugagcc ucucgcguca uauugugagg ggcgcgucca ccgaaacauu 60 ugggaaacca acguaacacc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 98 <210> 4 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptazyme <400> 4 ggguuggugu cugaugagcc ucucgcacca uauugugagg ggcgcgucca ccgaaacauu 60 ugggaaacca aacguaacac caaaaaaaaa aaaaaaa 97 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttggtgtctg atgagnnnnn cgcgccatat tgtgaggggc gcg 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acgtttggtt tcccaaacgt ttcgnnnnnc gcgcccctca caat 44 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtaatacga ctcactatag ggttggtgtc tgatgag 37 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttttttttt ttttttggtg ttacgtttgg tttcccaaa 39 <210> 9 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTAMER FOR HCV NS5B <400> 9 gggacauugu gaggggcuca gguggaucgc auggccgugu ccauaaccca gaggucgau 59 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTAMER FOR HCV NS5B <400> 10 gggacattgt gaggggctca ggtggatcgc atggccgtgt ccataaccca gaggtcgat 59 <210> 11 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme <400> 11 ggguuggugu cugaugaggc cuuuaggccg aaacauuugg gaaaccaaac guaacaccaa 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme <400> 12 gggttggtgt ctgatgaggc ctttaggccg aaacatttgg gaaaccaaac gtaacaccaa 60 60

Claims

서열번호 1 내지 4로 기재된 서열 중 1종 이상의 RNA 서열을 포함하는, HCV NS5B 의존적인 앱타자임.
삭제
삭제
HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 제조 방법으로서,

(a) 교류 모듈에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트(5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCC ATATTGTGAGGGGCGCG-3' 및 3' 프라이머: 5'-ACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNN NNNCGCGCCCCTCACAAT-3', N은 G, A, T, C가 동수로 포함됨) 및 taq polymerase로 PCR을 수행하는 단계;

(b) 단계 (a)의 PCR 산물에, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트(5'-GGTAATACG ACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTG GTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3')와 taq polymerase을 첨가하여, PCR을 수행하는 단계;

(c) 단계 (b)의 PCR 산물을 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 RNA로 전사하여, HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 제작하는 단계;

(d) 상기 HCV NS5B 의존적인 앱타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 이외의 단백질 및 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 이외의 단백질 존재하에서는 특이적인 자가-절단을 보이지 않지만 NS5B 단백질 존재하에서는 특이적 자가-절단을 보이는 RNA 풀을 수득하는 단계;

(e) 수득한 앱타자임 RNA 풀 각각을 RT-PCR하여 DNA를 수득하고, 각 염기서열을 확인하는 단계; 및

(f) 염기서열을 동정한 각 앱타자임 RNA를 표지한 다음, NS5B 단백질 이외의 단백질 및 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질과의 존재하에서만 특이적 자가-절단을 보이는 앱타자임을 선별하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 HCV NS5B 의존적인 앱타자임은 서열번호 1 내지 4로 기재된 서열 중 1종 이상의 서열을 포함하는 RNA 서열인 것을 특징으로 하는 HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 제조 방법.
제1항에 따른 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 Mg²⁺를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
Mg²⁺의 존재하에, 제1항에 따른 HCV NS5B 의존적인 앱타자임을 포함하는 HCV 진단용 조성물과 HCV 감염 의심 샘플을 접촉시키는 단계; 및

HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응을 확인하는 단계를 포함하며,

HCV NS5B 의존적인 앱타자임의 자가-절단 반응이 확인되면, 상기 샘플을 HCV 양성으로 진단하는 것을 특징으로 하는, HCV 진단을 위한 정보를 제공하는 HCV 검출방법.