KR100950441B1 - A method for preparing chlorophyll a and fotoditazin from spirulina - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a 및 포토디타진을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스피루리나로부터 저온 냉동침전을 이용하여 불순물을 제거하는 방법과 글루카민 처리를 통해 불순물을 제거하는 방법을 이용함으로써 효율적으로 클로로필 a를 추출하고, 상기 클로로필 a에 산을 처리하여 페오피틴 a를 형성시키고, 염기를 처리하여 염 클로린을 형성시킨 후 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음 클로린 1당량(eq)에 2당량(eq)의 글루카민을 첨가하여 최종 산물인 포토디타진을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing chlorophyll a and photoditazine from spirulina, and more particularly, by using a method of removing impurities from spirulina using low temperature cryoprecipitation and a method of removing impurities through glucamine treatment. Efficiently extract chlorophyll-a, treat chlorophyll-a with acid to form pheophytin-a, treat base with chlorine to form salt chlorine, and treat acetonitrile and acid to separate acid chlorine, and then add 1 equivalent of chlorine. The present invention relates to a method for preparing the final product photodiazine by adding 2 equivalents (eq) of glucamine to (eq).
스피루리나는 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수와 같은 열대지역 알칼리성 호수의 수면에서 왕성하게 자생하는 극히 작은 조류(藻類 algae)에 속하는 미생물이다. 그 세포 속에는 다량의 클로로필과 피코시아닌이 들어있어서 태양광선을 흡수하여 탄소동화작용을 활발하게 수행하여 자라고 있다. 이러한 색소들이 들어있어서 청남색을 띠고 있으므로 옛날부터 남조류(blue-green algae)로 분류했었다. Spirulina is a microorganism belonging to a very small algae that grows actively in the surface of tropical alkaline lakes such as Chad Lake in Africa and Texcoco Lake in Mexico. The cells contain a large amount of chlorophyll and phycocyanin, which are absorbed by the sun's rays, and are actively growing by carbon assimilation. Since these pigments have a blue-green color, they have been classified as blue-green algae since ancient times.
스피루리나(Spirulina)라는 이름은 그 모양이 나선형(Spiral)이어서 붙여졌으며, DNA가 2중 나선형인 점을 고려할 때 그 형태가 원시적인 것이다.The name Spirulina was given because it was shaped like a spiral, and the form is primitive given the fact that DNA is a double helix.
전자현미경의 발달로 미생물의 세포구조가 자세히 밝혀지면서 녹조류나 갈조류의 구조는 고등 식물의 구조와 다른 점을 발견하였다. 즉 녹조류의 구조는 고등식물의 구조와 동일하게 진핵 세포(eukaryote)구조를 가지고 있는 반면에, 남조류는 세균의 구조와 비슷한 원핵세포(prokaryote)구조를 가진 것이 밝혀짐에 따라, 1960년대 초부터 일부 미생물학자들이 남조류는 조류보다는 세균에 가까우므로, 세균류에 포함시켜야 한다는 주장이 나오게 되었다. 현재는 이 주장을 받아들여 청 남세 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다. 그러나 산업계에서는 옛날 관행대로 미세조류(微細藻類 micro-algae)라 부르고 있다. With the development of electron microscopy, the cell structure of microorganisms has been elucidated, and the structure of green algae and brown algae has been found to be different from those of higher plants. In other words, green algae have the same eukaryote structure as those of higher plants, while cyanobacteria have a prokaryote structure similar to that of bacteria. Microbiologists have argued that cyanobacteria are closer to bacteria than algae, so they should be included in bacteria. It now accepts this claim and classifies it as blue-green bacteria. However, the industry has called the microalgae the old practice.
클로로필(엽록소, 葉綠素, chlorophyll)은 광합성을 하는 생물이 가지는 동화색소의 일종이다. 4개의 피롤이 메틴기 －CH＝에 의해 결합된 고리모양테트라피롤에 시클로펜탄고리가 연결된 포르빈의 유도체인데, 테트라피톨고리의 중앙에 Mg원자가 1개 배위하고 피롤고리 Ⅳ의 프로피오닐기에 피롤 또는 파르네솔이 에스테르결합한 것이다. Chlorophyll (chlorophyll, 葉綠素, chlorophyll) is a kind of assimilation pigments of photosynthetic organisms. Four pyrroles are derivatives of forvinyl in which a cyclopentane ring is linked to a cyclic tetrapyrrole bound by a methine group —CH═, with one Mg atom coordinated in the center of the tetrapytol ring and the pyrrole group IV pyrrole or Farnesol is an ester bond.
클로로필은 헤모글로빈의 분자구조와 거의 일치하는 것으로 확인되어,푸른혈액이라고도 불리며, 실제로 동물의 혈액과 놀랍도록 비슷한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 클로로필은 항암, 항염작용을 하며, 손상된 세포를 재생시키고, 해독작용, 항콜레스테롤 작용에 이르기까지 매우 다양한 작용을 한다.Chlorophyll has been found to closely match the molecular structure of hemoglobin, also called blue blood, and is known to perform surprisingly similar functions to animal blood. In particular, chlorophyll is anti-cancer, anti-inflammatory action, regenerate damaged cells, detoxification, anti-cholesterol action and a wide variety of functions.
종래 클로로필 및 클로린을 제조하는 방법에 관한 특허문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-0841959호에 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클로렐라에 에탄올 및 선택적으로 다이옥산을 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법과, 상기 클로로필 a에 산을 처리하여 클로린을 제조하는 방법이 개시되어 있다.Patents related to the conventional method for producing chlorophyll and chlorine include a method of preparing chlorophyll a comprising treating ethanol and optionally dioxane in an intact chlorella that is not crushed in Korean Patent No. 10-0841959. And a method of producing chlorine by treating acid with chlorophyll-a.
그러나, 상기 등록특허에 기재된 방법은 클로렐라에서 클로로필을 추출하고 이로부터 클로린을 제조하는 방법으로, 클로로필 a 뿐만 아니라 클로로필 b도 추출되는 큰 단점이 있으며, 이와 같이 클로로필 a와 클로로필 b가 혼합되어 있는 추출액 및 침전물 형태로 반응이 진행되어 최종 물질인 광민감제 클로린의 정제도는 클로로필 a와 클로로필 b에서 파생된 물질의 정제도가 되어 결과적으로 실질적인 정제도가 낮은 단점이 있다.However, the method described in the registered patent is a method of extracting chlorophyll from chlorella and preparing chlorine therefrom, which has a big disadvantage in that not only chlorophyll a but also chlorophyll b is extracted. Thus, the chlorophyll a and chlorophyll b are mixed in the extract. And the reaction proceeds in the form of precipitates, the final degree of purification of the photosensitizer chlorine is a purification degree of the material derived from chlorophyll a and chlorophyll b has the disadvantage that the actual purification is low.
또한, live chlorella를 이용할 경우 여과 및 추출이 매우 힘들다는 단점이 있다. 특히 live chlorella에 유기용매(에탄올)을 넣고 여과할 경우 여과가 거의 되지 않으며, 따라서 원심분리를 이용한 방법을 사용해야한다. 이는 대량생산을 위한 여과공정에 많은 시간이 들게 된다. In addition, the use of live chlorella has the disadvantage that it is very difficult to filter and extract. Particularly, when the organic solvent (ethanol) is added to the live chlorella and filtered, the filter is hardly filtered. Therefore, the centrifugation method should be used. This takes a lot of time in the filtration process for mass production.
아울러, 보조용매로서 사용되는 Dioxane 성분의 경우 인체에 유해한것으로 알려져 있다. Dioxane은 발암 물질로 업계에서는 거의 사용하지 않는 시약이다. In addition, the Dioxane component used as a co-solvent is known to be harmful to the human body. Dioxane is a carcinogen and rarely used in the industry.
상기와 같은 종래 방법의 단점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 인택트 클로렐라 대신에 스피루리나로부터 물과 에탄올을 이용한 침전방법, 또는 물과 아세톤을 이용한 침전방법을 통해 클로로필 a를 추출하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 산과 염기를 처리하여 광민감제 클로린을 형성시키고 아세토니트릴과 산을 처리 하여 산 클로린을 분리한 다음 염기를 처리하여 염 클로린을 제조하는 방법에 관하여 특허출원하여 대한민국특허 제896327호로 등록받은 바 있다.In order to overcome the disadvantages of the conventional method as described above, the present inventors extract chlorophyll a from spirulina using water and ethanol, or water and acetone, instead of intact chlorella, and the chlorophyll obtained above. acid and base are treated with a to form a photosensitizer chlorine, and acetonitrile and acid are treated to separate acid chlorine, and then the base is treated with a salt. Patent application for a method for producing chlorine has been registered as Korean Patent No. 896327.
이에 본 발명자들은 상기 방법에 비해 보다 단순하고 비용대비 높은 수율과 높은 정제도로 클로로필 a를 추출할 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과 저온 냉동침전과 글루카민 처리로 스피루리나를 통해서도 효율적으로 클로로필 a를 추출할 수 있음을 확인하고, 더 나아가 상기 클로로필 a에 산을 처리하여 페오피틴 a를 형성시키고, 염기를 처리하여 염 클로린을 형성시킨 후 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음 클로린 1당량에 2당량의 글루카민을 첨가하여 포토디타진을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made efforts to find a method for extracting chlorophyll-a with a simpler and more cost-effective yield and higher purification compared to the above method. After confirming that the chlorophyll-a was treated with acid to form pheophytin a, the base was treated with salt to form chlorine, and then treated with acetonitrile and acid to separate acid chlorine, followed by 1 equivalent of chlorine. The present invention was completed by confirming that photodiazine could be prepared by adding 2 equivalents of glucamine to.
따라서 본 발명의 목적은 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for efficiently extracting chlorophyll-a from spirulina.
본 발명의 다른 목적은 상기 클로로필 a를 이용하여 광민감제인 포토디타진을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for producing a photosensitive digitazine photosensitive agent using the chlorophyll a.
하나의 양태로서, 본 발명은 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a method for efficiently extracting chlorophyll a from spirulina.
본 발명은 (1) 저온 냉동침전을 이용한 침전방법으로 불순물을 제거하는 단계와 (2) 글루카민을 통해 불순물을 제거하는 단계를 통해 스피루리나로부터 효율적으로 클로로필 a를 추출하는 방법이다.The present invention is a method of efficiently extracting chlorophyll a from spirulina by (1) removing impurities by precipitation method using low temperature freezing precipitation and (2) removing impurities through glucamine.
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 클로로필 a를 추출하는 방법을 제공할 수 있다:In a preferred embodiment, the present invention may provide a method for extracting chlorophyll a from spirulina comprising the following steps:
스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; Extracting chlorophyll-a by adding 90-100% ethanol to spirulina;
상기 추출액을 0℃ 이하의 저온에서 3시간 보관하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 침전시켜 여과함으로써 제거하는 단계; 및 Storing the extract at a low temperature of 0 ° C. or lower for 3 hours to precipitate and remove other components other than chlorophyll a by filtration; And
상기 여과액의 용매를 제거한 후 헥산에 녹인 다음 글루카민을 첨가하여 반응시키고 상등액을 모아서 용매를 제거함으로써 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계. Removing the solvent of the filtrate and dissolving it in hexane and then reacting with addition of glucamine and removing the solvent by collecting the supernatant to remove the solvent other than chlorophyll-a.
본 발명의 클로로필 a를 추출하는 방법에서, 글루카민으로는 D-글루카민 또는 N-메틸-D-글루카민을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.In the method for extracting chlorophyll-a of the present invention, glucamine may be used as, but not limited to, D-glucamine or N-methyl-D-glucamine.
본 발명의 클로로필 a를 추출하는 방법에서, 상기 저온 보관시 온도 범위는 0℃ 이하, 바람직하기로는 -10℃ 이하, 더욱 바람직하기로는 -10℃ 내지 -40℃일 수 있으며, 가장 바람직하기로는 -20℃이다.In the method for extracting chlorophyll a of the present invention, the low temperature storage temperature range is 0 ° C or less, preferably -10 ° C or less, more preferably -10 ° C to -40 ° C, and most preferably- 20 ° C.
본 발명의 클로로필 a를 추출하는 방법에서, 상기 저온 보관시 보관 시간은 1시간 이상, 바람직하기로는 1시간 내지 24시간 , 더욱 바람직하기로는 1시간 내지 6시간 일 수 있으며, 가장 바람직하기로는 3시간이다.In the method for extracting chlorophyll-a of the present invention, the storage time at low temperature may be 1 hour or more, preferably 1 hour to 24 hours, more preferably 1 hour to 6 hours, and most preferably 3 hours. to be.
클로로필 a - 추출과정Chlorophyll a-Extraction Process
클로로필 a - 추출과정은 스피루리나를 에탄올 용매로 추출한 다음 상기 클로로필 a 추출액을 0℃ 이하의 냉동고에 3시간 이상 보관함으로써, 저온 냉동침전 방법을 이용하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 침전시켜 여과함으로써 1차 제거하고, 상기 여과액에 글루카민을 처리하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 2차 제거하여 클로로필 a를 수득하는 과정으로 이루어져 있다.The chlorophyll-a extraction process is performed by first extracting spirulina with an ethanol solvent, and then storing the chlorophyll-a extract in a freezer at 0 ° C. or lower for at least 3 hours. Removing and treating glucamine with the filtrate to remove second components other than chlorophyll-a to obtain chlorophyll-a.
본 발명의 클로로필 a 추출과정은 상기한 바와 같이 저온 냉동침전을 통한 클로로필 a 이외의 다른 성분 즉, 불순물의 1차 제거과정과 글루카민 처리를 통한 불순물의 2차 제거과정으로 이루어짐으로써 2단계의 간단한 제거과정으로 클로로필 a의 정제도가 93.41%에 이르도록 효율적으로 클로로필 a를 추출할 수 있는 방법을 제공하게 된다.The chlorophyll-a extraction process of the present invention is a simple two-step process by consisting of the first removal of impurities other than chlorophyll-a through low temperature cryoprecipitation, and the second removal of impurities through glucamine treatment. As a result of the removal, chlorophyll-a can be efficiently extracted to reach 93.41% of chlorophyll-a.
본 발명에서, 클로로필 a를 수득하는데 이용되는 스피루리나는 파쇄된 스피루리나이다. 스피루리나를 파쇄된 형태로 사용하지 않을 경우 추출 및 여과 효율이 떨어지는 단점이 있다.In the present invention, spirulina used to obtain chlorophyll a is crushed spirulina. If spirulina is not used in a crushed form, the extraction and filtration efficiency is lowered.
본 발명의 클로로필 a 제조 방법에 있어 가장 큰 특징은, 상기 클로로필 a 추출액을 -20℃ 이하의 저온에서 3시간 이상 보관함으로써 저온 냉동침전 방법을 이용하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 침전시켜 여과함으로써 1차 제거하고, 상기 여과액에 글루카민을 처리하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 2차 제거함으로써 보다 단순한 공정과 높은 수율 및 정제도로 클로로필 a를 수득할 수 있다는 점이다.The biggest feature of the chlorophyll a production method of the present invention, by preserving the chlorophyll a extract at a low temperature of less than -20
본 발명에서, 클로로필 a의 추출에 에탄올을 사용한 이유는 저온 냉동침전으로 불순물을 침전시켜 제거하는 데 우수한 효율을 나타내기 때문이며 제조되는 클로로필 a가 식품으로 이용될 것을 예상하면 식품가공에 사용될 수 있는 유기용매인 에탄올을 이용하는 것이 바람직하기 때문이다. In the present invention, the reason for using ethanol for the extraction of chlorophyll-a is because it exhibits excellent efficiency in removing and precipitating impurities by low temperature freezing settling. Organic chlorophyll-a can be used in food processing if it is expected to be used as food. It is because it is preferable to use ethanol which is a solvent.
클로로필 a 추출과정에서 이용되는 에탄올은 90~100%의 농도를 갖는다. 50% 미만의 에탄올을 이용하면 스피루리나에서 클로로필 a가 추출되지 않으며 80% 미만의 에탄올을 이용하면 클로로필 a 추출 효율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 에탄올을 이용한 추출단계는 1회~3회, 가장 바람직하기로는 2회 실시한다. Ethanol used in the chlorophyll a extraction process has a concentration of 90-100%. If ethanol of less than 50% chlorophyll a is not extracted from spirulina, using less than 80% chlorophyll a extraction efficiency is greatly reduced. Extraction step using ethanol is carried out once to three times, most preferably twice.
본 발명에서, 저온 냉동침전시 온도 범위는 0℃ 이하이며, 바람직하기로는 -10℃ 이하, 더욱 바람직하기로는 -10℃ 내지 -40℃일 수 있으며, 가장 바람직하기 로는 -20℃이다. 상기 온도 범위로 설정하는 이유는 0℃보다 온도가 높으면 클로로필 a 이외의 다른 성분, 즉 불순물의 침전 효율이 떨어지기 때문이며, -40℃보다 온도가 낮게 설정되더라도 불순물의 침전 효율이 증가하지 않기 때문에 불필요할 뿐만 아니라 극저온으로 설정하는데 따른 에너지 소모가 더 크기 때문이기도 하다.In the present invention, the low temperature freezing precipitation temperature range is 0 ℃ or less, preferably -10 ℃ or less, more preferably -10 ℃ to -40 ℃, most preferably -20 ℃. The reason for setting the above temperature range is that if the temperature is higher than 0 ° C., the precipitation efficiency of other components other than chlorophyll a, that is, impurity is lowered, and even if the temperature is lower than −40 ° C., the precipitation efficiency of the impurities does not increase, which is unnecessary. Not only that, but also because the energy consumption is very high.
본 발명에서, 저온 냉동침전시 보관 시간은 3시간, 바람직하기로는 1시간 내지 24시간, 더욱 바람직하기로는 1시간 내지 6시간일 수 있으며, 가장 바람직하기로는 3시간이다. 상기 보관 시간으로 설정하는 이유는 1시간 미만이면 클로로필 a 이외의 다른 성분, 즉 불순물의 침전율이 떨어지기 때문이며, 24시간보다 길게 보관하더라도 불순물의 침전율이 크게 증가하지 않기 때문에 불필요할 뿐만 아니라, 클로로필a의 안정성에 문제가 발생할 수 있으며, 공정 시간도 더 길어지기 때문이다.In the present invention, the low-temperature cryoprecipitation storage time may be 3 hours, preferably 1 hour to 24 hours, more preferably 1 hour to 6 hours, most preferably 3 hours. The storage time is set to less than 1 hour because the precipitation rate of other components other than chlorophyll a, i.e., impurities, is lowered, and it is not necessary because the precipitation rate of impurities is not greatly increased even if stored for longer than 24 hours. This can cause problems with the stability of the process, and also increases the process time.
본 발명의 클로로필 a를 추출하는 방법에서, 글루카민으로는 D-글루카민 또는 N-메틸-D-글루카민 등을 사용할 수 있으며, 이들은 상업적으로 용이하게 입수 가능한 것을 구입하여 사용하거나 화학적 합성방법으로 제조하여 사용할 수도 있다.In the method for extracting chlorophyll-a of the present invention, glucamine may be used as D-glucamine or N-methyl-D-glucamine, and these may be purchased and used commercially or chemically. It can also manufacture and use.
본 발명의 실시예에서는, 스피루리나를 먼저 95% 에탄올에 첨가시키고 교반하여 클로로필 a를 추출하고 여과한 클로로필 a 추출액이 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 1일 동안 -20℃의 냉동고에 보관하여 저온 냉동침전 과정으로 침전되는 불순물을 여과하고 클로로필 a 추출액을 수득한다. 저온 냉동 침전되는 과정에서 클로로필 a 이외의 불순물은 침전이 되고, 여과를 통해 제거가 된다. 이후 여 과된 클로로필 a 추출액을 농축기로 에탄올 용매를 완전히 제거한 후 클로로필 a를 헥산(n-Hexane)에 녹인 후 여과하여 클로로필 a 용액에 1M 농도의 글루카민 수용액을 전체 볼륨의 1/3 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 준다. 상등액(헥산 용매층)을 모아서 농축기로 용매를 완전히 제거 한 후 클로로필 a를 수득한다.In an embodiment of the present invention, spirulina is first added to 95% ethanol and stirred to extract chlorophyll-a, and the filtered chlorophyll-a extract is well wrapped in foil so as not to be exposed to light, and then stored in a freezer at -20 ° C for 1 day. The precipitate precipitated by low temperature freeze precipitation and chlorophyll a extract is obtained. In the cold freezing process, impurities other than chlorophyll-a are precipitated and removed by filtration. Thereafter, the filtered chlorophyll-a extract was completely removed from the ethanol solvent with a concentrator, and then chlorophyll-a was dissolved in hexane (n-Hexane) and filtered. After addition Stir for 2 hours. Collect the supernatant (hexane solvent layer) to completely remove the solvent with a concentrator to obtain chlorophyll a.
본 발명의 클로로필 a 추출과정에서 클로로필 a에 대한 수율은 4.81%이다. 수율은 사용된 스피루리나 중량 1 g에 대한 수득한 클로로필 a의 중량비의 백분율로 계산된다. 아울러, 본 발명의 클로로필 a 추출과정의 클로로필 a 정제도는 93.41%이다.The yield for chlorophyll a in the chlorophyll a extraction process of the present invention is 4.81%. The yield is calculated as a percentage of the weight ratio of chlorophyll a obtained to 1 g of spirulina weight used. In addition, the chlorophyll a purification degree of the chlorophyll a extraction process of the present invention is 93.41%.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스피루리나로부터 추출된 클로로필 a를 이용하여 광민감제인 포토디타진을 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for preparing a photodithiazine, a photosensitizer, using chlorophyll a extracted from spirulina.
본 발명에서, 광민감제 포토디타진의 제조방법은 상기 클로로필 a 제조 방법에 의해 수득한 클로로필 a를 이용하여 포토디타진을 합성 또는 제조하는 과정이다. In the present invention, the method for producing a photosensitive sensitizer photodiazine is a process of synthesizing or preparing photodiazine using the chlorophyll a obtained by the chlorophyll a production method.
본 발명에서, 스피루리나에서 만들어지는 최종 물질은 클로로필 a에서만 반응이 진행되어 최종 물질의 정제도는 클로로필 a에서의 파생된 최종 물질인 광민감제 포토디타진의 정제도이다.In the present invention, the final material made in spirulina is a reaction proceeding only in chlorophyll a so that the degree of purification of the final material is a degree of purification of the photosensitive agent, a photosensitive agent, the final material derived from chlorophyll a.
바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 스피루리나로부터 포토디타진을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:In a preferred embodiment, the present invention may provide a method for preparing photodiazine from spirulina comprising the following steps:
스피루리나에 90-100% 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 추출하는 단계; Extracting chlorophyll-a by adding 90-100% ethanol to spirulina;
상기 추출액을 0℃ 이하의 저온에서 3시간 이상 보관하여 클로로필 a 이외의 다른 성분을 침전시켜 여과함으로써 제거하는 단계; Storing the extract at a low temperature of 0 ° C. or more for 3 hours or more to precipitate and remove other components other than chlorophyll a by filtration;
상기 여과액의 용매를 제거한 후 헥산에 녹인 다음 글루카민을 첨가하여 반응시키고 상등액을 모아서 용매를 제거함으로써 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계; Removing the solvent of the filtrate, dissolving it in hexane, reacting with addition of glucamine, and collecting the supernatant to remove the solvent to remove other components than chlorophyll a;
상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴 a(pheophytin) a를 수득하는 단계;Treating chlorophyll-a with the acid to remove magnesium ions from chlorophyll-a to obtain pheophytin a;
페오피틴 a에 염기를 처리하여 염 클로린을 형성시키는 단계; Treating base with pheophytin a to form salt chlorine;
염 클로린에 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리하는 단계; 및Treating the salt chlorine with acetonitrile and an acid to separate the acid chlorine; And
산 클로린 1 당량에 2 당량의 글루카민을 첨가하여 반응시켜 포토디타진을 수득하는 단계.Reacting by adding 2 equivalents of glucamine to 1 equivalent of acid chlorine to obtain photoditazine.
본 발명의 포토디타진 제조 방법에서, 상기 클로로필 a에 처리하는 산은 염산이나 황산 등의 무기산을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In the photodiazine production method of the present invention, the acid treated with chlorophyll-a may be an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, but is not limited thereto.
본 발명의 포토디타진 제조 방법에서, 상기 페오피틴 a에 처리하는 염기로는 NaOH 또는 KOH가 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In the photodiazine production method of the present invention, NaOH or KOH may be used as the base to be treated in the pheophytin a, but is not limited thereto.
본 발명의 포토디타진 제조 방법에서, 상기 산 클로린에 첨가하는 글루카민으로는 N-메틸-D-글루카민을 사용한다.In the photodiazine production method of the present invention, N-methyl-D-glucamine is used as the glucamine added to the acid chlorine.
페오피틴 a - 합성과정Pheophytin a-synthesis process
페오피틴 a - 합성과정은 상기 클로로필-추출과정에서 얻은 클로로필 a에 산 을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴 (pheophytin) a를 수득하는 과정으로 수행된다.Pheophytin a-Synthesis process is carried out in the process of obtaining phephyphytin a by treating the chlorophyll a obtained in the chlorophyll-extraction process to remove magnesium ions from the chlorophyll a.
클로로필 a를 에탄올로 녹인 후 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 중간물체인 페오피틴 a(pheophytin) a가 생성된다. 클로로필 a 및 페오피틴 a의 화학식은 하기 화학식 1 및 2와 같다.Chlorophyll a is dissolved in ethanol and the acid is treated to remove magnesium ions from chlorophyll a to produce the intermediate pheophytin a (pheophytin) a. The chemical formulas of chlorophyll a and pheophytin a are as follows:
클로로필 a 추출물에 산을 처리하여 클로로필 a 추출액의 pH를 1-2가 되도록 한다. 이 경우, pH 2 이상이면 마그네슘 이온 제거율이 크게 감소되는 문제점이 있 다. 이 단계에서 이용되는 산으로는 HCl 또는 H2SO4 이 사용되었다. Treat the chlorophyll-a extract with acid to bring the pH of the chlorophyll-a extract to 1-2. In this case, if the pH 2 or more, there is a problem that the magnesium ion removal rate is greatly reduced. As the acid used in this step, HCl or H 2 SO 4 was used.
본 발명의 실시예에서는, 상기 클로로필-추출과정에서 얻은 클로로필 a를 에탄올에 녹인 후 5N HCl 또는 5N H2SO4을 처리하여 용액의 pH를 1-2이 되도록 조정하고 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거하는 반응을 3시간 동안 교반 하에 수행한다. 교반 후 NaOH를 이용하여 pH를 6~7(중화)로 맞춘 후 검은색의 페오피틴 a 용액을 -20℃ 냉동실에 6시간 보관하여 침전이 형성되게 하고 페오피틴 a 용액을 여과한 후 페오피틴 a 침전물을 수득한다. In an embodiment of the present invention, the chlorophyll-a obtained in the chlorophyll-extraction process is dissolved in ethanol and treated with 5N HCl or 5N H 2 SO 4 to adjust the pH of the solution to 1-2 and remove magnesium ions from chlorophyll-a. The reaction is carried out under stirring for 3 hours. After stirring, the pH was adjusted to 6-7 (neutralized) using NaOH, and the black phephytin a solution was stored at -20 ° C. in the freezer for 6 hours to form a precipitate. Obtain opitine a precipitate.
본 발명에서, 페오피틴 a에 대한 수율은 2.63%이다. 수율은 사용된 클로로필 a 중량 1 g에 대한 수득한 페오피틴 a의 중량비의 백분율로 계산된다. 페오피틴 a 정제도는 88.396%이다.In the present invention, the yield for pheophytin a is 2.63%. The yield is calculated as a percentage of the weight ratio of obtained pheophytin a to 1 g of chlorophyll a weight used. Pheophytin a purity is 88.396%.
광민감제 포토디타진 - 합성과정Photosensitive Titagen-Synthesis Process
광민감제 포토디타진 - 합성과정은 페오피틴 a로부터 광민감제 포토디타진을 제조함에 있어서 아세톤 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 한다. Photosensitizer Photoditagen-The synthesis process is characterized in that the preparation of the photosensitizer photodiazine from pheophytin a is carried out in an acetone solvent.
본 과정은 최종 물질인 광민감제 포토디타진의 형성 단계로 먼저, 페오피틴 a 침전물을 아세톤으로 용해한 후 페오피틴 a 용액에 염기성 시약을 처리하여 pH 13-14가 되도록 한다. 이 단계에서 이용되는 염기로는 다양한 염기를 이용할 수 있으며 여기에서는 NaOH와 KOH가 사용되었다. 광민감제 포토디타진을 수득하는 단계는 아세톤 용매 하에서 실시된다. 아세톤 용매 하에 NaOH가 첨가되었을 경우, Na+ 염 클로린이 형성되며 KOH가 첨가되었을 경우에는 K+ 염 클로린이 형성된다. This process is the final step of the formation of the photosensitive sensitizer photodiazine, first dissolving the pheophitin a precipitate with acetone, and then treated with a basic reagent in a solution of pheophitin a to pH 13-14. As the base used in this step, various bases can be used, in which NaOH and KOH are used. Obtaining the photosensitizer photodithiazine is carried out under acetone solvent. Na + salt chlorine is formed when NaOH is added under acetone solvent and K + salt chlorine is formed when KOH is added.
이후 1% TFA가 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 포름산이 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 처리하여 산 클로린 형성을 위해 교반해 준 뒤, 여과하여 산 클로린을 분리한 후 농축기로 용매를 완전히 제거한다. 농축 완료하여 용매가 완전히 제거된 산 클로린에 증류수를 적당량 채워준 후 클로린 1당량(eq) 당 2당량(eq)의 글루카민의 수용액을 넣어주고 3시간 동안 교반시켜 준다. 물에 녹지 않는 산 클로린은 2당량의 글루카민에 의해 증류수로 녹아 들어간다. 여과한 후 동결건조시켜 증류수를 완전히 제거하여 최종 산물인 포토디타진을 수득한다.Thereafter, acetonitrile with 1% TFA or acetonitrile with 1% formic acid or acetonitrile with 1% acetic acid was treated, stirred to form acid chlorine, and filtered to separate acid chlorine, followed by a concentrator. Remove the solvent completely. After completion of concentration, an appropriate amount of distilled water was filled in the acid chlorine from which the solvent was completely removed, followed by adding 2 equivalents (eq) of aqueous solution of glucamine per 1 equivalent (eq) of chlorine and stirring for 3 hours. Acid chlorine, insoluble in water, is dissolved in distilled water by two equivalents of glucamine. After filtration and lyophilization, distilled water was completely removed to obtain the final product, photodiazine.
본 발명의 포토디타진 제조 방법에서, 상기 산 클로린에 첨가하는 글루카민으로는 N-메틸-D-글루카민을 사용할 수 있으며, 이는 상업적으로 용이하게 입수 가능한 것을 구입하여 사용하거나 화학적 합성방법으로 제조하여 사용할 수도 있다.In the photodiazine production method of the present invention, as the glucamine added to the acid chlorine, N-methyl-D-glucamine may be used, which may be purchased and used commercially or prepared by chemical synthesis. It can also be used.
본 발명에서, 광민감제 포토디타진 - 합성과정의 Na+ 염 클로린 또는 K+ 염 클로린에 대한 정제도는 98.04%, 1% TFA가 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 포름산이 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 처리하여 산 클로린을 분리한 후 글루카민을 처리하여 수득한 포토디타진에 대한 정제도는 99.55%이다. In the present invention, the degree of purification for the photosensitizer photodiazine-synthesis Na + salt chlorine or K + salt chlorine is 98.04%, acetonitrile with 1% TFA or acetonitrile with 1% formic acid or 1% acetic acid The purified degree for the photoditazine obtained by treating the added acetonitrile to separate the acid chlorine and then treating the glucamine is 99.55%.
본 발명에서, 포토디타진에 대한 수율은 스피루리나를 출발물질로 하는 경우 0.63%이다. 수율은 사용된 스피루리나의 건조 중량 1 g에 대한 수득한 포토디타진 의 중량비의 백분율로 계산된다.In the present invention, the yield for photoditazine is 0.63% with spirulina as starting material. The yield is calculated as a percentage of the weight ratio of the obtained photoditazine to 1 g dry weight of spirulina used.
포토디타진의 화학식은 하기 화학식 3과 같다.Chemical formula of the photodiazine is the same as the formula (3).
본 발명의 스피루리나를 이용한 클로로필 a의 추출방법은 공정과정이 단순하고 빠른 장점이 있다. 이에 따라 비용 대비 수율 및 정제도는 기존 방법에 비해 훨씬 우수하다. 또한 스피루리나에서 쉬운 방법으로 불순물을 제거함으로 순수 클로로필 a의 정제도가 매우 높다.Extraction method of chlorophyll a using spirulina of the present invention has the advantage of a simple and fast process. As a result, cost and yield are much better than conventional methods. In addition, the purity of pure chlorophyll-a is very high by removing impurities in spirulina by an easy method.
합성 및 제조되는 포토디타진의 정제도는 99.55%로 매우 쉬운 방법으로 의약품으로 사용 가능한 정제도를 나타낸다.The degree of purification of the synthesized and manufactured photoditazine is 99.55%, which indicates the degree of purification that can be used as a medicine in a very easy way.
즉, 스피루리나에서 저온 냉동침전 방법으로 불순물을 침전시켜 제거하고, 글루카민을 이용하여 불순물을 제거 시킨 후 클로로필 a를 수득하게 되고, 최종물질 또한 클로로필 a에서 형성되어진 순수한 광민감제 포토디타진이다. 1% TFA가 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 포름산이 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 처리하여 산 클로린 형성을 위해 교반해 준 뒤, 여과하여 산 클로린을 분리한 후 농축기로 용매를 농축한다. 농축 후 클로린 1당량(eq)에 대해 2당량(eq)의 글루카민을 첨가한 후 동결건조 완료 후 포토디타진을 수득하는 방법으로 포토디타진의 정제도는 99.55%로 매우 쉬운 방법으로 의약품으로 사용 가능한 정제도를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 스피루리나를 이용한 광민감제 포토디타진의 합성 및 제조 방법은 기존의 방법보다 간결해진 공정과정과 비용대비 높은 수율과 높은 정제도로 대량생산 공정에 적합한 방식이다.In other words, precipitates are removed in spirulina by low temperature cryoprecipitation, and impurities are removed using glucamine to obtain chlorophyll-a, and the final material is pure photo-sensitizer photodizazine formed from chlorophyll-a. Acetonitrile with 1% TFA or acetonitrile with 1% formic acid or acetonitrile with 1% acetic acid was treated to stir to form acid chlorine, and then filtered to separate acid chlorine, followed by solvent Concentrate. After distillation, 2 equivalents (eq) of glucamine was added to 1 equivalent (eq) of chlorine, and lyophilization was completed. Possible purification degrees are shown. Therefore, the synthesis and production method of the photosensitizer photodithiazine using the spirulina of the present invention is a method that is more suitable for mass production process with a simpler process and higher yield and high refining cost compared to the existing method.
본 발명은 스피루리나로부터 저온 냉동침전 방법으로 불순물을 침전시켜 제거하는 방법, 그리고 글루카민을 이용해 불순물을 제거하는 방법을 통해 효율적으로 클로로필 a를 수득하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 페오피틴 a를 형성시키고, 염기를 처리하여 염 클로린을 형성시키고 아세토니트릴과 산을 처리하여 산 클로린을 분리한 다음, 글루카민을 처리하여 포토디타진을 수득함으로써, 클로로필 a를 높은 순도로 수득하고 이로부터 클로로필 a에서 형성되어진 높은 순도의 광민감제 포토디타진을 제조할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.The present invention efficiently obtains chlorophyll-a through the method of precipitating and removing impurities from spirulina by low temperature cryoprecipitation, and by removing the impurities using glucamine, and treating the chlorophyll-a with acid in the above manner. Chlorophyll a is obtained in high purity by forming opitin a, treating base to form salt chlorine, treating acetonitrile and acid to separate acid chlorine, and then treating glucamine to obtain photoditazine. This has a very excellent effect of producing a high-purity photo-sensitizer photodiazine formed from chlorophyll a.
또한, 본 발명은 스피루리나를 이용하여 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 클로로필 a 추출과 글루카민을 첨가하여 광민감제 포토디타진의 합성 및 제조할 수 있는 장점을 가진다.In addition, the present invention has the advantage of synthesizing and preparing photosensitive photodiazine by adding chlorophyll a and glucamine in a manner suitable for mass production in a relatively simple process using spirulina.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail with reference to examples, but these examples are merely illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited only to these examples.
실시예 1: 출발물질로서 적합한 스피루리나의 선택Example 1 Selection of Spirulina Suitable as Starting Material
클로로필 a와 광민감제 포토디타진을 얻기 위한 출발물질로서 초음파 분쇄 스피루리나 시료를 준비하였다. 이어 초음파 분쇄 스피루리나에 함유되어 있는 클로로필 a 및 그 외의 성분들의 함량을 확인하였다. Ultrasonic ground spirulina samples were prepared as starting materials for obtaining chlorophyll a and photosensitive photodiazine. Subsequently, the contents of chlorophyll-a and other components contained in the ultrasonic grinding spirulina were checked.
초음파 분쇄 스피루리나 100 g을 취하여 에탄올 500 ml를 첨가하여 1시간, 3시간, 6시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석과 분자량 분석(mass spectrometry)을 하였고, agilent 1200과 agilent 6320 ion trap LC/MS 시스템을 이용하여 분석을 실시하였다. 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ml/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올(methanol)과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다. 100 g of ultrasonically ground spirulina was taken, 500 ml of ethanol was added, stirred for 1 hour, 3 hours, and 6 hours, followed by filtration to obtain an extract solution. HPLC analysis and mass spectrometry were performed on the extracted solution, and analyzed using agilent 1200 and agilent 6320 ion trap LC / MS systems. The sample injection volume was 10 µl and the solvent flow rate was 1 ml / min. As a developing solution, a mixture of methanol and acetonitrile in a 1: 1 ratio was used. As a reference, chlorophyll a from Sigma-aldrich company was used.
도 1에 정제 전 스피루리나의 HPLC 분석 결과를 나타내었다. 도 1에서, 머무 름시간 약 16.955 분에 해당하는 피크가 클로로필 a에 해당하는 것이다.1 shows the results of HPLC analysis of spirulina before purification. In Figure 1, the peak corresponding to the retention time of about 16.955 minutes corresponds to chlorophyll a.
실시예 2: 스피루리나로부터 클로로필 a의 수득Example 2: Obtaining Chlorophyll a from Spirulina
2-1: 스피루리나로부터 클로로필 a의 추출 및 불순물 제거2-1: Extraction of Chlorophyll a from Spirulina and Removal of Impurities
(주)Shanghai DND Pharm-Technology Co., Inc.에서 구입한 스피루리나(spirulina) 100g을 준비하고, 여기에 에탄올 500ml을 첨가시키고 교반하여 여과시킨 후 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에 넣어 두었다. 불순물은 침전되어, 여과로 클로로필 a 추출액과 분리되었다. 불순물 제거를 위해 냉동침전 방법은 총 1회 실시하였다. Prepare 100 g of spirulina purchased from Shanhai DND Pharm-Technology Co., Inc., add 500 ml of ethanol, filter it by stirring, and then remove it except light to remove the components other than chlorophyll-a. Wrapped in foil and placed in a -20 ° C freezer for 24 hours. Impurities were precipitated and separated from the chlorophyll a extract by filtration. The freeze-precipitation method was performed once to remove impurities.
여과된 클로로필 a 추출액을 농축기로 에탄올 용매를 완전히 제거한 후 클로로필 a를 헥산(n-Hexane) 300ml에 녹인 후 여과하여 클로로필 a 용액에 1M 농도의 D-글루카민 수용액 100ml를 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 주었다. 상등액(헥산 용매층)을 모아서 농축기로 용매를 완전히 제거 한 후 클로로필 a를 수득하였다.The filtered chlorophyll-a extract was completely removed from the ethanol solvent with a concentrator, and then chlorophyll-a was dissolved in 300 ml of hexane (n-Hexane) and filtered. After addition Stir for 2 hours. The supernatant (hexane solvent layer) was collected to completely remove the solvent with a concentrator to obtain chlorophyll a.
상기 여과된 추출액을 소량 취한 후 HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 agilent 1200 시스템을 이용하여 실시하였고, 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ml/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올(methanol)과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. After taking a small amount of the filtered extract, high pressure liquid chromatography (HPLC) confirmed how much chlorophyll a and other ingredients were contained. HPLC was performed using an agilent 1200 system with a sample injection volume of 10 μl and solvent flow rate of 1 ml / min. As a developing solution, a mixture of methanol and acetonitrile in a 1: 1 ratio was used.
그 결과, 도 2 에서 스피루리나로부터 정제된 클로로필 a 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타내었다. 도 3에서 클로로필 a로부터 제거된 불순물에 대한 결과를 나타내었다.As a result, FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of chlorophyll a extract purified from spirulina. 3 shows the results for impurities removed from chlorophyll a.
도 2 에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 17.155 min 에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 도2와 도3에서 머무름시간 0 min 에서 15 min 사이의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 정제도가 각각 93.41% 임을 확인할 수 있었다. 클로로필 a에 대한 수율은 4.81% 이었다. 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다. As can be seen in FIG. 2, a peak corresponding to chlorophyll a was observed at a retention time of about 17.155 min, and a considerable amount of impurities between 0 min and 15 min in retention time was removed in FIGS. 2 and 3. there was. In addition, it was confirmed that the purification degrees of chlorophyll-a were 93.41% in the HPLC chromatogram, respectively. The yield for chlorophyll a was 4.81%. As a reference, chlorophyll a from Sigma-aldrich company was used.
실시예 3: 클로로필 a로부터 광민감제 포토디타진의 제조Example 3 Preparation of Photosensitive Titadine from Chlorophyll a
3-1: 페오피틴(pheophytin) a의 생성3-1: Production of pheophytin a
상기 실시예 2의 과정에서 얻은 클로로필 a 4.81 g을 에탄올 300ml에 녹인 후 5N HCl 또는 5N H2SO4을 10ml 처리하여 용액의 pH를 1-2이 되도록 첨가하고 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거하는 반응을 3시간 동안 교반하였다. 교반 후 5N NaOH 8~10ml 첨가하여 pH를 6~7(중화)로 맞춘 후 검은색의 페오피틴 a 용액을 -20℃ 냉동실에 6시간 보관하여 침전이 형성되게 하고 페오피틴 a 용액을 여과한 후 페오피틴 a 침전물을 수득하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 7.477분에서 페오피틴 a에 해당하는 피크가 관찰되었고 페오피틴 a의 정제도는 88.40% 이었다. 페오피틴 a에 대한 수율은 3.63% 이었다.4.81 g of chlorophyll a obtained in Example 2 was dissolved in 300 ml of ethanol, and then treated with 10 ml of 5N HCl or 5N H 2 SO 4 to add a pH of the solution to 1-2 and to remove magnesium ions from chlorophyll-a. Was stirred for 3 hours. After stirring, add 8 ~ 10ml of 5N NaOH to adjust the pH to 6 ~ 7 (neutralize), and store the black pheophytin a solution in -20 ℃ freezer for 6 hours to form a precipitate, and filter the pheophytin a solution. Afterwards, a pheophitin a precipitate was obtained. As a result, as shown in FIG. 4, a peak corresponding to pheophytin a was observed at a retention time of about 7.477 minutes, and the purification degree of pheophytin a was 88.40%. The yield for pheophytin a was 3.63%.
3-2: 광민감제 클로린의 생성3-2: Production of the photosensitizer chlorine
과정 ACourse A
상기 3-1의 페오피틴 a 3.63 g 을 아세톤 300ml 으로 녹여낸 후 여기에 5N NaOH 또는 5N KOH 10ml을 첨가하여 페오피틴 a 용액의 pH를 13-14로 조정하고 6시간 동안 교반시켜 페오피틴 a로부터 광민감제 클로린 침전물을 형성시켰다. 여과를 한 후 아세톤을 완전히 제거하였다. Dissolve 3.63 g of the pheophitin a of 3-1 in 300 ml of acetone, and then add 10 ml of 5N NaOH or 5N KOH to adjust the pH of the phephytin a solution to 13-14 and stir for 6 hours A photosensitizer chlorine precipitate was formed from a. After filtration, acetone was completely removed.
Na+ 염 클로린 또는 K+ 염 클로린을 제조한 다음 1% TFA가 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 포름산이 첨가된 아세토니트릴 또는 1% 아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 처리하여 산 클로린 형성을 위해 교반해 준 뒤, 여과하여 산 클로린을 분리한 후 농축기로 용매를 완전히 제거하였다. Na + salt chlorine or K + salt chlorine was prepared and treated with acetonitrile with 1% TFA or acetonitrile with 1% formic acid or acetonitrile with 1% acetic acid and stirred to form acid chlorine. After filtration to separate acid chlorine, the solvent was completely removed by a concentrator.
상기에서 얻은 산 클로린 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로린 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. After taking a small amount of the acid chlorine precipitate obtained above, high pressure liquid chromatography (HPLC) confirmed how much chlorine and other components were contained.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 5.15분에서 클로린에 해당하는 피크가 관찰되었고 클로린의 정제도는 98.04% 이었다. 클로린에 대한 수율은 2.65% 이었다.As a result, as shown in FIG. 5, a peak corresponding to chlorine was observed at a retention time of about 5.15 minutes and the purity of chlorine was 98.04%. The yield for chlorine was 2.65%.
농축 완료하여 용매가 완전히 제거된 산 클로린 2.65g (0.0044 mol)에 증류수를 200ml 채워준 후 클로린 1당량(eq) 대비 2당량(2eq)의 글루카민(N-Methyl-D-Glucamine) 1.75g을 넣어주고 3시간 동안 교반시켜 주었다. 이때 물에 녹지 않는 산 클로린은 2당량의 글루카민(N-Methyl-D-Glucamine)에 의해 염형태를 이루어 증류수로 녹아 들어가게 된다. 여과한 후 동결 건조시켜 증류수를 완전히 제거하여 최종 산물인 포토디타진 2.98 g을 수득하였다. 수율은 2.98% 이었다. 또한, 포토디타진에 대해 HPLC(high pressure liquid chromatography)를 수행한 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 5.29분에 포토디타진에 해당하는 피크가 관찰되었고 포토디타진의 정제도는 99.55% 이었다.After completion of the concentration, 200 ml of distilled water was filled in 2.65 g (0.0044 mol) of acid chlorine completely removed from the solvent, followed by adding 1.75 g of N-Methyl-D-Glucamine (2 eq) to 2 equivalents (eq) of chlorine. It was stirred for 3 hours. At this time, acid chlorine that is insoluble in water is dissolved in distilled water in the form of a salt by 2 equivalents of glucamine (N-Methyl-D-Glucamine). After filtration and freeze-drying, the distilled water was completely removed to obtain 2.98 g of photoditazine as a final product. The yield was 2.98%. In addition, as a result of performing high pressure liquid chromatography (HPLC) on the photodiazine, a peak corresponding to the photodithiazine was observed at the retention time of about 5.29 minutes as shown in FIG. 6, and the purity of the photodiazine was 99.55. Was%.
상기와 같이 얻은 포토디타진에 대하여 NMR 분석을 수행한 결과를 도 7에 나타내었으며, 아울러 질량분석을 수행한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.The results of performing NMR analysis on the photodithiazine obtained as described above are shown in FIG. 7, and the results of performing mass spectrometry are shown in FIGS. 8 and 9.
도 1은 본 발명에서 사용하는 정제 전 클로로필 a의 HPLC 분석 결과이다.1 is a result of HPLC analysis of chlorophyll a before purification used in the present invention.
도 2는 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 저온 냉동침전방법과 글루카민 처리를 통해 정제된 클로로필 a의 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. Figure 2 is an HPLC chromatogram showing the results of chlorophyll a purified by cryoprecipitation method and glucamine treatment using spirulina in the present invention.
도 3은 본 발명에서 스피루리나를 이용하여 저온 냉동침전방법과 글루카민 처리를 통해 제거된 불순물 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. Figure 3 is an HPLC chromatogram showing the results of impurities removed through the cryogenic precipitation method and glucamine treatment using spirulina in the present invention.
도 4는 본 발명의 추출 방법에 따라 얻은 클로로필 a를 이용하여 제조된 페오피틴 a에 대한 HPLC이다.Figure 4 is an HPLC for pheophytin a prepared using chlorophyll a obtained according to the extraction method of the present invention.
도 5은 본 발명의 제조 방법에 따라 최종 생성된 클로린에 대한 HPLC 크로마토그램이다.5 is an HPLC chromatogram for chlorine finally produced according to the preparation method of the present invention.
도 6은 본 발명의 제조 방법에 따라 최종 생성된 포토디타진에 대한 HPLC 크로마토그램이다.FIG. 6 is an HPLC chromatogram for photoditazine finally produced according to the preparation method of the present invention. FIG.
도 7는 본 발명의 추출 방법에 따라 얻은 클로로필 a를 이용하여 제조된 포토디타진에 대한 NMR이다. Figure 7 is an NMR for photoditazine prepared using chlorophyll a obtained according to the extraction method of the present invention.
도 8는 본 발명의 추출 방법에 따라 얻은 클로로필 a를 이용하여 제조된 포토디타진에 대한 mass spectrometry이다.8 is a mass spectrometry of photoditagen prepared using chlorophyll-a obtained according to the extraction method of the present invention.
도 9는 본 발명의 추출 방법에 따라 얻은 클로로필 a를 이용하여 제조된 포토디타진에 대한 mass spectrometry이다.9 is a mass spectrometry of photoditagen prepared using chlorophyll a obtained according to the extraction method of the present invention.
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