KR100924371B1 - 베타 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및예측하는 방법 - Google Patents

베타 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및예측하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β 아고니스트에 대한 개체의 기관지 확장 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 β2AR 유전자의 특정 대립유전자 변이의 검출과 β2 아고니스트에의 반응에 대한 약리유전학적 마커로서의 용도에 관한 것이다.
천식, β-아고니스트, 기관지 확장

Description

베타 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하는 방법{Method of detecting and predicting bronchodilatory response to beta agonist}
본 발명은 β-아고니스트에 대한 개체의 기관지 확장 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 β2AR 유전자의 특정 대립유전자 변이(specific allelic variant)의 검출 및 β 아고니스트에 대한 반응에 대하여 약리유전학적 마커로서의 용도에 관계된다.
천식(asthma)은 증상 정도 및 회수가 사람마다 다르지만, 쌕쌕거림(wheezing), 흉부 긴장(chest tightness), 및 기침(coughing)이 되풀이되는 것을 특징으로 하는 만성 기도(airway) 염증 질환이다(Suki et al., 2003). 그것은 폐의 기도가 좁아지거나, 완전히 폐쇄됨으로써, 정상적인 호흡을 방해하는 상태이다. 그러나, 천식에서 이러한 폐의 활동에 대한 장애는 자연스럽게 또는 의약 처치에 따라 가역적일 수 있다. 일반적으로, 다음과 같은 3개의 주된 천식 치료가 적용될 수 있다(Jeffrey et al., 2000). (a) 흡입된 글루코스테로이드(Inhaled glucosteroids) (Martin, 2003; Settipane et al., 2003), (b) β 2-아고니스트(beta 2-agonists) (Eh et al., 2003), 및 (c) 류코트린 인히비터(leukotriene inhibitors) (Bjermer et al., 2002). 명백하게 동일한 유전형을 갖는 천식의 환자 들에 대한 약물 처치 반응은 매우 다양할 수 있다(Drysdale et al., 2000). β2AR 아고니스트는 천식에서의 기관지 확장 처치제로서 첫번째로 사용될 것이 추천된다(National Asthma Education and Prevention Program (1997) Expert Panel Report Ⅱ). 짤고 긴 반응하는 β 2 아고니스트는 기관지 수축 자극에 대하여 직접 또는 간접적인 보호 효과를 보여준다(Cockcroft et al., 1996). β 아드레너직 리셉터(beta-adrenergic receptor)는 적어도 3개의 별개의 그룹으로 분류되어 왔다. 즉, 각각 심장, 기도 평활근(airway smooth muscle), 및 지방 조직으로부터 확인된 β1, β2, β3의 그룹이 그것이다(Johnson M, 1998). β1, β2, 및 β3 리셉터의 사이에는 65 내지 70%의 상동성(homology)이 있다. β 아드레노 리셉터는 활성화된 및 비활성화된 형태로 존재하며, 휴식 조건 하에서 이 2개의 형태는 비활성화된 상태가 우세한 상태에서 평형을 이룬다는 좋은 증거가 현재 밝혀져 있다(Johnson M, 1998). β2AR은 구아노신 트리포스페이트(Guanosine TriPhosphate; GTP)의 분자와 함께 G 단백질의 알파 서브유닛과 관계되며, 리셉터가 아데닐레이트 사이클레이즈와 커플링되는 것은 이 알파 서브유니트를 통해서이다. GDP에 의한 GTP의 대체는 효소에 의해 ATP가 cAMP로 전환되는 것을 촉매하며, 리셉터의 알파 서브유니트에 대한 친화도를 매우 감소시킴으로써 분해를 야기하고, 리셉터가 낮은 에너지인 비활성화된 형태로 돌아가도록 한다(Johnson M, 1998). β2 아드레너직 리셉터는 천식에서 기관지 확장에 사용되는 β2 아고니스트 약물에 대한 주된 타겟이다. β2AR은 G 단백질과 커플링된 것이고, 하나의 세포외 아미노 말단(extraceluular amino terminus), 7개의 막횡단 스패닝 도메인(transmembrane spanning domain), 3개의 세포내(intracellular) 및 3개의 세포외(extracellular) 루프(loop), 및 하나의 세포내 카르복시 말단(intracellular carboxyl terminus)을 가진다. β2AR은 신체, 특히 기관지의 평활근 세포에 널리 분포되며, 다양한 조식 및 기관(organ)에서 카테콜라민(catecholamine)의 반응을 조절한다. β2AR은 413개의 아미노산 잔기(residue)로 구성되며, 약 46,500 달톤(Da)이다(Drysdale et al., 2000).
β2AR은 염색체 5q31-32 위에서 인트론 없는 유전자에 의해 인코딩된다(Kobilka et al., 1987). 존슨 M(Johnson M.,(1998))은 인간 개체군에서 β2AR 단백질의 구조에 중요한 유전적 변형을 가져오는 것으로서, β2AR 유전자의 코딩 블록에서의 여러 개의 단일 뉴클레오티드 다형(Single Nucleotid Polymorphisms; SNPs)을 보고하였다(GenBank Accession Numbers AF022953.1 GI:2570526; AF022954.1 GI:2570528; and AF022956.1 GI:2570532). 이러한 SNPs는 β2AR 코팅 시퀀스의 뉴클레오티드 46(A 또는 G), 79(C 또는 G), 및 491(C 또는 T)에 위치한다. SNPs는 아미노산 16(Arg 또는 Gly) 및 27(Gln 또는 Glu)에서의 리셉터의 아미노 말단, 및 아미노산 164(Thr 또는 Ile)에서의 4번째 막횡단 스패닝 도메인에서 변이 발생을 유발한다. 이러한 아미노산 변이는 재조합 세포 연구(Green et al., 1994), 상기 변이를 내부적으로(endogenously) 표현하는 세포(CHW-1102)의 첫번째 배양(Green et al., 1995), 및 심장에서 Thr164 또는 Ile164 리셉터를 과표현하는 트랜스제닉 마우스(Turki et al., 1996)에 의해 증명된 바와 같은 명확한 유전형적 차이를 갖는다. 나아가, 일본 학계에서는 코딩 시퀀스의 뉴클레오티드 523에서 C 또는 A의 동의적 다형이 살부타몰에 대한 변형된 반응과 관계된다고 보고되었 다(Ohe et al., 1995). 코딩 블록에서의 상기 언급된 다형 뿐만 아니라, 5' 프로모터 영역에서 다수개의 SNPs가 최근에 확인되었으며, 뉴클레오티드 -1023(A 또는 G), -654(G 또는 A), -468(C 또는 G), -367(T 또는 C), -47(C 또는 T), 및 -20(T 또는 C)에 위치하는 것으로 알려졌다(Scott et al., 1999). 최근에는 -709(C 또는 A) 및 -406(C 또는 T)에서 2개의 SNPs가 더 보고되었다(Drysdale et al., 2000). 따라서, 13개의 다형 사이트(polymorphic site)가 이미 겐뱅크 어세션 M15169.1(GenBank Accession No. M15169.1)의 뉴클레오티드 565와 2110 사이에 위치하는 β2AR 유전자의 영역에서 확인되었다. 여러 그룹들이 상기 언급된 몇몇 β2AR 아미노산 변이와 다양한 조건에 대한 감수성의 증가 사이의 관계, 예를 들어 고혈압(Gly16 변이, Hoit et al., 2000), 아토피(Gly16 변이, Dewar et al., 1998), 야간 천식(nocturnal asthma)(Gly16 변이, Turki et al., 1995), 비만증(obesity) 치료에 대한 반응(Gly16 변이, Sakane et al., 1999), 중증 근육 무력증(myasthenia gravis)(Arg16 변이, Xu et al., 2000), 아동 천식(Gln27 변이, Dewar et al., 1997), 비만(Glu27 변이, Large et al., 1997), 및 울혈성 심부전(congestive heart failure)에 의한 사망률(Ile164 변이, Liggett et al., 1998) 등을 제안하였다.
이상에서 논의된 몇몇 β2AR 유전자 다형은 천식에서 질병 조절자로서 행동하거나, β 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응에서 주지의 개체간 변이의 기초가 될 수 있다(Drysdale et al., 2000). 실제로, 마르티네스 등(Martinez et al, 1997)은 Arg16 변이에 대한 동종 또는 이종의 개체들이 Gly16 변이에 대한 동종의 개체보다 알부테롤(albuterol)에 대해 더 반응할 것이라고 보고하였다. 흥미롭게도, 또 다른 그룹은 β 아고니스트 포르모테롤(formoterol)에 의한 연속적 처치 후에 Gly16 변이에 대한 동종 천식에서 기관지 확장제에 대한 탈감각을 보고하였다(Tan et al., 1997). 그러나, 동시에, 다른 연구들에서는 약물 역반응과 β 아고니스트의 규칙적 처치 사이의 어떠한 상호 관계도 입증하지 못하였다(Lipworth et al., 1999).
천식은 전세계적으로 가장 공통적인 질병 중 하나이다. 인도에서는 1,500만 내지 2,000만의 천식 환자가 있고, 어린이의 6%가 천식을 앓고 있다(Chabra S. K., 1998). 천식은 복잡하고, 다양한 원인에 의한 질병으로서, 몇몇 환경 인자 뿐만 아니라, 다수의 유전자가 관계되어 있다(Suki et al., 2003). 그러나, 인도인에 대하여는 유전적 인자가 아직 완전히 해명되어 있지 않다. 천식에 대하여 다수의 불합리한 약물 처방에 따른 잘못된 치료는 천식에서 일반적인 대부분의 처방약에 대한 약물 반응이 개체 및 인종간의 다양하다는 지식의 결여에 기인한다. 이것은 어떠한 급성 케이스에서는 생명이 위독한 것으로 판명될 수 있다. 이러한 상황은 약물유전학적 이론에 기초하여 처방된 약물에 대한 개체의 반응의 사전 지식을 사용함으로써 회피될 수 있다. 불합리한 약물 처방 때문에 진전(tremor), 항진(palpitation), 빈맥(tachycardia), 및 효능에 대한 내성과 같은 다양한 부작용이 있다(O'Connor et al., 1992, Dennis et al., 2000). 본 발명에 개시되어 있는 뉴클레오티드 포지션 46(염기 A가 G로 치환)에서 β2AR 유전자의 대립유전자 변이(allelic variant)는 특히 인도 사람들에게서 β 아고니스트 약물의 기관지 확장 반응에 대한 지시 마커인 것으로 알려졌다. 때때로 천식에 걸린 환자들이 살부타몰에 반응하지 않고, 특정 환자가 약물처치에 반응하지 않음을 알기까지 오랜 시간(수일에서 수월)이 소요된다는 것이 관찰되었다. 이 시간동안 환자의 증상을 경감시키는 것은 매우 어렵다. 의사가 치료 초기에 반응자 또는 비반응자를 구별할 수 있다면, 도즈 적정 시간이 절약될 것이고, 환자는 다른 대체 치료에 의해 적절한 시간에 치료될 수 있을 것이다. 응급 상황에서 올바르고, 적절한 타이밍의 치료가 비반응자에게 주어질 수 있으며, 생명을 구할 수 있다.
미국 특허 제811286호에서 드리스달 등(drysdale et al, 2000)이 개시한 방법은 β2AR 유전자의 포지션 -654(염기 G가 A로 치환), 46(염기 A가 G로 치환), 및 252(염기 G가 A로 치환)에서의 세개의 SNPs가 코카시안(Caucasian)인들에서 β 아고니스트 약물의 반응을 결정하는 것을 포함하였다. 드리스달 등에 의해 클레임된 상기 방법 및 진단 키트는 더 많은 시간을 소모하고, 비싸다. 왜냐하면, 상기 방법 및 진단 키트는 프로브, 프라이머, 및 관련 생화학물의 세 개의 세트를 사용하기 때문이다. 또한, 상기 방법은 코카시안인에 대한 용도에 제한된다. 따라서, 인도에는 1,500만 내지 2,000만의 천식 환자가 있고, 인도의 어린이의 6%가 천식을 앓고 있기 때문에, β 아고니스트에 대한 인도인들의 약물 반응을 스크린하는 값싸고, 신속하며, 특정적인 진단 방법과 키트의 개발이 요구된다. 본 발명에 개시된 SNP는 생물학적 표현형(phenotype) 및 치료 표현형과 관계된 것으로 알려져 있으며, 개별 환자의 약물 반응에 대한 지표로서 강한 예측력을 갖는다.
천식은 임상적으로 정의하기 어려운 표현형을 갖는 복합 질명이다. 흡입된(inhaled) β-아드레너직 아고니스트는 천식 치료를 위하여 가장 널리 사용되는 처치 약물이다. β2AR의 다형은 리셉터의 조절에 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 신규성은 약물 반응을 결정하는 약리유전학적 유전자 자리(locus)로서의 하나의 단일 뉴클레오티드 다형과 인도인의 천식에서의 β 아고니스트에 대한 강한 관계를 제공하는데 있다. 본 발명의 신규성은 포지션 46(염기 A가 G로 치환)에서 β2AR 유전자의 대립유전자 변이를 검출하는 것에 의해 기관지 확장 반응을 예측하는 방법을 제공하는데 있다. 상기 단일 뉴클레오티드 다형은 인도 사람의 천식에서 약물 반응과 단독으로 관계되어 있는 것으로 알려졌다. 더욱이, 상기 SNP는 인도 사람들에게서 약물 반응에 대한 지시 마커인 것으로 알려졌다. 드리스달 등은 세개의 SNPs가 함께 코카시안인의 약물 반응에 기여하는 것을 발견하였지만, 인도 사람에게는 이러한 세개의 SNPs가 연관되지 않은 것으로 발견되었고, 따라서, 우리는 인도 사람들에서 이러한 세개의 SNPs를 함께 취하는 것이 하나의 SNP(A->G)보다 덜 중요함을 관찰하였다.
본 발명은, 또한 인도 사람들의 β2 아고니스트에 대한 반응자를 스크린하기 위한 신규한 특정 프로브, 프라이머 및 진단 키트를 제공한다.
본 발명은, 또한 β2 아고니스트에 대한 인도인 천식의 약물 반응을 예측하는 더 값싸고, 신속한 방법을 제공한다. β2AR 유전자의 상기 다형은 더 싼 진단 시약 및 본 질병에 대한 새로운 치료 개발에 있어서 상업적 큰 가치를 갖는다.
[발명의 목적]
본 발명의 주된 목적은 β2 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 β2AR 유전자의 특정 대립유전자 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형을 검출 및 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 β2 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하기 위한 약리유전학적 마커를 제조하는 방법에 관계된다.
본 발명의 또 다른 목적은 β2 아고니스트 천식 환자에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하기 위한 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 β2 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하는 신규한 약리유전학적 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 천식 환자를 β2 아고니스트에 대한 반응자 및 비반응자로 스크린하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약물 반응을 예측하기 위하여 β2AR 유전자에서 약물 유전학적 유전자 자리의 유전자형을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약물 반응에 대한 인도인 천식 환자들을 스크린 하는데 유용한 코딩 영역의 뉴클레오티드 46에서 β2AR 유전자의 비동의적(nonsynonymous) 대립유전자 변이(염기 A가 G로 치환)를 검출하기 위한 신규한, 특정의 프로브 및 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 β2AR 유전자에서 다형과 천식의 관계를 연구하는 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 인도인의 β 서브타입 2, 아드레너직 리셉터 유전자(β2AR 유전자)에서의 10개의 다형 사이트의 유전형 및 하플로타입(haplotype)을 개시한다. 본 발명은 β 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 예측하는 방법에 관계된다. 본 발명은 특히 인도인 천식 환자에 유리하다. 본 발명은 기관지 확장에 사용되는 β2-이고니스트에 대한 주된 타겟과 깊은 관계가 있는 것으로 예견되는 β2AR 유전자의 대립유전자 변이(유전형)를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개별 약물 반응을 예측하는 진단 키트를 개발하는데 유용하다. 염색체 5q31에서의 β2AR 유전자의 코딩 블록 내에서 다수의 미스센스(missense) 다형이 인간에게서 확인되었다. 본 발명은 또한 약물 반응과 깊이 관련된 β2AR 유전자에서 특정 대립유전자 변이를 검출하는 특정 프라이머 및 프로브를 개시한다.
[발명의 상세한 설명]
β2AR은 천식에서 기관지 확장에 사용되는 β2 아고니스트의 주된 타겟이다. 환자 샘플의 반응자 및 비반응자에서 이 유전자의 코딩 영역(단지 하나의 엑손)의 직접적인 시퀀싱은 약물 반응과 관계된 비동의적 다형의 발견을 야기하였다. 개체에서 아미노산 아르기는을 코딩하는 코돈 AGA는 글리신을 코딩하는 GGA로 변화하였다. 반응자/비반응자 개체의 동형 접합체 상태로 존재한다면 비동의적 다형은 변화된 기관지 확장을 유발할 수 있다. β2AR 유전자의 엑손 영역에서 비동의적 다형은 천식의 기관지 확장과 관계되지 때문에, 이것은 변화된 반응성과 관계있는 천식 환자들에서의 비동의적 다형의 발견을 유발하였다. 이 다형은 변형된 인 비보(in vivo) 반응을 예측하기 위하여 발견된다. 또한, 여러 천식 환자(반응자 및 비반응자)의 게노타이핑은 β2 아고니스트와 변화된 반응의 중요한 관계를 보여주었다. 이 결과는 β 아고니스트에 대한 변화된 반응성의 원인이 되는 단일 다형의 관계의 제1 증거를 구성한다.
본 발명은 또한 약물 반응과 관계된 β2AR 유전자의 다형 검출에 적합한 올리고뉴클레오티드 시퀀스(서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로 등재됨)를 제공한다.
본 발명에는 또한 필요한 버퍼를 따라 특정 프라이머 또는 프로브와, β2 아고니스트에 대한 개체의 반응을 확립하기 위하여 β2AR 유전자의 다형을 확인하는 데에 적합한 악세서리의 하나의 세트를 포함하는 β 아고니스트에 대한 개체의 반응을 예측하는 진단 키트를 포함한다.
따라서, 본 발명의 주된 실시예는 천식에 걸린 주체의 β2 아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 예측 및 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 주체에게 주지의, 빠르게 반응하는 β2 아고니스트의 약리적 활성 도즈를 적절한 루트를 통해 투여하고,
(b) 상기 β2 아고니스트에 대하여 천식에 걸린 표현형적 우량 반응자 및 열등 반응자를 분류 및 확인하고,
(c) 상기 반응자, 천식에 걸린 비반응자, 및 정상인들의 혈액 샘플로부터 유전자 DNA를 분리하고,
(d) 서열 번호 2 및 3을 가지며, 천식과 관련된 β2AR 유전자, 또는 유전자 자리(locus)의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인 및 합성하고,
(e) 서열 번호 2 및 3을 사용하여 표현형적으로 분류된 천식 환자의 반응자 및 비반응자의 유전자 DNA를 증폭하고,
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 증폭된 PCR 생산물을 시퀀싱하고, β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 주지의 시퀀스와 컴퓨터적으로 비교하여 상기 (e) 단계로부터 얻어진 상기 시퀀스된 PCR 생산물의 비동의적(nonsynonymous) 다형 또는 단일 뉴클레오티드 다형(SNPs)을 확인함으로써, 상기 특정 β2AR 대립유전자 변이를 검출하고,
(g) 상기 (f) 단계에서 확인된 상기 비동의적 다형 또는 단일 뉴클레오티드 다형(SNPs)의 말단에서 2번째 위치까지 서열 번호 4 및 5를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하고, 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 다형에 대한 상기 반응자 및 비반응자 천식 개체를 스크린하여, β2AR 유전자 자리 또는 유전자의 상기 특정 SNPs를 검출하되,
상기 공정은,
i. 96℃에서 10초간 상기 분리된 DNA를 변성하고,
ii. 55℃에서 5초간 상기 (i) 단계의 변성된 DNA에 서열 번호 4 및 5의 프라이머를 어닐링하고,
iii. 60℃에서 30초간 상기 (ii) 단계의 어닐링된 DNA의 확장을 착수하는 것을 포함하는 PCR 조건을 포함하고,
(h) 상기 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이의 존재 하에 서열 번호 6, 7, 8 및 9를 갖는 대립유전자 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 정상 대조 개체 및 상기 (g) 단계에서 얻어진 천식 환자(반응자와 비반응자를 포함함)를 확인하되, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고유하게 타겟 SNPs 또는 특정 βAR 대립유전자 변이에 혼성화되며, 상기 타겟 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이는 천식 환자의 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 뉴클레오티드 A가 G로(A -> G) 치환되어 있는 것을 포함하는 예측 및 검출 방법에 관계된다.
본 발명의 다른 실시예는 천식에 걸린 주체에서 β2AR 유전자의 특정 대립유전자 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형(SNPs)를 검출 및 예측하는 방법으로서,
(a) 상기 주체에게 주지의, 빠르게 반응하는 β2 아고니스트의 약리적 활성 도즈를 적절한 루트를 통해 투여하고,
(b) 상기 β2 아고니스트에 대하여 천식에 걸린 표현형적 우량 반응자 및 열등 반응자를 분류 및 확인하고,
(c) 상기 반응자, 천식에 걸린 비반응자, 및 정상인들의 혈액 샘플로부터 유전자 DNA를 분리하고,
(d) 서열 번호 2 및 3을 가지며, 천식과 관련된 β2AR 유전자의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인 및 합성하고,
(e) 서열 번호 2 및 3을 사용하여 표현형적으로 분류된 천식 환자의 반응자 및 비반응자의 유전자 DNA를 증폭하고,
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 증폭된 PCR 생산물을 시퀀싱하고, β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 주지의 시퀀스와 컴퓨터적으로 비교하여 상기 (e) 단계로부터 얻어진 상기 시퀀스된 PCR 생산물의 비동의적(nonsynonymous) 다형 또는 SNPs를 확인함으로써, 상기 특정 β2AR 대립유전자 변이를 검출하고,
(g) 상기 (f) 단계에서 확인된 상기 비동의적 다형 대립유전자 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형(SNPs)의 말단에서 2번째 위치까지 서열 번호 4 및 5를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하고, 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 다형에 대한 상기 반응자 및 비반응자 천식 개체에 대한 상기 β2AR 유전자 또는 유전자 자리를 스크린하여, 상기 특정 SNPs 또는 대립유전자 변이를 검출하되,
상기 공정은,
i. 96℃에서 10초간 상기 분리된 DNA를 변성하고,
ii. 55℃에서 5초간 상기 (i) 단계의 변성된 DNA에 서열 번호 4 및 5의 프라이머를 어닐링하고,
iii. 60℃에서 30초간 상기 (ii) 단계의 어닐링된 DNA의 확장을 착수하는 것을 포함하는 PCR 조건을 포함하고,
(h) 상기 SNPs 또는 특정 대립유전자 β2AR 또는 유전자 자리 변이의 존재 하에 서열 번호 6, 7, 8 및 9를 갖는 대립유전자 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 정상 대조 개체 및 상기 (g) 단계에서 얻어진 천식 환자(반응자와 비반응자를 포함함)를 확인하되, 상기 타겟 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이는 천식 환자의 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 뉴클레오티드 A가 G로(A -> G) 치환되어 있는 것을 포함하는 검출 및 예측 방법에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 천식에 걸린 주체에서 β-아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하기 위한 약리유전학적 마커의 제조 방법으로서,
(a) 상기 주체에게 주지의, 빠르게 반응하는 β2 아고니스트의 약리적 활성 도즈를 적절한 루트를 통해 투여하고,
(b) 상기 β2 아고니스트에 대하여 표현형적 우량 반응자 및 열등 반응자를 분류 및 확인하고,
(c) 상기 반응자, 천식에 걸린 비반응자, 및 정상인들의 혈액 샘플로부터 유전자 DNA를 분리하고,
(d) 서열 번호 2 및 3을 가지며, 천식과 관련된 β2AR 유전자의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인 및 합성하고,
(e) 서열 번호 2 및 3을 사용하여 표현형적으로 분류된 천식 환자의 반응자 및 비반응자의 유전자 DNA를 증폭하고,
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 증폭된 PCR 생산물을 시퀀싱하고, β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 주지의 시퀀스와 컴퓨터적으로 비교하여 상기 (e) 단계로부터 얻어진 상기 시퀀스된 PCR 생산물의 비동의적(nonsynonymous) 다형 또는 SNPs를 확인함으로써, 천식과 관계된 상기 특정 β2AR 대립유전자 변이를 검출하고,
(g) 상기 (f) 단계에서 확인된 상기 비동의적 다형 또는 SNPs의 말단에서 2번째 위치까지 서열 번호 4 및 5를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하고, 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 다형에 상기 반응자 및 비반응자 천식 개체를 스크린하여, 상기 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 특정 SNPs를 검출하되,
상기 공정은,
i. 96℃에서 10초간 상기 분리된 DNA를 변성하고,
ii. 55℃에서 5초간 상기 (i) 단계의 변성된 DNA에 서열 번호 4 및 5의 프라이머를 어닐링하고,
iii. 60℃에서 30초간 상기 (ii) 단계의 어닐링된 DNA의 확장을 착수하는 것을 포함하는 PCR 조건을 포함하고,
(h) 상기 SNPs 또는 특정 대립유전자 β2AR 또는 유전자 자리 변이의 존재 하에 서열 번호 6, 7, 8 및 9를 갖는 대립유전자 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 정상 대조 개체 및 상기 (g) 단계에서 얻어진 천식 환자(반응자와 비반응자를 포함함)를 확인하되, 상기 타겟 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이는 천식 환자의 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 뉴클레오티드 A가 G로(A -> G) 치환되어 있고,
(i) (d), (g), 및 (h) 단계로부터 β-아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하기 위한 약리유전학적 마커로서 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 및 9를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 확립하는 것을 포함하는 검출 및 예측 방법에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 천식에 걸린 주체에서 β-아고니스트에 대한 기관지 확장 반응을 검출 및 예측하기 위한 신규한 약리유전학적 마커로서,
(a) 서열 목록 2 및 3을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머,
(b) 서열 목록 4 및 5를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및
(c) 서열 목록 6, 7, 8, 및 9를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머
로 이루어진 신규한 약리유전학적 마커에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 β2 아고니스트에 대한 천식 환자의 기관지 확장 반응을 예측 및 검출하기 위한 진단 키트로서,
(a) β2AR 유전자의 마커 영역의 증폭하는 서열 번호 2 및 3을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제1 세트,
(b) 비동의적 다형 또는 단일 뉴클레오티드 다형을 게노타이핑하는 서열 번호 4 및 5를 갖는 프라이머의 제2 세트로서, 상기 공정은
i. 96℃에서 10초간 상기 분리된 DNA를 변성하고,
ii. 55℃에서 5초간 상기 (i) 단계의 변성된 DNA에 서열 번호 4 및 5의 프라이머를 어닐링하고,
iii. 60℃에서 30초간 상기 (ii) 단계의 어닐링된 DNA의 확장을 착수하는 것을 포함하는 서열 번호 4 및 5를 갖는 제2 세트, 및
(c) 대립유전자를 사용하여 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이의 존재 하에 정상 대조 개체 및 천식 환자(반응자와 비반응자를 포함함)를 확인하되, 상기 타겟 SNPs 또는 특정 β2AR 대립유전자 변이는 천식 환자의 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 염기 A가 G로(A -> G) 치환되어 있는 프라이머의 제3 세트를 포함하는 진단 키트에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 주체가 인간인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 β2-아고니스트가 살부타몰인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 β2 아고니스트인 살부타몰의 약리적 활성 도즈가 약 100 내지 250㎍인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 β2 아고니스트인 살부타몰의 약리적 활성 도즈가 약 200㎍인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 β2 아고니스트인 살부타몰의 약리적 활성 도즈가 흡입기를 통해 제공되는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 β2AR의 코팅 영역을 증폭하는데 적합한 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머가 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관계된다.
(a) 5'TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3' (서열 번호 2, 순방향 프라이머)
(b) 5'ACGATGGCCAGGACGATGAGA3' (서열 번호 3, 역방향 프라이머)
본 발명의 또 다른 실시예는 검출된 비동의적 다형 또는 SNPs를 증폭하는데 적합한 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관계된다.
(a) 5'GCCTTCTTGCTGGCACCCAAT3' (서열 번호 4, 순방향 프라이머)
(b) 5'CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC3' (서열 번호 5, 역방향 프라이머)
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 PCR가 수행되는 사이클이 37인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 SNPs, 또는 상기 βAR 유전자 또는 유전자 자리의 대립유전자 변이를 확인하는데 적합한 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관계된다.
(a) 5'GCACCCAATAGAAGCCATG3' (서열 번호 6, 순방향 프라이머)
(b) 5'CATGGCTTCTATTGGGTGC3' (서열 번호 7, 역방향 프라이머)
(c) 5'GCACCCAATGGAAGCCATG3' (서열 번호 8, 순방향 프라이머)
(d) 5'CATGGCTTCCATTGGGTGC3' (서열 번호 9, 역방향 프라이머)
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 길이가 5 내지 100 염기인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 길이가 8 내지 24 염기인 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 살부타몰에 대하여 유전형 GG는 우량 반응자와 연관되고, 유전형 AA는 열등 반응자와 연관되는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 기관지 확장 유도를 위한 비반응자 천식 환자에 적합한 치료의 개발에 유용하다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 개발된 방법은 인간에게서 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 단일 대립유전자 변이를 예측하고 검출하기 위한 마커, 프라이머 및 프로브를 제공하는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 약리유전학적 마커가 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 단일 특정 대립유전자 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형과 연관되는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 마커에서 상기 확인된 비동의적 다형 또는 SNPs 또는 상기 특정 단일 β2AR 대립유전자 변이가 약리유전학적 마커로서 기능하는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 마커에서 서열 목록 2 및 3을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 β2AR 유전자의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 마커에서 서열 번호 4 및 5를 갖는 마커/올리고뉴클레오티드 프라이머가 β2AR 유전자의 특정 SNPs를 검출하도록 46 포지션(본 발명에서 개시된 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일함)에서 다형에 대한 천식 개체의 반응자 및 비반응자를 스크린 및 확인할 수 있는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 마커에서 서열 번호 6, 7, 8, 및 9를 갖는 마커/올리고뉴클레오티드 프라이머가 SNPs 또는 특정 대립유전자 β2AR 또는 유전자 자리 변이의 존재 하에 상기 정상 대조 개체 및 천식 환자(반응자 및 비반응자를 포함함)를 확인할 수 있는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 키트가 기관지 확장을 유도하기 위하여 천식 환자의 비반응자에 적합한 치료를 확인하는데 유용하다는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 키트에서 상기 키트법이 인간에게서 β2AR 유전자 또는 유전자 자리의 단일 대립유전자 변이를 예측하고 검출하기 위한 마커, 프라이머 및 프로브를 제공하는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 키트에서 상기 확인된 비동의적 다형 또는 SNPs 또는 상기 특정 단일 β2AR 대립유전자 변이가 약리유전학적 마커로서 기능한다는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 키트에서 상기 키트의 단일 특정 β2AR 대립유전자 변이 또는 SNPs 또는 비동의적 다형이 β2 아고니스트에 대한 약리유전학적 마커로서 기능한다는 것에 관계된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 키트에서 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하고, β2AR 유전자 변이의 AA 또는 GG 유전자형에 기초한 반응자 타입을 배정하기 위한 지침을 더 포함한다는 것에 관계된다.
도 1a는 β2AR 유전자의 비동의적 다형을 포함하는 모든 SNPs의 개략도이다.
도 1b는 완전한 β2AR 유전자를 커버하는 영역의 PCR 증폭에 사용되는 프라이머를 도시한다.
도 1c는 SNPs의 위치 및 인도인에게서 β2AR 유전자의 영역의 연관 불균형을 설명하기 위한 도면이다.
도 1d는 뉴클레오티드 46 포지션에서 염기 A가 G로 치환된 다형(유전형)의 분포를 도시한다.
도 2a는 A의 존재를 나타내기 위한 서열 번호 6을 갖는 대립유전자 특정 프라이머의 혼성화를 설명하기 위한 도면이다.
도 2b는 A의 존재를 나타내기 위한 서열 번호 7을 갖는 대립유전자 특정 프라이머의 혼성화를 설명하기 위한 도면이다.
도 2c는 G의 존재를 나타내기 위한 서열 번호 8을 갖는 대립유전자 특정 프라이머의 혼성화를 설명하기 위한 도면이다.
도 2d는 G의 존재를 나타내기 위한 서열 번호 9를 갖는 대립유전자 특정 프라이머의 혼성화를 설명하기 위한 도면이다.
이하의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 방법으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 단정되지 않아야 한다.
실시예 1
Ⅰ. 개체군 연구: 흡입된 β2 아고니스트에 의한 기도 반응성 측정.
본 발명의 제1 단계로서, 출원인들은 환자를 살부타몰에 대한 반응에 기초하여 양호한 반응자 및 열등 반응자로 분류하는 더욱 묘사적인 연구를 위하여 다양한 정도의 반응을 나타내며, 단시간에 반응하는 β 아고니스트, 예를 들어 살부타몰을 환자에게 투여하는 연구를 수행하였다. 살부타몰은 구강 투여 또는 더욱 일반적으로 흡입 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 흡입기는 매우 적은 양의 약물 처치가 폐로 직접 제공되는 것을 담보한다. 천식의 진단은 가역적 기도 폐쇄 하에서 질병에 따른 징후(sign) 및 증상의 양성 병력(history)에 기초하였다. 모든 환자들은 다른 가능성있는 흉부 질환을 배제하기 위하여 일반적인 실험실적 진단 테스트 및 폐기능 테스트(PET)를 받았다. 폐활량 측정 테스트에서 최소 3개의 수용가능한 조작(maneuver)이 이루어졌고, "베스트 테스트" 커브가 선택되었다. 여기서, "베스트 테스트" 커브는 미국 흉부 협회(American Thoracic Society)에 의해 규정된 수용성 척도와 일치하며, FVC와 FEV1의 최대 합을 나타내는 테스트로 정의된다. 기도 폐쇄 징후를 나타내는 환자는 살부타몰(β 2 아드레너직 아고니스트) 200㎍이 주어졌고, 상기 테스트는 20분 후에 반복되었다. 이것은 기도 폐쇄의 가역성 정도를 산정하기 위해 수행되었다. 동일한 공정이 2주 이상의 간격으로 2-3회 반복되었으며, FEV1의 베스트 %age 지수 변화가 천식 환자를 살부타몰에 대한 양호, 불량 또는 비반응자로 분류하기 위해 채택되었다.
실시예 2
Ⅱ. β2AR 유전자에서의 다형 확인:
본 발명자들은 인도인의 5' 상류의 인접 영역과 β2AR 유전자의 코딩 시퀀스에서 인도인의 10개의 다형 사이트를 확인하였다(표 2). 이 결과는 13개의 다형 사이트가 보고된 드리스달 등(2000)의 발견과 차이가 있다.
하플로타입이 모든 사이트에서 동형 접합체(homozygous)인, 또는 하나 이하의 다양한 사이트에서 이형 접합체(heterozygous)인 개체들로부터 직접 할당되어 있는 클라크 알고리즘(Clark's algorithm)(Clark, 1990)의 확장을 이용하여 표 3에 나타난 7개의 하플로타입 쌍이 언페이스된(unphased) 유전형으로부터 평가되었다.
실시예 3
Ⅲ. 약물 반응의 지표로서 본 발명의 단일 다형:
본 발명자들은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 인간 β2AR 유전자의 액손 영역의 PCR 증폭을 수행하였다. 이 프라이머는 DOE 조인트 게놈 연구소(DOE Joint Genome Institute)와 스탠포드 인간 게놈 센터(Stanford Human Genome Center(1999/10/06)) (GenBank accession No.- AC011354)에 의해 제출된 인간 β2AR 유전자 시퀀스에 따라 디자인되었다. 정제된 PCR 생성물의 시퀀싱은 기관지 확장과 관계된 인간 β2AR 유전자의 엑손 영역에서 동종 접합체 비동의적 다형을 나타냈다.
본 발명은 약물 반응과 관계된 데이터 베이스(GenBank Accession No.- AC011354)에서 인간 β2AR 유전자 시퀀스의 엑손 영역의 비동의적 다형을 포함하는 인간 β2AR 유전자의 대립유전자 변이 시퀀스를 제공한다.
표 1
변화된 사이트 염기 변화 아미노산 변형
857 A->G 아르기닌->글리신
변화된 사이트는 인간 β2AR 유전자(GenBank Accession No.- AC011354)의 엑손 영역의 측면에 배치된 프라이머(서열 번호 2 및 3)를 사용하여 얻어진 PCR 생성물 시퀀스에 따른다.
A로부터 G로의 치환은 아미노산 아르기닌을 글리신으로 변화시키며, 결과적으로 인간 β2AR 유전자의 엑손 영역 대립유전자 변이의 뉴클레오티드 시퀀스를 유도한다. 비동의적 다형을 포함하는 PCR 생성물 시퀀스는 서열 번호 1의 인간 β2AR 유전자 엑손 영역의 비동의적 다형의 측면에 위치하는 서열 번호 2 및 3의 프라이 머을 사용하여 얻어진다.
다형 사이트는 상기 시퀀스(A*)의 뉴클레오티드 857 포지션에 있고, 데이터 베이스(GenBank Accession No.- AC011354)의 뉴클레오티드 46 포지션에 대응된다. 프라이머는 인간 β2AR 유전자의 엑손 영역의 측면에 위치하는 프라이머(서열 번호 2 및 3)를 사용하여 얻어진 PCR 생성물에 따라 857 포지션에서 다형을 검출하는 데에 사용된다(표 1).
실시예 4
Ⅳ. 약물 반응에 관한 연관 분석:
본 발명자들은 인도인의 살부타몰에 대한 환자의 기관지 확장 반응이 뉴클레오티드 46의 β2AR 유전자에서 단지 하나의 다형 사이트를 게노타이핑하는 것이 의해 신뢰성있게 예측될 수 있음을 발견하였다. 또한, 여러 천식 환자(반응자 및 비반응자)의 게노타이핑은 β 아고니스트에 대한 변화된 반응과의 중요한 관계를 보여주었다. 이 결과는 β 아고니스트에 대한 변화된 반응성의 원인이 되는 단일 다형의 관계의 제1 증거를 구성한다. 동형 접합체 Arg16과 동형 접합체 Gly16은 인도인에게서 열등한 반응과 양호한 반응 간의 관계를 보여주었다(도 1d). 더욱이, 아주 적은 수의 양성 기관지 확장 반응을 갖는 동형 접합체 Arg16의 천식 환자 및 음성 기관지 확장 반응을 갖는 Gly16의 천식 환자, 인종의 잠재적 혼동, 및 온화한 소아과 천식 환자의 이용은 다른 사람들(Martinez et al., 1997)의 연구가 인도 천식 환자, 특히 다수의 천식 환자와 심각한 천식을 갖는 성인 인도인을 이용하는 본 발명자의 연구와 비교할 수 없도록 한다. 본 출원인들은 인도 사람에게서 천식과 관계된 β2AR 유전자에서 어떠한 SNP도 발견할 수 없었다.
실시예 5
Ⅴ. 진단 키트:
본 발명은 β 아고니스트에 대한 개체의 반응을 예측하는 진단 키트를 제공한다.
진단 키트는 서열 번호 2 및 3의 PCR 증폭 프라이머,
서열 번호 4 또는 5의 스냅샷(snapshot) 프라이머,
서열 번호 6, 7, 8, 및 9의 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 적어도 하나의 대립유전자 특정 올리고뉴클레오티드, 및
PCR 또는 혼성화 반응을 위한 적절한 버퍼를 포함한다.
대안적으로 대립유전자 특정 올리고뉴클레오티드는 β2AR 유전자의 다형을 검출하는데 사용될 수 있는 기질에 고정되어 제공될 수 있다. 키트의 선택적인 추가 요소는 예를 들어 제한 효소, 폴리머레이즈(polymerase), 기질 뉴클레오시드 트리포스페이트(substrate nucleoside triphosphate), 라벨에 사용되는 수단(예컨대, 라벨이 바이오틴인 경우, 아비딘 효소 접합체, 효소 기질 및 크로모겐)을 포함한다.
실시예 6
흡입된 β2 아고니스트에 의한 기도 반응성 측정:
천식 진단은 가역적인 기도 폐쇄의 존재 하에서 질병에 따른 징후 및 증상의 양성 히스토리에 기초하여 이루어졌다. 모든 환자들은 다른 가능성있는 흉부 질환 을 배제하기 위하여 일반적인 실험실 진단 테스트 및 폐기능 테스트(PFT)를 받았다. 폐활량 측정 테스트에서 최소 3개의 수용가능한 조작(maneuver)이 이루어졌고, "베스트 테스트" 커브가 선택되었다. 여기서, "베스트 테스트" 커브는 미국 흉부 협회(American Thoracic Society)에 의해 규정된 수용성 척도와 일치하며, FVC와 FEV1의 최대 합을 나타내는 테스트로 정의된다. 기도 폐쇄 징후를 나타내는 환자는 살부타몰(β 2 아드레너직 아고니스트) 200㎍이 주어졌고, 상기 테스트는 20분 후에 반복되었다. 이것은 기도 폐쇄의 가역성 정도를 산정하기 위해 수행되었다. 동일한 공정이 2주 이상의 간격으로 2-3회 반복되었으며, FEV1의 베스트 %age 지수 변화가 천식 환자를 살부타몰에 대한 양호, 불량 또는 비반응자로 분류하기 위해 채택되었다.
실시예 7
β2AR 유전자의 다형 확인:
본 발명자들은 인도인의 5' 상류의 인접 영역과 β2AR 유전자의 코딩 시퀀스에서 인도인의 10개의 다형 사이트를 확인하였다(표 2). 이는 ATG 개시 사이트의 1581 염기쌍 상류로부터 ATG 개시 사이트의 약 750 염기쌍 하류에까지 10개의 다형 사이트의 검사를 설명한다. 드리스달 등(2000)에 의해 인간에게서 발견된 13개의 다형 사이트는 인도인들에게서 단지 10개의 다형 사이트가 있다는 우리의 발견과 차이가 있다. 하플로타입이 모든 사이트에서 동형 접합체인 또는 하나 이하의 다양한 사이트에서 이형 접합체인 개체들로부터 직접 할당되어 있는 클라크 알고리즘(Clark, 1990)의 확장을 이용하여 표 3에 나타난 7개의 하플로타입 쌍이 언페이 스된 유전형으로부터 평가되었다.
지시된 위치가 GenBank accession No.- AC011354에 대응하는 PCR 프라이머를 사용하여 β2AR 유전자의 중첩 부분이 천식 환자 및 정상 인도 개체의 유전자 DNA로부터 증폭되었다.
제1 부분
프라이머의 포지션이 개시 코돈이 +1인 제1 뉴클레오티드에 기초한다.
순방향 프라이머: nt -1472 내지 -1448
역방향 프라이머: nt -530 내지 -548의 요소
942nt 생성물(-1472 내지 -530)
제2 부분
순방향 프라이머(서열 번호 2): nt -811 내지 -787
역방향 프라이머(서열 번호 3): nt +143 내지 +122의 요소
954nt 생성물(-811 내지 +143)
제3 부분
순방향 프라이머(5): nt +126 내지 +148
역방향 프라이머(6): nt +721 내지 +699의 요소
595nt 생성물(+721 내지 +126)
표 2 : 인도 사람의 β2AR 유전자에서 확인된 다형
뉴클레오티드의 수는 프라이머의 포지션이 개시 코돈이 +1인 제1 뉴클레오티드에 기초한다. 대립유전자 대립유전자
-1023 G A
-654 G A
-468 G C
-367 C T
-47 C T
-20 T C
46 A G
79 C G
252 G A
523 C A
표 3 : 여기에 나타난 7개의 하플로타입 쌍은 하플로타입이 모든 사이트에서 동형 접합체인 또는 하나 이하의 다양한 사이트에서 이형 접합체인 개체들로부터 직접 할당되어 있는 클라크 알고리즘(Clark, 1990)의 확장을 사용하여 언페이스된 유전형으로부터 평가되었다.
-1023 -654 -468 -367 -47 -20 46 79 252 523
1. A G G C C C G G G C
2. G A C T T T A C G C
3. G A C T T T G C G C
4. G G C T T T G C A A
5. G A C T T T A C A A
6. G G C T T T G C A C
7. G G C T T T G C G C
실시예 8
β2AR 유전자에서 비동의적 다형의 확인:
본 실시예는 PCR에 의해 β2AR 유전자의 엑손 영역에서 비동의적 다형을 확인하고, 본 발명에 따른 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시퀀스하는 것을 기술한다.
게노믹 DNA는 염-침전법(salt-precipitation method)(Miller et al., 1988)을 사용하여 모세혈로부터 분리되었다. DNA의 농도는 260nm의 파장에서 샘플의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 그 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머 2 및 3(서 열 번호 2 및 3)을 사용하여 천식 환자의 DNA가 PCR에 의해 증폭되었다. 각 50㎕의 PCR 반응은 10x PCR 버퍼(Tris 100mM(pH 9.0), KCl 500mM, 및 젤라틴 0.1%를 포함함) 내에 DNA 200ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 2 및 3(서열 번호 2 및 3) 각각 20pmol, 타크 폴리머레이즈(Taq Polymerase) (Bangalore Genei), 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포시페이트(deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP)을 포함하였다.
상기 샘플은 94℃에서 5분동안 변성되었고(denatured), 이후 PCR 시스템(Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600)에서 94℃의 온도로 45초간 변성, 56℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1.2분간 확장(extension) 및 72℃에서 10분간 최종 확장이 37 사이클 동안 수행되었다. 이 반응은 954bp의 DNA 절편을 생성하였다. PCR 생성물은 폴리에틸렌 글리콜/소듐 아세테이트(Poly Ethylene Glycol/Sodium acetate) 용액(PEG 8000, 1M의 마스네슘 클로라이드, 및 3M 언히드러스 소듐 아세테이트를 포함하며, pH는 4-8임)에 의해 정제되었다. PCR 생성물의 2개의 스트랜드(strand) 모두 자동화된 DNA 시퀀서(ABI Prism 3100 automated DNA sequencer) 상에서 염색 말단 화학(dye terminator chemistry)을 이용하여 직접 시퀀스되었다. PCR 생성물은 데이터 베이스(GenBank Accession No.- AC011354)의 β2AR 유전자 시퀀스의 엑손과 동일한 것으로 나타났다. 시퀀스는 시퀀스 프로그램(Factura and Sequence Navigator software programs)를 이용하여 대응하는 와일드형 시퀀스와 연결되었다.
실시예 9
개체군에서의 다형 스크린:
본 실시예는 단일 뉴클레오티드 변이를 스크린하는데에 사용된 프라이머 확장 반응(extension reation)을 설명한다. 여러 천식 환자(반응자/비반응자) 및 여러 정상 주체로부터의 DNA 샘플이 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 생성물은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 정제되었다. 프라이머 확장 반응은 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 스냅샷 ddNTP 프라이머 확장 키트(PE Biosystems)를 이용하여 정제된 PCR 생성물 상에서 수행되었다. 스냅샷 기술은 분자 연구에서 확장적으로 사용되며, 다형 유전자 자리에서 정확한 염기를 확인하는데 유용하다. 전체 스냅샷 프로토콜을 위한 후속되는 기초 방법론은 모든 연구에서 동일하다. 그러나, 각 스냅샷 프로토콜은 그 자체로서 고유하다. 이것은 각 프로토콜이 특정한 유전자 자리이기 때문이다. 따라서, 특정 작동 프로토콜은 특정한 유전자 자리를 확인하기 위해 개발되고 발명되어야 한다. 다시 말하면, 본 연구에서 스냅샷 프로토콜을 이용하여 개발된 반응 및 PCR 조건은 다른 질병의 유전자 자리에 사용된 다른 스냅샷 기술과 다르다. 이것은 본 발명에서 주어진 스냅샷 기술의 신규한 특정 프로토콜이 매우 특정한 유전자 자리, 예를 들어 β2AR 유전자 자리에 대하여 확립되었음을 의미한다. 이 프로토콜은 단지 이 특정하게 디자인되고 개발된 서열 번호 4 및 서열 번호 5를 갖는 프라이머가 사용될 때 작동될 것이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 끝에서 2번째 포지션의 변이까지 디자인되었고, 프라이머는 변이 대립유전자에 따라 존재하는 하나의 ddNTP에 의해 확장된다. 상기 반응은 서열 번호 4 및 서열 번호 5를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 시스템(Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600) 에서 변성(96℃, 10분), 어닐링(55℃, 5초) 및 확장(60℃, 30초)의 30 사이클 동안 수행되었다. 프라이머 확장 생성물은 결합되지 않은 디디옥시뉴클레오티드(unincorporated dideoxynucleotide)를 제거하기 위하여 송아지 소장의 알칼리 포스퍼테이즈(calf intestine alkaline phosphatase) (New England Biolabs)로 처리되었다. 상기 생성물은 자동화된 DNA 시퀀서(ABI Prism 3100 automated DNA sequencer)에서 이루어졌다. 형광 표지되어 있으며, 결합되어 있지 않은 디디옥시뉴클레오티드의 색상에 따라 β2AR 유전자의 와일드형 및 다형 대립유전자가 검출되었다.
실시예 10
β2AR 유전자의 대립유전자 변이의 뉴클레오티드 시퀀스:
실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 유도된 β2AR 유전자의 대립유전자 변이의 뉴클레오티드 시퀀스는 다음과 같다.
(서열 번호 1)
5'GTT CGG AGT ACC CAG ATG GAG ACA TCC GTG TCT GTG TCG CTC TGG ATG CCT CCA AGC CAG CGT GTG TTT ACT TTC TGT GTG TGT CAC CAT GTC TTT GTG CTT CTG GGT GCT TCT GTG TTT GTT TCT GGC CGC GTT TCT GTG TTG GAC AGG GGT GAC TTT GTG CCG GAT GGC TTC TGT GTG AGA GCG CGC GCG AGT GTG CAT GTC GGT GAG CTG GGA GGG TGT GTC TCA GTG TCT ATG GCT GTG GTT CGG TAT AAG TCT GAG CAT GTC TGC CAG GGT GTA TTT GTG CCT GTA TGT GCG TGC CTC GGT GGG CAC TCT CGT TTC CTT CCG AAT GTG GGG CAG TGC CGG TGT GCT GCC CTC TGC CTT GAG ACC TCA AGC CGC GCA GGC GCC CAG GGC AGG CAG GTA GCG GCC ACA GAA GAG CCA AAA GCT CCC GGG TTG GCT GGT AAG GAC ACC ACC TCC AGC TTT AGC CCT CTG GGG CCA GCC AGG GTA GCC GGG AAG CAG TGG TGG CCC GCC CTC CAG GGA GCA GTT GGG CCC CGC CCG GGC CAG CCC CAG GAG AAG GAG GGC GAG GGG AGG GGA GGG AAA GGG GAG GAG TGC CTC GCC CCT TCG CGG CTG CCG GCG TGC CAT TGG CCG AAA GTT CCC GTA CGT CAC GGC GAG GGC AGT TCC CCT AAA GTC CTG TGC ACA TAA CGG GCA GAA CGC ACT GCG AAG CGG CTT CTT CAG AGC ACG GGC TGG AAC TGG CAG GCA CCG CGA GCC CCT AGC ACC CGA CAA GCT GAG TGT GCA GGA CGA GTC CCC ACC ACA CCC ACA CCA CAG CCG CTG AAT GAG GCT TCC AGG CGT CCG CTC GCG GCC CGC AGA GCC CCG CCG TGG GTC CGC CCG CTG AGG CGC CCC CAG CCA G TG CGC TTA CCT GCC AGA CTG CGC GCC ATG GGG CAA CCC GGG AAC GGC AGC GCC TTC TTG CTG GCA CCC AAT A*GA AGC CAT GCG CCG GAC CAC GAC GTC ACG CAG CAA AGG GAC GAG GTG TGG GTG GTG GGC ATG GGC ATC GTC ATG TCT CTC ATC GTC CTG GCC ATC GTG TTT GGC AAT GTG CTG GTC ATC ACA GCC ATT GCC AAG T TC GAG CGT CTG CAG ACG GTC ACC AAC TAC TTC ATC ACT TCA CTG GCC TGT GCT GAT CTG GTC 3'
실시예 11
약물 반응과 비동의적 다형의 관계
비동의적 SNP 또는 다형은 "변형된 코드(code)가 와일드형 시퀀스와 동일한 아미노산에 대응하지 않을 때, 예컨대 이들은 다른 아미노산을 유발하는 코딩 영역의 치환인 것"으로 정의된다.
본 발명자들은 인도인들의 살부타몰에 대한 환자 기관지 확장 반응이 뉴클레 오티드 포지션 46에서 β2AR 유전자의 단지 하나의 다형 사이트를 게노타이핑하는 것에 의해 신뢰성 있게 예측될 수 있음을 발견하였다. 또한, 여러 천식 환자(반응자 및 비반응자)의 게노타이핑은 β2 아고니스트과 변형된 반응의 중요한 관계를 보여주었다. 이 결과는 β2 아고니스트에 대한 변성된 반응에 단독으로 원인이 되는 단일 변성의 연관성의 제1 증거를 구성한다. 동형 접합체 Arg16 및 동형 접합체 Gly16은 인도인에서 열등한 반응과 양호한 반응 간의 관계를 보여주었다(도 1d). 나아가, 매우 적은 수의 양성 기관지 확장 반응을 갖는 동형 접합체 Arg16 천식 환자 및 음성 기관지 확장 반응을 갖는 Gly16 천식 환자, 인종의 잠재적 혼동, 및 온화한 소아과 천식 환자의 이용은 다른 사람들(Martinez et al., 1997)의 연구가 인도 천식 환자, 특히 다수의 천식 환자와 심각한 천식을 갖는 성인 인도인을 이용하는 본 발명자의 연구와 비교할 수 없도록 한다. 본 출원인들은 인도 사람에게서 천식과 관계된 β2AR 유전자에서 어떠한 SNP도 발견할 수 없었다.
AA 유전자형을 갖는 환자는 0.76의 확률로 열등 반응자가 될 것으로 예상되고, GG 유전자형을 갖는 환자는 0.72의 확률로 양호한 반응자가 될 것으로 예상된다.
살부타몰 처치에 대한 반응자 상태 및 천식 환자의 β2AR 유전자에서의 유전자형은 인도 사람에게서 강하게 연관되어 있다(χ2=11.28, df=2, p=0.004).
실시예 12
뉴클레오티드 포지션 46에서의 다형을 확인하기 위하여 시퀀스 특정 올리고뉴클레오티드(sequence specific oligonucleotide; SSO) 혼성화 실험이 준비되었 다. 상기 실험은 PCR에 의한 관심 영역의 증폭에 기초하였다. PCR에 후속하여 나이론 막에서 PCR 생성물의 블로팅(blotting)이 수행되었고, 이어서 서열 번호 6, 7, 8, 및 9의 방사선 표지된 프라이머와 혼성화되었다. 천식 환자로부터의 DNA는 올리고뉴클레오티드 프라이머 2 및 3(서열 번호 2 및 3)을 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 각 50㎕의 PCR 반응은 10x PCR 버퍼(Tris 100mM(pH 9.0), KCl 500mM, 및 젤라틴 0.1%를 포함함) 내에 DNA 200ng, 올리고뉴클레오티드 프라이머 2 및 3(서열 번호 2 및 3) 각각 20pmol, 타크 폴리머레이즈(Taq Polymerase) (Bangalore Genei), 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포시페이트(deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP)을 포함하였다.
상기와 같이 생성된 PCR 생성물 각각의 1㎕는 1%의 아가로즈 겔 상에서 전기영동되었고, 나일론막으로 이동되고, 6X SSPE(NaCl 0.9M; NaH2PO4 70mM; EDTA 6mM), 0.5% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate; SDS), 5X Denhardt's, 및 뉴클레오티드 포지션 46에 특정한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 갖는 연어 정자 DNA 100㎍/ml에서 혼성화되었다. 혼성화는 표준 프로토콜로서 결정된 각 올리고뉴클레오티드의 녹는점에서 엄격한 조건(stringent condition)에 수행되었다. 필터가 2X SSPE, 0.1% SDS에서 10분동안 상온에서 2회 세척되고, 6X SSPE, 1% SDS에서 10분 동안, 녹는점보다 2℃ 높은 온도에서 세척되었고, 그 후 자가방사선(autoradiography)에 노출되었다. 방사선 표지된 대립유전자 특정 프라이머(서열 번호 6, 7, 8, 및 9)를 갖는 포지션 46의 SNP을 포함하는 시퀀스의 PCR 생성물의 혼성화로 유발된 혼성화된 지점을 분석하기 위해 상기 노출된 방사선 사진이 분석 되었다. 서열 번호 6, 7, 8, 및 9의 대립유전자 특정 프라이머의 결과가 각각 도 2a, 도 2b, 도 2c, 및 도 2d에 도시되어 있다.
도 2a 및 도 2b을 참조하면, 각 도면에서의 2개의 래인(lane) 중 하나의 래인은 서열 번호 6 및 7의 대립유전자 특정 프라이머를 갖는 혼성화된 지점을 보여주며, 대립유전자 A의 존재를 확인하여 주었다. 반면, 도 2c 및 도 2d에서 서열 번호 8 및 9의 대립유전자 특정 프라이머를 갖는 혼성화된 지점은 46 뉴클레오티드 포지션에서 대립유전자 G의 존재를 확인하여 주었다.
참조:
1. Bjermer, L. , Diamant, Z. (2002). The use of leukotriene receptor antagonists (LTRAs) as complementary therapy in asthma. Monaldi Arch Chest Dis. 57(1):76-83.
2. Chabra S. K. (1998). Epidemiology of childhood asthma. Ind. J. of Chest Disease & Allied Sci. 40: 179-93.
3. Clark, A. G. , Mol Bio Evol 7,111-122, 1990.
4.Cockcroft, D. W. and Swystun, V. A. (1996). antagonism: tolerance produced by inhaled beta 2 agonist. Thorax 51, 1051-1056.
5. Dennis S. M., Sharp S. J., Vickers M. R., et al. (2000). Regular inhaled salbutamol and asthma control: the TRUST randomized trial. Therapy Working Group of the National Asthma Task Force and the MRC General Practice Research Framework. Lancet 355:1675-9
6. Dewar, Wheatley, Venn, Morrison, Britton & Hall (1998). Beta2-adrenoceptor polymorphisms are in linkage disequilibrium, but are not associated with asthma in an adult population. Clinical & Experimental Allergy, 28 (4) :442 -448.
7. Dewar, J. C., Wilkinson, J. , Wheatley, A. , N. Thomas, S. (1997) . The glutamine 27 beta2-adrenoceptor polymorphism is associated with elevated IgE levels in asthmatic families. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 100 (2) : 261-265.
8. Drysdale, Connie M. , Judson, Richard S. , Liggett, Stephen B. , Nandabalan, K. , Stack, Catherine B. , Stephens, J. Claiborne (2002). Association of beta2-adrenergic receptor haplotypes with drug response.
9. Eh, W. , Walters, J. , Gibson, Mdp (2003). Inhaled long acting beta agonists for stable chronic asthma. Cochrane Database Syst Rev.; 4:CD001385.
10. Green, S. A. (1994). Amino-Terminal Polymorphisms of the Human B2-Adrenergic Receptor Impart Distinct Agonist-Promoted Regulatory Properties. Biochemistry,Vol. 33, P. 9414 - 9419.
11. Green, S. A.,Turld, J. ,Bejarano@, P. , Hall, I. P. , and Liggett, S. B. (1995). Influence of beta 2-adrenergic receptor genotypes on signal transduction in human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13: 25-33.
12. Hoit, B. D. , Suresh, D. P. , Craft, L. , Walsh, R. A., Liggett S. B. (2000). Beta2-adrenergic receptor polymorphisms at amino acid 16 differentially influence agonist-stimulated blood pressure and peripheral blood flow in normal individuals. Am Heart J. 139(3):537- 42.
13. Jeffrey, M. Drazen, Edwin K. Silverman and Tak H. Lee (2000). Heterogeneity of therapeutic responses in asthma. British Medical Bulletin 56:1054-1070.
14. Johnson, M. (1998) The beta-adrenoceptor. Am J Respir Crit Care Med. 158(5 Pt 3) :S146.
15. Kobilka, B. K. , Dixon, R. A. , Frielle, H. G. , Dohlman, M. A., Bolanowski, I. and Sigal 1. S. (1987). cDNA for the human beta2-adrenergic receptor: a protein with multiple spanning domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with that of a receptor for platelet growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci 84:46-50.
16. Large,V.,Hellstrom, L. , Reynisdottir, S.,Lonnqvist, F. , Eriksson, P. , Lannfelt, L and Amer, P (1997). Human Beta-2 Adrenoceptor Gene Polymorphisms Are Highly Frequent in Obesity and Associate with Altered Adipocyte Beta-2 Adrenoceptor Function. J. Clin. Invest. 100:3005-3013.
17. Liggett, S. B. , Wagoner, LE., Craft, L. L., Hornung, R. W., Hoit, B. D., McIntosh, T. C. and Walsh, R. A (1998). TheIlel64 2-Adrenergic Receptor Polymorphism Adversely Affects the Outcome of Congestive Heart Failure. J. Clin. Invest. 102:1534-1539. Lipworth, B. J. , Hall, 1. P. , Aziz, I. , Tan, K. S. and Wheatley, A. (1999). Beta2- Adrenoceptor polymorphism and bronchoprotective sensitivity with regular short- and long-acting beta2-agonist therapy. Clinical Science 96: 253-259.
18. Martin, R. J. (2003). Considering therapeutic options in the real world. J Allergy ClinImmunol. 112(5 Suppl):S112-115.
19. Martinez, F. D. , Graves, P. E. , Baldini, M. , Solomon, S. and Erickson, R.(1997). Association between Genetic Polymorphisms of the beta2-Adrenoceptor and Response to Albuterol in Children with and without a History of Wheezing. J. Clin. Invest. 100: 3184-3188.
20. National Asthma Education and Prevention Program (1997) Expert Panel Report II, Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma, National Institutes of Health Publication 9724051, Bethesda, MD.
21. Ohe, M. , Munakata, M. , Hizawa, N. , Itoh, A. , Doi, I. , Yamaguchi, E., Homma, Y and Kawakami, Y (1995). Beta 2 adrenergic receptor gene restriction fragment length polymorphism and bronchial asthma. Thorax 50: 353 - 359.
22. O'Connor B.J.,Ailanan S. L., and Bames P.J.(1992). Tolerance to the nonbronchodilator effects of inhaled beta 2-agonists in asthma. N Engl J Med 327:1204-8 23. Reihsaus, E. , Innis, M., Maclntyre, N and Liggett, S. B. (1993) Mutations in the gene encoding for the beta 2-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol Biol. 8(3):334-339.
24. Scott M. G. H. , Swan C. , Wheatley A. P. , and Hall 1. P. (1999). Identification of novel polymorphisms within the promoter region of the human ss; 2 adrenergic receptor gene. Br J Pharmacol 126: 841-844.
25. Sulci B. , Frey (2003). Temporal dynamics of recurrent airway symptoms and cellular random walk. U. J Appl Physiol. 95(5):2122-21227.
26. Settipane, R. A. (2003). Defining the effects of an inhaled corticosteroid and long-acting beta-agonist on therapeutic targets. Allergy Asthma Proc. Mar-Apr;24(2):85-89.
27. 28.Sakane, N. , Yoshida, T., Umekawa, T. , Kogure, A. , Kondo, M.(1999). ss; 2-adrenoceptor gene polymorphism and obesity. Lancet 353 (9168):1976.
28. Turki, J. , Jolm N. Lorenz, Stuart A. Green, Elizabeth T. Donnelly, Marie Jacinto, and Stephen B. Liggett. (1996). signaling defects and impaired cardiac function of a human beta2-adrenergic receptor polymorphism expressed in transgenic mice. PNAS 93: 10483-10488.
29. Turki J, Pak J, Green SA, Martin RJ, Liggett SB (1995). Genetic polymorphisms of the beta 2-adrenergic receptor in nocturnal andnonnocturnal asthma. Evidence thatGlyl6 correlates with the nocturnal phenotype. J Clin Invest. 95(4):1635-1641.
30. Tan, S. , Hall, I. P. , Dewar, J. , Dow, E. , Lipworth, B. (1997). Association between ss;2- adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderately severe stable asthmatics. Lancet 350 (9083) : 995.
31. Xu, B. Y. , Huang, D. , Pirskanen, R & Lefvert, A.K. (2000). Beta2- adrenergic receptor gene polymorphisms in myasthenia gravis (MG). Clinical & Experimental Immunology 119 (1) Page 156.
<110> COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH <120> A method of detecting and predicting bronchodilatory response to a beta agonist drug <130> 1 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 gttcggagta cccagatgga gacatccgtg tctgtgtcgc tctggatgcc tccaagccag 60 cgtgtgttta ctttctgtgt gtgtcaccat gtctttgtgc ttctgggtgc ttctgtgttt 120 gtttctggcc gcgtttctgt gttggacagg ggtgactttg tgccggatgg cttctgtgtg 180 agagcgcgcg cgagtgtgca tgtcggtgag ctgggagggt gtgtctcagt gtctatggct 240 gtggttcggt ataagtctga gcatgtctgc cagggtgtat ttgtgcctgt atgtgcgtgc 300 ctcggtgggc actctcgttt ccttccgaat gtggggcagt gccggtgtgc tgccctctgc 360 cttgagacct caagccgcgc aggcgcccag ggcaggcagg tagcggccac agaagagcca 420 aaagctcccg ggttggctgg taaggacacc acctccagct ttagccctct ggggccagcc 480 agggtagccg ggaagcagtg gtggcccgcc ctccagggag cagttgggcc ccgcccgggc 540 cagccccagg agaaggaggg cgaggggagg ggagggaaag gggaggagtg cctcgcccct 600 tcgcggctgc cggcgtgcca ttggccgaaa gttcccgtac gtcacggcga gggcagttcc 660 cctaaagtcc tgtgcacata acgggcagaa cgcactgcga agcggcttct tcagagcacg 720 ggctggaact ggcaggcacc gcgagcccct agcacccgac aagctgagtg tgcaggacga 780 gtccccacca cacccacacc acagccgctg aatgaggctt ccaggcgtcc gctcgcggcc 840 cgcagagccc cgccgtgggt ccgcccgctg aggcgccccc agccagtgcg cttacctgcc 900 agactgcgcg ccatggggca acccgggaac ggcagcgcct tcttgctggc acccaata*g 960 aagccatgcg ccggaccacg acgtcacgca gcaaagggac gaggtgtggg tggtgggcat 1020 gggcatcgtc atgtctctca tcgtcctggc catcgtgttt ggcaatgtgc tggtcatcac 1080 agccattgcc aagttcgagc gtctgcagac ggtcaccaac tacttcatca cttcactggc 1140 ctgtgctgat ctggtc 1156 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 tctgggtgct tctgtgtttg tttc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 acgatggcca ggacgatgag a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Oligonucleotide <400> 4 gccttcttgc tggcacccaa t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 5 cgtggtccgg cgcatggctt c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 6 gcacccaata gaagccatg 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 catggcttct attgggtgc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 8 gcacccaatg gaagccatg 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 9 catggcttcc attgggtgc 19

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  27. β2 아고니스트에 대한 천식 환자의 기관지 확장 반응을 예측 및 검출하기 위한 키트로서,
    (a) 서열 번호 2 및 3을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제1 세트,
    (b) 서열 번호 4 및 5를 갖는 프라이머의 제2 세트, 및
    (c) 서열 번호 6, 7, 8, 및 9를 갖는 올리고뉴클레오티드의 제3 세트를 포함하는 키트.
  28. 제27 항에 있어서,
    서열 번호 2 및 3을 갖는 프라이머의 제1 세트는 β2AR 코딩 영역을 증폭 및 검출하는데 적합한 키트.
  29. 제27 항에 있어서,
    서열 번호 4 및 5를 갖는 프라이머는 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일한 β2AR 유전자의 뉴클레오티드 포지션 46에서 염기 A가 G로 치환되어 있는 단일 뉴클레오티드 다형을 검출하는 스냅샷 프라이머인 키트.
  30. 제27 항에 있어서,
    서열 번호 6, 7, 8, 및 9를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 상기 제3 세트는 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일한 β2AR 유전자의 뉴클레오티드 포지션 46에서 염기 A가 G로 치환되어 있는 단일 뉴클레오티드 다형을 확인하는 ASO 프로브인 키트.
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  32. 제27 항에 있어서,
    상기 키트는 살부타몰에 대하여 우량 반응자와 연관된 유전형 GG, 및 열등 반응자와 연관된 유전형 AA를 갖는 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일한 β2AR 유전자의 뉴클레오티드 포지션 46에서 SNPs를 검출하는 키트.
  33. 제27 항에 있어서,
    상기 키트는 비반응자 천식 환자의 기관지 확장을 유도하는데 적합한 치료의 확인에 유용한 키트.
  34. 제27 항에 있어서,
    상기 키트는 인간에게서 서열 번호 1에서의 857 염기 포지션과 동일한 β2AR 유전자의 뉴클레오티드 포지션 46에서 염기 A가 G로 치환되어 있는 단일 뉴클레오티드 다형을 예측 및 검출하기 위한 약리유전학적 마커, 프라이머 및 프로브를 제공하는 키트.
  35. 제30 항에 있어서,
    상기 확인된 단일 뉴클레오티드 다형은 약리유전학적 마커로서 기능하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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GB2573297A (en) * 2018-04-30 2019-11-06 Mexichem Fluor Sa De Cv Pharmaceutical composition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586183B2 (en) * 2000-04-13 2003-07-01 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Association of β2-adrenergic receptor haplotypes with drug response

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156503A (en) * 1997-03-03 2000-12-05 The Regents Of The University Of California Diagnosing asthma patients predisposed to adverse β-agonist reactions

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