KR100903766B1

KR100903766B1 - 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2의 콩 발효물질을함유하는 어류용 사료첨가제

Info

Publication number: KR100903766B1
Application number: KR1020070138301A
Authority: KR
Inventors: 강재선; 김천규; 김강민; 김동희; 이진영; 홍용근; 최광진; 이상길; 황성우; 나해춘; 원태수
Original assignee: 주식회사 유영제약; 인제대학교 산학협력단; 강재선
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2009-06-19

Abstract

본 발명은 신규 분리균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus Polyfermenticus KJS-2)의 콩 발효물질을 함유하는 어류용 사료첨가제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 분리균주인 유산간균 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus Polyfermenticus KJS -2)를 콩에 접종하여 발효시켜 제조된 발효물질을 어류용 사료첨가제로 사용하여 돌돔의 이리도 바이러스(Irido virus) 감염에 대한 예방효과 및 복합적으로 감염되는 병원성 미생물균에 대한 치료효과를 통해 어류의 폐사 방지와 사료의 효율증대를 통해 궁극적으로는 어민의 소득 향상을 목적으로 안출된 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

Description

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2의 콩 발효물질을 함유하는 어류용 사료첨가제{Feed additives for cultivated fish including fermented soybean by Bacillus polyfermenticus KJS-2}

본 발명은 항균작용 및 항바이러스에 의한 어류의 폐사 방지와 사료의 효율증가를 목적으로 제공된 것으로서, 신규로 분리된 유산간균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 콩에 접종하여 발효시킨 후 이렇게 제조된 발효물질로 이루어진 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

양식 산업에서 이리도 바이러스에 의한 어류의 폐사율은 최소 30%에서 최대 90%이상으로써, 가장 심각한 질환중의 하나이며, 현재는 돌돔 뿐 만 아니라 참돔, 넙치, 농어 등에 이르기까지 바이러스가 확산되어 어민에게 큰 피해를 주고 있다. 하지만 아직까지 이리도 바이러스에 대한 특별한 대책이나 바이러스를 막기 위한 약물은 없는 실정이며 일부 국내외 연구기관에서 상기 바이러스 예방을 목적으로 한 백신을 제조하려는 노력에도 불구하고 아직까지는 효과적인 결과를 도출하지 못하고 있으며 백신이 제조되어도 그 효능에 대한 논란과 함께 잔류성으로 인한 인체에 미치는 영향 등에 대한 평가가 전무한 상태이므로 이를 산업화하기까지는 상당한 시간이 소요될 것으로 보인다.

또한 지금까지 어류용 사료 첨가제로는 항균작용 및 정화의 목적으로 미생물 자체를 사용한 예가 있으나 폐사율 개선, 사료 효율증가 및 바이러스 예방에 대한 문제점을 개선하기 위하여 미생물을 이용한 고체 발효물이 사용된 예는 없었다. 그리고 현재 폐사율 개선을 위한 항생제 사용은 잔류 및 남용 등으로 인한 내성의 문제가 대두 되면서 사용상의 제약은 물론 인체에 유해를 일으키는 등의 문제점으로 인해 항생제 사용 역시 큰 효과를 얻기가 어려워지고 있다.

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 를 이용하여 콩을 배지로 발효를 하고 그 발효물질을 어류용 사료첨가제로 사용함으로써 사료 효율을 증가시키며 해양 병원성균 및 바이러스에 대하여 항균 및 항바이러스 작용을 하여 어류의 폐사율을 감소시키므로 인하여 궁극적으로는 어민의 소득개선을 목적으로 상업화하기 위하여 제안되었다.

본 발명은 신규 분리 균주인 유산간균 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 이용한 콩 발효물질을 어류용 사료에 첨가하여 복용시킴으로서 항균 및 항바이러스 작용에 의한 어류 폐사 방지, 사료 효율 개선 작용 등을 통하여 궁극적으로 어류의 무 항생제 사육과 어민의 소득 증대에 기여 할 수 있는 매우 유용한 효과가 있는 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용한 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 이용하여 콩을 발효시켜 얻은 콩 발효물질을 동결 건조한 것과 이를 분쇄하여 미세한 가루로 만든 것 (이하 ‘ BP2FS’ 라고 함)을 보여주는 사진.

도 2는 본 발명에서 사용한 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 이용하여 콩을 3일 동안 발효하여 추출 및 부분 정제하여 얻은 물질의 엘씨매스 (LC/Mass) 분석 결과이며, 분자량(M.W)이 약 1,000내외의 지단백 (Lipopeptide)물질이 대부분 혼합되어 있는 것을 나타낸 것.

도 3은 본 발명에서 사용한 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 이용하여 콩을 3일동안 발효하여 얻은 산침전물 및 동결건조물에 의한 스트렙토코커스 인이에(Streptococcus iniae ATCC 29178), 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis DSM 6631), 비브리오 하베이 (Vibrio harveyi ATCC 14126), 비브리오 오다리 (Vibrio ordalii KCCM 41669), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus ATCC 27562), 플렉시박터 트락투오수스 (Flexibacter tractuosus KCTC 2670), 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda ATCC 15947), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garviae KCCM 40698)의 항균성 실험을 나타낸 결과물.

도 4는 임상실험(Field test)이 진행된 가두리 양식장의 모습을 촬영한 사진.

도 5는 실험기간인 2007. 07월 ～ 2007. 10월까지 이리도 바이러스(Irido virus) 및 병원성균에 의한 돌돔의 10일 간격의 누적 폐사량을 나타낸 그래프.

도 6은 실험 약 3개월 후인 10월 중순에 이리도 바이러스 (Irido virus) 및 해양 유래 병원성 균주인 비브리오 (Vibrio) 및 플렉시박터 (Flexibacter)로 추정되는 균주에 의해 돌돔이 폐사되는 모습을 촬영한 사진.

도 7은 실험 4개월 동안의 돌돔의 체중 (g)이 변화되는 모습을 나타낸 그래프.

도 8은 이리도 바이러스에 감염된 돌돔(대조군)과 건강한 돌돔(실험군)의 장기 및 비장 (Spleen)의 모습을 상호 비교하여 촬영한 사진.

도 9는 대조군에서 감염된 어류의 비장 (Spleen), 심장 (Heart), 간 (Liver)에서의 균주 확인을 나타낸 것으로, 실험용 플레이트의 왼쪽 반원은 대조군 중에서 정상적인 상태의 돌돔의 비장, 심장, 간에서의 병원성 미생물 검출 결과이고 플레이트의 오른쪽 반원은 대조군 중에서 병원성이 나타난 돌돔의 비장, 심장, 간에서의 병원성 미생물 검출 결과를 보여주는 사진.

도 10은 시험한 돌돔의 장내에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2, 도면에는 ‘BP 2’라 표현하였음)의 존재를 확인하기 위하여 돌돔의 내장 5 gram을 펩톤수(1.5% NaCl, 1% peptone) 20 ml에 현탁하고 100배 희석하여 500 μl 씩 플레이트에 도말하여 셀수 (colony counting)를 확인한 결과 대조군에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2는 검출되지 않았고 실험군에서만 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2는 평균 13 콜로니가 검출되었다. 이것은 약 5.2 x 10⁴ cfu/5 g (장기)/ 20 ml (1% peptone 수)로 확인 된 것임.

도 11은 시험한 돌돔의 비장 (Spleen)에서 이리도 바이러스 (Irido virus)확인을 위하여 피시알 (PCR:Polymerase chain reaction) 실험에 의한 결과를 나타낸 것.

도 12는 이리도 바이러스 (Irido virus)에 의해 감염된 어류의 특징인 이형비대세포 관찰을 위하여 헤마칼라 스테인 (Hemacolor stain)의 결과를 광학현미경으로 관찰한 것.

본 발명은 항균성이 우수한 신규 분리균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus Polyfermenticus KJS -2)의 콩 발효물질을 동결 건조하여 제조된 어류용 사료첨가제에 관한 것이다. 신규 분리균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus Polyfermenticus KJS -2)는 2006년 8월 16일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다.(기탁번호 KCCM 10769P)

본 발명자 등은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2, 기탁번호 KCCM 10769P), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis ), 트라우스토카이트리움 에스피. 케이제이에스-1 (Thraustochytrium sp. KJS-1, 기탁번호 KCCM 10667P)의 균주자체를 이용한 항균작용 및 정화 목적을 위한 어류용 사료 첨가제를 발명하여 특허출원 (특허출원번호: 10-2006-96935)하였으며, 본 발명은 콩을 멸균한 후 (121℃, 20 분) 상기 신규로 분리된 유산 간균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 기본배지인 TSA (Tryptic soy agar)에 배양하여 멸균된 콩에 붓고 40℃에서 배양하여 항균성 물질을 포함한 균주의 1차, 2차 대사산물을 생성토록 발효를 하고 그 생산물을 동결 건조과정을 거쳐 어류용 사료첨가제로 사용한 것이다. 이 경우에 대사산물 중에 고농도 발효에 의하여 만들어지는 생리 활성물질이 함유된 발효제품이 병원성균 및 바이러스 예방을 위한 사료 첨가제로 사용되어지게 된다.

특히 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)의 콩 발효 건조물로 이루어진 사료첨가제는 일반사료 1 킬로그램 당 유산균 콩 발효물 0.15 그램 내지 15 그램을 사용였을 때, 바람직하게는 0.3 그램 내지 7.5 그램을 사용하였을 때 나타내는 효과를 특징으로 발명한 것이며 이는 일반사료 1 그램 당 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)의 수가 약 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ cfu이며 바람직하게는 2 x 10⁶ 내지 5 x 10⁷ cfu임을 의미한다.

이하, 본 발명의 실제 실험 예(실시예)를 통해 상세히 설명하면 다음과 같다. 이하의 실시예 1 내지 7에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 균주를 이용한 콩 발효물질을 만드는 과정과 이것의 동결건조물(BP2FS)을 어류에 적용할 경우, 특히 돌돔에 적용할 경우의 복용량과 복용법을 나타내었고 그에 따른 결과를 보여주고 있다. 또한, 실험실적 결과(in vitro)로서 항균성 시험 및 감염 돌돔에서 PCR을 이용한 바이러스 확인 실험을 나타내었다. 임상시험(field test)은 경남 통영에 위치한 세보수산에서 실시하였으며 실험은 항생제를 전혀 사용하지 않고 진행되었다.

[실시예 1]

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 전 배양하여 멸균한 콩에 접종하여 콩 발효물질을 얻는 구체적인 과정은 다음과 같다.

본 발명자의 연구실에서 냉장 보관중인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 일정량 취하여 트립틱 소이 브로스 (Tryptic soy broth ,TSB, pH 7.2) 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 교반 배양하여 접종원 (seed strain)으로 사용하였다. 접종원 (seed strain)의 3 ㎖을 TSB 100 ㎖에 접종하여 12시간 액상 배양하였다 (이를 ‘2nd culture’로 명명함). 이와는 별도로 콩 100그램을 3차 증류수에 넣어 콩이 수분을 흡수하게 하였고, 콩에 내재되어 있는 균을 완전히 없애기 위해 121℃에서 20분간 고압증기 멸균을 실시하여 멸균된 콩을 사용하였고 상기 멸균된 콩은 순수분리 배양시 무균상태임을 확인할 수 있었다. 멸균된 콩 100 그램과 2nd culture의 균주 30 ㎖을 섞어 40℃에서 72시간 배양하였고 배양 후 4℃에 보관하여 충분히 식혀서 동결건조 하였다. 동결 건조물은 콩 100 그램을 기준으로 약 40 그램을 얻을 수 있었으며, 상기 동결 건조물을 일정 입자로 분쇄하여 실험용 사료 첨가제(이하 'BP2FS'라 함)로 사용하였다. (도 1 참조)

[실시예 2]

다음은 콩 발효물에 존재하는 유효성분을 정제하여 조사한 결과에 관한 것이다. 실시예 1에서와 같이 콩에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 를 접종 후 72시간동안 배양한 다음 메탄올에 넣어 원심분리 후 침전물을 제거하고 메탄올을 증발시켜 제거 한 후 3몰의 염산(3 M HCl)을 가지고 산도 2 (pH 2)로 만든 후 침전되는 물질만 원심 분리 하여 얻은 후 LC/Mass로 분석한 결과 약 1kda의 분자량(M.W)을 가지는 물질의 복합제로 밝혀졌다. 상기 물질은 7개의 아미노산에 지방산이 붙은 형태 (지단백, Lipopeptide)를 띠고 있으며 이는 Bacillus natto, Bacillus subtilis , Bacillus polyfermenticus SCD 균주가 생성하는 2차 대사산물과 유사성이 있으며 다만 섞여있는 아류 (subtype)의 종류와 각각의 함유량에서 차이점이 발생한다(도 2 참조).

이런 분석 결과는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)가 콩 발효에 의해 생성하는 모든 항균성 물질을 규명한 것은 아니며 다만 여러 항균성 물질 중에 분석이 완료된 대표적인 구조성분을 보여준 것이다. 그리고 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 이용한 지단백 (Lipopeptide)의 분석결과는 본 발명에 의해 처음 밝혀지게 되었다.

[실시예 3]

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 콩에서 발효시켜 얻은 동결건조물(BP2FS)의 실험실적 효과 (in vitro)를 검정하기 위하여 실시예 1 및 2에서의 동결건조물 및 산침전물을 이용하여 항균성 실험에 사용하였다. 항균성 실험은 spot-on-lawn방식으로 진행되었으며, 생물자원센터 및 한국미생물보존센터에서 실험용으로 분양받은 해양에서 분리된 유해균주인 스트렙토코커스 인이에(Streptococcus iniae ATCC 29178), 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis DSM 6631), 비브리오 하베이 (Vibrio harveyi ATCC 14126), 비브리오 오다리 (Vibrio ordalii KCCM 41669), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus ATCC 27562), 플렉시박터 트락투오수스 (Flexibacter tractuosus KCTC 2670), 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda ATCC 15947), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garviae KCCM 40698)에서 항균성 실험이 진행되었다.

모든 균주는 에탄올에 영향을 받았으며 50% 아세톤에서는 영향이 없음을 확인하여용매로 50% 아세톤을 선정하였고 각각의 병원성 균주들은 최적 생육조건에서 배양하여 항균력 여부를 관찰하였다. 항균성실험에서는 동결건조물 및 산침전물을 각각 1 mg/㎖, 500 μg/㎖의 농도로 20 ㎕씩 떨어 뜨려 시험하였다.

위의 실시예 1에서 얻은 동결건조물을 고압증기 멸균하여 내재된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 사멸 시킨 후 에탄올을 넣어 활성성분을 녹인 후 원심분리 (5000 rpm, 3분)하여 에탄올 층을 얻고 휘발에 의하여 에탄올을 제거하였으며 남아있는 침전물 (pellet)을 50% Acetone을 넣어 잘 섞고 filter (pore size 100 mesh)를 이용하여 여과한 후 고형물은 제거하고 50% acetone에 녹은 물질을 시험에 사용하였다.

또한 위의 실시예 2에서 얻은 산침전물은 3차 증류수 900 ㎖에 넣고 잘 섞은후 filter (pore size 100 mesh)를 이용하여 여과하고 고형물은 제거하고 50% Acetone에 녹여 항균성 시험을 하였다. 동결 건조물에서는 콩 100 그램을 기준으로 지단백(Lipopeptide)을 0.28~0.34 그램을 얻을 수 있었고, 산침전물에서는 콩 100 그램을 기준으로 지단백(Lipopeptide)을 1~5 그램을 얻을 수 있었다.

현재, 콩에 존재하는 물질로는 protease, melanoide, polymer hexane, peptide, polyglutamic acid, lecthin, saponin, phytic acid, trypsin inhibitor, antioxidant, fibroid materials가 존재한다고 알려져 있으며 항균성시험에 사용된 지단백 물질은 균을 통해 배양된 2차대사물질이라고 알려져 있다. (K.K. Gautam and V.K. Tyagi, Microbial surfactants: A review, Journal of oleo science. Vol. 55, no. 4, 155-166 2006; Akiko okamoto, Hiroshi hanagata, Yujio Kawamura and Fujiharu yanagida, Anti-hypertensive substance in fermented soybean, natto. 47, 39-47, 1995)

항균성 실험 결과 상기 분양받은 유해 균주 모두에서 유효성이 있는 결과를 얻었으며 이는 도 3을 참조하여 보면 투명한 부분이 효과를 보이는 결과이다.

[실시예 4]

실시예 1에서 얻은 동결 건조물(BP2FS)을 이용하여 약 3그램의 무게를 가지는 돌돔을 대상으로 가두리양식장에서 대조군 (일반사료만 투여) 1만 마리와 실험군 (일반사료 + BP2FS) 1만 마리로 나누어 시험을 실시하였다. 실험군 돌돔 1만 마리에 대한 BP2FS 사용량은 일반사료 1 킬로그램당 유산균의 수를 고려하여 0.15 그램 내지 15 그램을 혼합하여 1일 2회 사용하였다. 즉, 실험군 돌돔 1만 마리에 대한 BP2FS를 투여하여 최종균수를 사료 1g 당 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)의 수가 약 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ cfu/g 정도로, 특히 약 2.089 x 10⁷ cfu/ g 정도로 만들어 1일 2회 사용하였다. 실험은 약 4개월 (2007. 07 - 2007. 10)동안 시행되었으며 임상실험에서의 바이러스 및 병원성 균주에 대한 효과를 알아보기 위하여 병원성을 나타내는 돌돔 및 그렇지 않은 돌돔을 나누어 실험을 하였다.

실험의 결과로 바이러스 및 병원성 균주에 감염되어 폐사되는 돌돔의 개체수가 차이가 났으며 아래 표와 같이 실험종료일까지 120일 동안의 누적 폐사율은 대조군에서는 60.92 %(6092마리)였고 실험군은 18.95 %(1895마리)로 나타났다. (도 5 참조)

날짜(일)		10	20	30	40	50	60	70	80	90	100	110	120
누적폐사수	대조군	72	186	272	421	617	724	1050	1456	1716	3188	4752	6092
누적폐사수	실험군	67	112	244	322	365	463	609	696	815	1107	1454	1895
누적폐사율(%)	대조군	0.72	1.86	2.72	4.21	6.17	7.24	10.5	14.56	17.16	31.88	47.52	60.92
누적폐사율(%)	실험군	0.67	1.12	2.44	3.22	3.65	4.63	6.09	6.96	8.15	11.07	14.54	18.95

이리도 바이러스(Irido virus)가 활발한 10월 중순에 대조군 및 실험군의 건강하게 보이는 돌돔을 채집하여 여러 바이러스를 확인하기 위하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 한 결과 대조군에서만 이리도 바이러스(Irido virus)가 나타나는 것을 확인 하였다.(도 11 참조) 또한, 장기 전체의 무게를 비교한 결과 이리도 바이러스(Irido virus)가 감염된 어류에서만 나타나는 전체 장기 및 특히 비장 (Spleen)이 비대해짐을 대조군에서만 확인하였고(도 8 참조) 비장에서의 헤마칼러 스테인 (Hemacolor stain)을 하여 현미경을 확인한 결과 이형비대세포를 관찰 할 수 있었다. (도 12 참조)

비장(Spleen), 심장 (Heart), 간 (Liver) 조직에서의 균주를 확인하기 위하여 TSA (Tryptic soy agar)를 이용하여 시험 하였을 때 비브리오(Vibrio) 및 플렉시박터 (Flexibacter)로 추정되는 균주를 대조군에서만 확인할 수 있었다. (도 9 참조)

또한, 대조군 및 실험군 어류의 각 50마리에 대한 체중 (g)을 확인 한 결과 돌돔들의 체중 (g)이 실험일로부터 120일 후 대조군은 56.56 ± 8.21 g이었고 실험군은 67.29 ± 12.62 g으로 평균 약 11 g 더 증가함을 알 수 있었고(도 7 참조), 이리도 바이러스(Irido virus) 및 병원성균을 가진 대조군의 돌돔들의 내장이 비대해짐을 알 수 있었다. (도 8 참조)

실험중에 나타난 특징 중의 하나는 일반 사료를 복용시킨 시험군에 비하여, 일반사료에 BP2FS를 첨가한 시험군에서는 먹이 투입시에 먹이를 먹으려는 경향이 강하여 바닷물의 표면에 머물러 있는 경향을 보였으며 이러한 결과는 BP2FS를 사료에 첨가함으로써 특유의 냄새로 먹이를 유인하는 작용과 함께 체중증가라는 결과를 보이는 것으로 사료된다.

[실시예 5]

돌돔에 BP2FS 사료첨가제(2.089 x 10⁷ cfu/g)를 투여 한 후 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)의 셀수 (colony counting)를 확인하기 위하여 8월 중순, 10월 중순에 돌돔의 절식 5일 후 대조군 및 실험군의 각 3마리 장기를 적출하여 균주분리 후 순수배양 하였다. 구체적으로는 100℃, 30분 동안 처리한 장기전체를 펩톤수 (1.5% NaCl, 1% peptone) 20ml 현탁하고 100배 희석하여 500 μl 씩 플레이트에 도말하여 셀수 (colony counting)를 확인한 결과 실험군에서만 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)가 평균 13 콜로니 검출되었다. 이것은 약 5.2 x 10⁴ cfu/5 g (장기)/20ml(1% 펩톤수)으로 확인되었다.(도 10 참조) 이것은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)가 spore (포자) 균으로써 포자를 형성함으로써 장내에서 안정적으로 존재함을 의미한다.

[실시예 6]

대조군 및 실험군 돌돔에서의 바이러스를 확인하기 위하여 PCR( polymerase chain reaction)을 실시하였는데 먼저, 5마리 장기를 분쇄한 후 합쳐 50 -500 mg (장기)/ml (Trizol reagent)을 사용하여 5 - 10분간 상온에서 정치시킨다. Insoluble material을 제거하기 위하여 4℃, 12,000 g, 10분 동안 원심분리 하고 상등액을 e-tube (약 200 μl)에 옮긴다. 0.2 ㎖ Chloroform을 넣고 다시 1 ㎖ Trizol을 넣은 다음 15초 동안 손으로 살짝 흔들어 섞어 준 뒤 실온에서 2-3분 동안 배양한 후 4℃, 12,000 g, 10분 동안 원심분리 하여 상등액 약 500 μl을 얻고 다시 Trizol 500 μl을 넣어 거꾸로 하여 실온에서 10분간 정치시키고 4℃, 12,000 g, 10분 동안 원심 분리하여 희게 침전되는 Total RNA를 얻는다. -20℃에서 보관된 70% 에탄올(0.1% DEPC(diethylpyrocarbonate)/D.W)을 Total RNA가 있는 Tube에 채우고 vortex 후 4℃, 7,500 g, 5분 동안 원심분리 한다. 에탄올층을 제거하고 다시 spin down하여 여분의 에탄올층을 다시 제거한다 이렇게 하여 얻은 RNA를 기중건조 하거나 Vacuum pump로 진공건조후 0.1% DEPC/D.W 혹은 TE buffer 10-50 μl로 RNA를 얻고 바로 cDNA합성을 하였다. cDNA합성은 한 튜브에 First strand buffer (5x) 4 μl, 0.l M DTT (dithiothreitol) 1 μl , 0.1% DEPC/D.W 10 μl, dNTP(deoxynucleotide triphosphate) 1 μl, random primer 1 μl, Superscript II RT (Reverse transcriptase) 1 μl, RNA 2 μl, Total volume 20 μl로 하여 잘 섞고 cDNA합성을 위하여 1시간 동안 실온에서 배양하여 cDNA를 얻었다. 그 후 5 x PCR premix 9 μl, 멸균된 3차 증류수 7 μl, Foward primer 1 μl, Reverse primer 1 μl, cDNA 2 μl, Total volume 20 μl로 하여 PCR을 실시하였다. DNA바이러스인 이리도바이러스(Irido virus)는 total DNA를 분리하여 실험에 사용하였다. 각각의 바이러스에 대한 primer는 다음과 같다.

Birna virus: Foward-GCACCACGAAGGTACGAAAT,

Reverse-GTACGTTGCCGTTTCCTGAT,

Irido virus: Foward-GTGACTGCACACCAATGGAC,

Reverse- GGCTTTCTCAATCAGCTTGC,

HRV(Hirame rhabdo virus) virus: Foward-ACCCTGGGATTCCTTGATTC,

Reverse-TCTGGTGGGCACGATAAGTT,

VNN(Viral nervous necrosis) virus: Foward-CGGATACGTTGTTGTTGACG,

Reverse-CAACAGGCAGCAGAATTTGA,

VHS( Viral hemorrhagic septicemia) virus: Foward-GAGAGAACTGGCCCTGACTG,

Reverse-ATGATCCGTCTGGCTGACTC

또한 PCR반응의 조건은 Tag DNA polymerase (Takara)를 이용하여, Birna virus는 변성반응을 94℃에서 5분으로 하고, 이후 변성반응을 94℃에서 30초, 결합반응을 55℃에서 1분, 중합반응을 72℃에서 1분간 30주기를 반복하고, 마지막으로 중합반응을 72℃에서 7분간 연장시켜 반응하였고, Irido virus는 변성반응을 94℃에서 5분으로 하고, 이후 변성반응을 94℃에서 30초, 결합반응을 58℃에서 60초, 중합반응을 72℃에서 60초간 30주기를 반복하고, 마지막으로 중합반응을 72℃에서 7분간 연장시켜 반응하였으며, HRV(Hirame rhabdovirus)는 변성반응을 94℃에서 5분으로 하고, 이후 변성반응을 94℃에서 30초, 결합반응을 55℃에서 30초, 중합반응을 72℃에서 45초간 30주기를 반복하고, 마지막으로 중합반응을 72℃에서 7분간 연장시켜 반응하였고, VNN(Viral nervous necrosis) virus는 변성반응을 95℃에서 5분으로 하고, 이후 변성반응을 95℃에서 40초, 결합반응을 50℃에서 40초, 중합반응을 72℃에서 40초간 25주기를 반복하고, 마지막으로 중합반응을 72℃에서 7분간 연장시켜 반응하였고, 마지막으로 VHS(Viral hemorrhagic septicemia) virus는 변성반응을 94℃에서 5분으로 하고, 이후 변성반응을 94℃에서 30초, 결합반응을 52℃에서 30초, 중합반응을 68℃에서 60초간 35주기를 반복하고, 마지막으로 중합반응을 72℃에서 7분간 연장시켜 반응하였다. PCR반응 산물은 1.5% agarose gel에서 전기 영동하여 확인하였다. 각각의 virus에 대한 크기 (Size)는 Birnavirus : 597 bp, Irido virus: 698 bp, HRV (Hirame rhabdovirus) virus: 533 bp, VNN (Viral nervous necrosis) virus: 758 bp, VHS (Viral hemorrhagic septicemia) virus: 444 bp이고 대조군 및 실험군에서 각 5마리에서의 비장 (Spleen) 및 신장 (Kidney)을 확인결과 대조군에서만 이리도 바이러스(Irido virus)가 확인되었다. (도 11 참조)

[실시예 7]

이리도 바이러스(Irido virus)에 의해 감염된 대조군의 돌돔의 조직 내의 이형비대세포 (heteromorphic balloon cell; Enlarged cell)를 관찰하기 위하여 비장 (Spleen)을 분리하여 헤마칼라 스테인(Hemacolor stain)을 실시하였다. 먼저, 슬라이드 (Slide)에 비장내의 세균을 도말하여 5분 정도 굳히고 Hemacolor red 용액을 떨어뜨려 10초 정도 염색시키고 다시 Hemacolor blue 용액을 떨어뜨려 10초 정도 다시 염색시킨다. 천천히 물을 떨어뜨려 반응하지 않은 초과된 염색시약을 제거하고 완전히 말린다. 공기드라이어를 이용하여 완전히 굳히고 광학현미경을 통해 이리도 바이러스(Irido virus)에 의한 이형비대세포를 관찰할 수 있었다.(도 12 참조)

본 발명은 상기 기재된 실시예 1내지 7을 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술상의 범위내에서 수정이 가능함은 본 발명에 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 본 발명의 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

Claims

어류의 이리도 바이러스(Irido virus)에 대한 예방효과를 가지는 신규의 유산간균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2 )에 의한 콩 유산균 발효물을 포함하는 어류용 사료첨가제.
어류의 병원균주에 의한 폐사율감소 효과를 가지는 신규의 유산간균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2 )에 의한 콩 유산균 발효물을 포함하는 어류용 사료첨가제.
양식 어류의 사료 유인효과 및 체중증가 효과를 가지는 신규의 유산간균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2 )에 의한 콩 유산균 발효물을 포함하는 어류용 사료첨가제.
청구항 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 콩 유산균 발효물이란 항균성을 나타내는 지단백(lipopeptide)을 포함하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 어류용 사료첨가제는 동결건조시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
청구항 5항에 있어서, 어류용 사료첨가제는 일반사료 1 킬로그램당 0.15 그램 내지 15 그램을 사용하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
청구항 5항에 있어서, 어류용 사료첨가제는 일반사료 1 그램당 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ cfu가 포함되도록 사용하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 어류용 사료첨가제는 동결건조시켜 사용하고, 일반사료 1 킬로그램당 0.15 그램 내지 15그램을 사용하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 어류용 사료첨가제는 동결건조시켜 사용하고, 일반사료 1 그램당 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)를 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ cfu가 포함되도록 사용하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.