KR100880012B1 - 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의동시추출 및 분석 방법 - Google Patents

초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의동시추출 및 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돈육에 포함된 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 초임계유체추출법을 이용하여 동시추출하는 추출 공정 조건을 제공하고, 상기 초임계유체추출법을 이용하여 추출한 플루오로퀴놀론계 항생제들을 분석하는 방법을 제공하는 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법에 관한 것이다.
돈육, 항생제, 초임계유체추출, 동시추출

Description

초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법{Method for Simultaneous extraction and analysis of enrofloxacin, danofloxacin and ciprofloxacin in pig by using supercritical fluid extraction}
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 도시한 도면이다.
도 2a 내지 도 2c, 도 3a 내지 도 3c, 도 4a 내지 도 4c 및 도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 이용하여 돈육으로부터 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출하기 위한 초임계유체추출 방법의 공정 조건을 결정하기 위한 실험 결과를 도시한 그래프들이다.
도 6a 내지 도 6c는 돼지에게 엔로플록사신 및 다노플록사신을 각각 연속 7일간 및 연속 3일간 투여한 다음 최종 투약 후 1, 2, 3, 5, 7일째에 각 조직에서 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 잔류량을 나타내는 그래프들이다.
본 발명은 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 돈육에 포함된 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 초임계유체추출법을 이용하여 동시추출하는 추출 공정 조건을 제공하고, 상기 초임계유체추출법을 이용하여 추출한 플루오로퀴놀론계 항생제들을 분석하는 방법을 제공하는 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법에 관한 것이다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 가축과 사람에 널리 사용되는 중요한 합성 항생제 중 하나이다.
상기 플루오로퀴놀론계 항생제는 그램 양성 세균과 그램 음성 세균 모두에 항균활성을 나타내는 항균 범위가 넓은 매우 유용한 항생제이다.
또한, 이러한 넓은 항균활성 범위로 인해 돼지, 닭 및 소 등 식육용 가축에 널리 사용되고 있으며 그로 인해 식육용 가축에 잔류할 위험성이 있다. 식육용 가축에 잔류하는 항생물질은 인간에 사용되는 의약품에 대한 병원체의 내성을 유도할 수 있고, 플루오로퀴놀론계 항생제에 노출된 유아에서 중추신경에 영향을 미치는 부작용이 보고된 바 있다.
이와 같은 식육용 가축에 플루오로퀴놀론계 항생제가 잔류하는 것은 잠재적으로 문제를 야기시킬 것으로 추측되며, 이를 모니터링하는 것은 식품안전성 검사에서 중요한 항목 중의 하나로 여겨지고 있다.
따라서, 식육용 가축에서의 플루오로퀴놀론계 항생제를 검출하기 위한 방법을 개발하기 위하여 많은 연구가 수행되어져 왔다.
한편 돼지에서의 플루오로퀴놀론계 항생제를 크로마토그래피 방법으로 검출하기 위한 여러 가지 방법들이 보고되었으며, 대부분 형광이나 자외선 검출기, 부분적으로 질량 분석기를 사용한 액체크로마토그래피를 이용하는 방법들이었다.
상기 방법들은 유기 용매와 수용성 용매를 사용하여 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출한 다음 정제 과정(Cleanup procedure)을 거친 후 크로마토그래프에 주입하여 분석하는 것이다.
용매를 이용하여 생체 시료에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 경우에는 에멀션(emulsion)이나 거품을 만들어 항생제의 분리와 정제를 어렵게 하기도 하고 물질의 용해도를 고려하여 용매의 선택에 있어 세심한 주의가 필요하다.
또한 플루오로퀴놀론계 항생제의 종류에 따라 각기 다른 추출 방법과 정제 방법을 사용해야 하기 때문에 번거로우며 다량의 유기 용매를 소비하여 환경오염 배출이 많다는 단점이 있다. 그러므로 생체시료 중 플루오로퀴놀론계 항생제를 분석하는데 있어서 유기 용매의 사용량을 줄이는 친환경적인 추출방법이 필요한 실정이다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위한 것으로, 돈육에 포함된 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 초임계유체추출법을 이용하여 동시추출하는 추출 공정 조건을 제공하고, 상기 초임계유체추출법을 이용하여 추출한 플루오로퀴놀론계 항생제들을 분석하는 방법을 제공함으로써 용매를 이용한 추출 및 정제과정을 거치지 않아 경제적이고 환경 친화적일 뿐만 아니라 추출과정이 단순한 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법을 제공함에 본 발명의 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은 추출보조제를 10% 이상 포함하는 초임계유체 이산화탄소를 이용하고, 30분 이상의 추출시간, 40℃ 이상의 추출온도 및 250kg/㎠ 이상의 추출압력을 공정 조건으로 하는 초임계유체추출법을 이용하여 돈육에서 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시추출하는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법에 의해 달성된다.
또한, 본 발명의 상기 목적은 상기 추출시간이 40 내지 50분이거나, 상기 추출온도가 60 내지 80℃이거나, 상기 추출압력이 280 내지 300kg/㎠이거나, 상기 추출보조제가 20 내지 30%가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴 놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법에 의해서도 달성된다.
또한, 본 발명의 상기 목적은 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 투여한 경력이 없는 돼지로부터 시료를 채취하여 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 주입한 후 동결 건조하는 단계; 상기 동결건조된 시료를 이용하여 상기 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출할 수 있는 초임계유체추출법의 공정 조건을 마련하는 단계; 상기 공정 조건이 마련된 초임계유체추출법으로 상기 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신이 투여된 경력이 있는 돼지로부터 채취한 시료에서 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물을 농축하고 HPLC 이동상으로 용해한 후 황산암모늄과 HSCM을 넣고 원심분리하여 상등액을 획득하는 단계; 및 상기 상등액을 HPLC 분석법으로 분석하여 상기 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신이 투여된 경력이 있는 돼지에 잔류하는 항생제의 잔류 농도를 계산하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법에 의해서도 달성된다.
또한, 본 발명의 상기 목적은 상기 초임계유체추출법의 공정 조건이 추출보조제를 10% 이상 포함하는 초임계유체 이산화탄소를 이용하고, 30분 이상의 추출시간, 40℃ 이상의 추출온도 및 250kg/㎠ 이상의 추출압력인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신 의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법에 의해서도 달성된다.
또한, 본 발명의 상기 목적은 상기 추출시간이 40 내지 50분이거나, 상기 추출온도가 60 내지 80℃이거나, 상기 추출압력이 280 내지 300kg/㎠이거나, 상기 추출보조제가 20 내지 30%가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법에 의해서도 달성된다.
본 발명의 상기 목적과 기술적 구성 및 그에 따른 작용효과에 관한 자세한 사항은 본 발명의 바람직한 실시 예를 도시하고 있는 도면을 참조한 이하 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 도시한 도면이다.
도 1을 참조하여 설명하면, 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치(Supercritical fluid extraction device)(100)는 이산화탄소 가스통(110), 쿨링-자켓(Cooling-jacket)(120), 냉각기(130), 제1펌프(140), 초임계용기(150), 보조용매 용기(160), 제2펌프(170), 추출용기(180) 및 역압력조절기(back pressure regulator)(190)로 구성될 수 있다.
이때 상기 초임계유체추출 장치(100)의 작동 순서를 개략적으로 설명하면, 하기와 같다.
우선, 상기 이산화탄소 가스통(110)으로부터 이산화탄소 가스가 상기 쿨링-자켓(120)으로 유입된다.
상기 쿨링-자켓(120)으로 유입된 이산화탄소 가스는 상기 냉각기(130)와 상기 쿨링-자켓(120)을 순환하는 냉매에 의해 액체 이산화탄소로 상변화가 일어나게 된다.
그리고 상기 제1펌프(140)에 의해 상기 초임계용기(150)로 상기 액체 이산화탄소가 공급되게 된다.
한편, 상기 보조용매 용기(160)로부터 보조용매가 공급되면 상기 제2펌프(170)로 상기 보조용매를 상기 초임계용기(150)로 공급하게 된다.
이때, 상기 제1펌프(140) 및 제2펌프(150)에 의해 상기 초임계용기(150)로 공급되는 액체 이산화탄소 및 보조용매는 서로 혼합되고, 상기 초임계용기(150)로 유입된 상기 액체 이산화탄소 및 보조용매는 임계온도와 임계압력 이상의 조건에서 초임계유체로 변화된다.
상기 초임계용기(150)에서 초임계유체를 변화된 보조용매를 포함하는 초임계이산화탄소는 추출용기(180)으로 유입되고, 상기 추출용기(180) 내의 시료를 추출하게된다. 이때, 상기 추출용기(180) 내에는 시료뿐만 아니라 EDTA-4Na를 더 포함하고 있을 수 있다. 상기 EDTA-4Na은 플루오로퀴놀론계 항생제 중 시프로플록사신의 추출 효율을 높이기 위해 포함될 수 있다.
그리고, 상기 추출액은 상기 역압력조절기(190)에서 추출액 용기(195)로 유출된다.
따라서, 상기 초임계유체추출 장치(100)는 보조용매를 포함하는 초임계이산화탄소를 이용하여 시료에서 추출액을 추출할 수 있다.
본 발명은 상기 도 1을 참조하여 설명한 초임계유체추출 장치를 이용하여 돈육으로부터 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시추출하는 조건을 제시한다.
이하, 도 2a 내지 도 2c, 도 3a 내지 도 3c, 도 4a 내지 도 4c 및 도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 이용하여 돈육으로부터 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출하기 위한 초임계유체추출 방법의 공정 조건을 결정하기 위한 실험 결과를 도시한 그래프들이다.
이때, 상기 초임계유체추출 방법의 공정 조건을 결정하기 위해 준비된 시료는 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
우선, 플루오로퀴놀론계 항생제를 투여한 경력이 없는 3개월령 돼지를 입수하여 7일 동안 실험조건에 순응시켰다. 이때 상기 돼지는 플루오로퀴놀론계 항생제가 없는 사료를 체중 별 권장양에 준하여 급식하였고 물은 자유급식하였다.
그리고 상기 돼지를 부검하여 근육, 폐 및 신장을 적출하여 각각 표준 시료를 준비하였다.
그리고 상기 각각의 표준 시료에 엔로플록사신 및 시프로플록사신은 각각 0.2㎍/g, 다노플록사신은 0.1㎍/g의 농도로 처리한 후 오픈(Oven)에서 10분 동안 건조하여 용매를 증발시킨 다음 동결 건조하여 시료를 준비하였다.
상기와 같은 방법으로 준비된 시료를 본 발명의 일실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 이용하여 각각의 공정 조건을 변화시키면서 추출액을 추출하고, 상 기 추출액을 진공 증발기(Vacuum evaporator)를 이용하여 40℃ 이하에서 농축한 다음 HPLC(High-performance liquid chromatography) 이동상으로 용해한 후 황산암모늄(ammonium sulfate)과 HSCM(Hyflo Super Cell Medium)을 넣고 원심분리하였다. 이때, 상기 HSCM은 상기 추출액 중 단백질 등과 같이 상증액과 분리되는 침전물을 흡착하여 하부로 침전되게 하는 역할을 한다.
그리고 상기 원심분리에서 분리된 상증액을 HPLC 분석에 사용되었다.
도 2a 내지 도 2c를 참조하여 설명하면, 각 도들의 그래프는 돈육의 근육, 폐 및 신장 시료의 추출시간에 따른 엔로플록사신의 추출 비율(도 2a), 추출시간에 따른 다노플록시산의 추출 비율(도 2b) 및 추출시간에 따른 시프로플록사신의 추출 비율(도 2c)을 나타내고 있다. 이때, 상기 추출 비율(%)는 전체 추출 시간 동안 추출된 크로마토그래프의 총면적에서 그 추출시간 동안 추출된 면적을 비율로 나타내는 것이다. 예컨대, 총 60분 동안 추출실험을 한 경우, 60분 동안 추출한 총추출액으로 크로마토그래프 분석법으로 분석하여 총면적을 계산하고, 특정 시간 동안 추출한 추출액의 면적을 계산하여 총면적 분의 특정 시간 동안 추출된 추출액의 면적의 비를 계산한 것을 추출 비율(%)로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c에서 보는 바와 같이 추출시간이 증가함에 따라 추출시간에 따른 추출 비율(%)은 작아짐으로 추출시간을 길게 할수록 각각의 항생제들의 추출 정도는 커질 것이다.
그러나 그래프에서 보는 바와 같이 추출시간이 30분인 경우에는 추출 비율(%)이 10% 미만이고, 추출시간이 40분인 경우에는 추출비율(%)이 거의 0%에 근접 하고 있음으로 효율적인 추출시간을 결정할 수 있을 것으로 보인다.
즉, 추출비율(%)이 10% 이하인 경우 추출시간이 증가하여도 추출되는 항생제의 양은 적어 성분분석에 큰 영향을 미치지 않을 것임으로 추출시간은 30분 이상으로 설정하면 돈육에 존재하는 항생제를 충분히 측정할 수 있을 것으로 판단된다. 만일 정확한 실험을 원하는 경우 추출시간을 40분 또는 50분 이상으로 설정하여도 무방하나 무한정 추출시간을 늘릴 경우 실험의 효율성이 낮아짐으로 40 내지 50분으로 추출시간을 설정하여도 충분히 추출될 것이라 판단된다.
따라서, 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 때 추출시간은 30분 이상이기만 하면 가능하고, 더 정확한 추출을 위해서는 40 내지 50분으로 하는 것이 바람직하다.
도 3a 내지 도 3c를 참조하여 설명하면, 각 도들의 그래프는 돈육의 근육, 폐 및 신장 시료의 추출온도에 따른 엔로플록사신의 피크 면적(Peak area)(도 3a), 추출온도에 따른 다노플록시산의 피크 면적(도 3b) 및 추출온도에 따른 시프로플록사신의 피크 면적(도 3c)을 나타내고 있다.
각 그래프에서 보는 바와 같이 추출온도가 증가할수록 피크 면적은 증가하는 경향을 보이고 있음을 알 수 있다. 이에 따라 추출온도는 높을수록 피크 면적은 증가되는 것을 알 수 있다.
이때, 추출온도의 하한온도는 도 3c에서 추측할 수 있는데 신장에서 시프로플록사신을 추출하는 경우 추출온도가 40℃인 일 때 그 피크 면적이 약 5000 정도임으로 추출온도가 40℃ 이하인 경우에는 피크 면적이 아주 낮을 것으로 예상된다. 따라서 추출온도는 최소한 40℃ 이상인 것이 바람직하다.
한편 추출온도를 무조건 높일 수는 없는데 이는 온도를 높이면 상대적으로 초임계유체의 밀도가 감소하여 용해도 즉, 추출력이 감소하기 때문이다. 상기와 같은 이유를 감안하고 성분분석에 필요한 충분한 추출물이 추출되는 추출온도 범위를 감안한다면 그 추출온도 범위는 60 내지 80℃임으로 상기 추출온도가 바람직한 추출온도 범위라 할 수 있다.
따라서, 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 때 추출온도는 40℃ 이상이기만 하면 가능하고, 더 정확한 측정을 위해서는 60 내지 80℃의 추출온도 범위에서 추출하는 것이 바람직하다.
도 4a 내지 도 4c를 참조하여 설명하면, 각 도들의 그래프는 돈육의 근육, 폐 및 신장 시료의 추출압력에 따른 엔로플록사신의 피크 면적(Peak area)(도 4a), 추출압력에 따른 다노플록시산의 피크 면적(도 4b) 및 추출압력에 따른 시프로플록사신의 피크 면적(도 4c)을 나타내고 있다.
각 그래프에서 보는 바와 같이 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출하는데 있어서 추출압력의 변화에 따른 영향은 그렇게 큰 것은 아니라고 판단된다.
다만 초임계유체추출법은 임계압력 이상의 압력을 유지하여야 함으로 추출압력은 250kg/㎠ 이상인 것이 바람직한 것으로 판단된다.
또한 다노플록시산 및 시프로플록사신의 그래프들(도 4b 및 도 4c)에서 보여주고 있는 바와 같이 추출압력이 280 내지 300kg/㎠인 경우 효율적인 추출이 이루어짐을 알 수 있다.
따라서, 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 때 추출압력은 250kg/㎠ 이상이기만 하면 가능하고, 더 정확한 측정을 위해서는 280 내지 300kg/㎠의 추출압력 범위에서 추출하는 것이 바람직하다.
도 5a 내지 도 5c를 참조하여 설명하면, 각 도들의 그래프는 돈육의 근육, 폐 및 신장 시료의 추출보조제의 비율에 따른 엔로플록사신의 피크 면적(Peak area)(도 5a), 추출보조제의 비율에 따른 다노플록시산의 피크 면적(도 5b) 및 추c출보조제의 비율에 따른 시프로플록사신의 피크 면적(도 5c)을 나타내고 있다.
각 그래프에서 보는 바와 같이 추출보조제의 비율(%)이 증가함에 따라 각 항생제의 피크 면적들 역시 증가하는 경향을 보이고 있다. 따라서 추출보조제의 비율(%)의 양은 많을수록 추출 효율은 높다는 것을 알 수 있다.
다만 추출보조제의 비율(%)이 10%인 경우, 도 5b에서 나타내고 있는 바와 같이 신장에서 다나플록시산을 추출하게 되면 피크 면적이 약 5000인 것을 알 수 있다. 이를 감안하면 추출보조제의 비율이 10% 이하인 경우 너무 낮은 피크 면적을 나타낼 것으로 보임으로 추출보조제는 최소한 10% 이상인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 초임계유체추출법은 용매의 사용이 최소화하는 것에 특징이 있음으로 사용되는 추출보조제의 용매가 50% 이상 포함되어 있는 것을 바람직하지 않고 도 5a 내지 도 5c에서도 보여주고 있는 바와 같이 20 내지 30%의 추출보조제가 첨가되어도 충분한 양이 추출되어질 수 있다.
따라서, 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제를 추출할 때 추출보조제는 적어도 10% 이상 포함하고, 바람직한 비율은 20 내지 30%임을 알 수 있다.
따라서, 상기 도 2a 내지 도 2c, 도 3a 내지 도 3c, 도 4a 내지 도 4c 및 도 5a 내지 도 5c를 참조하여 설명함 본 발명의 일 실시 예에 따른 초임계유체추출 장치를 이용하여 돈육으로부터 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출하기 위한 초임계유체추출 방법의 공정 조건으로는 추출시간은 30분 이상으로 하고, 추출온도는 40℃ 이상으로 하고, 추출압력은 250kg/㎠ 이상으로 하고, 추출보조제의 비율은 10% 이상으로 하여도 무방하고, 추출시간은 40분 내지 50분으로 하고, 추출온도는 60 내지 80℃로 하고, 추출압력은 280 내지 300kg/㎠으로 하고, 추출보조제의 비율은 20 내지 30%으로 하는 것이 바람직한 공정 조건이라 할 수 있다.
<실험 예 1>
본 실험 예에서는 상기에서 상술한 초임계유체추출 방법의 공정 조건 중 최적 공정 조건으로 인위적으로 플루오르퀴놀을 투여한 돼지의 조직별 수득율을 측정하였다.
우선, 플루오로퀴놀론계 항생제를 투여한 경력이 없는 3개월령 돼지를 구입하여 7일 동안 실험조건에 순응시켰다.
이때, 상기 돼지의 사료는 플루오르퀴놀론계 항생제가 없는 사료를 체중별 권장양에 준하여 급식하였고 물은 자유급식하였다.
상기 돼지에 엔로플록사신을 5mg/kg으로 연속 7일, 다노플록사신은 1.25mg/kg으로 연속 3일간 투여하였으며 최종 투약 후 1, 2, 3, 5, 7일에 부검하여 근육, 폐 및 신장 등을 적출하였다. 그리고 적출된 시료 중 2g을 동결건조하였으며 이것으로 시료의 수분량을 측정하였다. 이때, 상기 엔로플록사신을 투여함으로써 엔로플록사신의 주요 대사물질인 시프로플록사신 역시 생성된다.
상기에서 적출한 근육, 폐 및 신장을 상기에서 제시한 최적 공정 조건, 즉, 30%의 메탄올(추출보조제)을 포함하는 초임계유체 이산화탄소를 이용하여 추출시간은 40분으로 하고, 추출온도는 80℃로 하고, 추출압력은 300kg/㎠으로 하고 3ml/min의 유속으로 수행하였고 이때 수득율은 하기 표 1에서 정리된 바와 같다.
Spiking concentration(ppm) 근육 폐 신장
엔로플록사신 0.05 97.6±5.5 96.6±0.9 95.4±1.7
0.1 90.7±7.9 99.0±2.8 92.2±5.4
0.5 97.2±1.3 102.7±0.9 95.3±6.0
다노플록사신 0.02 82.3±2.4 104.7±4.5 97.4±4.3
0.1 80.7±4.8 101.4±1.6 97.1±0.7
0.5 92.6±2.5 102.9±1.2 96.4±3.2
시프로플록사신 0.1 68.5±7.1 48.5±3.0 64.0±1.0
0.2 72.0±2.5 59.2±0.9 59.6±7.0
0.5 64.2±2.1 66.1±0.2 59.0±5.9
<실험 예 2>
본 실험 예에서는 상기에서 상술한 초임계유체추출 방법의 공정 조건 중 최적 공정 조건으로 인위적으로 플루오르퀴놀을 투여한 돼지의 조직별 잔류량을 측정하였다.
도 6a 내지 도 6c는 돼지에게 엔로플록사신 및 다노플록사신을 각각 연속 7일간 및 연속 3일간 투여한 다음 최종 투약 후 1, 2, 3, 5, 7일째에 각 조직에서 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 잔류량을 나타내는 그래프들이다. 이때, 돼지의 근육, 폐 및 신장은 상기 실험 예 1에서 채취한 방법과 동일한 방법으로 채취하였다.
엔로플록사신 및 다노플록사신 표준품의 일정량을 메탄올에 용해하여 100㎍/ml의 저장 용액(Stock solution)을 만들었으며 작업 용액(Working solution)은 HPLC의 이동상 즉, 0.04M 인산염 완충액(Phosphate buffer)(pH 3.0)과 아세토니트릴(acetonitrile)을 82:18로 썩은 혼합액에 저장 용액을 희석하여 순차적으로 준비하였다.
그리고, 상기 플루오르퀴놀론계 항생제는 0.001 내지 0.1ppm의 범위에서 측정하여 표준곡선을 구하였으며 시료 중 플루오르퀴놀론계 항생제의 잔류량은 검량곡선을 이용하여 계산하였다. 시료의 농도가 표준곡선의 범위를 넘어섰을 경우에는 적당한 배수로 희석하여 측정하였고 희석배수를 곱하여 최종 농도를 계산하였다.
도 6a 내지 도 6c를 참조하여 설명하면, 엔로플록사신 및 다노플록사신은 모든 조직에서 시간이 지남에 따라 그 잔류량이 감소함을 볼 수 있다(도 6a 및 도 6b 참조). 그와 동시에 엔로플록사신의 주요대사 물질은 시프로플록사신도 시간이 지남에 따라 잔류량이 감소함을 확인할 수 있었다(도 6c 참조).
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명의 초임계유체추출법을 이용한 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 및 분석 방법은 초임계유체추출법으로 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출할 수 있는 공정 조건을 제시하였을 뿐만 아니라 잔류량을 분석하는 방법을 제시하고 있고, 초임계유체추출법을 이용함으로써 유기용매의 사용량을 줄일 수 있어 친환경적인 추출법을 제공하는 효과가 있다.

Claims (13)

  1. 메탄올로 이루어진 추출보조제를 10% 이상 포함하는 초임계유체 이산화탄소를 이용하고, 30분 이상의 추출시간, 40℃ 이상의 추출온도 및 250kg/㎠ 이상의 추출압력을 공정 조건으로 하는 초임계유체추출법을 이용하여 돈육에서 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시추출하는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 추출시간은 40 내지 50분인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 추출온도는 60 내지 80℃인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 추출압력은 280 내지 300kg/㎠인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 추출보조제는 20 내지 30%가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 투여한 경력이 없는 돼지로부터 시료를 채취하여 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 주입한 후 동결 건조하는 단계;
    상기 동결건조된 시료를 이용하여 상기 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신을 동시에 추출할 수 있는 초임계유체추출법의 공정 조건을 마련하는 단계;
    상기 공정 조건이 마련된 초임계유체추출법으로 상기 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신이 투여된 경력이 있는 돼지로부터 채취한 시료에서 추출물을 추출하는 단계;
    상기 추출물을 농축하고 HPLC(High-performance liquid chromatography) 이동상으로 용해한 후 황산암모늄과 HSCM(Hyflo Super Cell Medium)을 넣고 원심분리하여 상증액을 획득하는 단계; 및
    상기 상증액을 HPLC 분석법으로 분석하여 상기 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신이 투여된 경력이 있는 돼지에 잔류하는 항생제의 잔류 농도를 계산하는 단계;를 포함하며,
    상기 초임계유체 추출법의 공정 조건은 메탄올로 이루어진 추출보조제를 10% 이상 포함하는 초임계유체 이산화탄소를 이용하고, 30분 이상의 추출시간, 40℃ 이상의 추출온도 및 250kg/㎠ 이상의 추출압력인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 추출시간은 40 내지 50분인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 추출온도는 60 내지 80℃인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 추출압력은 280 내지 300kg/㎠인 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 추출보조제는 20 내지 30%가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돈육에서 플루오로퀴놀론계 항생제인 엔로플록사신, 다노플록사신 및 시프로플록사신의 동시추출하여 잔류 농도를 분석하는 방법.
  13. 삭제
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