KR100871128B1 - 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를포함하는 항암제 - Google Patents

4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를포함하는 항암제

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Abstract

본 발명은 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 피페라진 유도체는 in vitro 실험에서 다양한 암세포의 증식 억제 효과가 우수하고, in vivo 실험에서 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 경우 마우스의 체중, 종양크기 및 종양무게를 통계적으로 유의하게 감소시킨다. 또한, 본 발명의 피페라진 유도체는 파네실트랜스퍼라제(farnesyltransferase)의 저해를 통해 Ras의 신호전달을 저해하여 세포증식을 억제시키고, RhoB의 활성화로 JNK1/JNK2의 양적 증가를 유도시켜 미토콘드리아를 경유하는 신호전달 조절 이상을 초래함으로써 생존과 관련된 Bcl-2의 인산화를 증가시켜 세포사멸을 일으킨다. 따라서, 본 발명의 피페라진 유도체는 종양세포의 성장을 억제하고 아폽토시스를 유발시키므로 다양한 암 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제 {Anti-cancer agent comprising 4-hexadecanoyl-1,1-dimethyl-piperazin-1-ium iodide}
본 발명은 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제에 관한 것이다.
암이란 "제어되지 않는 세포성장"으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 학문적으로는 신생물(neoplasia)이라고도 불린다.
암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 전 세계적으로 암으로 고통받는 환자는 2000만 명이 넘으며, 매년 600만 명 이상이 암으로 사망하고 있고, 2020년경에는 1,100만 명이 암으로 사망할 것으로 예측되므로 암은 시급히 그 치료법을 찾아내어야 할 중요 질환이다. 암은 나라마다 차이는 있지만 선진국이나 우리나라의 경우 전체 사망원인의 20% 이상을 차지한다. 하지만 많은 노력에도 불구하고 아직까지 암 발생의 정확한 원인이나 기전은 밝혀져 있지 않은 상태이다. 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분하기도 한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지는 않았으나, 적어도 80~90%가 환경요인 등 외적 인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자 (oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.
암은 크게 혈액암과 고형암으로 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다. 이들 악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 헥산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다.
화학요법제는 크게 대사길항제(antimetabolites), 알킬화제(alkylating agents), 유사분열 억제제(antimitotic drugs), 호르몬제(hormones) 등으로 분류된다. 대사길항제는 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 것으로, 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 엽산 유도체, 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine) 및 6-티오구아닌(6-thioguanine)과 같은 퓨린 유도체, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 시타라빈(cytarabine)과 같은 피리미딘 유도체 등이 있다. 알킬화제는 DNA의 구아닌 등에 알킬기를 도입하여 DNA의 구조를 변형시키고 사슬을 절단시켜 항암효과를 발휘하는 것으로, 클로람부실(chlorambucil) 및 시클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 니트로겐 머스타드계 화합물, 티오테파(thiotepa)와 같은 에틸렌이민계 화합물, 부설판(busulfan)과 같은 알킬설포네이트계 화합물, 카르무스틴(carmustine)과 같은 니트로소우레아계 화합물, 다카바진(dacarbazine)과 같은 트리아젠계 화합물이 있다. 유사분열 억제제는 분열시기 특이성 약물로서 유사분열을 차단하여 세포분열을 억제하는 것으로, 악티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성 항암제; 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물 알칼로이드; 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등이 포함된다. 이외에 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제와 시스플라틴 같은 백금함유 화합물이 항암제로서 사용되고 있다.
화학요법제의 가장 큰 문제는 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 약제 내성의 원인을 규명하는 연구와 동시에 기존의 약제에 내성을 지닌 암을 치료하기 위해서는 새로운 기전을 가진 항암제의 개발이 지속적으로 필요하다. 현재 개발이 진행 중인 항암제는 약제 내성 차단제, 혈관신생 저해제, 종양 전이 억제제, 유전자 발현을 표적으로 하는 약물 등이 있다.
이에, 본 발명자들은 종양성장을 억제하고 아폽토시스를 유발하는 새로운 기전의 항암제에 대해 연구하던 중, 특정 구조의 피페라진 유도체가 in vitro 실험에서 다양한 암세포의 증식을 효과적으로 억제시키고, in vivo 실험에서 마우스의 체중, 종양크기 및 종양무게를 감소시키며, 파네실트랜스퍼라제의 저해를 통해 Ras의 신호전달을 저해하여 세포증식을 억제시키고, RhoB의 활성화로 JNK1/JNK2의 양적 증가를 유도시켜 미토콘드리아를 경유하는 신호전달 조절 이상을 초래함으로써 생존과 관련된 Bcl-2의 인산화를 증가시켜 세포사멸을 일으키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제를 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 항암제의 유효성분인 상기 화학식 1로 표시되는 피페라진 유도체는 화학적인 합성 방법으로 제조하거나 또는 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명의 피페라진 유도체는 in vitro 실험에서 다양한 암세포의 증식 억제 효과가 우수하고, in vivo 실험에서 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 경우 마우스의 체중, 종양크기 및 종양무게를 통계적으로 유의하게 감소시킨다. 또한, 본 발명의 피페라진 유도체는 아넥신 V(Annexin V) 및 카스파제 3(caspase 3) 분석에 의해 세포사멸의 직접적인 효소인 카스파제 3를 가수분해시켜 불활성 형태의 프로카스파제 (procaspase) 3가 활성 형태의 카스파제 3로 절단되어 활성 형태의 카스파제 3의 양을 증가시키며, 카스파제 3의 기질인 PARP를 절단시킨다. 또한, 세포 분석(Flow Cytometric Analysis)에 의해 아폽토시스 정도를 현저히 감소시킨다.
또한, 본 발명의 피페라진 유도체는 파네실트랜스퍼라제의 저해를 통해 Ras의 신호전달을 저해하여 세포증식을 억제시키고, RhoB의 활성화로 JNK1/JNK2의 양적 증가를 유도시켜 미토콘드리아를 경유하는 신호전달 조절 이상을 초래함으로써 생존과 관련된 Bcl-2의 인산화를 증가시켜 세포사멸을 일으킨다. 따라서, 본 발명의 피페라진 유도체는 종양세포의 성장을 억제하고 아폽토시스를 유발시키므로 다양한 암 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등이 있다.
본 발명의 항암제는 상기 화학식 1의 화합물과 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 항암제는 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 항암제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항암제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물의 일일 투여량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001~100 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 항암제는 암 질환 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본 발명의 항암제와 조합하여 사용할 수 있는 항암제로는 세포성장억제 계열의 지노스타틴(zinostatin), 피라루비신(pirarubicin), 이다루비신(idarubicin), 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate), 스트렙토조신(streptozocin), 지노스타틴 스티말라머(zinostatin stimalamer) 등이 있고, 항체 계열의 렌티난 (lentinan), 프로코다졸(procodazol), 세라시스(TheraCys), 온코백-CL(OncoVAX-CL), 우크라인(ukrain), BCG 백신(BCG vaccine), 시졸필란(sizofilan) 등이 있다. 또한, 호르몬 계열의 아미노글루테시미드(aminoglutethimide), 파드로졸 (fadrozole), 포르메스탄(formestane), 트릴로스탄(trilostane) 등이 있고, 그 외 계열로 라족산(razoxane), 에토포시드 포스페이트(etoposide phosphate), 빈데신 (vindesine), 니트라크린(nitracrine), 트레티노인(tretinoin), 암사크린 (amsacrine), 비노렐빈(vinorelbine), 소부족산(sobuzoxane) 등이 있다. 그 외에도 시타라빈, 독소루비신, 다우노루비신, 마이톡산트론, 6-티오구아닌, 머캅토퓨린, 프리드니손, 에토포사이드, 아스파라지나제, 빈크리스틴, 프리드니손, 시클로포스파마이드, 5-FU, 파클리탁솔 등과 병용하여 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 종양세포의 성장억제 실험
본 발명에 따른 화합물의 종양세포의 성장억제 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 in vitro 및 in vivo 실험을 수행하였다.
1. 종양세포의 성장억제 실험( in vitro )
인간 종양 세포주 HCT-15(대장암, ATCC, 미국), LOXIMVI(흑색소 세포종, ATCC, 미국), PC-3(전립선암, ATCC, 미국), ACHN(신장암, ATCC, 미국), MBA-MB-231 (유방암, ATCC, 미국), NCI-H23(비소세포성 폐암, ATCC, 미국) 및 NUGC-3(위암, ATCC, 미국)를 10% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양하였다.
항암활성을 측정하고자 할 때는, 5% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지에 적절한 농도(약 5 x 104 cells/㎖)의 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포를 분주한 후, 하루가 경과한 다음 화학식 1의 화합물로 처리하기 직전의 세포 농도를 결정하기 위하여 제로시간(Time zero, T0) 플레이트에 50% 트리클로로아세트산을 웰당 50㎕씩 넣어 세포들을 고정하고 영점으로 정하였다. 화학식 1의 화합물로 처리한 세포들의 경우에는 48시간 이후에 50% 트리클로로아세트산을 웰당 50㎕씩 넣어 세포들을 고정하였다. 세포에 가해지는 화학식 1의 화합물의 최종 농도는 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 ㎍/㎖가 되도록 하였다. 고정한 플레이트는 수돗물로 세척하고 건조시킨 후, 0.1% 아세트산에 용해된 설포로다민 B(sulphorhodamine B; SRB)의 0.4% 용액을 웰당 100㎕씩 가하여 세포를 염색하였다. 30 분간 방치한 후, 0.1% 아세트산으로 세척하고 다시 상온에서 건조시킨 후 10 mM 트리스 베이스(pH 10.5)를 가하여 염색시약을 용해시켰다. 540㎚에서 측정된 흡광도를 대조군에 대한 백분율로 환산한 후, 암세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도(GI50(㎍/㎖))를 산출하였다.
결과는 표 1에 나타내었다.
GI50 (㎍/㎖)
HCT-15(대장암) 2.023
LOXIMVI(흑색소 세포종) 1.845
PC-3(전립선암) 0.950
ACHN(신장암) 1.783
MBA-MB-231(유방암) 1.369
NCI-H23(비소세포성 폐암) 1.182
NUGC-3(위암) 0.308
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 피페라진 유도체는 암세포의 증식 억제 효과가 우수하며, 특히 PC-3(전립선암) 및 NUGC-3(위암) 세포주에서 증식 억제 효과가 가장 우수하였다.
또한, 상기 암 세포주 중 본 발명의 피페라진 유도체의 GI50 값이 가장 우수한 PC-3(전립선암) 및 NUGC-3(위암) 세포주의 상대적인 약물 민감도를 쥐의 정상 섬유아세포주와 비교하여 도 1에 나타내었다. 이때 본 발명의 피페라진 유도체의 농도는 0, 0.2, 0.6, 2, 6 μM 이었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 피페라진 유도체는 PC-3(전립선암)과 및 NUGC-3(위암) 세포주에 처리하였을 때, 쥐의 정상 섬유아세포주에 처리하였을 때보다 현저한 세포증식 억제 작용을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 피페라진 유도체는 항암효과가 뛰어나면서 정상세포에는 비교적 독성이 적은 화합물인 것으로 판단된다.
2. 동물시험계의 종양성장억제 실험( in vivo )
인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주의 3×107 cells/㎖를 암컷 S.P.F BALB/c 누드 마우스(7주령)에 이식한 후, 화학식 1의 화합물을 복강으로 하루 30 ㎎/㎏ 용량으로 27일 동안 투여하고, 양성대조군으로는 아드리아마이신(adriamycin) 2 ㎎/㎏을 이틀에 한 번씩 복강 투여하였다. 약물 활성 및 독성 정도를 알아보기 위하여, 투여 기간 동안 동물의 일반증상 및 체중 변화, 사망동물, 종양크기 및 종양무게를 관찰하였다.
동물의 체중 변화는 도 2에 나타내었고, 종양크기의 변화는 도 3에 나타내었으며, 최종일에서의 종양무게는 도 4에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물을 복강 투여한 마우스는 시험기간 동안 특이한 일반증상이 관찰되지 않았다. 또한, 최종일에서 마우스의 체중 변화는 용매 대조군과 비교하여 본 발명의 화합물 시료 투여군(30 ㎎/㎏)에서 9.7%(p<0.05)의 통계적으로 유의한 체중감소가 관찰되었다. 양성대조물질 투여군에서는 28.3%(p<0.001)의 통계적으로 유의한 체중감소가 관찰되었다.
또한 도 3에 나타난 바와 같이, 최종일에서 마우스의 종양크기 변화는 용매 대조군과 비교하여 본 발명의 화합물 시료 투여군(30 mg/kg)에서 74.7%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 종양크기의 감소가 관찰되었다. 양성대조물질 투여군에서는 85.8%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 종양크기의 감소를 나타내었다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, 실험 최종일에 마우스를 희생시켜 종양을 절제한 후 그 무게를 측정한 결과, 용매대조군과 비교하여 본 발명의 화합물 시료 투여군(30 mg/kg)에서 69.5%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 종양무게 감소가 관찰되었다. 양성대조물질 투여군에서는 84.9%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 종양무게 감소가 나타났다.
실시예 2 : 세포사멸 실험
본 발명의 화합물이 세포사멸을 유도하는지 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 아넥신 V( Annexin V) 및 카스파제 3( caspase 3) 분석에 의한 세포사멸
아폽토시스의 가장 초기 징조의 하나로 플라즈마 막(plasma membrane)의 안쪽에서 바깥쪽 부위로 막 포스포 포스파티딜세린(membrane phospho phosphatidylserine; PS)의 이동이 일어난다. 세포 표면 환경에서, PS의 결합 위치는 Ca2 +-의존적이므로, 인지질 결합 단백질(phospholipid binding protein)에 대해 높은 친화력을 가진 아넥신 V를 이용하게 된다. 따라서, FITC(fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광색소(fluorochrome)가 접합된 아넥신 V를 이용함으로써, 아폽토시스의 초기 단계를 감지할 수 있다. 실험적으로 우선 자궁경부암 세포 (HeLa cell)에 화학식 1의 화합물을 처리하고 12시간 후에 세포를 수확한 후 FITC-아넥신 V를 처리하고 Facscan을 이용하여 아넥신 V와의 결합 정도를 조사하였다. 이 분석은 BD Biosciences의 ANNEXIN V-FITC DETECTION KIT I을 이용하였고 제공된 매뉴얼에 따라 실험하였다. 자궁경부암(HeLa) 세포주에 화학식 1의 화합물을 처리한 후 아넥신 V와 결합하는 PS의 양을 측정함으로써 화학식 1의 화합물이 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.
카스파제 3의 활성 조사는 세포사멸 관련 여부를 검증하는 방법으로 카스파제 3의 불활성화 구조가 단백질의 절단이 일어나면서 활성화된 카스파제 3로 단백질의 양을 측정하여 세포사멸의 진행 여부를 조사할 수 있다. 또한 카스파제 3의 기질인 PARP의 절단된 형태의 양의 변화를 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰함으로써 세포사멸 분석을 수행할 수 있다. 화학식 1의 화합물을 처리한 후 단백질 용해 용액으로 처리하여, 단백질을 분리하고 SDS-PAGE 겔을 통하여 전기영동 시킨 후 카스파제 3 항체와 기질인 PARP의 항체를 이용하여 카스파제 3의 양과 PARP 단백질의 양을 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물의 처리에 의해 아넥신 V를 인지하는 피크를 확인하였다. 따라서 본 발명의 화합물에 의해 아폽토시스의 초기 현상인 막 포스포 포스파티딜세린(PS)의 양이 증가하였음을 아넥신 V 측정 실험을 통해 검증하였다(도 5A). 또한, 본 발명의 화합물의 처리에 의해 세포사멸의 직접적인 효소인 카스파제 3는 가수분해되어 불활성 형태의 프로카스파제(procaspase) 3가 활성 형태의 카스파제 3로 절단되어 활성 형태의 카스파제 3의 양이 증가되었으며, 카스파제 3의 기질인 PARP가 절단되어 사라진 것을 관찰하였다(도 5B). 따라서, 본 발명의 화합물이 자궁경부암(HeLa) 세포에서 세포사멸을 유발시킨다는 것을 알 수 있다.
2. 세포 분석( Flow Cytometric Analysis )에 의한 세포사멸
5% CO2가 포함된 37℃ 배양기에서 5% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지로 키운 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 직경 60㎜ 배양접시에 5 x 105 개씩 깔고 24시간 동안 배양한 후, 화학식 1의 화합물을 각각 0, 2, 5 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 0.1% 트립신으로 처리하여 세포를 떼어낸 후, 세포를 15㎖ 원추형 시험관(conical tube)에 옮겨 200xg에서 5분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌 후 상층액을 제거하였다. 여기에 0.1㎎/㎖ 농도의 RNase A가 포함된 PBS 용액을 0.5㎖ 첨가하여 세포를 재현탁시킨 후, 여기에 PI(propidium iodide) DNA 염색액을 50㎍/㎖ 농도로 처리하여 세포 내의 DNA를 30분 이상 염색하였다. 이렇게 염색된 세포를 유세포 분석기(Becton Dickinson 제품)를 사용하여 488㎚의 레이저 빔(laser beam)을 이용하여 PI를 여기(excitation)시킨 후 발광(emission)된 588㎚ 파장의 빛의 양을 히스토그램으로 표시하고, 이것을 정량 분석하여 세포내 DNA의 양을 결정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물을 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 경우 아폽토시스 정도가 현저히 증가하였다. 따라서, 본 발명의 화합물이 위암(NUGC-3) 세포주에서 세포사멸을 유발시킨다는 것을 알 수 있다.
실시예 3 : 웨스턴 블롯 분석( Western Blot Analysis )
본 발명의 화합물의 세포사멸 작용기전을 연구하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 직경 100㎜인 배양 접시(culture dish)에 4×106개를 5% FBS를 포함한 RPMI 배지에 깔아 하루 동안 배양한 후, 화학식 1의 화합물을 각각 0, 2, 5 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 10㎖ PBS로 조심스럽게 2번 세척한 후 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche, completeTM-mini)이 든 PBS(1 tablet/ 50㎖ PBS)를 접시 당 1㎖ 씩 넣고 세포를 긁어 모아 초음파 처리로 세포를 파쇄시켰다. 이 시료를 마이크로원심분리기로 12000 rpm으로 20분간 원심분리 후 상층액을 모아 브래드포드 염료 시약(Bradford dye reagent, Bio-Rad)으로 단백질을 정량한 후 20㎍의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 겔 상에서 전개하였다. 이를 다시 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane, from Bio-Rad)으로 옮긴 후 각각의 조사하고자 하는 단백질에 특이적인 일차 항체와 HRP(horseradish peroxidase)가 붙은 이차 항체 (Amersham 또는 Bio-Rad), 및 ECL 화학발광 시약(chemiluminescence reagent, Amersham)을 사용하여 각각의 단백질의 양적 변화를 분석하였다.
또한, 화학식 1의 화합물을 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 RhoB에 의해 활성화되는 것으로 알려진 JNK1/JNK2의 양적 변화를 관찰하였으며, 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 JNK 활성 저해제를 처리한 다음 화학식 1의 화합물을 처리한 후 현미경과 FACS 분석을 통해 세포사멸 억제 효과를 관찰하였다.
본 발명의 화합물을 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 세포 내 신호전달 관련 단백질의 양적 변화를 나타낸 결과는 도 7에 나타내었고, 본 발명의 화합물을 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 JNK1/JNK2의 양적 변화와, 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 JNK 활성 저해제를 처리한 다음 본 발명의 화합물을 처리한 후 현미경과 FACS 분석을 통해 세포사멸 억제 효과를 관찰한 결과는 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물에 의해 PTEN(Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten)의 탈인산화가 일어나 PTEN이 활성화되어 Akt를 탈인산화시켜 Akt의 작용을 억제시켜 세포의 생존을 감소시켰다(도 7A). 한편 본 발명의 화합물에 의해 제라닐제나릴트랜스퍼라제 (Geranylgeranyltransferase)의 양에는 변함이 없으나, 파네실트랜스퍼라제 (farnesyltransferase)의 양은 감소되었고, 위암(NUGC-3) 세포주에 존재하는 FTase의 타겟인 K-ras의 양도 감소되었다. 또한, Ras의 다운스트림(downstream)인 Raf의 Ser-259의 탈인산화로 Raf의 활성이 억제되어 MEK-1의 양이 감소되었음을 확인하였다(도 7B). 또한, 암 억제유전자(suppressor)로 알려져 있는 RhoB의 양은 증가하였으나 RhoA의 양적 변화는 없었으며, Bcl-2의 인산화가 증가되었음을 확인하였다(도 7C). 따라서, 본 발명의 피페라진 유도체는 파네실트랜스퍼라제의 저해를 통해 Ras의 신호전달을 저해하여 세포증식을 억제시키고, RhoB 단백질의 아미노산 C-말단의 파네실화를 억제시켜 제라닐제라닐화가 일어난 RhoB가 JNK를 활성화시켜 다운스트림인 Bcl-2의 인산화를 증가시킴으로써 세포의 아폽토시스를 촉진시키는 것으로 판단된다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물을 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 시간이 경과함에 따라 JNK1/JNK2의 양이 점차 증가되어 1~2시간 사이에 많은 양의 단백질이 발현되었고, 4시간 이후에도 단백질이 다량 발현되는 것을 관찰하였다(도 8A). 또한, 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 JNK 활성 저해제를 처리한 다음 본 발명의 화합물을 처리한 후 현미경으로 관찰한 경우, 세포는 본 발명의 화합물이 존재하여도 정상적인 형태를 나타내었다(도 8B). 또한, 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 JNK 활성 저해제를 처리한 다음 본 발명의 화합물을 처리한 후 FACS 분석을 통해 관찰한 경우 위암(NUGC-3) 세포주의 세포사멸 현상이 감소되었음을 확인하였다(도 8C). 상기한 바와 같이, 본 발명의 피페라진 유도체는 RhoB를 경유한 JNK1/JNK2 영향으로 암세포의 세포사멸을 유도하였으며, 이를 통해 본 발명의 피페라진 유도체에 의한 위암(NUGC-3) 세포주의 세포사멸이 JNK에 의해 유도된다는 것이 증명되었다.
본 발명의 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드는 in vitro 실험에서 다양한 암세포의 증식 억제 효과가 우수하고, in vivo 실험에서 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 경우 마우스의 체중, 종양크기 및 종양무게를 통계적으로 유의하게 감소시킨다. 또한, 본 발명의 피페라진 유도체는 파네실트랜스퍼라제의 저해를 통해 Ras의 신호전달을 저해하여 세포증식을 억제시키고, RhoB의 활성화로 JNK1/JNK2의 양적 증가를 유도시켜 미토콘드리아를 경유하는 신호전달 조절 이상을 초래함으로써 생존과 관련된 Bcl-2의 인산화를 증가시켜 세포사멸을 일으킨다. 따라서, 본 발명의 피페라진 유도체는 종양세포의 성장을 억제하고 아폽토시스를 유발시키므로 다양한 암 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 피페라진 유도체가 다양한 암세포주의 성장에 미치는 효과를 나타낸 도이다(NUGC-3 : 위암 세포주, PC-3 : 전립선암 세포주, Rat-2 : 쥐의 정상 섬유아세포주).
도 2는 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 후 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 후 종양크기의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주를 이종이식한 누드 마우스에 본 발명의 피페라진 유도체를 복강 투여한 후 최종일(28일)에서의 종양무게를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 피페라진 유도체의 아넥신 V(Annexin V) 및 카스파제 3 (caspase 3) 분석에 의한 세포사멸 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 피페라진 유도체의 세포 분석(Flow Cytometric Analysis)에 의한 세포사멸 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 피페라진 유도체를 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 세포 내 신호전달 관련 단백질의 양적 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 피페라진 유도체를 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 처리한 후 JNK1/JNK2의 양적 변화(도 8A)와, 인체 유래 위암(NUGC-3) 세포주에 JNK 활성 저해제를 처리한 다음 본 발명의 피페라진 유도체를 처리한 후 현미경(도 8B)과 FACS 분석(도 8C)을 통해 세포사멸 억제 효과를 관찰한 도이다.

Claims (3)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 4-헥사데카노일-1,1-디메틸-피페라진-1-윰 아이오다이드를 포함하는 항암제.
    <화학식 1>
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항암제.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 암은 대장암, 피부암, 전립선암, 신장암, 유방암, 비소세포성 폐암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항암제.
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