KR100845146B1 - 벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효성분으로 함유하는항진균제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제에 관한 것으로, 벼 과산화소체 수용체 단백질(OsPex5pL) 또는 그의 단편인 단백질(OsPex5pS)을 유효성분으로 함유하는 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 항진균제는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)와 같은 식물에 대한 병원성 진균에 효과적이다.
Figure 112007049111197-pat00001
항진균성 단백질, 과산화소체, 수용체, 단백질, 벼, 발현, cDNA 클로닝

Description

벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제{Antifungal agent containing rice peroxisomal receptor protein as active ingredient}
본 발명은 벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 벼 과산화소체 수용체 단백질(OsPex5pL) 및 그의 단편인 단백질(OsPex5pS)을 유효성분으로 함유하는 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 항진균제는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)와 같은 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제에 관한 것이다.
경제적으로 중요한 농작물을 병원체 공격으로부터 보호하는데 잠재적인 가치를 지닌 항진균 단백질을 선별하는데 많은 연구가 집중되어 왔다. 연구 결과 타 우마틴-유사 단백질, 키티나제, 리보솜 불활성화 단백질, 디펜신, 사이클로필린 및 프로테아제 저해제와 같은 다양한 식물 항진균 단백질이 분리되었다. 실제로 항진균 단백질을 과발현하는 여러 형질전환 식물이 다양한 병원체에 대한 증가된 저항성을 제공하는 것으로 나타났다.
많은 항진균 단백질이 확인되었으나 더 많은 광범위하고 체계적인 선별 시스템으로 새로운 형태의 항진균 단백질을 선별할 필요가 있다. 이러한 목적으로 본 발명은 도열병균-감염 벼 잎에서 새로운 형태의 항진균 단백질을 분리하고 새로운 형태의 항진균 단백질인 OsPex5p로 명명된 과산화소체 수용체 단백질을 확인하였다. 실질적으로 OsPex5p는 과산화소체 생합성동안 과산화소체 타겟 신호 1(PTS1) 서열을 포함한 과산화소체 매트릭스 단백질을 특이적으로 전달할 수 있는 과산화소체 수용체 단백질인 것으로 나타났다. 단일 막으로 형성된 조절 소기관인 과산화소체는 생물 및 무생물 스트레스에 대한 세포적 방어 시스템에 중요한 역할을 하고, 세포 커뮤니케이션에 2차 신호전달 메신저로 알려진 과산화수소(H2O2), 과산화물 라디칼(O2·-) 및 산화질소(·NO)를 생성할 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 진균성 병원체에 대항하여 식물체가 발현하는 단백질을 분리 정제하고 이를 통해 식물 병원성 진균에 대한 항진균제를 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 벼 과산화소체 수용체 단백질(OsPex5pL)(서열번호: 1) 또는 그의 단편인 단백질(OsPex5pS)(서열번호: 2)을 유효성분으로 함유하는 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 항진균제는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)와 같은 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제임을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 항진균제의 유효 성분 농도는 0.01∼100 mM임을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 항진균제는 벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효 성분으로 하여 안정화제, 계면활성제, 보존제, pH 조절제 등에서 선택된 첨가제를 물 또는 수용성 유기 용매에 용해시켜 제조된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 효과는 진균성 병원체에 대항하여 식물체가 발현하는 단백질을 분리 정제하고 이를 통해 식물 병원성 진균에 대한 항진균제를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도열병균(마그나포르테 그리세아, Magnaporthe grisea)-처리 벼 잎에서 유래한 새로운 형태의 항진균성 단백질이 CM-Sepharose 이온-교환, Affi-겔 블루 및 HPLC 겔 여과 컬럼 상의 연속 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다.
본 발명은 정제된 단백질의 N-말단 펩타이드 서열을 측정하고 인터넷 상의 NCBI/BLAST 데이터베이스에서 검색한 결과 본 단백질이 벼 내 과산화소체 수용체 단백질(OsPex5p)의 부분적 단편인 것으로 나타났다. 벼 잎 cDNA 라이브러리 유래의 OsPEX5의 스플라이싱 변이체인 OsPEX5L 및 OsPEX5S 유전자를 암호화하는 2개의 cDNA을 클론한 후 본 발명은 이들의 항진균 특성을 조사하였다.
E. coli에서 발현된 재조합 단백질은 다양한 병원성 진균 균주의 세포 생장을 저해하였다. OsPEX5L 유전자의 mRNA 전사체는 벼 도열병균, 진균 유인제 또는 H2O2, 앱시스산, 자스몬산 및 살리실산을 포함한 다른 신호전달 분자와 같은 다양한 외부 스트레스에 의해 유도되었다.
따라서 과산화소체 수용체 단백질인 OsPex5p가 진균성 병원체 공격을 포함한 다양한 외부 스트레스에 대한 벼 방어 기작에 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
식물 원료 유래의 새로운 형태의 항진균 단백질을 분리하기 위해 도열병균-감염 벼 잎이 채취되었고 항진균 활성을 측정함으로서 단백질을 선별하는데 이용되었다. CM-Sepharose, Affi-겔 블루 및 FPLC 겔 여과 컬럼 상의 연속적 크로마토그래피를 이용하여 본 발명은 항진균 활성을 지닌 일부 단백질 피크를 정제할 수 있다(도 1).
Edman 분해에 의해 정제된 항진균 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 측정하 고 인터넷 상에서 NCBI/BLAST 데이터베이스로 서열을 비교함으로서 OsPex5pS의 부분적 단편으로 알려진 새로운 형태의 항진균 단백질을 확인하는 것이 가능하였다(도 1C, F-2). 단백질은 과산화소체 생합성시 과산화소체 단백질의 잘 알려진 수용체이고 SDS-PAGE 상에서 측정된 그의 분자량은 약 45 kDa으로 나타났다(도 1C, 삽입사진)(도 2, N-seq 라인).
본 발명의 결과 이외에 진균 병원체 또는 H2O2와 같은 외부 스트레스의 처리에 의해 발현이 유도되는 스트레스 저항성에 대한 간접적 증거를 기술하는 PEX5 유전자에 대한 여러 논문이 존재한다. 본 발명은 OsPex5p가 과산화소체 수용체 단백질로서 뿐만 아니라 벼를 생물 및 무생물 스트레스로부터 보호하는 항진균 단백질로서 역할을 함을 입증하였다.
정제된 단백질의 항진균 기능을 더욱 상세히 조사하기 위해 본 발명은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)를 포함한 다양한 진균 균주에 대한 OsPex5p의 부분적 단편의 항진균 활성을 시험하였고, 시험된 모든 진균의 생장이 본 단백질에 의해 저해되었다(도 3).
이러한 결과를 기반으로 본 발명은 OsPex5p의 고유 형태의 항진균 활성을 확 인하였으며, 따라서 본 발명은 PCR 기술에 의해 병원체-처리된 벼 잎 cDNA 라이브러리로부터 OsPex5p를 암호화하는 전체-길이 cDNA를 클로닝하였다. N- 및 C-말단 올리고뉴클레오타이드 PCR 프라이머를 이용함으로서 본 발명은 대안적 스플라이싱 생성물로 종전 알려진 OsPEX5의 2개 cDNA, OsPEX5L 및 OsPEX5S(GenBank 수탁번호 AY772415 및 AY772416)를 수득하였다(도 2).
OsPEX5S가 OsPEX5L의 뉴클레오타이드 1044∼1214에 상응하는 171 bp가 결핍된 것을 제외하고는 OsPEX5L 및 OsPEX5S는 동일한 서열을 포함하였다(도 2).
프로브로서 OsPEX5L cDNA를 이용하여 본 발명은 배아-유래 벼 현탁 세포를 이용하여 병원체, 진균 유인제 및 다양한 스트레스-신호전달 작용제의 처리에 의해 유전자의 발현 수치를 조사하였다(도 4).
OsPEX5L의 전사체 수치는 벼 도열병균, 진균 유인제, H2O2, 앱시스산(ABA), 자스몬산(JA) 및 살리실산(SA)과 같은 다양한 스트레스 신호전달 분자에 의해 현저하게 증가되었다. 이러한 결과는 식물 내 방어 시스템이 식물 호르몬을 포함한 방어 신호전달 경로의 복잡화된-네트워킹에 의해 조절됨을 나타낸다. 스트레스 신호는 국지적 영역뿐만 아니라 감염 사이트에서 먼 부분에서 다양한 방어 반응을 활성화시킬 수 있다.
OsPEX5pL 및 OsPEX5pS의 항진균 활성을 특성화하기 위해 본 발명은 cDNA를 각각 pGEX 발현 벡터와 융합시킴으로서 E. coli 내에서 2개의 단백질을 발현시켰다. 융합 단백질이 GSH-아가로스 친화력 겔 크로마토그래피에 의해 정제된 후 단백질의 GST-부분이 트롬빈 처리에 의해 제거되고 새로운 형태의 OsPex5 단백질을 수득하였다(도 5).
2개의 박테리아를 통해 발현된 OsPex5pL 및 OsPex5pS 단백질의 진균 생장-저해 활성 분석시 2개의 단백질이 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 진균 생장을 억제하는 항진균 활성을 명백하게 나타냄이 판명되었다(도 6).
2개의 OsPex5 단백질은 항진균 활성 수치와 유사하게 균사체 전면 영역에서 초승달-형태 저해 구역을 생성하였다. OsPex5 단백질의 생장-저해 활성이 시험된 진균 균주에 대해 명백한 차이를 나타내었기 때문에(도 5A 및 5C와 비교) 본 발명은 다양한 종류의 진균 균주를 이용하여 생장 저해 활성을 분석하였다(표 1).
Figure 112007049111197-pat00002
본 발명에서 E. coli 내 OsPex5pS 단백질의 발현 수치가 OsPex5pL 보다 높았기 때문에 본 발명은 OsPex5pS를 이용하였다. 예측된 바와 같이 OsPex5pS는 다양한 종류의 진균에 대해 항진균 활성의 유의적인 차이를 나타낸다. 페니실리움 베루코숨 바르. 베루코숨(Penicillium verrucosum var. verrucosum)이 OsPex5pS에 매우 민감한 반면 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)는 OsPex5pS의 항진균 활성에 매우 저항적이다.
타겟 진균 내 OsPex5pS의 세포적 위치를 조사하기 위해 단백질은 FITC로 표지되고 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 함께 인큐베이트되었다. 공초점 현미경 하에서 형광 분석시 FITC-표지된 OsPex5pS는 타겟 진균의 세포벽에서 처음 검출되었으나(도 7, 레인 1) 단백질은 인큐베이션 시간 경과에 따라 세포질 공간 내로 완전하게 침투되었다(도 7, 레인 3).
현재 Pex5p는 진핵세포 내 과산화소체 생합성에 관련된 많은 PEX 유전자들 중 하나의 구성요소로 간주되고 특성화되었다. 따라서 Pex5p의 기능은 과산화소체 내로 과산화소체 단백질의 수송 기구에 대해서만 광범위하게 연구되었다. 또한 과산화소체 단백질 이동에 관련된 Pex5 단백질 및 그 수송 기구에 의해 전달되는 과산화소체 단백질의 타겟 신호도 많이 연구되었다. 본 발명은 Pex5p의 항진균 기능에 대한 최초의 발명이다.
인체 내 Pex5 단백질의 결함이 과산화소체 생합성 장애와 같은 중증 유전자 장애를 유발할 수 있다는 사실을 고려시 Pex5p가 세포 생존에 중요한 다양한 세포적 기능을 수행함이 제안될 수 있다. 결국 항진균 단백질로서 OsPex5pL 및 OsPex5pS 단백질의 새로운 기능의 확인은 진핵세포 내 Pex5p의 아직 확인되지 않은 기능의 이해를 증진시킨다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
식물 재료
새로운 형태의 항진균 단백질의 분리를 위해 본 발명은 도열병균-감염 벼 잎을 이용하였다. 표면-멸균된 벼(Oryza sativa L.) 종자는 4℃에서 48시간 동안 수화되었고 모종은 28℃에서 16시간 광주기 및 70%의 상대습도로 생장 챔버 내에서 생장되었다. 온실에서 생장된 벼 모종의 4번째 및 5번째 잎 단계가 도열병균의 접종에 이용되었다. 항진균 활성 측정을 위해 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates)(KCTC 6145), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)(KCTC 6598), 페니실리움 베루코숨 바르. 베루코숨(Penicillium verrucosum var. verrucosum)(KCTC 6265), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)(KCTC 16909), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)(KCTC 6326), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum)(KCTC 6043), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)(KACC 40573), 콜렉토트리키움 코코데스(Collectotrichum coccodes)(KACC 40803), 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)(KACC 40669), 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)(KACC 40718) 및 피토프토라 니코티아네(Phytophthora nicotianae)(KACC 40164)와 같은 한국생명공학연구원(KCTC) 또는 농업생명공학연구원(KACC)에서 수득된 다양한 종류의 진균 균주가 이용되었다. 유전자 발현을 조사하기 위해 H2O2(5 mM), 앱시스산(ABA)(200 μM), 자스몬산(JA)(250 μM) 및 살리실산(SA)(5 mM)과 같은 다양한 종류의 신호전달 분자가 S.T. Kim et al., Proteomics 4:3569-3578, 2004 및 M. Hajduch et al., Electrophoresis 22: 2824-2831, 2001에 기술된 절차와 동일하게 벼 현탁 배양물에 처리되었다.
(실시예 1) 도열병균-감염 벼 잎 유래 항진균 단백질의 정제
도열병균-감염 벼 잎(100 g)이 추출 완충액 A(1 mM DTT 및 1 mM EDTA를 함유한 25 mM Tris-HCl 완충액, pH 6.5)로 분말로 분쇄되고 40,000 ㅧ g에서 30분간 원심분리되었다. 상층액은 CM-Sepharose 컬럼(2.5 ㅧ 15 cm)에 로드되었고 흡착된 단백질은 선형 기울기의 0-1 M NaCl로 용출되었다. 항진균 활성을 포함한 분획이 수집되고 완충액 B(1 mM DTT 및 1 mM EDTA를 함유한 25 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.2)로 투석되고 완충액 B로 안정화된 Affi-겔 블루 겔 컬럼(1.5 ㅧ 8 cm)에 로드되었다. 비흡착 단백질을 제거하기 위해 컬럼은 선형 기울기의 0-0.5 M NaCl로 용출되었다. 최종적으로 활성 분획은 완충액 B로 미리-안정화된 Superdex 75 HR 10/30 컬럼 상에서 FPLC 겔 여과 크로마토그래피되었다. 각 크로마토그래피 단계에서 수집된 분획의 항진균 활성은 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 이용함으로서 분석되었다. 정제된 항진균 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 Edman 분해 기술에 의해 측정되었다.
(실시예 2) OsPEX5L 및 OsPEX5S cDNA의 클로닝 및 E. coli 내 단백질 발현
OsPEX5의 대안적 스플라이싱 유전자 생성물인 OsPEX5L 및 OsPEX5S 유전자가 PCR 기술에 의해 진균 유인제-처리 벼 잎 cDNA 라이브러리로부터 클론되었다. 2개의 OsPex5 단백질 발현을 위해 2개의 클론된 유전자는 각각 pGEX 벡터 내로 라이게이트되고 E. coli BL21(pLys S)내로 형질전환되었다. 0.5 M IPTG 처리에 의한 E. coli 내 단백질 유도 후 단백질은 초음파처리에 의해 세포에서 추출되었다. 세포 추출물로부터 재조합 GST-OsPex5pL 및 GST-OsPex5pS가 GSH-아가로스 친화력-겔을 이용하여 정제되었고, 단백질의 글루타티온 S-전이효소(GST)-부분은 트롬빈 처리에 의해 절단되어졌다. 용출된 단백질은 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에 대해 투석되었고 그의 생화학적 특성 분석을 위해 이용되었다.
(실시예 3) 노던 블럿 분석
총 RNA는 S.T. Kim et al., Proteomics 4:3569-3578, 2004 및 M. Hajduch et al., Electrophoresis 22: 2824-2831, 2001에 기술된 바와 같이 12시간 동안 다양한 종류의 외부 스트레스로 처리된 벼 현탁 배양 세포에서 추출되었다. 20 ㎍의 총 RNA는 1.2% 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되고 나일론 멤브레인(Amersham)에 옮겨졌다. 블럿은 프로브로서 [α-32P]ATP-표지 OsPEX5L cDNA로 혼성화되었다.
(실시예 4) 항진균 활성 분석
항진균 활성을 가시화하기 위해 본 발명은 라디칼 생장 저해 및 연속 미세-희석 분석을 수행하였다. 간단하게는 진균 단편은 감자-덱스트로스-한천(PDA) 플레이트 중심에 놓이고 28℃에서 60시간 동안 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후 멸균 종이 디스크를 진균 단편 주변 및 적당히 떨어진 거리에 놓고 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2) 내의 항진균 단백질 일정량을 점찍었다. 중심 디스크로부터 균사체 생장이 항진균 단백질의 항진균 활성에 의해 저해될 때까지 플레이트는 28℃에서 72시간 동안 인큐베이트되었고, 주변 저해 구역이 유발되었다. 다양한 진균 병원체에 대해 EC50을 측정하기 위해 28℃의 PDA 플레이트 상에서 생장된 10일령 배양물 유래의 진균 포자는 0.08% Triton X-100으로 수집되었고 PD 배지 내 80 ㎕의 2 ㅧ 104 포자/ml 현탁액이 96-웰 미량 역가판에 놓였다. 이후 각 웰에 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2) 내에서 2-배 연속적으로 희석된 20 ㎕의 항진균 단백질이 첨가되었다. 28℃에서 24∼36시간의 인큐베이션 후 진균 생장 또는 발아가 도립현미경을 이용하여 조사되었다. 또한 각 웰의 탁도는 미량역가 판독기(Molecular Devices Emax, CA, 미국)을 이용하여 590 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었다.
(실시예 5) 공초점 레이저 주사현미경
항진균 단백질의 세포 분포를 분석하기 위해 본 발명은 공초점 레이저 주사현미경을 이용하였다. 진균 세포 현탁액(104 분생자/ml)은 폴리-L-리신-코팅 유리 슬라이드 상에 점 찍은 후 슬라이드에 대한 세포 부착이 가능하도록 플레이트는 45분간 실온에서 유지되었다. 슬라이드가 인산 완충 식염수(PBSS)로 세척된 후 FITC-표지 항진균 단백질이 세포 내로 첨가되었고 30분간 인큐베이트되었다. PBSS로 슬라이드를 수차례 세척한 후 형광은 Zeiss(Gottingen, 독일) 레이저 주사 현미경(LSM 510META) 하에서 관찰되었다. 진균의 광학 연속 섹션(0.2∼0.3 ㎛)은 x-y 평면에 이미지를 생성하였다. 이미지는 512- × 512-픽셀 포맷으로 디지털로 기록되었다.
도 1은 본 발명의 항진균 효과를 지닌 벼 과산화소체 수용체 단백질을 정제하기 위한 절차를 나타낸 것이다. 도 1A는 CM-Sepharose 이온 교환 크로마토그래피 그래프이고, 도 1B는 Affi-겔 블루 친화력 크로마토그래피 그래프이고, 도 1C는 Superdex 75 HR 10/30 컬럼 상의 FPLC 겔 여과 크로마토그래피 그래프이다. 용해성 단백질의 추출 및 크로마토그래피 절차는 본 발명의 실시예에 기술되어 있다. 이를 통해 항진균 활성을 지닌 분획이 수집되고 정제되었다. 도 1C의 삽입사진은 12% SDS-PAGE 상에서 측정된 정제된 항진균 단백질의 분자량을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 정제된 항진균 단백질(도 1C의 F2 분획)의 N-말단 아미노산 서열의 측정 및 벼 cDNA 클론에서 추정된 OsPex5pL 및 OsPex5pS의 서열과의 비교를 나타낸 것이다. OsPEX5L 및 OsPEX5S 유전자는 PCR 기술에 의해 병원체-처리 벼 잎 cDNA 라이브러리로부터 클론되었다. 각각의 폴리펩타이드의 길이는 서열의 우측에 나타나 있고 점선은 갭을 나타낸다. OsPex5pL 서열의 상단-선은 OsPex5 단백질의 대안적으로 스플라이스된 영역을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 정제된 항진균 단백질의 칸디다 알비칸스(A), 푸사리움 옥시스포룸(B) 및 보트리티스 시네레아(C)에 대한 생장-저해 활성을 나타낸 것이다. 레인 1에서 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2) 내의 정제된 본 발명의 항진균 단백질 10 μM이 플레이트에 첨가되었다. 레인 2에서는 대조군으로서 단백질을 함유하지 않은 완충액이 첨가되었다.
도 4는 본 발명의 벼 현탁 세포 내 다양한 외부 스트레스에 대한 OsPEX5L mRNA의 발현 수치를 나타낸 것이다. 총 RNA는 12시간 동안 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea)(P), 진균 유인제(E), 5 mM 과산화수소(H2O2), 200 μM 앱시스산(ABA), 250 μM 자스몬산(JA) 및 5 mM 살리실산(SA)으로 처리 후 배아-유래 벼 캘러스에서 추출되었다. 비처리 캘러스의 발현 수치를 100%(C)으로 고정하여 대조군으로 이용되었다. 20 ㎍의 총 RNA는 1.2% 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고 나일론 멤브레인(Amersham)으로 옮겨졌다. [α-32P]ATP-표지된 OsPEX5L cDNA가 프로브로 사용되었다.
도 5는 본 발명의 도열병균-감염 벼 잎 유래의 정제된 항진균 단백질 및 박테리아를 통해 발현된 재조합 OsPex5 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 단백질 크기 마커는 레인 1에 로드되었다. 컬럼 크로마토그래피에서 정제된 항진균 단백질(도 1)은 레인 2에 적용되었다. 박테리아를 통해 발현된 OsPex5pS 및 OsPex5pL 단백질은 각각 레인 3 및 레인 4에 로드되었다. 12% SDS-PAGE에서 분리된 단백질은 쿠마시 블루로 염색되었다.
도 6은 본 발명의 다양한 진균에 대한 재조합 OsPex5 단백질, OsPex5pL 및 OsPex5pS의 항진균 활성을 나타낸 것이다. 재조합 OsPex5pL 및 OsPex5pS는 디디멜라 브리오니에(A), 보트리티스 시네레아(B) 및 푸사리움 옥시스포룸(C)으로 방사 생장 저해 시험되었다. 종이 디스크-1 및 디스크-2에서 100 ㎍의 OsPex5pL 및 OsPex5pS가 각각 적가되었다. 그러나 종이 디스크-B 및 디스크-C에서 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2) 또는 완충액 + 우혈청 알부민이 각각 대조군으로서 적가되었다.
도 7은 본 발명의 FITC-표지된 OsPex5pS와 인큐베이트된 진균의 공초점 레이저 현미경 촬영 사진이다. 칸디다 알비칸스(A) 및 푸사리움 옥시스포룸(B)의 균사는 20 μM FITC-표지된 OsPex5pS와 함께 30분간 인큐베이트되었다. 진균 세포 내 단백질의 형광 이미지는 패널 1에 나타나 있고 동일한 세포의 밝은 시야 이미지는 형광 현미경 하의 패널 2에 나타나 있다. 2개 패널의 병합 이미지는 패널 3에 나타나 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 벼 과산화소체 수용체 단백질(OsPex5pL)(서열번호: 1) 또는 그의 단편인 단백질(OsPex5pS)(서열번호: 2)을 유효성분으로 함유하는 식물에 대한 병원성 진균에 효과적인 항진균제
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항진균제는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 디디멜라 브리오니에(Didymella bryoniae)에서 선택된 식물에 대한 병원성 진균에 효과적임을 특징으로 하는 항진균제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항진균제의 유효 성분 농도는 0.01∼100 mM임을 특징으로 하는 항진균제
  4. 벼 과산화소체 수용체 단백질을 유효 성분으로 하여 안정화제, 계면활성제, 보존제, pH 조절제에서 선택된 첨가제를 물 또는 수용성 유기 용매에 용해시킴을 특징으로 하는 제 1항의 항진균제의 제조방법
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Mol. cell, Vol.23, No.2, pp.161-169
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