KR100841536B1 - 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주 - Google Patents

페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주 Download PDF

Info

Publication number
KR100841536B1
KR100841536B1 KR1020070022986A KR20070022986A KR100841536B1 KR 100841536 B1 KR100841536 B1 KR 100841536B1 KR 1020070022986 A KR1020070022986 A KR 1020070022986A KR 20070022986 A KR20070022986 A KR 20070022986A KR 100841536 B1 KR100841536 B1 KR 100841536B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
paa
gene
phenylacetic acid
seq
strain
Prior art date
Application number
KR1020070022986A
Other languages
English (en)
Inventor
박우준
김주현
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020070022986A priority Critical patent/KR100841536B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100841536B1 publication Critical patent/KR100841536B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/0103—Phenylacetate--CoA ligase (6.2.1.30)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 페닐아세트산에 대해서만 특징적으로 반응하여 페닐아세트산을 신속, 정확하고 경제적으로 탐지할 수 있는 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 paaA 유전자 프로모터(promoter) 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여 형질전환된 슈도모나스 속의 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주를 제공한다.
페닐아세트산, 슈도모나스 푸티다, 탐지, 바이오센서

Description

페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주{Biosensor cell for detecting phenylacetic acid using phenylacetic acid degradation genes}
도 1a는 슈도모나스 푸티다 KT2440(Pseudomonas putida KT2440)의 페닐아세트산(phenylacetic acid, PAA)을 분해하는 유전자 집단을 도식화한 도면이다.
도 1b는 슈도모나스 푸티다 KT2440을 각각 2% 글루코오스(glucose), 5mM 페닐아세트산 그리고 2% 글루코오스와 5mM 페닐아세트산을 함께 넣은 최소영양배지인 M9에 접종하여 균을 배양 후 각각의 조건에서 페닐아세트산 분해 유전자인 paaA , paaG , paaL mRNA 발현 양상을 노던 분석(Northern blot analysis)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명에 의한 PAA 감지벡터인 pPRKP paaA - gfp이 삽입된 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주를 2% 글루코오스(A) 또는 5mM PAA (C) 함유하는 최소영양배지인 M9에 각각 접종 및 배양 후 형광 현미경(Carlzeiss, Germany)을 통해 균의 GFP 발현 양상을 나타낸 사진으로, (B) 와 (D) 의 사진은 각각 (A)와 (C)에 대한 형광 현미경 사진이다.
도 2b는 다른 농도의 PAA 존재 내에서 본 발명에 의한 pPRKP paaA - gfp이 삽입 된 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주의 GFP 발현정도를 수치화한 그래프로서, 수치는 균주의 형광강도/OD600(Fluorescence intensity/OD600 of cells)으로 나타내었다.
도 2c는 페닐아세트산(PAA)의 대사와 다른 탄소원과의 관계를 알기 위해, P.putida KT2440 (pRKP paaA - gfp) 균주의 GFP 발현정도를 수치화한 것으로 균을 LB 또는 M9 배지에 글루코오스(10mM), 파이루베이트(pyruvate, 10mM), 숙신산(succinate, 10mM)의 탄소원에서 각각 키운 후 PAA 투입 후 3시간 뒤 GFP를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명에 의한 pPRKP paaA - gfp이 삽입된 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주(A)와 이 균주에 PAA-CoA 리가아제(ligase)를 유도하는 유전자인 paaF 유전자(gene)를 과발현시킨 벡터인 pBBR paaF 를 삽입한 균주(C)를 글루코오스와 PAA를 함께 함유한 최소영양배지 M9에 배양 후 형광현미경으로 두 균주의 GFP 발현 양상을 나타낸 사진으로, (B)와 (D)는 각각 (A)와 (C)에 대한 형광 현미경 사진이다.
도 3b는 도 3a에 나타난 GFP 발현 정도를 수치화한 그래프이다.
도 4는 PAA 생산균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(A)와 버크홀데리아 sp. MP1(Burkholderia sp . MP1)(B) 균주를 키웠던 배양액에서 본 발명에 의한 pPRKP paaA - gfp와 pBBR paaF 의 두 벡터를 함유한 슈도모나스 푸티다 KT2440(Pseudomonas putida KT2440)를 접종 및 배양한 후 형광현미경으로 균의 GFP 발현 양상을 나타낸 사진이다.
본 발명은 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 페닐아세트산의 분해 유전자를 이용하여 페닐아세트산에 대해서만 특징적으로 반응하여 페닐아세트산을 신속, 정확하고 경제적으로 탐지할 수 있는 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주 및 상기 바이오센서를 이용하여 페닐아세트산을 탐지하는 방법에 관한 것이다.
페닐아세트산(이하, PAA라고 함)은 현재 제초제로 쓰이는 농약이나 향수 등에 널리 이용되고 있는 유기화학물질이다. 또한 PAA는 스티렌(styrene), 트로픽 액시드(tropic acid), 에틸벤젠(Ethyl benzene) 등과 같은 오염물질이 분해되는 과정의 중간대사물질이기도 하다. 대장균(E. coli )이나 푸른곰팡이(penicillium )에서는 PAA를 이용하여 페니실린 G(penicillin G)를 생산하기도 한다. 또한 스트렙토마이세스 휴미더스 (Streptomyces humidus )나 버크홀데리아 sp.(Burkholderia sp.)의 경우 PAA를 생산하여 항진균제로 사용하기도 한다.
이러한 PAA 특성으로 미루어 볼 때 PAA를 탐지할 수 있는 균주는 과도한 농약의 사용으로 인한 PAA 오염지역을 선별하거나 토양의 PAA 오염 정도를 측정할 수 있을 뿐 아니라, PAA를 생산해내는 다양한 균주를 발굴하여 다양한 식물병원균의 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다 할 것이다.
한편, 기존 보고된 화학적 오염물질을 탐지하기 위한 균주는 특정 오염물질 에 대해 반응하는 균주가 아니라 대부분의 방향족 화합물에 대해 반응하는 바이오센서 균주이다. 대한민국 공개특허공보 특2003-0088315호에는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터를 이용한 미생물 바이오센서 및 이를 이용한 방향족 환경오염물질의 탐지방법이 개시되어 있다. 상기 발명의 dnaK는 DNA 샤프론(chaperone) 단백질로 방향족 환경오염물질에만 관여한다고 보기에 어렵다. 이는 방향족 오염물질 외에 다른 스트레스 조건에서도 dnaK 유전자를 충분히 발현시킬 수 있기 때문이다.
또한 종래에 PAA를 생산해내는 균주는 기체크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 등의 방법을 이용하였으나 시간과 비용이 많이 드는 문제점이 있었다.
따라서 과도한 농약의 사용으로 인한 PAA의 오염 정도 측정이나, PAA를 생산하는 균주의 선별에 효과적으로 이용될 수 있는 PAA에 대해서만 특징적으로 반응하여 PAA를 신속, 정확하고 경제적으로 탐지할 수 있는 바이오센서 균주에 대한 요구가 계속해서 있어 왔다.
본 발명은 종래 기술의 문제점 및 상기 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 페닐아세트산에 대해서만 특징적으로 반응하여 페닐아세트산을 신속하고 경제적으로 탐지할 수 있는 바이오센서 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규의 바이오센서 균주를 이용하여 페닐아세트산을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 paaA 유전자 프로모터(promoter) 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 페닐아세트산 탐지 바이오센서용 재조합 벡터를 제공한다.
바람직하게는 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자이다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서용 재조합 벡터를 도입하여 형질전환된 슈도모나스 속의 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 균주 내에 서열번호 6의 염기서열을 갖는 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 paaF 유전자를 포함하는 paaF 유전자의 과발현을 위한 재조합 벡터를 도입한 또 다른 바이오센서 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서 균주들 중 하나를 페닐아세트산에 노출시키고, GFP에 의한 형광값을 측정하여 페닐아세트산을 탐지하는 페닐아세트산(PAA) 탐지방법을 제공한다.
서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자 절편을 증폭하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 PCR용 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 유전자 절편을 증폭하기 위한 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음 과 같다.
본 발명자들은 도 1a에 도시된 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 조절유전자인 paaX, paaY를 모두 포함하는 paaA 유전자 프로모터를 선발하고, 이 프로모터와 프로모터 확인용 벡터를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 슈도모나스 푸티다 균주의 페닐아세트산 탐지능력을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
보다 구체적으로는 상기 paaA 유전자 프로모터(promoter)는 슈도모나스 푸티다 KT2440의 게놈 DNA 및 paa-F(CGC GGATCC CGG GCC GTT GCA GGG TAA TGA GC; 서열번호 1)와 paa-R(CGC GAATTC CAA GGT GGC GGT GAA TGT GAG; 서열번호 2) 프라이머를 이용하여 증폭되어 얻어진다.
이렇게 얻어진 유전자 단편(서열번호 3, 2108bp)은 프로모터 확인용 벡터에 도입되고 이 벡터를 이용하여 슈도모나스 속 균주가 형질전환되어 바이오센서 균주가 제작된다.
상기 프로모터 확인용 벡터는 예를 들어 안정적이고 다른 기질을 필요로 하지 않는 GFP 유전자가 리포터로 존재하는 pRK415(Yin et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003)일 수 있고, 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주(Pseudomonas putida KT2440(pRKP paaA - gfp)일 수 있다.
이렇게 제작된 바이오센서 균주는 PAA에 노출되면 GFP에 의한 형광값이 증가되므로 이를 확인하여 PAA를 신속, 정확하고 경제적으로 탐지할 수 있다(도 2a 및 도 2b 참조).
한편, 본 발명자들은 상기 PAA 분해에 필요한 효소를 만드는 유전자 집단 중 각 오페론의 첫 번째 유전자인 paaA, paaG 그리고 paaL의 유전자 발현 양상을 살펴본 결과 단일 탄소 에너지원으로 PAA가 존재 시에만 발현되고, 글루코오스 함께 넣고 배양했을 경우 PAA 분해에 필요한 유전자의 발현이 나타나지 않은 것을 확인하였다(도 1b). 본 발명자들은 이를 글루코오스에 의한 이화물 억제 기작으로 판단하였다.
따라서 PAA 분해 시스템(catabolic system)을 억제하는 탄소원의 존재 하에서도 PAA를 탐지할 수 있는 바이오센서 균주를 제작하기 위해, PAA 분해에 유도인자(inducer)인 PAA-CoA 리가아제(ligase) 역할을 하는 paaF 유전자의 과발현을 유도할 수 있는 유전자(서열번호 6, 1499bp)를 paaF-F (CGC GGATCC CCC GGC AGA ACG CAG GCA AAA A; 서열번호 4)와 paaF-R (CGC CTCGAG AGA CCC TGG CTT GTT ACC; 서열번호 5) 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통해 얻었다.
상기 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터를 상기 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주(Pseudomonas putida KT2440(pRKP paaA - gfp)에 도입하여 새로운 바이오센서 균주(Pesuomonas putida KT2440 (pPRKP paaA -gfp/ pBBRpaaF))를 구축하여 PAA 분해 시스템(catabolic system)을 억제하는 탄소원이 존재하는 자연계에서도 PAA를 탐지할 수 있는 능력을 확인하였다(도 3a 내지 도 4).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. PAA 분해 유전자( catabolic gene )의 발현
토양 미생물 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida KT2440)의 PAA 분해에 필요한 유전자는 도 1a에 도시된 바와 같다. PAA 분해 시스템(catabolic system)과 관련된 유전자의 발현 정도를 보기 위해 노던 분석(Northern blot analysis)을 통해 확인하였다.
총 RNA는 3ml의 대수기 (exponentially phase)의 세포를 RNeasy kit (Qiagen)를 사용하여 얻었다. RNA 농도는 260nm 흡광도를 이용하여 하나의 샘플당 5ug을 사용하였으며, 정량된 RNA는 나일론 막(membrane)에 Turboblotter (Schleicher & Schuell)를 사용하여 옮겼으며, 32P-동위원소로 표지된 paaA, paaG, paaL을 사용하여 발현을 알아보았다.
도 1b에 나타난 바와 같이, PAA 분해에 필요한 효소를 만드는 유전자 집단 중 각 오페론의 첫 번째 유전자인 paaA, paaG 그리고 paaL의 유전자 발현 양상을 살펴본 결과 단일 탄소 에너지원으로 PAA가 존재 시에만 발현되는 것을 확인하였다. 그런데 두 가지 탄소원(PAA, glucose)을 함께 넣고 배양했을 경우 PAA 분해에 필요한 유전자의 발현이 나타나지 않았다.
실시예 2: PAA 분해 유전자를 이용하여 형질전환된 PAA 탐지 균주의 구축 및 특성
Pseudomonas putida KT2440의 PAA 분해 유전자 중 조절유전자인 paaX, paaY를 모두 포함하는 paaA의 프로모터(promoter) 부위를 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=26986745) paa-F(CGC GGATCC CGG GCC GTT GCA GGG TAA TGA GC; 서열번호 1)와 paa-R(CGC GAATTC CAA GGT GGC GGT GAA TGT GAG; 서열번호 2) 프라이머(primer)를 이용, PCR을 통해 (annealing temperature 61℃) 얻었다[94℃ 1분 30초(1 cycle), 94℃ 45초- 61℃ 45초- 72℃ 45초(35 cycle), 72℃ 5분(1 cycle); Eppendorf HotMasterMix(Eppendorf, USA)].
상기 PCR을 통해 얻은 단편 (서열번호 3, 2108bp)과 gfp 유전자가 리포터(repoter)로 존재하는 벡터인 pRK415를 제한효소인 EcoRI과 BamHI 각각 처리하여 PCR 산물과 벡터를 T4 리가아제(ligase)를 이용해 리게이션(ligation)을 유도하였다.
이 재조합 벡터를 형질전환성 세포인 Esecherichia coli S17-1 균주에 전기충격방식으로 삽입하였다. 이렇게 구축된 E. coli S17-1(pRKP paaA - gfp) 균주와 P. putida KT2440 모균주와의 접합(30℃, LB plate에서 8시간 혼합배양)을 통해 pRK415paaA - gfp 벡터를 P. putida KT2440로 이동시켜 PAA가 존재시 GFP 단백질이 발현되는 균주인 P. putida KT2440 (pRKP paaA - gfp) 제작하였다.
이 균주의 PAA 탐지 가능성을 확인하기 위해 PAA (5mM)을 넣은 최소배지(minimal medium)에 배양 후 13시간 뒤 형광현미경으로 (Carlzeiss, Germany) 균을 관찰한 결과, PAA가 없는 조건에서는 GFP 형광이 관찰되지 않는 반면 PAA가 있는 조건에서는 GFP 형광을 확인할 수 있었다(도 2a).
또한 PAA 감지 농도를 측정하기 위해 다양한 농도의 PAA를 투입한 후 3시간 뒤 이 균들을 모아 마이크로티터 플레이트 판독기(microtiter plate reader, VICTOR, Biorad) 이용하여 GFP 강도(intensity)를 측정한 결과 10μM 이상부터 발현 양상이 증가함을 알 수 있었다(도 2b).
먼저 실시한 바 있는 노던 분석(Northern bolt analysis) 결과와 같이 이 균주를 PAA를 넣은 LB 배지나, 글루코오스(glucose)가 포함된 최소영양배지에서는 GFP 의 발현 양상이 나타나지 않았다. 이는 글루코오스에 의한 이화물 억제 기작으로 보인다. 하지만 다른 탄소원인 숙신산(succinate)이나 파이루베이트(pyruvate)의 경우는 PAA 분해 유전자에 대한 이화물 억제 기작에 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다(도 2c).
실시예 3: PAA 탐지 균주내의 paaF 유전자의 과발현 및 효과
본 발명자들은 앞서 구축한 PAA 탐지 균주의 이화물 억제 기작을 줄이기 위 해, PAA 분해에 유도인자(inducer)인 PAA-CoA 리가아제(ligase) 역할을 하는 paaF 유전자의 과발현을 유도하였다.
보다 구체적으로는 paaF-F (CGC GGATCC CCC GGC AGA ACG CAG GCA AAA A; 서열번호 4)와 paaF-R (CGC CTCGAG AGA CCC TGC GCT TGT TAC C; 서열번호 5) 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통해 1499bp의 단편(서열번호 6 )을 얻었다[94℃ 1분 30초(1 cycle), 94℃ 45초- 61℃ 45초- 72℃ 45초(35 cycle), 72℃ 5분(1 cycle); Eppendorf HotMasterMix(Eppendorf, USA)].
상기 얻어진 단편을 제한효소인 BamHI 과 XhoI 처리하여 pBBR1MCS2의 BamHI, XhoI cloning site에 T4 리가아제(ligase)를 이용하여 삽입하였다. 이 재조합 벡터를 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방식을 이용하여, 기존에 구축한 PAA 탐지 균주인 P. putida KT2440 (pPRKP paaA - gfp)에 삽입함으로써 새로운 PAA 탐지 균주인 P. putida KT2440 (pPRKP paaA - gfp / pBBR paaF )를 구축하였다.
paaF 유전자를 과발현시킨 PAA 탐지 균주와 그렇지 않은 탐지균주를 각각 글루코오스(glucose)가 포함된 최소영양배지에서 OD600~0.3 수준까지 배양 후 PAA를 넣고 3시간 뒤 형광현미경과 VICTOR로 GFP 발현 양상을 살펴보았다.
그 결과 도 3a에서 보는 바와 같이 paaF 유전자를 과발현시킨 균주에서는 글루코오스에 의한 이화물 억제에 대한 기작을 확연히 줄일 수 있었다. 이러한 양상의 수치는 paaF의 과발현을 유도하지 않은 PAA 탐지균주보다 약 3배 정도 높은 GFP 발현정도를 보여준다(도 3b). 따라서 P. putida KT2440 (pPRKP paaA - gfp / pBBR paaF ) 균 주는 자연계에서 PAA 분해 시스템(catabolic system)을 억제하는 탄소원의 존재에도 PAA를 탐지할 수 있는 것으로 판단된다.
또한 본 발명자들은 이 균주를 PAA를 생산하는 균으로 알려진 버크홀데리아(Burkholderia sp.)와 바실러스(Bacillus sp.)의 5일간 배양한 LB 배지(medium)의 상층액에 배양시킨 후 형광현미경 관찰 결과 GFP 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 4).
상술한 바와 같이 본 발명은 슈도모나스 푸티다 KT2440(Pseudomonas putia KT2440) 균주의 PAA 분해 유전자를 이용해 PAA를 탐지하여 모니터링 할 수 있는 균주를 구축하였다. 상기와 같이, PAA에 대해서만 특징적으로 반응하여 PAA를 탐지할 수 있는 균주를 구축함으로써, 토양의 PAA의 오염정도를 모니터링 할 수 있을 뿐만 아니라, PAA를 생산해내는 균주를 GC-MS 등의 방법을 쓰지 않고도 선별할 수 있다.
따라서 본 발명에 의한 PAA를 탐지하는 균주를 이용하면 PAA를 검출하는데 필요한 시간과 비용을 크게 절감할 수 있는 효과를 도모할 수 있다. 나아가 PAA를 생산해 내는 다양한 균주를 신속, 경제적으로 발굴할 수 있어 다양한 식물병원균의 제제에도 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 3의 염기서열을 갖는 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 paaA 유전자 프로모터(promoter); 및
    상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 페닐아세트산 탐지 바이오센서용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자인 바이오센서용 재조합 벡터.
  3. 제2항에 기재된 상기 바이오센서용 재조합 벡터를 도입하여 형질전환된 슈도모나스 속의 페닐아세트산 탐지용 바이오센서 균주.
  4. 서열번호 6의 염기서열을 갖는 페닐아세트산(PAA) 분해 유전자 중 paaF 유전자를 포함하는 상기 paaF의 과발현을 위한 재조합 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 균주 내에 제4항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 바이오센서 균주.
  6. 제3항 기재의 상기 바이오센서 균주를 페닐아세트산에 노출시키고, GFP에 의한 형광값을 측정하여 페닐아세트산을 탐지하는 페닐아세트산(PAA) 탐지방법.
  7. 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자 절편을 증폭하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 PCR용 프라이머.
  8. 서열번호 6의 염기서열을 갖는 유전자 절편을 증폭하기 위한 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머.
KR1020070022986A 2007-03-08 2007-03-08 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주 KR100841536B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070022986A KR100841536B1 (ko) 2007-03-08 2007-03-08 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070022986A KR100841536B1 (ko) 2007-03-08 2007-03-08 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100841536B1 true KR100841536B1 (ko) 2008-06-26

Family

ID=39772545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070022986A KR100841536B1 (ko) 2007-03-08 2007-03-08 페닐아세트산 분해 유전자를 이용한 페닐아세트산 탐지용바이오센서 균주

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100841536B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033496A1 (de) 2002-10-04 2004-04-22 Symrise Gmbh & Co. Kg Agonisten und antagonisten des humanen duftstoffrezeptors or17-4 sowie verwendungen davon
KR20060116418A (ko) * 2005-05-10 2006-11-15 고려대학교 산학협력단 산화적 스트레스 탐지용 유전자 구조체 및 이를 이용한바이오센서

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033496A1 (de) 2002-10-04 2004-04-22 Symrise Gmbh & Co. Kg Agonisten und antagonisten des humanen duftstoffrezeptors or17-4 sowie verwendungen davon
KR20060116418A (ko) * 2005-05-10 2006-11-15 고려대학교 산학협력단 산화적 스트레스 탐지용 유전자 구조체 및 이를 이용한바이오센서

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bin et al. Expression and characteristics of the gene encoding azoreductase from Rhodobacter sphaeroides AS1. 1737
Kahng et al. Characterization of strain HY99, a novel microorganism capable of aerobic and anaerobic degradation of aniline
Widada et al. Recent developments in molecular techniques for identification and monitoring of xenobiotic-degrading bacteria and their catabolic genes in bioremediation
Watanabe et al. Molecular detection, isolation, and physiological characterization of functionally dominant phenol-degrading bacteria in activated sludge
Kang et al. Acinetobacter oleivorans sp. nov. is capable of adhering to and growing on diesel-oil
Christensen et al. Establishment of new genetic traits in a microbial biofilm community
Sørensen et al. Molecular tools in rhizosphere microbiology—from single-cell to whole-community analysis
Huang et al. Chromosomally located gene fusions constructed in Acinetobacter sp. ADP1 for the detection of salicylate
Park et al. N-acylhomoserine lactonase producing Rhodococcus spp. with different AHL-degrading activities
Iizumi et al. A bioluminescence assay using Nitrosomonas europaea for rapid and sensitive detection of nitrification inhibitors
Pasco et al. Development and applications of whole cell biosensors for ecotoxicity testing
Heinaru et al. Biodegradation efficiency of functionally important populations selected for bioaugmentation in phenol-and oil-polluted area
Koch et al. Carbon limitation induces ςS-dependent gene expression in pseudomonas fluorescens in soil
Behzadian et al. Construction and characterization of Escherichia coli whole-cell biosensors for toluene and related compounds
Shi et al. Arsenite oxidation regulator AioR regulates bacterial chemotaxis towards arsenite in Agrobacterium tumefaciens GW4
Kim et al. Effect of iron concentration on the growth rate of Pseudomonas syringae and the expression of virulence factors in hrp-inducing minimal medium
Schoeffler et al. Growth of an anaerobic sulfate‐reducing bacterium sustained by oxygen respiratory energy conservation after O2‐driven experimental evolution
Woo et al. The measurement of toluene dioxygenase activity in biofilm culture of Pseudomonas putida F1
KR20010020420A (ko) 생물발광 리포터 박테리아 및 생물학적 폐수 처리 시스템에서의 독성 관측 방법
Suar et al. Dynamics of multiple lin gene expression in Sphingomonas paucimobilis B90A in response to different hexachlorocyclohexane isomers
Sun et al. Characterization of the multiple molecular mechanisms underlying RsaL control of phenazine‐1‐carboxylic acid biosynthesis in the rhizosphere bacterium Pseudomonas aeruginosa PA1201
Tizzard et al. A resazurin-based biosensor for organic pollutants
Ramos et al. A bioluminescent derivative of Pseudomonas putida KT2440 for deliberate release into the environment
Hinz et al. Golden gate assembly of aerobic and anaerobic microbial bioreporters
Picard et al. Identification of a novel type of glucose dehydrogenase involved in the mineral weathering ability of Collimonas pratensis strain PMB3 (1)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120319

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130405

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee