KR100827543B1 - 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노 구조물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오칩을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노구조물을 형성하는 방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명은 본 발명은 마이크로-콘택트 프린팅(micro-contact printing) 방식을 이용하여 패턴화시킨 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노구조물을 정밀하게 제조함으로써, 바이오칩의 감도를 고도로 높이고 비특정 흡착이 발생하지 않도록 하여 바이오 센서의 신뢰성을 높이도록 한다.

Description

템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노 구조물 및 이의 제조 방법{THREE-DIMENSIONAL NANOSTRUCTURES WITH ACTIVE ENZYMES BY SURFACE TEMPLATED LAYER-BY-LAYER ASSEMBLY AND METHOD FOR BUILDING THE SAME}
도 1은 본 발명에 따라 기능성 효소를 포함하는 3차원 나노구조물를 형성하는 공정을 개략적으로 나타낸 단면도이다.
도 2는 조립 사이클 수에 따른 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 막의 두께를 도시한다.
도 3은 조립 사이클 수에 따른 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 3차원 나노구조물의 원자힘현미경 이미지를 도시한다.
도 4는 1, 5 및 9개의 이중층 샘플에 대한 571nm에서 다른 시간 간격 동안의 흡수도 변화를 도시하는 그래프이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
10: 기판 20: 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프
30: 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH) 스트립
본 발명은 바이오칩을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노구조물을 형성하는 방법에 관한 것이다.
최근 인간 유전체의 구조가 거의 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 기능연구에 대한 관심이 급증하고 있다. 이와 같이, 유전자의 기능을 규명하는 총체적인 연구 분야를 기능 제노믹스(Functional Genomics)라 정의하며, 이는 유전자를 실험재료로 사용하여 연구하는 제노믹스(genomics), 세포 내의 총체적인 단백질군을 대상으로 연구하여 유전자의 기능을 규명하는 프로테오믹스(proteomics), 그리고 이 두 분야를 공통적으로 원하는 바이오인포매틱스(bioinformatics)로 구분되어 진다. 최근까지만 하더라도 유전자나 세포의 기능연구에 대한 분자생물학적인 접근은 대부분 단일 유전자나 그 유전자가 발현하는 mRNA의 발현 조절을 중심으로 이루어졌으나, 요즘에는 단백질체를 중심으로 바뀌고 있는 추세이다.
상기 단백질체 연구에 필수적으로 이용될 수 있는 핵심기술이 단백질칩(protein chip)이다(Gavin MacBeath and Stuart L. Schreiber, Science, 289:1760~1763, 2000). 단백질칩은 수십 내지 수천 개의 단백질을 작은 기판상에 고정해 동시다발적으로 단백질의 결합을 분석하는 자동화기기 시스템이다. 이는 수십 내지 수천 개의 유전자를 기판상에 고정화시켜 동시다발적으로 유전자의 변화를 유전자간의 상보적 결합을 통하여 정량분석함으로써 유전자 발현이나 돌연변이를 검색하는 마이크로 어레이 DNA칩(microarray DNA chip)과 비슷하다(Yasuda, H., Lamage, C. E., J. A ppl. Polym. Sci.17: 201, 1973; Muguruma, H., Karube, I., Trends Anal. Chem.18: 62, 1999; Nalanishi, K., Muguruma, H., Karube, I., Anal. Chem.68: 1695, 1996; Miyachi, H., Hiratsuka, A., Ikebukuro, K., Yano, K., Muguruma, H., Karube, I., Biotechnol. Bioengin.69: 323, 2000) . 그러나 단백질칩은 상기 DNA칩으로는 알아내지 못하는 다음과 같은 부분을 분석할 수 있다.
첫째, 단백질-단백질간의 상호작용에 관한 정보를 얻을 수 있다. 세포 내 신호전달이나 조절은 단백질-단백질간의 상호작용의 형태로 나타나는데, 이를 단백질칩을 통하여서 분석할 수 있다.
둘째, 인간을 포함한 고등생물체로부터 효모에 이르기까지 단백질은 유전자와는 관계없이 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어나는데, 인산화(phosphorylation), 산화(oxidation) 등과 같은 이차적인 수식에 관한 정보를 얻을 수 있다.
셋째, mRNA 생성 후 발생하는 문제점을 검출할 수 있다. 많은 질병이 전사(transcription) 후 조절이나 단백질의 생성, 그리고 단백질의 위치(localization)와 같은 문제점으로부터 야기되는데, mRNA를 검출하는 DNA칩으로는 이런 정보를 얻기가 힘들다.
넷째, mRNA가 단백질로 발현시 둘 사이의 정량적인 상관관계가 그리 높지 않을 수 있기 때문에, 경우에 따라 단백질에 관한 정확한 정보를 제공할 수 없다는 DNA칩의 한계를 단백질칩을 통하여 극복할 수 있다.
다섯째, DNA칩으로 규명되는 유전자의 염기서열의 차이가 직접적인 질병을 의미하거나, 표현형의 차이를 나타내지 않는다. 더욱이 비슷한 특성을 가진 아미노 산으로의 돌연변이는 대개 단백질의 고유특성을 유지하기 때문에, 질병이나 표현형의 차이를 유발하지 않는다. 그러나 단백질칩을 이용하면 직접적인 질병 및 표현형의 차이를 나타내는 단백질을 규명할 수 있다.
단백질칩을 이용하면 단백질-단백질간의 상호관계에 관한 데이터 생성이 가능하며, 신약 개발시 시간 및 비용의 절감효과를 가져올 수 있는데, 한 예로 현재의 유전자를 이용한 치료약 개발보다 걸리는 시간을 비약적으로 단축시킬 수 있다. 또한, 단백질칩은 산업적 수요뿐 아니라, 질환 진단, 환경 모니터링, 유해성 검진 등 잠재수요도 대단히 크다.
단백질칩에 있어서, 그 핵심기술은 단백질을 칩의 표면에 결합시키는 단백질 고정화 기술이다. 단백질 고정화 기술은 특성에 따라 다음과 같이 세 가지로 나눠진다. 첫 번째는 카르복시메틸-덱스트란(CM(carboxymethyl-dextran)을 이용하여 특정 단백질을 센서칩의 표면에 고정하는 방법으로, 가장 널리 이용되고 있는 방법이다. 그 중 아민(amine)결합이 가장 보편적으로 이용되며, 산성을 띠는 단백질이나 DNA 등을 결합시키기 위한 티올(thiol)결합이나, 아비딘-바이오틴(avidin-biotin) 결합이 이용되기도 한다. 두 번째는 다수의 동일 특성을 띠는 단백질군을 결합할 수 있도록 센서칩의 표면을 처리하는 방법이다. 세 번째는 불특정 다수의 단백질을 결합시키는 방법으로, 폴리라이신(polylysine)이나 calix crown(칼릭스 크라운)을 예로 들 수 있다.
그러나 상기 센서칩의 핵심기술인 단백질을 기판에 고정화시키는데 있어, 비특정 표면 고정화(nonspecific surface immobilization), 고체 표면에의 고정화에 따른 단백질의 생물학적 활성의 상실, 상대적으로 낮은 활성물질의 표면 농도, 표면이탈에 따른 분석신호의 소멸 등의 기술적 어려움이 있는바, 그 해결이 시급한 실정이다.
단백질을 기판에 고정화시키는데 있어서 가장 필요한 기술은 나노미터 크기의 소자를 만들기 위한 신뢰성 있는 패터닝기술이다. 또한, 단백질 고정 기술과 관련하여 마이크로 크기 내지 나노 크기에서 기능성 바이오 분자를 표면에 정확하게 부착시키는 것은 어래이형 고효율 스크리닝 기술, 새로운 바이오센서, 바이오전자분야, 피부 공학 및 셀바이오 분야의 기초 연구 등에 있어서 매우 중요하다.
이와 같은 단백질 고정 기술에는 잉크젯 프린팅, 마이크로 유체, 마이크로-콘택트 프린팅(μCP), 전자빔 리소그래피 및 주사탐침형 기술 등이 있다.
광학적인 방식을 이용한 방법으로서, 현재까지 사용되어 왔고 가까운 미래까지 주요 기술로 사용될 노광공정(photolithography)은 해상도 면에 있어서 100nm 정도의 한계를 가지고 있다. 이는 100nm이하의 크기에서 일어나는 빛의 간섭문제 때문인데 90년대 중반부터 이러한 노광공정을 대체하기 위해 많은 노력이 있었다. 경제적인 문제만 없다면 100nm이하의 해상도를 갖는 광학 리소그래피 방법은 벌써 개발되어 있는 상황이며, 예를 들어 전자빔 리소그래피(electron-beam lithography), 엑스선 리소그래피(X-ray lithography), 주사 탐침 리소그래피(scanning probe lithography) 등이 그러한 방법의 예이다. 그러나 광학적인 방법에 의한 패턴 방식은 비싼 광원을 사용해야하고 장비도 많이 사용되어야 한다는 단점이 있다. 또한, 이 방식에서 사용되는 빛 차단 물질은 비 환경 친화적이라 다른 기술의 도입이 필요하다.
종래기술로서, 2002년 11월 26일 특허 허여된 미국특허 US 6,485,984, 칼릭스크라운 유도체, 이의 제조 방법, 이를 이용하여 준비된 칼릭스크라운 유도체의 자기 조립 단분자막 및 칼릭스크라운 유도체의 자기 조립 단분자막을 이용하여 단백질 단분자막을 고정하는 방법(Calixcrown derivatives, a process for the preparation thereof, a self-assembled monolayer of the calixcrown derivatives prepared by using the same and a process for immobilizing a protein monolayer by using the self-assembled monolayer of the calixcrown derivatives)에서는 자기 조립 단분자막을 이용하여 기판 위에 단백질을 고정시키는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 종래 기술에서는 선택적으로 원하는 위치에 단백질을 고정시키지 못하였으며, 공정이 복잡하고 패턴 형성이 명확하지 못하였다.
또한, 종래 기술로서 감광성인 폴리에틸렌글리콜을 모세관력 리소그래피를 이용하여 패터닝한 후 폴리디메틸실록산(PDMS) 도장을 덮고 자외선을 조사하여 경화시킨 후 플루오로카본(flourocarbon) 플라즈마로 에칭한 다음, 단백질을 선택적인 위치에 고정화하는 기술이 개시되었다 (Microstructures of poly ethylene glycol by molding and dewetting, K.Y. Suh, R. Langer, Appl. Phys. Lett., Vol. 83, No. 8, 1668, 2003). 그러나 상기 기술은 자외선을 조사하여야 하기 때문에 복잡하고 패터닝 속도가 느리기 때문에 저렴하게 바이오 센서의 기판을 제공하는 것이 곤란하였다.
미국특허출원 USSN 20030062334호 (2003년 4월 3일 출원, Method for forming a micro-pattern on a substrate by using capillary force)에서는 모세관력 리소그래피를 이용하여 다양한 방식으로 고분자 패턴을 만드는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 종래 기술에서는 모두 액상으로 이루어져 있기 때문에 얇은 고분자 막을 패턴하는 것이 곤란하며, 모세관력 리소그래피 공정 후 잔존물이 발생하기 때문에, 상기 종래 기술을 생체 물질 패턴 형성에 사용하는 것이 곤란하다.
이제까지의 종래 기술에 의해 형성된 바이오칩은 하나의 바이오 분자층만을 가지고 있기 때문에 고민감 센서와 같은 응용 분야에는 사용될 수 없다는 문제점을 가진다. 또한, 종래의 바이오칩에서는 여전히 비특정 흡착이 발생하기 때문에 바이오 센서의 신뢰성이 낮다는 문제점을 가진다. 또한, 이제까지 바이오 분자를 가진 층간 조립(Layer-By-Layer assembly) 분야에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 아직까지 활성 효소를 가진 다층 3D 마이크로/나노 구조가 구현되지 못했다.
따라서, 본 발명은 상기 종래 기술이 가지고 있는 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 바이오칩의 감도를 높이고 비특정 흡착이 발생하지 않도록 활성 효소를 가진 다층 3D 마이크로/나노 구조를 구현하여 바이오 센서의 신뢰성을 높이는 것을 목적으로 한다.
이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 마이크로-콘택트 프린팅(micro-contact printing) 방식을 이용하여 패턴화시킨 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층(Layer-By-Layer) 형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원(3D) 나노구조물에 의해 달성된다.
단백질과 관련된 비특정 상호작용이 레지스트 백그라운드 상에 비특정 흡착을 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 명확하게 형성되는 다층 구조를 얻기 위해, 비특정 흡착을 최소화하였다. 여기서, 우리는 저항성 코팅으로서, 비특정 바이오분자 흡착을 감소시키는 것으로 알려져 있는 헥사(에틸렌 글리콜)기로 말단화된 자기조립단분자막(self-assembled monolayer:SAM)를 이용한다. 본 발명에서 모델 효소로서 효소당 평균 2.3 바이오틴이 표지된 양고추냉이 페록시다아제(바이오틴-HRP)를 선택하고 생체적합한 링커로서 아비딘을 선택하였는데, 각각의 아비딘은 각각의 단백질 측면 상에 2개씩, 4개의 바이오틴 결합 사이트를 가지고 있기 때문이다. 이는 또한 아비딘 및 바이오틴 사이에 상당히 강한 바이오특정 결합이 이루어지는 장점을 이용한다(해리 상수, K d ~ 10-15 M).
이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 설명한다.
도 1은 본 발명에 따라 활성 효소를 가진 3차원 구조를 형성하는 공정을 개략적으로 나타낸 단면도이다. 본 실시예에서는 기판을 패터닝하기 위해 마이크로-콘택트 프린팅(μCP) 기술이 이용된다. 또한, 본 실시예에서 평탄한 금 표면을 가진 기판(10) 상에 저항성 코팅제로서 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH(11-mercaptoundecylhexa-(ethylene glycol) alcohol))로된 미크론 사이즈의 자기조립단분자막(SAM) 스트립(30)을 프린팅한다(도 1c 및 1d). 다음에 스탬핑되지 않은 영역을 바이오틴으로 말단화된 티올(thiol)로된 자기조립단분자막(SAM)으로 채운운다(도 1e).
다음에 바이오티닐화된 자기조립단분자막(SAM) 영역 상에 아비딘이 바이오틴 결합 사이트중 두개를 이용하여 조립된다(도 1f). 그리고 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP)를 결합시키기 위한 추가의 두개의 바이오틴 결합사이트는 남겨둔다.
그 후에 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP)가 상기 두개의 바이오틴 결합사이트에 결합한다(도 1g). 이러한 결합에 의해 가장 바깥 쪽에 바이오틴으로 말단화된 층이 형성되며, 여기에 제 2 아비딘층이 결합될 수 있다.
본 실시예에서 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프는 2μm갭으로 분리되는 2μm 스트립을 가진다. PDMS 스탬프는 에탄올중 2mM의 헥사에틸렌글리콜알코올((EG)6OH) 용액으로 적신다(inked). 다음에 상기 스탬프는 질소로 송풍 건조되고 금도금 된 기판과 컨포멀 콘택을 하게 되고, 이러한 접촉 상태를 약 20-30초 동안 유지한다. 프린팅 후에, 금 기판은 약 1시간 동안 바이오틴-이황화물 용액으로 인큐베이팅되어 바이오틴이 말단화된 자기조립단분자막(SAM)으로 스탬핑되지 않은 영역을 채운다. 기판은 에탄올, 메탄올 및 밀리큐 워터로 세정되어 결합되지 않은 바이오틴-이황화물을 제거하고, 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP)층간 조립을 템플릿한다.
기판은 약 0.5시간 동안 0.1mg/ml 아비딘 용액에서 인큐베이팅되고, 인산완충식염수(PBS)로 세정되고 다음에 약 0.5시간 동안 0.2mg/ml 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 용액에 적신다. 이것이 첫번째 단백질 이중층이며, 이를 줄여 (아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP))1이라고 한다. 추가의 이중층을 형성하기 위해 앞서의 단계를 반복한다.
이와 같이, 아비딘 및 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP)에 의한 선택적인 층간 조립을 반복하여 3차원 효소 구조를 성장시킨다. 효소는 생체적합한 단백질(아비딘)층 상부에 조립되기 때문에, 고정화된 효소는 촉매 기능을 유지하여야 한다. 기능성 효소를 포함하는 적층 형태(Layer by Layer)의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노 구조물은 일반적으로 단지 하나의 층의 효소만을 포함하는 기존의 고정화된 효소 어레이(array) 보다 전체 촉매 활성도가 높다.
<실시예>
본 발명에 따라 제조된 3차원 구조의 성능을 확인하기 위하여, 다음과 같이 실시하였다. 금으로 코팅된 실리콘 표면(~10nm 크롬 접착층을 가진 ~200nm 두께의 금)에 다층 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 막을 조립하고, 원편광분석기(ellipsometry)를 이용하여 조립 사이클 수에 따라 두께 변화를 측정했다. 금 표면은 약 1.5시간 동안 바이오틴-이황화물 용액(에탄올중 1mM)에서 인큐베이팅함으로써 바이오틴이 말단화된 티올로 이루어진 자기조립단분자막(SAM)으로 코팅되고, 이를 조립에 이용하기 전에 에탄올, 메탄올 및 밀리큐 워터로 철저하게 세정했다. 제 1아비딘층은 약 30분 동안 아비딘 용액(인산완충식염수(PBS)중 0.1 mg/mL, 10 mM phosphate, 150 mM NaCl, 2 mM NaN3, pH 7.4)으로 상기 표면을 인큐베이팅함으로써 조립된다. 인산완충식염수(PBS)로 세정한 후에, 상기 표면은 30분 동안 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP)(인산완충식염수(PBS)중 0.2mg/mL)로 인큐베이팅되고, 인산완충식염수(PBS)로 세정된다.
도 2는 조립 사이클 수에 따른 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 막의 두께를 도시한다. 도 1에 따르면 조립 사이클 수가 증가함에 따라 단백질 막 두께가 증가하는 것을 알 수 있으며, 이는 첫번째 이중층 다음에 효소 막이 정확하게 층간 조립되었음을 나타낸다. 각각의 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 이중층의 평균 두께는 ~1.44nm인데, 이는 촘촘하게 밀집한 양고추냉이 페록시다아제(HRP) 및 아비딘 층(약 8-10nm)의 결합 두께보다 상당히 얇다.
도 3은 조립 사이클 수에 따른 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 3차원 나노구조물을 나타내는 원자힘현미경 이미지를 도시한다. 본 발명에 따라, 3차원 구조상에 효소를 조립하고, 층간 조립(LBL assembly) 공정에 따른 효소 패턴을 관찰했다. 도 3a는 마이크로-콘택트 프린팅(μCP)으로 패턴닝된 자기조립단분자막(SAM) 템플릿의 이미지를 보여주는데, 이는 평탄한 얇은 금 코팅 표면상에 2μm 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH) 자기조립단분자막(SAM) 스트립이 바이오틴-티올 스트립으로 분리되어 있다. 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH) 스트립은 바이오틴-티올 스트립 보다 ~2.4nm 높다. 이는 두개의 SAM 사이에 두께 차이를 가진다는 것을 의미한다.
아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 이중층이 템플릿상에 조립된 후에, 단백질 및 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH) 스트립 사이의 지형적 구조는 반전된다(도 3b). 이제 단백질 스트립이 헥사에틸렌글리콜알코올(EG6OH) 스트립 보다 ~1.2nm 높은데, 이는 단백질이 바이오틴 스트립 상에 조립됐기 때문이다.
바이오분자에 대해 가장 효율적인 저항성 코팅제중 하나인 EG6OH SAM을 이용함에도 불구하고, 레지스트 스트립 상에 비특정 흡착이 일부 관찰되었다. 본 발명에서 대부분의 비특정 흡착된 단백질은 약 1.5시간 동안 계면활성제(인산완충식염수(PBS)중 0.1% Tween 20)로 표면을 처리함으로써 제거하였다. 이러한 처리에 의해 두개의 스트립 사이의 높이 차가 ~3.2nm까지 증가하였다(도 3c). 각각의 조립 단계 사이에서 계면활성제로 세정을 해줌으로써, 3차원 구조의 다층 아비딘/효소는 LBL 조립에 의하여 패턴화된 표면상에 쉽게 제조될 수 있다.
도 3d는 9개의 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 이중층의 조립 후에 패턴화된 표면의 이미지를 도시한다. 효소 스트립의 높이는 레지스트 백그라운드로부터 ~12nm 이다. 이는 전체 단백질 층 두께 ~14.4nm에 상응한다. 이는 EG6OH 상에 비특정 흡착이 거의 없음을 보여주는 것으로서, 기능성 패턴 영역 상에 3차원 효소 구조를 층간 조립으로 정확하게 형성할 수 있음을 나타낸다.
흡착에 대한 검정이 고정화된 효소의 활성도를 측정하기 위하여 이용되었다. 571nm에서 다른 시간 간격 동안 1, 5 및 9개의 이중층 샘플에 대한 흡수도 변화가 측정되었다(도 4). 과산화수소(H2O2) 존재하에서, 양고추냉이 페록시다아제(HRP)는 무색 기판(암플렉스 레드(Amplex red))을 571nm에서 최대 흡수도를 가진 유색 제품(레소루핀(resorufin))으로 바꾼다. 모든 3개의 샘플은 촉매적으로 활성화되어 있으며 전체 활성도는 효소층의 수에 따라 증가했다. 효소층에 따른 활성도의 증가율은 선형은 아니며, 5 이중층 및 9 이중층의 활성도는 1 이중층에 비해 약 ~25% 및 ~40% 높다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 층간 조립을 유도하기 위해 마이크로-콘택트 프린팅 패턴닝된 자기조립단분자막(SAM) 템플레이트를 이용함으로써 정확하게 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체가 구비된 3차원 나노구조물을 성공적으로 제조할 수 있다. 조립된 효소는 촉매 활성도를 유지하여, 전체 활성도는 효소층 수에 따라 증가하게 된다.
이상에서 설명한 것은 본 발명에 따른 하나의 실시예를 설명한 것이며, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 않고, 이하의 청구범위에서 청구하는 바와 같이 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 변경실시 가능한 범위까지 본 발명의 범위에 있다고 할 것이다.
본 발명은 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층형태의 조립체인 3차원 나노구조물을 구현하여 바이오칩의 감도를 고도로 높이고 비특정 흡착이 발생하지 않도록 하여 바이오 센서의 신뢰성을 높이는 효과를 가진다.

Claims (7)

  1. 마이크로-콘택트 프린팅(micro-contact printing) 방식을 이용하여 패턴화시킨 템플레이트 표면에 기능성 효소를 포함하는 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물.
  2. a) 금 표면을 가진 기판 상에 저항성 코팅제로서 헥사에틸렌글리콜 그룹으로 말단화된 자기조립단분자막(SAM) 스트립을 스탬핑하는 단계;
    b) 스탬핑되지 않은 영역을 바이오틴으로 말단화된 자기조립단분자막(SAM)으로 채우는 단계;
    c) 바이오틴으로 말단화된 자기조립단분자막(SAM) 영역 상에 아비딘을 조립하는 단계;
    d) 바이오틴-기능성 효소를 상기 아비딘과 결합시키는 단계; 및
    e) 상기 단계 c) 및 d)를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물을 형성하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단계 b) 내지 d) 단계중 어느 한 단계를 수행한 후에 계면활성제로 표면을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물을 형성하는 방법.
  4. a) 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프를 에탄올중 2mM의 헥사에틸렌글리콜 알코올((EG)6OH) 용액으로 적시는 단계;
    b) 상기 스탬프를 금도금 된 기판과 20-30초 동안 접촉시키는 단계;
    c) 상기 금 기판의 스탬핑되지 않은 영역을 1시간 동안 바이오틴-이황화물 용액으로 인큐베이팅하여 바이오틴이 말단화된 자기조립단분자막(SAM)으로 채우는 단계;
    d) 상기 기판을 에탄올, 메탄올 및 밀리큐 워터로 세정하여 결합되지 않은 바이오틴-이황화물을 제거하는 단계;
    e) 상기 기판을 0.5시간 동안 0.1 mg/ml 아비딘 용액에서 인큐베이팅하는 단계;
    f) 상기 기판을 0.5시간 동안 0.2mg/ml 바이오틴-양고추냉이 페록시다아제(HRP) 용액에 적시는 단계 ;
    g) 기판 상에 아비딘/바이오틴-양고추냉이 페록시다아제 이중층 조립체(assembly)를 수득하는 단계; 및
    h) 추가의 이중층 조립체를 형성하기 위해 상기 단계 e) 및 f)를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물을 형성하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프는 2 ㎛ 갭으로 분리되는 2 ㎛ 스트립을 가지는 것을 특징으로 하는 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물을 형성하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 단계 e)단계 및 f)단계 후에 기판을 인산완충식염수(PBS)로 세정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 적층 (layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물을 형성하는 방법.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 적층(layer by layer)형태의 조립체(assembly)가 구비된 3차원 나노구조물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101318411B1 (ko) * 2011-06-20 2013-10-15 서강대학교산학협력단 단일 핵산 분자 분석용 고상 지지체
CN104030238B (zh) * 2014-06-12 2015-12-09 西安交通大学 微接触压印实现图形化ZnO纳米线阵列的制备方法
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010093189A (ko) * 1998-12-17 2001-10-27 로날드 디. 맥크레이 광학 회절에 기초한 생체감응장치용 항체 결합 단백질의패턴화 부착
KR20040039553A (ko) * 2002-11-02 2004-05-12 한국전자통신연구원 정렬된 나노 크기의 금속 구조체들을 사용하는 국소 표면플라즈몬 센서 및 그 제조 방법
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010093189A (ko) * 1998-12-17 2001-10-27 로날드 디. 맥크레이 광학 회절에 기초한 생체감응장치용 항체 결합 단백질의패턴화 부착
KR100460769B1 (ko) 2001-11-19 2004-12-08 홍석인 스크린프린트법을 이용한 바이오마이크로시스템용미세유체 흐름관 제작 방법
KR20040039553A (ko) * 2002-11-02 2004-05-12 한국전자통신연구원 정렬된 나노 크기의 금속 구조체들을 사용하는 국소 표면플라즈몬 센서 및 그 제조 방법
JP2005049101A (ja) 2003-07-29 2005-02-24 Omron Corp 生体分子の形状転写方法、チップ基板の製造方法及びバイオチップの製造方法

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