KR100820960B1 - Streptomyces cinnamonensis strain isolated from soil having antibacterial acivity - Google Patents

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Abstract

A Streptomyces cinnamonensis strain isolated from soil is provided to show high antibacterial capability on pathogenic microorganisms, specifically having strong antibacterial activity on Acinetobacter baumannii. A Streptomyces cinnamonensis strain having the antibacterial activity against at least one strain selected from the group consisting of Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium phlei, Sarcina lutea, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescence, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Mucor ramannianus, Rhizoctonia solani, Pyricularia oryzae, Aspergillus fumigatus, Glomerella cingulata, Colletotrichum gloeosporioides, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Chlorella regularis and Chlorella sp. A2dl is deposited as a deposition no. KCTC 11045BP. A composition having antibacterial activity comprises the Streptomyces cinnamonensis strain as an effective ingredient.

Description

토양으로부터 분리한 항균활성 스트렙토마이세스 시나모넨시스 균주{Streptomyces cinnamonensis strain isolated from soil having antibacterial acivity}Streptomyces cinnamonensis strain isolated from soil having antibacterial acivity

도 1은 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis)의 세포벽 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid, DAP) 이성체의 크로마토그래피 결과를 나타낸다(1: 스탠다드 DAP, 2 내지 5: 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스 균주).1 is the present invention Streptomyces cinamonensis ( Streptomyces) The chromatograph of the cell wall diaminopimelic acid (DAP) isomer of cinnamonensis is shown (1: standard DAP, 2-5: the streptomyces cinnamonensis strain of this invention).

도 2는 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주의 16S rDNA를 중합연쇄반응하여 증폭한 것이다(M; 사이즈 마커). Figure 2 is amplified by a polymerase chain reaction of 16S rDNA of Streptomyces cinnamonensis strain of the present invention (M; size marker).

도 3은 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the 16S rDNA nucleotide sequence of the present invention Streptomyces cinnamonensis strain.

도 4는 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통학적 분류를 나타낸 것이다.Figure 4 shows the phylogenetic classification using the 16S rDNA sequence of the present invention Streptomyces cinnamonensis strain.

도 5는 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주의 아시네토박터 바우마니 균주에 대한 항균활성을 나타낸 것이다.Figure 5 shows the antimicrobial activity against the Acinetobacter Baumani strain of the present invention Streptomyces cinnamonensis strain.

본 발명은 토양으로부터 분리한 항균활성 스트렙토마이세스 시나모넨시스 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토양으로부터 분리한, 아시네토박터 바우마니 균주에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주에 관한 것이다.The present invention relates to an antimicrobial Streptomyces cinamonensis strain isolated from soil, and more particularly Streptomyces (Sreptomyces) showing a strong antimicrobial activity against Acinetobacter Baumani strain isolated from soil cinnamonensis ) strains.

지금까지 많은 종류의 항생물질이 발견, 개발되어 질병치료에 널리 사용되고 있으나, 점차 내성이 생긴 병원성 미생물이 출현하게 되면서, 현 의학계에서는 심한 몸살을 앓고 있는 실정이다. 1929년 영국의 플레밍(Fleming)에 의해 페니실린(penicillin)이 발견되어 미생물 감염에 대한 치료에 많은 도움이 되었으나, 곧 내성이 생겨 새로운 항생물질인 메치실린(methicillin)이 발견되었고 병원성미생물 특히, 스태필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 치료에 큰 역할을 하였다. 그러나 이 항생물질의 과다한 사용으로 또다시 대부분의 항생물질에 대해서도 내성을 보이는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)가 출현하여 ‘슈퍼버그(superbug)'라고 부르기도 하였다. 그 이후에 글라이코펩타이드(glycopeptide)계 최초의 항생물질로서 모든 세균을 사멸한다는 의미의 반코마이신(vancomycin;van은 vanquish에서 유래), 테이코플라닌(teicoplanin) 계통의 항생제를 사용하였는데(Griffith, R. S. (1984) J. Antimicrob . Chemother. 14:1~5), 이들 항생제는 페니실린 및 메티실린계 항생제 내성균주에 대한 치료에 가장 효과 적으로 사용되어 왔다. Until now, many kinds of antibiotics have been discovered and developed and widely used in the treatment of diseases. However, as the pathogenic microorganisms become increasingly resistant, the current medical community suffers from severe soreness. Penicillin was discovered in 1929 by Fleming, England, and was very helpful in treating microbial infections, but soon became resistant and a new antibiotic, meccillin, was discovered. It played a major role in the treatment of Cocos aureus . However, the overuse of these antibiotics has also led to the emergence of MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus ), which is also resistant to most antibiotics, sometimes referred to as 'superbugs'. Since then, the first antibiotic in the glycopeptide family, vancomycin (vancomycin; vanquish derived) and teicoplanin antibiotics (Griffith, RS) were used to kill all bacteria. (1984) J. Antimicrob . Chemother . 14: 1-5), these antibiotics have been used most effectively in the treatment of penicillin and methicillin antibiotic resistant strains.

최근 병원 감염의 원인균으로 증가하고 있는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 중환자실 감염의 2 내지 10%를 차지한다. 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 대부분의 환경에서 생존하고 항생제 내성도 쉽게 획득하여 병원에서 지속적으로 전파할 수 있다. 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균종은 포도당 비발효 그람음성 간균으로, 최근 증가하고 있는 병원감염의 주요한 원인균 중 하나로 균혈증, 뇌막염, 요로감염, 창상감염 등을 일으키고, 병원감염 폐렴의 중요한 원인균이다. 병원 환경에서 상당기간 생존가능하며 사람이나 기구에 의한 전파로 병원 내 유행을 유발하기도 한다(Dy 등. 1999; Husni 등. 1999). Acinetobacter baumannii , which has recently been increasing as a causative agent of hospital infections, accounts for 2 to 10% of ICU infections. Acinetobacter baumannii survives in most environments and easily acquires antibiotic resistance so that it can be transmitted continuously in the hospital. Acinetobacter baumannii ) The bacterium is a non-fermented Gram-negative bacillus, which is one of the main causes of the recent increase in pathogens, causing bacteremia, meningitis, urinary tract infections, and wound infections. It can survive for a long time in a hospital setting, and it can also cause epidemics in hospitals by radio waves by humans or devices (Dy et al. 1999; Husni et al. 1999).

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 의한 감염은 인공호흡기 등의 인공물의 사용, 중추신경계 수술, 급성 호흡, 두부 손상 등과 연관되어 있다(Levin. 2002). 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)가 크게 문제되는 점은 항생제에 반응하지 않는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 상처가 감염된 이라크에 파견된 미군들에 의해 항생제의 내성문제가 심각하게 대두되고 있으며 폐렴을 유발할수 있고 그로인한 사망률이 20% 이상 된다.Infections with Acinetobacter baumannii have been associated with the use of artifacts such as respirators, central nervous system surgery, acute breathing, and head injury (Levin. 2002). Ahsine Sat bakteo Bauer Mani (Acinetobacter baumannii) the point to be larger ahsine problem is not responding to antibiotics Sat bakteo Bauer Mani (Acinetobacter US troops sent to Iraq infected with baumannii wounds have raised the issue of resistance to antibiotics and can cause pneumonia, resulting in a mortality rate of more than 20%.

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 β-락탐(β-lactam) 항균제를 비롯한 대부분의 약제에 높은 내성을 보이고 있다. 아직까지 이미페넴(imipenem)이 가장 효과적인 치료제로 사용되고 있었다. 이미페넴 내성 균주에 의한 감염은 사실상 기존에 쓰이던 항균제로는 치료가 어려우며 최근 콜리스 틴(colistin) 같은 기존에 쓰이지 않던 치료제를 사용하거나 두 가지 이상의 항균제를 병합하는 것이 시도되고 있다. 병합요법은 항균범위를 넓히고, 독성과 내성균의 발생을 감소시키며 항균효과의 상승효과를 목적으로 이용한다(Song 등. 2003). Acinetobacter baumannii is highly resistant to most drugs, including β-lactam antibacterial agents. To date, imipenem has been used as the most effective treatment. Infections with imipenem-resistant strains are difficult to treat with conventional antimicrobial agents, and recently, an unused therapeutic agent such as colistin or a combination of two or more antimicrobial agents have been attempted. Combination therapy is used for the purpose of broadening the antimicrobial range, reducing the incidence of toxic and resistant bacteria and synergistic effects of the antimicrobial effect (Song et al. 2003).

현재 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 감염되면 효과적으로 치료할 수 있는 적절한 항생제가 아직까지는 없는 점에서 특별한 대안이 없고, 또한 새로운 내성균주들의 출현이 계속되고 있는 추세에 항내성균성 항생물질의 개발 현황은 현재까지 내성발현에 초점을 맞춰 끊임없는 물질 분리 연구가 진행 중이나 아직까지 주목할 만한 성과는 거의 없는 형편이다. 앞으로 내성병원균주에 대한 강력한 살균효과를 나타내는 새로운 항생제의 개발이 시급한 것으로 판단된다. The current status of the development of anti-bacterial antibiotics is that there is no special alternative since there is no appropriate antibiotic to treat effectively when infected with Acinetobacter baumannii . To date, there are ongoing researches on material separation, focusing on the development of resistance, but there are few results that are yet to be noted. In the future, it is urgent to develop new antibiotics that exhibit strong bactericidal effects against resistant pathogens.

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 대한 항균물질에 관한 종래기술로는 대한민국 특허출원 제10-2002-0028116호, 제10-2005-7000524호 및 제10-2005-7011194호에 공지된 바 있으나 강력한 항균효과를 나타내는 미생물에 관한 기술은 미비한 실정이다.To Acinetobacter baumannii As a conventional technology regarding the antimicrobial agent for Korea, but known in the Republic of Korea Patent Application No. 10-2002-0028116, 10-2005-7000524 and 10-2005-7011194 It is inadequate.

또한 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) 균주를 이용한 병원성 미생물의 항균효과에 관한 연구로는 대한민국 특허등록 제10-461579호, 제10-411185호, 특허출원 제10-2003-62099호 등에 공지된 바와 같이 식물병원성 미생물에 대해 항균활성만이 기술되어 있다.In addition, studies on the antimicrobial effect of pathogenic microorganisms using Streptomyces sp. Strains are known in the Republic of Korea Patent Registration No. 10-461579, 10-411185, Patent Application No. 10-2003-62099 As described, only antimicrobial activity against phytopathogenic microorganisms is described.

따라서, 본 발명의 목적은 토양으로부터 분리한, 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)와 병원성균에 대해 강력한 항균활성 나타내는 스트렙토마이세스 시나모넨시스 균주를 제공함에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a strain of Streptomyces cinamonensis isolated from soil, showing strong antibacterial activity against Acinetobacter baumannii and pathogenic bacteria.

본 발명의 상기 목적은 토양으로부터 방선균주를 순수분리한 후 분리한 방선균주들 중 항생물질을 생산하는 균주를 선발하여 동정한 다음 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주 및 기타 병원성 미생물에 대한 항균활성을 측정함으로써 달성하였다.The object of the present invention is to identify and identify antibiotic-producing strains of the actinomycetes isolated after pure separation of actinomycetes from the soil and then identified as Acinetobacter Baumani ( Acinetobacter baumannii ) This was achieved by measuring antimicrobial activity against strains and other pathogenic microorganisms.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described.

본 발명은 토양으로부터 토양방선균을 분리선별 후 동정하는 단계; 동정된 균주를 배양하는 단계; 아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii)에 대해 항균활성을 측정하는 단계; 및 기타 병원성 미생물에 대한 항균활성을 측정하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of identifying and separating the soil actinomycetes from the soil; Culturing the identified strains; Acinetobacter baumannii strains (Acinetobacter baumannii ) measuring the antimicrobial activity against; And measuring the antimicrobial activity against other pathogenic microorganisms.

본 발명자들은 토양으로부터 분리한 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주를 스트렙토마이세스 속 KH29라 명명하고 2006년 12월 14일 기탁번호를 KCTC 11045BP로 하여 기탁하였다.The inventors of the present invention Streptomyces ( Streptomyces ) isolated from the soil cinnamonensis ) strain was named KH29 in Streptomyces genus and deposited on December 14, 2006 with the accession number KCTC 11045BP.

본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 대한 항균활성을 측정을 위하여 고려대학교 의대 구로병원 감염내과에서 분리한 49종의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주를 분양받아 사용하였다. Streptomyces of the present invention ( Streptomyces) cinnamonensis strain Acinetobacter baumannii ) Acinetobacter baumannii , 49 species isolated from Korea University Medical Center Guro Hospital Strains were distributed and used.

본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주가 생산하는 항생물질은 대부분의 병원균에 강한 활성을 보이며 특히 아시네토박 터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주에 대해서 강력한 항균활성을 나타냄을 특징으로 한다.Streptomyces of the present invention ( Streptomyces) The antibiotics produced by cinnamonensis strains have strong activity against most pathogens, especially Acinetobacter. baumannii ) is characterized by strong antimicrobial activity against the strain.

본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주는 아시네토박터 바우마니 균주를 포함하여 그람양성, 그랑음성, 효모, 곰팡이 미생물 및 조류(algae)에 대해 항균활성을 나타내는데 그 구체적인 균주들로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스태필로코코스 아우레우스(staphylococcus aureus), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 살시나 루테아(Sarcina lutea), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉐도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디아 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 무코르 라만니아너스(Mucor ramannianus), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 파이리쿠라리아 오리제(Pyricularia oryzae), 아스페르질러스 퍼미가터스(Aspergillus fumigatus), 글로머렐라 신구라타(Glomerella cingulata), 콜레토트리첨 글로에오스포로이데스(Colletotrichum gloeosporoides), 트리초피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes), 트리초피톤 루브룸(Trichophyton rubrum), 크롤렐라 레큘라리스(Chlorella regularis) 등이다.Streptomyces of the present invention ( Streptomyces) cinnamonensis ) strains, including Acinetobacter Baumani strains, exhibit antimicrobial activity against gram-positive, granular, yeast, fungal microorganisms and algae. Specific strains include Bacillus subtilis and Staphylococcus Aureus ( staphylococcus aureus ), Mycobacterium phlei , Sarcina lutea , Escherichia coli coli ), Pseudomonas fluorescence , Candida albicans albicans), Cryptococcus nose Syracuse's only neo-PORT (Cryptococcus neoformans ), Mucor ramannianus ), Rhizoctonia solani ), Pyricularia oryzae ), Aspergillus fumigatus ), Glomerella cingulata ), Colletotrichum gloeosporoides , Trichophyton Mentagrophytes mentagrophytes ), Trichophyton rubrum ), Chlorella regularis ).

본 발명은 또한 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주(기탁번호: KCTC 11045BP)를 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial active composition containing Streptomyces cinnamonensis strain (Accession Number: KCTC 11045BP) as an active ingredient.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.

실시예Example 1: 토양으로부터 균주 분리 1: Strain Separation from Soil

전국 각지의 미경작지 토양의 지표면으로부터 약 10 ㎝ 깊이에서 토양 1 g을 채취하여 통풍이 잘되는 그늘에서 2 내지 3주 동안 풍건시켜 잘게 분쇄한 다음 일부는 조회분 분석용 도가니(crucible)에 담아 100℃의 건조오븐(drying oven)에서 1시간 건열처리하고 나머지는 그대로 토양미생물 분리원으로 사용하였다.Take 1 g of soil at a depth of about 10 cm from the surface of uncultivated soils around the country, dry it for 2 to 3 weeks in a well-ventilated shade, crush it finely, and then put some in a crucible for ash analysis. 1 hour dry heat treatment in a drying oven was used as a source for soil microbial separation.

가열 처리한 토양 시료와 가열 처리하지 않은 토양 시료 각각 1 g씩을 멸균증류수 1 mL에 넣어 약 1분 동안 교반한 후 상등액을 10배 희석법에 의해 멸균증류수로 희석하여 그 희석액 1 mL을 각각 멸균 페트리-디쉬(petri-dish)에 취하고 방선균 분리배지인 에스고체배지(S agar)와 항생물질, 비타민 및 미량원소를 함유하는 에이부이고체배지(AV agar)를 20 mL씩을 각각 분주하여 평판을 제조한 다음 27℃ 배양기(incubator)에서 약 7 내지 14일간 배양하였다. 1 g of each heated and unheated soil sample was added to 1 mL of sterile distilled water and stirred for about 1 minute. The supernatant was diluted with sterile distilled water by a 10-fold dilution method and each 1 mL of the diluted solution was sterilized. A plate was prepared by dispensing 20 ml each of S. agar, an actinomycetes isolated medium, and AV agar, which contains antibiotics, vitamins, and trace elements, in a petri-dish. Incubated for about 7 to 14 days in a 27 ℃ incubator.

평판배지에 나타난 방선균 콜로니(colony)를 동일한 분리배지 평판에 도말하여 균주를 순수분리하였으며, 순수분리된 균주는 효모 추출물-몰트 추출물 고체사면배지(yeast extract-malt extract agar)에 이식하여 27℃에서 약 7일간 배양하여 기균사와 포자가 충분히 발달되도록 배양하여 실온에 보존하여 사용하였다.Actinomycetes colonies (colony) appearing on the flat plate was plated on the same separation medium plate to isolate the strain. The pure strain was transplanted into yeast extract-malt extract agar and then at 27 ° C. After culturing for about 7 days, cultured to sufficiently develop the mycelia and spores were stored at room temperature and used.

실시예Example 2: 분리된 균주의 동정 2: Identification of Isolated Strains

상기 실시예 1에서 순수분리된 균주의 콜로니 형태, 영양균사와 기균사의 형태 및 포자형성 여부, 포자표면의 형태 등의 형태적 특성, 세포벽의 DAP 이성체 조성과 16S rDNA 분석법을 이용하여 동정하였다. 또 항생물질의 생산배양 조건 검토를 위한 접종원 피씨Ⅱ(PCⅡ)배지를 전배양배지로 하여 접종원으로 사용하였다. In Example 1, the colony morphology of the purely isolated strains, the morphology and the form of spores of the trophic mycelia and the mycelia were determined, the morphological characteristics such as the shape of the spore surface, DAP isomer composition of the cell wall and 16S rDNA analysis. In addition, the inoculator PC II (PCII) medium for the examination of the production culture conditions of antibiotics was used as the preculture medium.

탄소원에 의한 영향은 탄소원을 배제한 피와이배지(PY)에 여러 종류의 탄소원을 각각 2.5%되게 첨가하여 배지를 조제하고, 각 배지에 전배양액을 2%되게 접종하여 27℃ 에서 4일간 배양하여 항생물질 생산에 미치는 각 탄소원의 영향을 검토하였다. The effect of the carbon source is to prepare a medium by adding 2.5% of various carbon sources to the PY medium (excluding the carbon source), inoculate 2% of the preculture solution in each medium, and incubate at 27 ° C for 4 days. The impact of each carbon source on the production of the material was examined.

질소원에 의한 영향은 질소원을 제외한 PY 배지에 여러 종류의 질소원을 각각 1.1% 되게 첨가하여 배지를 조제하고, 각 배지에 전 배양액을 2% 접종하여 27℃ 에서 4일간 배양하여 항생물질 생산에 미치는 각 질소원의 영향을 검토하였다. The effect of nitrogen source is to prepare the medium by adding 1.1% of various nitrogen sources to PY medium excluding nitrogen source, and inoculate 2% of whole culture solution in each medium and incubate at 27 ℃ for 4 days to affect the production of antibiotics. The influence of nitrogen sources was examined.

실험결과 하기 표 1과 같이 본 발명 분리 균주는 세포벽의 DAP 이성체가 LL-DAP이고, 아미노산을 방선균 월 캐모타입(wall chemotype)과 펩티도글리칸 타입(peptidoglycan type)과 비교하여 볼 때 세포벽의 펩타이드는 글라이신(glycine)으로 연결되어 있는 펩티도글리칸 타입 A3γ이며, 월 캐모타입 I에 해당되는 것으로 확인되었다.Experimental results As shown in Table 1, the isolated strain of the present invention, the DAP isomer of the cell wall is LL-DAP, and the amino acid is compared to the wall chemotype and the peptidoglycan type when compared to the peptide of the cell wall. Is a peptidoglycan type A3γ linked by glycine and has been confirmed to correspond to wall camotype I.

형태적 특성과 배양특성을 비교 분석을 통하여 본 발명 균주는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 것으로 분류되었으며, 로찌(Locci, 1989)의 스트렙토마이세스(Streptomycetes) 속에 속하는 속들의 분류와 본 발명 균주의 콜로니 형태의 형태학적 특성, 배양특성, 세포벽의 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid, DAP) 이성체 및 아미노산 등 화학적 특성을 고려하여 볼 때 본 발명 균주는 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 분류되었다. 도 1에 본 발명 스트렙토마이스세스 속 KH29 균주의 세포벽 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid, DAP) 이성체의 크로마토그래피 결과를 나타내었다. 여기에서 1은 스탠다드 DAP이고, 2 내지 5는 본 발명 균주를 표시한 것이다.Morphological characteristics and the present invention through a comparative analysis of the culture characteristics strain was classified as belonging to the genus Streptomyces (Streptomyces), rojji of (Locci, 1989) Streptomyces classification of in the present invention, strains belonging to the genus (Streptomycetes) of The strains of the present invention were classified as Streptomyces in consideration of the morphological characteristics of the colony form, culture characteristics, chemical properties such as diaminopimelic acid (DAP) isomers and amino acids of the cell wall. Figure 1 shows the chromatographic results of the cell wall diaminopimelic acid (DAP) isomer of the present invention Streptomyces sp. KH29 strain. Wherein 1 is standard DAP and 2 to 5 represent strains of the present invention.

본 발명 균주의 동정은 분자계통학적 분류 및 동정의 목적을 위해서 현재 가장 많이 이용되고 있는 16S rRNA 동정법으로 동정하였다.Identification of the strain of the present invention was identified by the 16S rRNA identification method that is currently used most for the purpose of molecular classification and identification.

하기 표 1 및 도 1의 결과에서 본 발명 균주는 스트렙토마이세스 시나모네시스(Streptomyces cinamonesis)와 98%의 유사성을 나타내었고 16S rRNA염기서열을 비교할 때 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinamonensis)와 가장 가까운 근연군에 속한다고 판단하였다.In the results of Table 1 and FIG. 1, the strain of the present invention showed 98% similarity to Streptomyces cinamonesis , and compared with Streptomyces cinamonensis when comparing 16S rRNA sequences. It was judged that it belongs to the near muscular group.

그리고 본 발명 균주의 16S rDNA를 중합연쇄반응으로 증폭한 결과 도 2 및 도 3과 같은 DNA 산물과 염기서열을 얻었으며 Blast search program (NCBI)을 이용하여 가장 유사도가 높은 균주들을 검색한 결과 도 4에 나타낸 것과 같이 본 발명 균주는 스트렙토마이세스 시나모네시스(Streptomyces cinamonensis) AY999746과 98% 유사성을 보였다. As a result of amplifying the 16S rDNA of the strain of the present invention by a polymerase chain reaction, DNA products and sequences were obtained as shown in FIGS. 2 and 3, and the strains having the highest similarity were searched using a Blast search program (NCBI). As shown in the present invention strain Streptomyces ( Sreptomyces) cinamonensis ) showed 98% similarity to AY999746.

본 발명 균주는 형태학적 특징, 16S rRNA 동정법을 통하여 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces sp .)로 판명하였으며 본 발명자들은 스트렙토마이세스 속 KH29로 명명하고 상기 본 발명 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주를 2006년 12월 14일 기탁번호를 KCTC 11045BP로 하여 기탁하였다.The strain of the present invention is a morphological characteristic, Streptomyces strain through the 16S rRNA identification method sp . The present inventors named Streptomyces cinnamonensis strain of the present invention Streptomyces cinnamonensis (December 14, 2006), the deposit number of KCTC 11045BP was deposited.

스트렙토마이세스, 스트렙토베티실리움, 키네오스포리아, 스포리크타야 및 KH29균주의 특성 비교Comparison of the Characteristics of Streptomyces, Streptobetacillium, Kineosporia, Sforectaya, and KH29 Strains 특　 징Characteristic 스트렙토마이세스Streptomyces 스트립토 베리실리움Stripto Berrysilium 키네오스포리아Kineosporia 스포리치티아Sporicitia KH29KH29 콜로니 크기Colony size 별개의 (discrete) +Discrete (discrete) + 별개의 (discrete) -Discrete (discrete)- 소(small) +Small + 초소형 (microscopic) -Microscopic- 별개의 (discrete) +Discrete (discrete) + 생화학적 기질Biochemical substrate 　 　 　 　 　 포자Spores ++ -- -- -- ++ 스포랜지아Sporangia -- -- ++ -- -- 운동성motility -- -- ++ -- -- 호기성 균사체Aerobic Mycelium 　 　 　 　 　 분절포자의 연쇄상(chains of arthrospores)Chains of arthrospores ++ ++ -- ++ ++ 윤생체 내의 분절포자(arthrospores in verticils)Arthrospores in verticils -- ++ -- -- -- 포자 표면 매끄러움(Spore sur·face smooth)Spore sur face smooth ++ ++ -- ++ ++ 포자 표면 털, 가시 또는 혹 여부(Spore surface　hairy, Spiny, or　warty)Spore surface hair, spiny, or warty ++ -- -- -- ++ 운동성 포자 (motile spore)Motile spore -- -- -- -- -- 월 캐모타입 (Wall　chemotypes)Wall chemotypes II II II II II [주] 월 캐모타입(wall chemotype): I, LL-DAP　 및 글라이신Wall chemotype: I, LL-DAP® and glycine

실시예Example 3:  3: 아시네토박터Acinetobacter 바우마니(Baumani Acinetobacter baumanniiAcinetobacter baumannii )에)on 대한 항균활성 측정 Antimicrobial Activity Measurement

본 발명 스트렙토마이세스 속 KH 29균주를 시험관에(20 Ø × 175 mm) 유리구슬 4~5개를 넣어 만든 PC Ⅱ 배지(glucose 5.0g/L, polypeptone 3.0g/L, yeast extract 2.0g/L, meat extract 5/0g/L, asparagine 0.5g/L, thiamine·HCl 0.1g) 10 mL에 1 백금이를 접종하여 27℃ 시험관 진탕배양기(Model SA-31, Yamato, Co., Japan)에서 280 strokes/min로 48시간 동안 전배양을 실시하였다. 이어서, 항생물질 생산배지인 PY 배지(glucose 5.0g/L, polypeptone 3.0g/L, yeast extract 2.0g/L, meat extract 5/0g/L, soluble starch 10.0g/L, glucerol 10.0g/L, casein 1.0g/L, CaCO3 2.0g/L, Thiamine·HCL 0.01g/L) 100 mL을 500 mL용 에렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣어 멸균한 다음 상기 전배양액을 2%(v/v)되게 접종하여 27℃에서 회전 진탕배양기(Model: TGR 1-D, IWASHIA, Japan)를 이용하여 250 rpm으로 96시간 동안 본배양을 실시하였다.PC Ⅱ medium (glucose 5.0 g / L, polypeptone 3.0 g / L, yeast extract 2.0 g / L) was prepared by inserting 4-5 strains of KH 29 strain of Streptomyces genus of the present invention into a test tube (20 Ø × 175 mm). 1 ml of platinum was inoculated into 10 mL of meat extract 5 / 0g / L, asparagine 0.5g / L, and 0.1g of thiamine and HCl, and 280 in a 27 ° C in vitro shaker (Model SA-31, Yamato, Co., Japan). Preculture was performed for 48 hours at strokes / min. Subsequently, antibiotic production medium PY medium (glucose 5.0g / L, polypeptone 3.0g / L, yeast extract 2.0g / L, meat extract 5 / 0g / L, soluble starch 10.0g / L, glucerol 10.0g / L, 100 ml of casein 1.0 g / L, CaCO 3 2.0 g / L, Thiamine HCL 0.01 g / L) was added to a 500 mL Erlenmeyer flask to sterilize, and the preculture was 2% (v / v). Inoculation was carried out for 96 hours at 250 rpm using a rotary shaker (Model: TGR 1-D, IWASHIA, Japan) at 27 ℃.

그 다음 상기에서 얻은 배양액을 원심분리(2,000 × g, 20 min.)하여 상등액을 얻고, 균체는 순수 아세톤으로 균체내 항생물질을 추출한 후 감압 건조하여 항균활성 및 항종양 활성을 측정하기 위한 시료로 사용하였다.Then, the culture broth obtained above was centrifuged (2,000 × g, 20 min.) To obtain a supernatant, and the cells were extracted with antibiotics in the cell with pure acetone, and dried under reduced pressure. Used.

본 발명 스트렙토마이세스 속 KH29 균주의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 대한 항균활성을 측정을 위하여 고려대학교 의대 구로병원 감염내과에서 분양받은 49종의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주에 대한 항균활성을 측정하였다.49 kinds of Acinetobacter baumannii , which was distributed in the Department of Internal Medicine, Guro Hospital of the University of Medicine, to measure the antimicrobial activity of Acinetobacter baumannii of the KH29 strain of Streptomyces sp. Antimicrobial activity against the strain was measured.

항균활성을 측정하기 위해 검정평판배지을 사용하였다. 상기 검정평판배지는 브레인 헐트 인퓨젼 배지(Brain Heart Infusion)이며, 전배양은 시험관에 브레인 허트 인퓨젼 브로스(Brain Heart Infusion broth) 5 mL을 넣어 멸균한 배지에 검정균 단일 콜로니(colony)를 접종하여 37℃에서 18 내지 24시간 배양하였다.Assay plate medium was used to measure the antimicrobial activity. The assay plate was Brain Heart Infusion medium, and the preculture was inoculated with a single colony of colony in a sterilized medium by adding 5 mL of Brain Heart Infusion broth to a test tube. Incubated for 18 to 24 hours at 37 ℃.

실험결과, 본 발명 스트렙토마이세스 속 KH29 균주의 49종의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항균활성결과 표 2에 나타낸 바와 같이 생육저지환 15 mm이상의 활성(+++)을 보이는 균주는 6%, 생육저지환 10 내지 15mm사이의 활성(++)을 보이는 균주는 45%, 생육저지환 5 내지 10mm사이의 활성(+)을 보이는 균주는 33%가 활성을 보였다. 도 5에 나타낸 것과 같이 본 발명 스트렙토마이세스 속 KH29 균주는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주에 강한 항균활성을 나타냈으며 49종의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주 중 41종에 대해 항균활성을 나타냈다.As a result, 49 strains of Acinetobacter baumannii of Streptomyces genus KH29 strain of the present invention showed the antimicrobial activity as shown in Table 2, the strain showing an activity (+ + +) of 15 mm or more growth inhibition ring 6%, the strain showing the activity (++) between 10-15mm growth-lowering ring, the strain showing the activity (+) between 5-10mm growth-lowering ring showed 33% activity. As shown in Figure 5 Streptomyces genus KH29 strain of the present invention Acinetobacter Baumani ( Acinetobacter baumannii ) It showed strong antimicrobial activity against the strain and 49 kinds of Acinetobacter baumannii ) It showed antimicrobial activity against 41 of the strains.

본 발명 스트렙토마이세스 속 KH29 균주의 49 종의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 대한 항균활성Antimicrobial Activity against 49 Acinetobacter baumannii Species of Streptomyces sp. KH29 Strain 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii)*** Acinetobacter baumannii (A. baumannii) *** 항균활성Antimicrobial activity 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii)*** Acinetobacter baumannii (A. baumannii) *** 항균활성Antimicrobial activity 1One ++++ 2626 -- 22 ++++ 2727 -- 33 ++++ 2828 -- 44 -- 2929 ++++ 55 -- 3030 ++ 66 ++ 3131 ++++ 77 ++++++ 3232 ++ 88 ++++ 3333 ++++ 99 ++++++ 3434 ++++ 1010 ++ 3535 ++++ 1111 ++++ 3636 ++++ 1212 ++++ 3737 ++++ 1313 ++++ 3838 ++ 1414 ++ 3939 ++++ 1515 ++++ 4040 ++ 1616 ++ 4141 ++++ 1717 ++++++ 4242 ++++ 1818 ++++ 4343 ++++ 1919 ++ 4444 ++++ 2020 ++ 4545 ++ 2121 ++ 4646 ++++ 2222 ++ 4747 ++ 2323 -- 4848 ++ 2424 -- 4949 -- 2525 ++++ 　 　 [주] ***: The Korean journal of preventive medicine, 131-140 Vol.34. No.2(2001) 항균활성 - : 0mm,　 + : 10~12mm,　 ++ : 13~15mm,　 +++ : 15mm이상[Note] ***: The Korean journal of preventive medicine, 131-140 Vol. 34. No.2 (2001) Antibacterial activity-: 0mm, +: 10 ~ 12mm, ++: 13 ~ 15mm, +++: 15mm or more

실시예 4 : 본 발명 스트렙토마이세스 속 KH 29 균주의 기타 병원성 미생물에 대한 항균활성측정Example 4: Determination of antimicrobial activity against other pathogenic microorganisms of the strain KH 29 of Streptomyces sp.

본 발명 스트렙토마이세스 속 KH29 균주의 그람양성균, 그람음성균, 효모 및 곰팡이 등 기타 병원성 미생물에 대한 항균활성을 측정하였다. 측정 방법은 상기 실시예 3과 같은 방법으로 실시하였다.The antimicrobial activity of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, yeast and fungi such as fungi of the strain KH29 of the genus Streptomyces was measured. The measurement method was carried out in the same manner as in Example 3.

실험결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 총 18종의 병원성 미생물 모두에서 항균활성을 나타내었으며 그 중에서도 E. coli를 포함한 10종의 병원성 미생물에서 아주 강력한 항균활성을 나타내었다.As a result of the experiment, as shown in Table 3, all 18 pathogenic microorganisms showed antimicrobial activity, and among them, 10 microorganisms including E. coli showed very strong antimicrobial activity.

본 발명 스트립토마이세스 KH29 균주의 병원성 미생물에 대한 항균활성Antimicrobial Activity against Pathogenic Microorganisms of the Stripomyces KH29 Strain of the Invention 병원성균Pathogenic bacteria 항균활성Antimicrobial activity <그람양성균(Gram positive bacteria)>Gram positive bacteria 　 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IAM 1069(NIHJ PCI 219P) Bacillus subtilis IAM 1069 (NIHJ PCI 219P) ++++++ 스태필로코코스 아우레우스(staphylococcus aureus) IAM 1011Stafford Philo Cocos aureus (staphylococcus aureus) IAM 1011 ++++ 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei) DIPH IFO 3518 Mycobacterium phlei DIPH IFO 3518 ++++++ 살시나 루테아(Sarcina lutea) Sarcina lutea ) ++++++ <그람음성균(Gram negative bacteria)>Gram negative bacteria 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) Escherichia coli coli ) ++++++ 쉐도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)IAM 1201 Pseudomonas fluorescence IAM 1201 ++++++ <효모(Yeast)><Yeast> 칸디아 알비칸스(Candida albicans) IAM 4905 Candida albicans albicans ) IAM 4905 ++++++ 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) ATCC 13690Cryptococcus neoformus neoformans ) ATCC 13690 ++++++ <곰팡이(Fungi)>Fungi 무코르 라만니아너스(Mucor ramannianus) IAM 6218 Mucor Lamanianus ramannianus ) IAM 6218 ++++ 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) IFO 6218 Rhizoctonia solani ) IFO 6218 ++++ 파이리쿠라리아 오리제(Pyricularia oryzae) IFO5994 Pyricularia oryzae ) IFO5994 ++++++ 아스페르질러스 퍼미가터스(Aspergillus fumigatus) ATCC 42202 Aspergillus pergatus fumigatus ) ATCC 42202 ++ 글로머렐라 신구라타(Glomerella cingulata) IFO 9767 Glomerella Shingurata cingulata ) IFO 9767 ++++++ 콜레토트리첨 글로에오스포로이데스(Colletotrichum gloeosporoides) Colletotrichum gloeosporoides ) ++++ 트리초피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes) ATCC 18749 Trichophyton mentagrophytes ) ATCC 18749 ++++ 트리초피톤 루브룸(Trichophyton rubrum) ATCC 44766 Trichophyton rubrum ) ATCC 44766 ++ <조류(Algae)><Algae> 크롤렐라 레큘라리스(Chlorella regularis) Clorella regularis ) ++++ 크롤레라속 A2dl(Chlorella sp . A2dl) Clerella A 2 dl ( Chlorella sp . A 2 dl) ++++++

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 토양으로부터 분리한 방선균주 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis)는 기존 항생물질에 대해 내성을 나타내는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 균주에 대해 강한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라 기타 병원성균에 대해서도 뛰어난 항균활성 효과가 있으므로 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the actinomycetes strain Streptomyces cinnamonensis isolated from the soil of the present invention as described through the above embodiment ( Streptomyces) cinnamonensis) is Acinetobacter showing resistant to existing antibiotics Bauer Mani (Acinetobacter baumannii ) It is a very useful invention for the biopharmaceutical industry because it shows a strong antimicrobial activity against the strain, as well as excellent antimicrobial activity against other pathogenic bacteria.

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Claims (2)

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스태필로코코스 아우레우스(staphylococcus aureus), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 살시나 루테아(Sarcina lutea), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉐도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디아 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 무코르 라만니아너스(Mucor ramannianus), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 파이리쿠라리아 오리제(Pyricularia oryzae), 아스페르질러스 퍼미가터스(Aspergillus fumigatus), 글로머렐라 신구라타(Glomerella cingulata), 콜레토트리첨 글로에오스포로이데스(Colletotrichum gloeosporoides), 트리초피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes), 트리초피톤 루브룸(Trichophyton rubrum), 크롤렐라 레큘라리스(Chlorella regularis) 및 크롤레라속 A2dl(Chlorella sp . A2dl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주(기탁번호: KCTC 11045BP). Acinetobacter baumannii), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Stafford Philo Cocos aureus (staphylococcus aureus), Mycobacterium play (Mycobacterium phlei), live Sina Lu Te (Sarcina lutea ), Escherichia coli coli ), Pseudomonas fluorescence , Candida albicans albicans), Cryptococcus nose Syracuse's only neo-PORT (Cryptococcus neoformans ), Mucor ramannianus ), Rhizoctonia solani ), Pyricularia oryzae ), Aspergillus fumigatus , Glomerella cingulata , Colletotrichum gloeosporoides , Trichophyton mentagrophytes , Trichophyton rubrum ), Chlorella regularis ) and genus Cralera A 2 dl ( Chlorella sp . A 2 dl) Streptomyces (Sreptomyces) having antimicrobial activity against any one or more strains selected from the group consisting of cinnamonensis ) strain (Accession Number: KCTC 11045BP). 제 1항 기재의 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주(기탁번호: KCTC 11045BP)를 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물.The Streptomyces Sinai monen of 1 base system (Streptomyces cinnamonensis ) antimicrobial composition containing strain (Accession Number: KCTC 11045BP) as an active ingredient.
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