KR100813266B1 - 마이크로어레이-커버 슬립 조립체로부터 기포를 제거하는방법 및 이를 위한 마이크로어레이 키트 - Google Patents

마이크로어레이-커버 슬립 조립체로부터 기포를 제거하는방법 및 이를 위한 마이크로어레이 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 자성 입자 용액을 주입하는 단계; 및 상기 커버 슬립과 상기 마이크어레이로 구성된 조립체에 자성을 가하여 상기 자성 입자들을 이동시켜 상기 마이크로어레이의 혼성화 영역으로부터 혼성화 용액 중의 기포를 제거하는 단계;를 포함하는, 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법 및 이를 위한 마이크로어레이 키트에 관한 것이다.
Figure R1020060090466
마이크로어레이, 커버 슬립, 혼성화, 자성 입자, 기포.

Description

마이크로어레이-커버 슬립 조립체로부터 기포를 제거하는 방법 및 이를 위한 마이크로어레이 키트{Method for removing air bubbles from hybridization solution of a microarray-cover slip assembly and a microarray kit for the same}
도 1은 마이크로어레이 상에 혼성화 용액을 적용하고 커버 슬립을 덮어 형성된 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액에 기포가 포함된 상태 및 이에 따른 마이크로어레이 프로브 스팟(probe spot)의 이용 상태를 나타낸다.
도 2는 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액에 자성 입자를 주입하여 처리한 경우의 스팟의 형태 및 신호 강도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, 혼성화 영역에 기포가 포함된 경우에 자석을 통해 자성을 가하는 단계를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서, 기포가 마이크로어레이의 혼성화 영역으로부터 제거되는 단계들을 나타낸다.
본 발명은 커버 슬립을 이용하는 마이크로어레이의 혼성화 영역에 포집된 기 포를 제거하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 자성 입자 및 자석을 이용하여 커버 슬립을 사용하는 마이크로어레이의 혼성화 시에 프로브 스팟 영역에 포집된 기포를 제거하는 방법에 관한 것이다.
마이크로어레이(microarray)는 표면개질 유리, 실리콘, 또는 나일론 등의 재질로 된 작은 고형의 기판 표면에 그 서열이 알려진 DNA, DNA 단편, cDNA, 올리고뉴클레오티드, RNA, 또는 RNA 단편 등을 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개까지 일정한 간격으로 배열하여 부착시킴으로써, 유전자의 발현방식, 분포 양상 및 돌연변이 등을 분석할 수 있는 생물학적 마이크로 칩이다.
마이크로어레이의 표면에 시료에 포함된 특정 유전 정보 물질을 탐색할 수 있게 하는 프로브(probe) 역할을 할 수 있는 생물 분자들을 고정시키고 분석대상인 시료와 반응시키면, 시료에 함유되어 있는 생물 분자와 마이크로어레이의 표면에 고정된 프로브가 서열의 상보성 또는 친화성의 정도의 따라 상이한 정도로 결합되어 혼성화 상태를 이루게 된다. 이 혼성화 상태를 검출하고 해석하여, 시료에 함유된 핵산 등의 전체 생물 분자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이와 같이, 마이크로어레이는 단시간 내에 방대한 양의 정보 획득이 가능하기 때문에, 과학기술 연구, 신약 개발, 임상 진단, 농업, 식품, 환경 분야 등에서 혁신적 변화를 일으킬 수 있는 기술로서 주목받고 있다.
일반적으로, 마이크로어레이를 이용한 분석에서 혼성화는 DNA 등의 생물 분자가 고정된 슬라이드 글라스 위에 시료를 포함하는 일정량의 혼성화 용액을 떨어뜨린 후 커버 슬립으로 덮어 넓게 펴준 후 챔버에 넣거나 혹은 슬라이드 글라스와 커버 스립 조립체의 상태로 소정의 온도로 유지되는 인큐베이터 등에 넣어 반응시키는 것에 의해 이루어진다. 커버 슬립을 이용한 혼성화에서는 혼성화 용액이 마이크로어레이 상에서 균일하게 분포되지 않아 구배가 형성되는 것과 마이크로어레이 상에 혼성화 용액을 적용하고 커버 슬립을 덮을 때 기포가 포집되는 것이 주요한 문제점으로 대두되고 있다. 전자의 경우는, 마이크로어레이 상에서 혼성화 용액이 각 스팟 마다 동일한 용량으로 분배될 수 있게 하는 리프터슬립(LifterSlip™)을 이용하면 해결될 수 있다. 리프터슬립™은 커버 슬립의 양단에 0.04mm - 0.06mm 두께의 날(edge)이 있어서, 커버 슬립 내에서 혼성화 용액이 마이크로어레이 표면상에 균일하게 퍼져서 스팟당 혼성화 용액의 양의 변이를 감소시킬 수 있다. 후자, 즉, 혼성화 용액 내 기포 형성의 경우는 실험자의 숙련도 및 심신 상태에 따라 그 심각도가 좌우된다. 이에 대해 현재까지 특별한 해법은 없고, 단지 기포가 포함되지 않도록 주의하는 것에만 의존하고 있다. 혼성화 용액을 적용하고 커버 슬립을 덮은 후에 기포가 발생되면, 그 기포 부분의 마이크로어레이는 시료와 제대로 반응이 이루어지지 않게 되므로, 시료 및 마이크로어레이의 일정부분을 낭비하게 된다. 특히, 마이크로어레이를 이용한 환자의 진단 시, 혼성화 영역 내에서 발생한 기포는 분석에 영향을 미쳐 진단 분석시 실험오차의 원인이 되기도 한다. Agilent, Corning, Telechem 등에서 판매 중인 마이크로어레이 키트의 사용자 매뉴얼이나 NIH/NHGRI 등의 국립 연구소나 대학 등에서 활용되는 매뉴얼 등에서도 단지 기포가 포함되지 않도록 주의하고, 기포가 포함된 경우에는 굳이 이를 제거하고자 시도하기보다는 그 부분의 데이터를 포기하고 실험을 진행할 것이 권고되고 있다. 커버 슬립 아래의 혼성화 용액에 이미 포함된 기포는 제거하기가 어렵고, 이를 시도하다가 어렵게 얻은 시료 및 값비싼 마이크로어레이만 버리게 될 수 있기 때문이다. 따라서, 혼성화 준비단계에서 커버 슬립을 서서히 덮으면서 가능한 한 기포가 포함되지 않도록 주의하고, 그럼에도 불구하고 형성된 기포에 대해서는 마이크로어레이 상에서 그 부분의 데이터를 포기하는 방법에 의존하고 있다. 그러나, 시료의 중요성, 시료의 준비에 소요되는 시간 및 노력 및 마이크로어레이의 비용을 고려할 때, 실험 오차를 줄이고 마이크로어레이를 최대한 활용할 수 있게 하는 방법의 개발이 요구된다.
이에, 본 발명자는 자성 입자가 DNA 마이크로어레이의 스팟에 영향을 미치지 않는다는 실험 결과에 근거하여, 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액에 포함된 기포를 제거하는 방법에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체 분자가 고정된 마이크로어레이, 커버 슬립, 혼성화 용액, 자성 입자, 자석 및 사용자 설명서를 포함하는 마이크로어레이 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 자성 입자 용액을 주입하는 단계; 및
상기 커버 슬립과 마이크어레이로 구성된 조립체에 자성을 가하여 상기 자성 입자들을 이동시켜 상기 마이크로어레이의 혼성화 영역으로부터 혼성화 용액 중의 기포를 제거하는 단계;를 포함하는, 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 자성 입자 용액을 주입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 마이크로어레이에는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), 펩타이드 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 생물 분자가 고정된다. 바람직하게는, 마이크로어레이에 고정되는 생물 분자는 DNA, RNA, PNA, LNA 등의 핵산이고, 보다 바람직하게는 DNA이다.
본 발명의 일 양태에서, 마이크로어레이의 기판은 표면개질 유리 슬라이드이다.
본 발명의 일 양태에서, 커버 슬립은 바람직하게는 리프터슬립(LiferSlip™)이다.
본 발명의 일 양태에서, 마이크로어레이의 혼성화에 이용되는 혼성화 용액은 프로브와 시료 간의 비특이적 결합을 저해하기 위해 우혈청 알부민, 덴하르트 용액, 세제(detergent) 등을 포함한다. 이에 의해, 혼성화 용액은 약간의 점도를 가지며 기포 발생이 쉽다.
일반적으로 커버 슬립을 이용한 마이크로어레이의 혼성화 분석에서 원하는 생물 분자가 프로브로서 고정된 마이크로어레이 상에 분석 대상인 시료와 혼합된 혼성화 용액을 떨어뜨리고 커버 슬립을 덮어서 마이크로어레이-커버 슬립 조립체를 형성한다. 이 단계에서 시료를 포함하는 혼성화 용액이 마이크로어레이 상에 균일하게 분포되지 않으면 혼성화 및 분석 결과에 영향을 미치게 된다. 커버 슬립으로 리프터슬립™을 이용하면, 리프터슬립™을 마이크로어레이 위에 놓고 이 마이크로어레이-리프터슬립™ 조립체에 혼성화 용액을 주입하여 마이크로어레이 상에서 혼성화 용액의 균일한 분포를 얻을 수 있다. 리프터슬립™은 커버 슬립의 양단에 0.04mm - 0.06mm 두께의 날을 가진 구조이므로, 커버 슬립 내에서 혼성화 용액이 마이크로어레이 표면상에 균일하게 퍼질 수 있게 한다.
또한, 혼성화 용액이 약간의 점도를 가지므로, 도 1에 도시된 바와 같이 마이크로어레이에 시료를 포함하는 혼성화 용액을 적용하고 커버 슬립을 덮을 때, 혼성화 용액 내에 기포가 포집될 수 있다. 기포가 형성된 부분의 스팟들은 시료와 반응할 수 없기 때문에 기포를 제거하지 않으면, 마이크로어레이의 일부만을 사용하고 시료 및 혼성화 용액을 낭비하는 결과가 초래된다. 상업적으로 판매되고 있는 마이크로어레이 키트의 사용자 매뉴얼이나 실험실 등에서 이용되는 매뉴얼에 의하면, 기포가 형성되지 않도록 최대한 주의하고 만약 커버 슬립 밑에 기포가 관찰되면 이를 제거하기 위해 시도하다가 마이크로어레이 전체를 못쓰게 될 수도 있으므로, 그보다는 기포가 있는 부분을 포기하고 실험을 진행하고 있다.
기포 발생에 의해 야기되는 혼성화 저해를 해소하기 위해, 도 4에 도시된 바와 같이 커버 슬립을 덮어 형성된 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액에 기포가 형성된 경우, 마이크로어레이와 커버 슬립의 사이로 자성 입자 용액을 주입한다.
본 발명의 일 양태에서, 자성 입자는 직경이 0.5 ㎛ 내지 60 ㎛이다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 자성 입자는 표면에 음전하를 띠는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 자성 입자는 마이크로어레이 하부 또는 커버 슬립의 상부에 접촉된 자석을 통해 이동될 수 있을 정도의 크기이어야 한다. 따라서, 자성 입자는 그 직경이 0.5 ㎛ 내지 60 ㎛이다. 자성을 가하여 기포를 이동시킬 수 있기 위해서는 일정량의 자성 입자들이 포함되어야 한다. 자성 입자의 직경이 작을수록 보다 많은 수로 포함되어야 하나, 혼성화 용액의 전체 용량을 고려할 때, 1 x 106 내지 1 x 108/0.5-10 ㎕로 포함되어야 한다.
자성 입자 용액은 혼성화 용액이나 탈염수에 자성 입자를 첨가하여 준비한다.
자성 입자 용액을 커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 주입하는 것은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로파이펫의 끝을 커버 슬립과 마이크로어레이가 맞닿은 면에 대고 조심스럽게 용액을 주입한다.
본 발명에 따른 방법은 커버 슬립과 마이크어레이로 구성된 조립체에 자성을 가하여 상기 자성 입자들을 이동시켜 마이크로어레이의 혼성화 영역으로부터 혼성화 용액 중의 기포를 제거하는 단계를 포함한다.
커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 상기 조립체에 자성을 가하여, 자성 입자들이 혼성화 용액 내에서 이동하게 하면, 이 입자들의 이동에 따라 기포도 함께 움직여서 혼성화 영역으로부터 제거된다. 그 후, 혼성화 반응을 진행하면, 기포에 의해 이용할 수 없게 되는 영역 없이 마이크로어레이의 혼성화 영역 전체를 이용할 수 있게 된다.
본 발명의 일 양태에서, 커버 슬립과 마이크로어레이 조립체에 자성을 가하는 단계는 자석을 마이크로어레이 하부, 커버 슬립의 상부 또는 마이크로어레이의 하부 및 커버 슬립의 상부 모두에 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자석을 마이크로어레이의 하부 및 커버 슬립의 상부 모두에, 즉, 마이크로어레이-커버 슬립 조립체의 상하부에 접촉시키는 것을 포함한다.
자성 입자 용액을 마이크로어레이와 커버 슬립의 사이에 주입한 후, 자성은 자석을 마이크로어레이의 하부 또는 커버 슬립의 상부에 접촉시켜 움직이는 것에 의해 자성 입자에 가해진다. 도 3에 도시된 바와 같이, 자석을 마이크로어레이의 하부와 커버 슬립의 상부에서 동시에 접촉시키면, 자성이 보다 강하게, 집중적으로 적용되어 혼성화 용액 내의 자성 입자들을 용이하게 이동시킬 수 있다.
본 발명은 또한 생물 분자가 고정된 마이크로어레이, 커버 슬립, 혼성화 용액, 자성 입자, 자석 및 사용자 설명서를 포함하는 마이크로어레이 키트로서, 상기 자성 입자 및 자석은 상기 마이크로어레이에 시료를 포함하는 혼성화 용액을 적용하고 커버 슬립을 덮어 형성된 마이크로어레이-커버 슬립 조립체에 포함된 기포를 제거하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 키트를 제공한다.
최근에는 특정 질병이나 유전적 특징을 검출하기 위한 마이크로어레이와 혼성화 및 신호 검출에 필요한 각종 시약 등 시료 분석에 필요한 모든 요소들을 포함하는 키트(kit)가 다양하게 개발되고 있다. 마이크로어레이 상에 커버 슬립을 덮고 혼성화 반응을 진행시키는 단계를 포함하는 키트의 경우, 커버 슬립 아래의 혼성화 용액에 기포가 포함될 수 있고, 본 발명의 방법에 따라 기포를 제거하기 위해 자성 입자 및 자석을 이용할 수 있다. 따라서, 마이크로어레이 키트에 자성 입자 및 자석을 포함시키면 사용자들이 본 발명에 따른 방법을 적용하여 마이크로어레이의 혼성화 영역 및 시료의 낭비 없이 키트를 활용할 수 있고 실험간 오차를 줄일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 마이크로어레이 키트에 포함된 사용자 설명서는 마이크로어레이에 커버 슬립을 덮어 커버 슬립-마이크로어레이 조립체를 형성한 후, 시료를 포함한 혼성화 용액을 적용하여 커버 슬립 아래의 혼성화 영역에서 기포가 발생한 경우, 키트에 포함된 자성 입자 및 자석을 이용하여 기포를 제거하는 방법에 대한 설명을 포함한다.
이하에서, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이하의 설명에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 자성 입자가 혼성화에 미치는 영향
본 발명에 따른 방법을 이용하여 혼성화 용액 내의 기포를 제거하는 경우, 자성 입자가 마이크로어레이에 고정된 프로브와 시료 간의 혼성화에 미치는 영향을 조사하였다.
마이크로어레이(호흡기 감염질환 병원균 동정칩)에 리프터슬립™(Erie Scientific Company, P/N 25x25I-2-4823)을 덮고 시료를 포함한 혼성화 용액(0.005% Triton X-100을 포함하는 6X SSPE) 30㎕를 기포가 발생하지 않도록 주의하면서 적용하고 혼성화 용액이 마이크로어레이 전체에 균일하게 분포되게 하였다. 그 후, 자성 비드인 Dynabead M-270 카르복시산(Dynal Inc., 직경:2.8㎛)을 1 x 107개 포함하는 혼성화 용액(6X SSPET:0.5㎕ 내지 10㎕)을 마이크로어레이와 커버 슬립 사이에 주입하였다. 혼성화 용액 내에서 자성 입자들을 이동시키기 위해 도 3과 같이 자석을 마이크로어레이 하부 및 커버 슬립의 상부에 동시에 접촉시켜 원하는 방향으로 약 15분간 움직여 준 뒤, 자성 입자들을 마이크로어레이의 혼성화 영역의 외부로 이동시켰다. 그 후, 마이크로어레이-커버 슬립 조립체를 1시간 동안 42℃에서 혼성화시킨 후 스캐닝하여 스팟의 형태(spot integrity) 및 신호 강도(signal intensity)를 조사하였다(Molecular Devices Co., GenePix4000B 마이크로어레이 스캐너). 대조구는 자성 입자들에 의해 처리하는 단계를 제외하고는 동일한 단계들을 수행하여 얻었다. 그 결과를 도시하는 도 2에서 보는 바와 같이, 자성 입자들에 의한 처리는 스팟의 형태 및 신호 강도에 영향을 미치지 않았다. 오히려, 신호 강도는 대조구에 비해 약간 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 마이크로어레이 상의 혼성화 용액에서 자성 입자들을 움직여 주는 과정에서 발생하는 혼합의 효과에 의한 것으로 사료된다.
실시예 2. 자성 입자 및 자석을 이용한 기포 제거
자성 입자 및 자석을 이용하여 리프터슬립™을 덮은 생물 분자가 고정된 마이크로어레이에 시료를 포함하는 혼성화 용액을 적용할 때 혼성화 용액 내에 형성된 기포를 제거하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 마이크로어레이-커버 슬립의 조립체에 포함된 혼성화 용액에 기포가 형성된 경우, 마이크로어레이와 커버 슬립의 사이로 1 x 107개의 자성 입자들을 주입하고 자성을 가하였다. 자성은 도 3에 나타난 바와 같이, 자석을 마이크로어레이의 하부 및 커버 슬립의 상부에 동시에 접촉시켜서 가하였다. 자석을 접촉시키면, 자성 입자들이 그 부위로 집결하고, 자석을 움직이면 이에 따라 자성 입자들의 집결체가 이동하면서 기포도 같이 움직였다. 기포가 완전히 제거될 수 있을 정도로 충분한 시간 동안(1-2분 이내) 자석을 움직여 기포를 제거하고 더 이상 기포가 보이지 않으면 도 4에 나타낸 바와 같이 자성 입자들을 마이크로어레이의 혼성화 영역외부로 이동시켜 제거하였다. 기포가 제거된 마이크로어레이-커버 슬립 조립체로 혼성화 반응을 진행시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 혼성화 반응 전에 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액에 자성 입자를 주입하고 자석을 움직여 이들을 혼성화 용액 내에서 이동시켜도 시료와 마이크로어레이 상의 프로브 간의 혼성화 및 스팟의 형태, 신호 강도에 영향을 미치지 않으므로, 자성 입자 및 자석을 이용한 전단계 처리에 의해 기포에 의해 혼성화 신호의 검출을 포기해야 하는 영역 없이 마이크로어레이의 혼성화 영역을 최대한 이용할 수 있었다.
커버 슬립을 이용하는 마이크로어레이의 혼성화에서 커버 슬립 아래의 혼성화 용액에 기포가 포집되었을 때, 자성 입자 및 자석을 이용하여 기포를 혼성화 영역으로부터 제거하여 기포에 의해 사용되지 못하는 마이크로어레이의 혼성화 영역을 최소화할 수 있다.

Claims (6)

  1. 커버 슬립과 마이크로어레이 사이로 자성 입자 용액을 주입하는 단계; 및
    상기 커버 슬립과 상기 마이크어레이로 구성된 조립체에 자성을 가하여 상기 자성 입자들을 이동시켜 상기 마이크로어레이의 혼성화 영역으로부터 혼성화 용액 중의 기포를 제거하는 단계;를 포함하는, 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자성을 가하는 단계는 자석을 상기 마이크로어레이 하부, 상기 커버 슬립의 상부 또는 상기 마이크로어레이의 하부 및 상기 커버 슬립의 상부 모두에 접촉시키는 것을 포함하는 것인 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 DNA, RNA, PNA, LNA, 펩타이드 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 생물 분자가 고정되어 있는 것인 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 자성 입자는 직경이 0.5 ㎛ 내지 60 ㎛인 것인 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 자성 입자는 음전하를 띠는 것인 자성 입자를 이용하여 마이크로어레이-커버 슬립 조립체 내의 혼성화 용액으로부터 기포를 제거하는 방법.
  6. 생물 분자가 고정된 마이크로어레이, 커버 슬립, 혼성화 용액, 자성 입자, 및 자석을 포함하는 마이크로어레이 키트로서, 상기 자성 입자 및 상기 자석은 상기 마이크로어레이에 상기 커버 슬립을 덮어 형성된 마이크로어레이-커버 슬립 조립체에 시료를 포함하는 상기 혼성화 용액을 적용할 때 생성된 기포를 제거하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 키트.
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