KR100813224B1 - Thermo-reversible coacervate combination gels for protein delivery - Google Patents

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KR100813224B1
KR100813224B1 KR1020070085750A KR20070085750A KR100813224B1 KR 100813224 B1 KR100813224 B1 KR 100813224B1 KR 1020070085750 A KR1020070085750 A KR 1020070085750A KR 20070085750 A KR20070085750 A KR 20070085750A KR 100813224 B1 KR100813224 B1 KR 100813224B1
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protein
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김용희
진광미
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한양대학교 산학협력단
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Abstract

A drug delivering gel is provided to be easy to handle in a sol state at room temperature and be rapidly converted into a gel state in according to the temperature increase after being injected in the body to show the continuous releasing pattern of the combined gel for a long time, thereby being useful for delivering a protein drug. A drug delivering gel comprises: a complex coacervate consisting of a positively charged protein and a negatively charged polysaccharide; and a negative thermo-reversible polysaccharide including a salted-out salt, wherein the positively charged protein is selected from the group consisting of gelatin, bovine pancreatic trypsinogen, basic fibroblast growth factor, fibronectin, aggrecan, and casein, the negatively charged polysaccharide is selected from the group consisting of chondrotin sulfate, heparin, heparan sulfate, hyaluronan, dermatan sulfate and keratan sulfate, the salted-out salt is selected from the group consisting of salted-out salts including a Hofmeister series anion such as SO4^2-, HPO4^2-, F^-, Cl^-, Br^-, NO3^-, I^-, ClO4^-, and SCN^-, and the negative thermo-reversible polysaccharide is selected from the group consisting of methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, ethylhydroxyethylcellulose, carrageenan, and scleroglucan. A method for preparing the drug delivering gel comprises the steps of: (a) mixing the positively charged protein with the negatively charged polysaccharide to form the complex coacervate; and (b) mixing the complex coacervate with the negative thermo-reversible polysaccharide including the salted-out salt.

Description

단백질 약물전달용 온도 가역성 코아세르베이트 조합 겔{THERMO-REVERSIBLE COACERVATE COMBINATION GELS FOR PROTEIN DELIVERY} Temperature for reversible protein drug delivery coacervate combination gel {THERMO-REVERSIBLE COACERVATE COMBINATION GELS FOR PROTEIN DELIVERY}

본 발명은 약물 전달용 겔에 관한 것이다. The present invention relates to a gel for drug delivery. 더 구체적으로 본 발명은 단백질 약물 전달에 유용한, 복합 코아세르베이트와 온도 가역성 다당류의 조합 겔에 관한 것이다. The present invention more specifically relates to a combination of a gel useful, complex coacervate and temperature reversible polysaccharide to protein drug delivery.

가장 간단한 일반적인 약물 전달 시스템은 경구 또는 주사나 패치 형태를 들 수 있다. The simplest general drug delivery system can be given orally or by injection or patch form. 그러나, 약물의 종류가 다양해지면서 이와 같은 고전적인 형태의 약물전달 시스템이 부적합한 성질을 가지는 경우가 발생하였다. However, the type of drug As vary occurred is if the classical form of a drug delivery system such as this having an inappropriate properties.

단백질 약물의 경우, 일반적으로 정제 등의 경구 투여나 수술을 통한 투약이 이루어지고 있다. In the case of protein drugs, the medication via oral administration or surgeries such as general tablets being made. 그러나, 경구 투여의 경우에는 장내 소화효소에 의하여 목적하는 단백질 약물이 대부분 분해되어 약물의 목적하는 효과가 미미하고, 수술을 통하는 방법은 위험성과 비용 측면에서 비효율적이다. However, in the case of oral administration of protein drugs for the purpose by the intestinal digestive enzymes are mostly decomposed desired effect of the drug minimal, and how through surgery is inefficient in terms of risk and cost.

더욱이, 경구 투여 등의 전신을 대상으로 하는 약물 전달 시스템은 약효가 필요하지 않거나 좋지 않은 영향을 미치는 질병외 부위에까지 약물을 동일 농도로 전달하여 바람직하지 않은 효과를 나타내는 큰 단점이 있다. Furthermore, the drug delivery to target the whole body, such as oral administration system has the big disadvantage that indicates undesirable to deliver medication far region other diseases affecting adversely does not require a drug concentration in the same effect.

따라서, 특정 질병부위를 표적화하여 치료하기 위한 약물전달 시스템의 필요성이 급증할 뿐 아니라, 잦은 투여로 인한 번거로움이나 위험성을 줄이기 위하여 표적 부위에 정확히 작용하면서도 되도록 장기간 약물이 서서히 방출되는 최적의 약물전달 시스템에 대한 필요성이 있다. Thus, the optimal drug delivery that a long period of time the drug is released slowly so that, while not only the need for a drug delivery system for the treatment by targeting a specific disease site proliferation, correctly act on the target site, in order to reduce the trouble or risks caused by frequent administration there is a need for a system.

근래 수년간, 약물전달 및 조직배양처리(tissue engineering)를 포함한 다양한 생물학적 의학용도로 인시튜(in situ)-형성 시스템이 보고되었다 (RL Dunn 등, Biodegradable in-situ forming implants and methods of producing the same, US Patent 4 (1990) 938-763; BO Haglund 등, J. Control. Release 41 (1996) 229-235; 및 Y. An 등, J. Control. Release 64 (2000) 205-215 참조). Recent years, drug delivery and tissue culture treatment (tissue engineering) to a variety of biological medical uses in-situ (in situ), including - formation system have been reported (RL Dunn, etc., Biodegradable in-situ forming implants and methods of producing the same, US Patent 4 (1990) 938-763; and references including Y. An, J. Control Release 64 (2000) 205-215); BO Haglund, etc., J. Control Release 41 (1996) 229-235...

예를 들어, 용매교환(solvent exchange), pH 변화, 자외선(UV)조사, 이온 교차결합 및 온도전이와 같은 몇 가지 기전에 의해, 인시튜 겔 형성에 도달할 수 있게 되었다. For example, the solvent exchange (solvent exchange), pH changes, ultraviolet rays (UV) were able to reach the irradiation, by some mechanism, such as ionic cross-links and the transition temperature, in-situ gel formation. 낮은 용액임계온도 (Lower Critical Solution Temperature (LCST))를 가지는 네거티브 온도 감응성 고분자 또는 가열이나 냉각 시에 가역적 겔-졸 전이행태(sol-gel transition behavior)를 나타내는 온도-가역적 하이드로겔은 약물전달용 자극-감응적 고분자 시스템의 가장 보편적으로 연구된 분야이다. Lower solution critical temperature (Lower Critical Solution Temperature (LCST)) to have a negative temperature-sensitive reversibly gelling upon the polymer, or heating or cooling-temperature indicating sol transition behavior (sol-gel transition behavior)-reversible hydrogel is stimulated for drug delivery - it is the most common field of study of the ever-sensitive polymer systems. 몇 가지 합성 고분자들이 체온에서 온도-가역적 겔화 행동을 나타내는 것으로 보고된 바 있고 약물전달에 사용된 바 있으나, 자체의 생체적합성(biocompatibility) 문제와 생체분해성(biodegradation)에 관련된 문제가 여전히 남아있는 실정이다. Several synthetic polymers are at body temperature the temperature-a, and was reported to exhibit reversible gelling behavior used for drug delivery bar, but the situation with its own biocompatible (biocompatibility) issues and problems associated with the biodegradable (biodegradation) remains .

고분자량 천연 셀룰로오스는 분자내- 및 분자간 수소결합으로 인해 수용액에서 불용성인 경우가 많다(Gels Handbook, Vol. 4; Osaka, Y., Kanji, K., Eds, 역자: Hatsuo Ishida; Academic Press: San Diego, CA (2001)). . The high molecular weight natural cellulose molecule - and in many cases insoluble in the aqueous solution due to intermolecular hydrogen bonding (Gels Handbook, Vol 4; Osaka, Y., Kanji, K., Eds, Translator: Hatsuo Ishida; Academic Press: San diego, CA (2001)). 일부 히드록실기가 예컨대 메틸이나 히드록실프로필과 같은 소수성 기로 치환되면, 일부 수소결합이 파괴되어 수용성, 소수성으로 변성된(hydrophobically modified) 셀룰로오스가 만들어지게 된다 (Guenet, J, Thermoreversible Gelation of Polymers and Biopolymers, Academic Press: London (1992); 및 Kabayashi, K. 등, Macromolecules 32 (1999) 7070 참조). Some When a hydroxyl group is, for example substituted with a hydrophobic, such as methyl or hydroxyl-propyl, a part of hydrogen bonds is destroyed and the modified water-soluble, hydrophobic (hydrophobically modified) cellulose will be made (Guenet, J, Thermoreversible Gelation of Polymers and Biopolymers , Academic Press: London (1992); and Kabayashi, see K. et al., Macromolecules 32 (1999) 7070).

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메틸셀룰로오스 (MC)는 수용액에서 온도 가역적인 물리적 겔을 형성하는, 소수성으로 변성된 비이온성 셀룰로오스 유도체이다. Methyl cellulose (MC) is a non-ionic cellulose derivatives modified with temperature to form a reversible physical gel in an aqueous solution, hydrophobic. 메틸셀룰로오스는 치환도가 높은 소수성 영역과 치환도가 낮거나 치환이 일어나지 않은 친수성 영역으로 이루어진 비균질성 교호식(alternative) 블록공중합체 구조이다(Kundu, KK, Polymer. 42 (2001) 2015-2020 참조). Methyl cellulose is a substitution of a highly hydrophobic region and the substitution degree is low or non-homogeneity alternating (alternative) consisting of a hydrophilic area is not induced substituted block copolymer structure (See Kundu, KK, Polymer. 42 (2001) 2015-2020) . 소수성 영역은 물 구조를 국소적으로 안정화시키고, 가열시에는 물 구조가 파괴되어 소수성 상호작용을 증강시킴으로써 결과적으로는 겔화 현상을 초래하게 된다. By hydrophobic regions stabilize the structure of water and topically, have been destroyed during the heating water structure enhances the hydrophobic interaction is consequently will result in gelation. 치환도(DS)가 1.4-2.0인 시판되는 MC는 물속에서 MC의 농도 1.0-2.5%에서 가열시에 졸-겔 전이를 수행한다. Substitution of commercially available MC (DS) is 1.4 to 2.0 when heating the sol at a concentration of 1.0-2.5% MC in water - performs a gel transition. 이 같은 상-전이 특성은 식품 및 제약산업에 광범위하게 응용되어 결합제 또는 증점제로 사용된다. The same-transfer properties are widely applied in food and pharmaceutical industry is used as a binder or thickening agent.

셀룰라아제는 셀룰로오스를 베타-글루코오스로 분해시키는 효소 복합체이다. Cellulase is cellulose, beta-enzyme complex to decompose to glucose. 사람을 포함한 대부분의 동물들은 이러한 효소를 생산하지 않기 때문에 식물체의 에너지를 독립적으로 활용할 수 없다. Most animals, including humans, can not take advantage of the plant energy independent because they do not produce this enzyme. 그러나, 셀룰라아제는 진균류 및 미생물 유기체에 광범위하게 풍부하게 존재하며, 사람의 보건위생상 식품보조제로 사용되어 식물체의 다당류(polysaccharide)를 가수분해하여 분해시킬 수 있도록 한다. However, the cellulase is present in abundance extensively on fungi and microbial organisms, are used for health and hygiene of food supplements so that people can be decomposed by hydrolysis of polysaccharides (polysaccharide) of the plant. 어떤 진 균류는 셀룰로오스의 산화작용을 촉매하는 효소를 분비한다. Any binary fungi secrete enzymes that catalyze the oxidation of cellulose. 페록시다아제는 과산화수소를 분비하여 셀룰로오스의 C 2 -C 3 위치에 있는 자유 라디칼을 공격함으로써 알데히드 셀룰로오스를 형성하게 되는데, 이것은 반응성이 매우 높으며 보다 저분자량의 분획들로 가수분해를 진행시킨다. Peroxidase is secreted by the hydrogen peroxide attack of free radicals in the cellulose of the C 2 -C 3 where there is formed an aldehyde cellulose, which advances the hydrolysis low molecular weight than with the very high reactivity fraction. 박테리아는 셀룰로오스를 분해시키는 내인성(엔도-)- 및 외인성(엑소-)- 효소를 분비하여 탄수화물 영양소를 생산하기도 한다(Aubert, JP, Beguin, P., Millet, J. Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. Academic, New York (1988) 참조). Bacteria are endogenous (endo -) - decomposition of the cellulose and extrinsic (exo -) and secrete enzymes sometimes produce carbohydrate nutrient (Aubert, JP, Beguin, P., Millet, J. Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. see Academic, New York (1988)).

MC를 체온에서 겔화되는 인시튜-형성 약물전달 시스템으로 응용하기 위해서는, 예컨대 중합체, 비전해질 또는 염과 같은 첨가제를 사용하여 MC의 네거티브 열-겔화 기작을 변성시킬 필요가 있다. To application to form drug delivery systems, such as the negative of the MC column using additives such as polymers, salts or nonelectrolyte-situ the MC is gelled at body temperature it is necessary to denature the gelling mechanism. MC의 겔화 온도는 MC의 농도를 증가시켜서 저하시킬 수도 있지만, 용액의 점도가 높아져 취급이 어려워진다. The gelling temperature of MC, the handling becomes difficult, but may be decreased by increasing the concentration of the MC, the viscosity of the solution.

겔화 온도를 변성시키는 간단한 방법은 수용성 중합체의 상(phase) 변화에 현저한 영향을 주는 것으로 공지된 염석(salting-out) 염(salt)류를 사용하는 것이다(Schott, M.; Royce, AE; Han, SK J Colloid Interface Sci 98 (1984) 196 참조). A simple method of modifying the gelation temperature is the use of a salting-out (salting-out) salt (salt) kind known as having a significant effect on the (phase) variation of the water-soluble polymer (Schott, M ​​.; Royce, AE; Han , SK J Colloid Interface Sci 98 (1984), see 196). 염류의 음이온(anion)은 비극성 용질이나 거대분자의 소수성을 안정화시키기 위해 양이온보다 훨씬 효과적인 것으로 알려져 있다. Negative ion (anion) of salts are known to be much more effective cation to stabilize the hydrophobic non-polar solutes and large molecules. 호프마이스터 시리즈(Hofmeister series) (Collins, KD; Washabaugh, MW Q Rev Biophys. 4 (1985) 323) 또는 친액성 시리즈 (Lyotropic series)(M. Khairy 등, Journal of Polymer Science (2003) 3547-3559)에 따르면, 음이온의 염석 농도는 다음과 같다: Hope Meister Series (Hofmeister series) (Collins, KD;. Washabaugh, MW Q Rev Biophys 4 (1985) 323) or lyophilic Series (Lyotropic series) (. M Khairy, etc., Journal of Polymer Science (2003) 3547-3559) according to the concentration of the salting-out anion is:

호프마이스터 시리즈 (Hofmeister series) : Hope Meister Series (Hofmeister series):

SO 4 SO 4 2- > HPO 4 2 - > F - > Cl - > Br - > NO3 - > I - > ClO 4 - > SCN - 2-> HPO 4 2 -> F -> Cl -> Br -> NO3 -> I -> ClO 4 -> SCN -

친액성 시리즈 (Lyotropic series) : Lyophilic Series (Lyotropic series):

Al 3 + >Ca 2 + >Mg 2 + >K + =NH 4 + >Na + >Li + , PO 4 3 - >SO 4 2 - >Cl - >NO 3 - Al 3 +> Ca 2 +> Mg 2 +> K + = NH 4 +> Na +> Li +, PO 4 3 -> SO 4 2 -> Cl -> NO 3 -

코아세르베이트 형성(Coacervation)은 하전된 거대분자의 균질용액이 액상-액상 분리를 수행하여 중합체가 풍부한 고밀도 상을 생성하게 되는 과정이다. Coacervate formation (Coacervation) is a homogeneous solution of a charged macromolecular liquid - a process that generates a high-density polymer-rich phase is carried out by a liquid phase separation. 반대 극성으로 대전된 2개의 거대분자(또는 고분자전해질이나 반대극성으로 대전된 콜로이드)는 정전기적 작용 및 추가의 상호작용을 거쳐서 복합 코아세르베이트 형성 과정을 수행할 수 있다. A polarity opposite to the two macromolecular (or high molecular electrolyte or a colloidal charged to the opposite polarity) as the charging may be via an electrostatic action, and further interaction perform complex coacervate formation.
코아세르베이트는 단백질 정제 및 약물전달에 광범위하게 적용되어 왔다(Xia, J. 및 Dubin, PL, Protein-polyelectrolyte complexes. In: Dubin, PL, Bock, J., Davis, R., Schulz, DN, 및 Thies, C., Eds. Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology. Berlin: Springer-Verlag (1994) 247-271; Poznansky MJ, Juliano RL., Pharmacol Rev 36 (1984) 277-335; 및 Gombotz WR., Bioconjugate Chem 6 (1995) 332-51). Coacervate has been applied extensively in protein purification and drug delivery (Xia, J. and Dubin, PL, Protein-polyelectrolyte complexes In:. Dubin, PL, Bock, J., Davis, R., Schulz, DN, and Thies , C., Eds Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology Berlin:.... Springer-Verlag (1994) 247-271; Poznansky MJ, Juliano RL, Pharmacol Rev 36 (1984) 277-335; and Gombotz WR, Bioconjugate Chem 6 (1995) 332-51).

복합 코아세르베이트는 수성 매질에서 반대로 하전된 고분자전해질을 혼합시킬 때 동시적으로 형성될 수 있다. Complex coacervate can be formed simultaneously when mixing the charged polymer electrolyte contrary in an aqueous medium. 단백질-단백질, 단백질-다당류, 및 다당류-다당류 조합물은 약물전달용 및 생-의학적용도로 빈번히 연구되어 왔다. Protein-protein, protein-polysaccharide and polysaccharide-polysaccharide combination is for drug delivery and production - have been frequently research into medical uses. 예를 들어, 다가 양이온이나 양쪽성 이온으로서의 젤라틴 A 및 다가 음이온으로서의 콘드로이틴 6-황산염(CS)으로 이루어진 복합 코아세르베이트 형성에 의한 마이크로스피어(microsphere)는 치료용 단백질의 관절내 전달시스템으로 효율적인 것으로 보고되었다 (Kimberly EB, Arthritis&Rheumatism (1998) 2185-2195). For example, it has been reported to be effective multivalent cation or zwitterion as gelatine A and a polyvalent anion as a chondroitin 6-sulfate (CS) complex coacervate is formed by microspheres (microsphere) is a joint of the therapeutic protein inside a delivery system consisting of (Kimberly EB, Arthritis & Rheumatism (1998) 2185-2195). 특히 다가 이온들은 연골(cartilage)과 활막(synovium)의 세포외 매트릭스의 주성분이므로, 마이크로스피어는 염증유발성 사이토킨에 의해 유발된 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease, MMP)에 대하여 감응성을 가진다. In particular, multivalent ions has a sensitivity with respect to cartilage (cartilage) and protease (matrix metalloprotease, MMP), microspheres because it is the main component of the extracellular matrix of the synovial membrane (synovium) is in a metal matrix induced by inflammatory cytokines.

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따라서, 종래 약물전달 시스템의 상기와 같은 단점을 보완할 수 있는, 주로 치료 등의 목적으로 단백질을 표적 부위에 효율적으로 전달하면서도 인체 적용 부위에서 장시간 지속적으로 단백질이 방출되어 목적하는 효과를 지속할 수 있는 약물 내지 단백질 전달 시스템의 필요가 있다. Thus, the conventional drug delivery to compensate for the disadvantages of the above systems, to sustain the effect of the protein was released purpose for a long time continuously to the protein for the purpose of mainly treated in efficiently delivered while the body application site to the target site in that there is a need for a drug to protein delivery systems.

본 발명자들은 놀랍게도 반대 전하로 하전된 두 가지의 생체 고분자물질로 형성된 복합 코아세르베이트를 네거티브 온도-가역성 다당류와 공동제형화하면, 실온에서는 물과 같은 상태로 투여가 용이한 상태로 존재하다가 인체에 주입하였을 때는 즉시 겔이 형성되어 겔 내에 함유된 단백질을 천천히 지속 방출한다는 사실을 발견하여 복합 코아세르베이트와 온도-가역성 다당류 겔의 조합으로 이루어지는 단백질 전달용 겔 및 그 제조방법으로 이루어진 본 발명을 완성하기에 이르렀다. The present inventors have surprisingly complex coacervate formed of two biopolymer materials of the opposite electric charge charged negative temperature-reversible when polysaccharide and co-formulated with, at room temperature, while present in the easy administration in the same conditions and water conditions hayeoteul injected to the human body when complex coacervate and temperature found that immediate gel formation is slow sustained release of the protein contained in the gel-thus completing the present invention consists of a gel for protein delivery comprising a combination of a reversible polysaccharide gel and a method of manufacturing the same.

본 발명자들은 특히, 화학적으로 가교 결합되지 않고 물리적으로 조합된 겔로서, 천연 단백질이나 치료용 단백질과 다당류로 이루어진 2 개의 하전된 생체 거대분자를 가하여 형성되는 복합 코아세르베이트를 제공한다. The inventors have in particular, rather than being grouped as chemical cross-linking as a physical combination of the gel, provides a complex coacervate that is formed by adding the two charged biological macromolecules consisting of native protein and therapeutic proteins and polysaccharides for. 이러한 복합 코아세르베이트를 온도-가역적 고분자와 함께 더 공동제형화(co-formulating)함으로써, 주사용 및 지능형 (intelligent) 약물 전달 시스템을 제조한다. These complex coacervate temperature by adding co-formulated with (co-formulating) with a reversible polymer, to prepare an injectable and intelligent (intelligent) drug delivery system. 이러한 복합 코아세르베이트 형성 및 온도 반응성 겔의 두 가지 장점을 가지는 최적화된 신규 전달 시스템을 도입함으로써 효과적 단백질 전달시스템으로서의 가치가 입증되었다. By introducing a new transport system optimized with the two advantages of such a complex coacervate it is formed and a temperature responsive gel has proved valuable as an effective protein delivery systems.

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이하에서는 본 발명을 더 상세하게 설명한다. The following describes in more detail the present invention.

본 발명의 한 양태에서는 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류로 이루어진 복합 코아세르베이트 및 염석 염을 함유하는 네거티브 온도 가역성 다당류의 조합으로 이루어지는 약물 전달용 겔을 제공한다. Strip a positive charge in the one aspect of the invention provides a drug delivery gel for a preparation of a negative temperature reversible polysaccharide containing a complex coacervate and salting out salts consisting of polysaccharides are negatively charged and the protein bands.

본 발명에 의하여 효과적으로 전달되는 약물의 종류는 제한되지 않는다. The type of drug delivered by the present invention effective is not limited. 생체 내 전달이 요구되는 어떠한 약물도 본 발명의 겔을 사용하여 전달될 수 있다. Any drug that requires in vivo delivery can also be delivered using the gel of the present invention. 바람직하게는 약물은 치료 용도의 단백질 또는 유전자 제제이다. Preferably the drug is a protein or a gene formulation of the therapeutic applications.

양전하를 띠는 단백질은 복합 코아세르베이트의 생성에 통상적으로 사용되는 임의의 단백질이다. Band are the positively charged protein is any protein that is commonly used in the production of complex coacervate. 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 양전하를 띠는 단백질의 예는 젤라틴, 소 이자 트립시노겐, 달걀 리소자임, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 피브로넥틴, 아그레칸, 카제인 등이 있다. Examples of the protein bands with a positive charge can be preferably used in the present invention include gelatin, and bovine trypsinogen, egg lysozyme, basic fibroblast growth factor, fibronectin, Oh Grace compartment, casein.

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가장 바람직하게는, 양전하를 띠는 단백질은 젤라틴이다. Most preferably, the strip positively charged protein is a gelatin.

음전하를 띠는 다당류는 복합 코아세르베이트의 생성에 통상적으로 사용되는 임의의 천연 다당류일 수 있다. Is negatively charged polysaccharides may be of any natural polysaccharide commonly used in the production of composite coacervate. 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 음전하를 띠는 다당류의 예는 콘드로이틴 황산염, 헤파린/헤파란 설페이트(HS), 히알루로난, 데르마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 등이 사용될 수 있다. Examples of preferably negatively charged polysaccharides which can be used in the present invention may be used, such as chondroitin sulfate, heparin / heparan sulfate (HS), I hyaluronidase, der dermatan sulfate, Kane Ratan sulfate.

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가장 바람직하게는, 음전하를 띠는 다당류는 콘드로이틴 6-황산염이다. Most preferably, the negatively charged polysaccharide is chondroitin 6-sulfate.

가장 안정한 복합 코아세르베이트의 형성을 위한, 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류 사이의 구성 비율은 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 복합 코아세르베이트 형성 정도가 가장 우수한 비율을 측정할 수 있다. The strip - that is, the formation of a stable complex coacervate, a positive charge may measure the composition ratio is the highest ratio degree complex coacervate formed using any method known to those skilled in the art between the protein and the negatively charged polysaccharide is band. 바람직하게는, 구성 비율은 코아세르베이트 형성 혼합물의 혼탁도를 측정함에 의하여 결정할 수 있다. Preferably, the constituent ratio can be determined by measuring the turbidity of the mixture as coacervate formation.

본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 네거티브 온도 가역성 다당류의 예는 메틸 셀룰로스(MC), 히드록시프로필 메틸 셀룰로스(HPMC), 에틸히드록시에틸셀룰로스(EHEC), 카라기난, 스클레로글루칸 등이 사용될 수 있다. Examples of preferred negative-temperature reversible polysaccharide that may be used with the present invention can be used include methyl cellulose (MC), hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), ethyl hydroxyethyl cellulose (EHEC), carrageenan, by bus Klee glucan . 바람직하게는, 네거티브 온도 가역성 다당류는 메틸 셀룰로스이다. Preferably, the negative-temperature reversible polysaccharide is a methylcellulose.

본 발명에서 네거티브 온도 가역성 다당류에는 겔화 온도를 낮추기 위하여 염석 염을 첨가한다. The present invention salting out salts are added to lower the negative-temperature reversible polysaccharide gelling temperature is in. 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있는 염석 염의 예는 암모늄 설페이트, 소듐 도데실 설페이트, 글리세로포스페이트, 소듐 카르보네이트, 소듐 퍼클로레이트, 황산, 탄산수소나트륨 등이 있다. Salting-out salts for example, which can be preferably used in the present invention include ammonium sulfate, sodium dodecyl sulfate, glycerophosphate, sodium carbonate, sodium perchlorate, sulfuric acid, sodium hydrogen carbonate. 사용되는 염석 염의 종류는 다당류의 종류 및 특성에 따라 선택될 수 있다. Salting out salt type to be used may be selected according to the type and properties of the polysaccharide. 본 발명에서는 암모늄 설페이트가 가장 바람직하다. In the present invention, it is most preferably an ammonium sulphate.

본 발명의 다른 양태에서는 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류를 혼합하여 복합 코아세르베이트를 형성하는 단계, 및 복합코아세르베이트를 염석 염을 함유하는 네거티브 온도 가역성 다당류에 혼합하는 단계를 포함하는 약물 전달용 조합 겔의 제조방법을 제공한다. Strip a positive charge in the other aspects of the invention for drug delivery, including the step of mixing the negative-temperature reversible polysaccharide containing a salt salting out the step of forming a complex coacervate by mixing the polysaccharide is band-protein and negatively charged, and the composite coacervate It provides a process for the preparation of a combination gel.

복합 코아세르베이트의 형성 및 복합 코아세르베이트와 네거티브 온도 가역성 다당류의 조합 겔의 형성 조건은 성분의 선택에 따라 온도와 완충액을 적당하게 선택하여 혼합하는 당업계에 잘 알려진 임의의 어떤 방법을 사용하여도 무관하다. Formation conditions of the complex coacervate is formed and the complex coacervate combination with the gel of the negative-temperature reversible polysaccharide is also independent of using the temperature and any any method well-known in the art of mixing to properly select the buffer according to the choice of components.

당업자는 구체적 구성성분에 따라 조건을 변화시켜가며 가장 안정한 코아세르베이트를 형성할 수 있다. Those skilled in the art to varying conditions based on the specific constituents can form the most stable coacervate.

본 발명의 또 다른 양태에서는 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류를 혼합하여 복합 코아세르베이트를 형성하는 단계, 복합코아세르베이트를 염석 염을 함유하는 네거티브 온도 가역성 다당류에 혼합하는 단계, 및 목적하는 약물을 혼합하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조합 겔의 제조방법을 제공한다. Strip a positive charge In another aspect of the invention is a step, and the objective substance for mixing the negative-temperature reversible polysaccharide containing a salt salting out the step of forming a complex coacervate by mixing the polysaccharide is band-protein and negatively charged, complex coacervate It provides a process for the preparation of a gel for combination drug delivery comprising a step of mixing.

본 발명에 따르는 복합 코아세르베이트와 온도-가역적 고분자 겔로 이루어진 최적화된 신규 약물 전달 시스템을 사용하면, 효과적으로 체내로 단백질 약물을 전달할 수 있다. Complex coacervate and temperature according to the invention using a reversible polymer gel comprising optimizing the novel drug delivery system, can effectively deliver the protein drug in vivo.

또한, 본 발명의 방법에 따라 제조되는 온도 가역적 복합 코아세르베이트 겔은 복합 코아세르베이트와 온도 가역적 고분자가 화학적으로 가교 결합되지 않고 물리적으로 조합되어 생분해성 및 생적합성이 뛰어나고 반응과정이 단순하여 용이하게 제조될 수 있다. Further, the temperature of reversibly complex coacervate gel is prepared according to the process of this invention composite coacervate and temperature reversible polymer is not bonded chemically cross-linked to be physically combined in a biodegradable and biocompatible are excellent in the course of the reaction can be easily produced by simple have.

또한, 본 발명에 따르는 전달시스템은 투여가 용이하고, 독성 유기용매 없는 수성환경의 관점에서도 장점을 가진다. Furthermore, the delivery system according to the invention has the advantage in terms of water-based environment without the administration is easy, and toxic organic solvents.

본 발명의 생분해가능하고 온도-가역적인 주사용 물리적 겔은, 2개의 대전된 생체 거대분자들 간의 복합 코아세르베이트를 형성한 후, 염석 염을 함유한 네거티브 온도 감응성 다당류와 함께 공동제형화함으로써 제조되었다. Biodegradable, and temperature of the present invention using a reversible state physical gel, was prepared by co-formulated with two one charged form a complex coacervate between biomacromolecule and then, the negative containing a salting-out salt thermosensitive polysaccharide.

이와 같이 제조된 생분해가 가능하고 온도-가역적인 본 발명의 겔은 래트에 피하주사한 후 곧 구형 디포가 형성되는데, 그 디포의 형태와 굳기는 1주일간 견실히 유지되었다. Thus the biodegradability is available and the temperature produced-gel of the present invention is reversible after subcutaneous injection in rats there is immediately formed a spherical depot, the depot form of the stiffness was maintained for one week steadily.

복합 코아세르베이트와 온도-가역적 겔의 조합물은 단백질의 방출속도 및 인시튜 겔 디포 형성에서 상승효과를 입증하였다. Complex coacervate and temperature combination of the reversible gel has demonstrated a synergistic effect on the release rate and in-situ gelling depot form of the protein. 겔은 모델 단백질이 초기의 최소 방출개시후 25일에 걸쳐 지속적으로 방출되는 패턴을 보인다. The gel shows a pattern model protein is released continuously over a period of at least after the start of the release of the initial 25 days. 지속적인 단백질 방출을 위해서, 등전위점(pI)에 따라 대전된 고분자전해질을 가지는 안정한 복합 코아세르베이트가 제공되었고, 염석 염을 함유한 네거티브 온도 감응성 다당류 (본 실시예에서는 MC 겔)과 함께 동시적으로 제형화되었다. For the sustained protein release, it was provided in a stable complex coacervate having a polymer electrolyte charged according to the isoelectric point (pI), formulated simultaneously with a negative temperature-sensitive polysaccharides (MC gel in the present embodiment) containing a salting-out salt It was.

복합 코아세르베이트 형성 및 온도 반응성의 2가지 장점을 가지는 본 발명의 최적화된 신규의 인시튜 겔 디포 시스템이 개발되었다. The novel in situ gelling depot system optimized according to the present invention has the two advantages of the complex coacervate is formed and a temperature-reactive been developed. 이러한 시스템은 투여의 용이성, 독성 유기용매가 없는 수성 환경, 및 제조방법의 단순화 측면에서 효과적인 단백질 약물전달 용도로의 가치를 입증하였다. This system proved to be an effective value of the protein drug delivery purposes the ease, simplicity toxic side of the organic solvent is not water-based environments, and methods of administration.

1. GA와 CS간의 복합 코아세르베이트 형성 1. complex coacervate formed between GA and CS

pH7.4에서 젤라틴과 콘드로이틴 6-황산염(CS) 간의 다이온성(polyionic) 복 합체형성(복합 코아세르베이트)을 평가하는 간단한 방법으로서, 450nm에서의 흡광도에 의해 혼합용액의 혼탁도(turbidity)를 측정하여 젤라틴과 CS간의 최적 비율을 찾아내어 안정한 복합 코아세르베이트를 형성시켰다. A simple method of evaluating gelatin and chondroitin 6-sulfate (CS) die-ionic (polyionic) repeat polymer formed (complex coacervate) between at pH7.4, by measuring the turbidity (turbidity) of the mixed solution by the absorbance at 450nm It finds the optimal ratio between the gelatin and the CS to form a stable complex coacervate.

도 1은 25℃의 PBS(pH7.4)에서 다양한 농도의 젤라틴과 CS 혼합물에 대한 혼탁측정 적정곡선을 도시한 것이다. Figure 1 shows the turbidity measurement for a titration curve CS gelatin and mixtures of various concentrations in PBS (pH7.4) for 25 ℃. 적정에 양이온성 GA를 사용하였을 경우, 혼합용액은 CS/GA 중량비0.1에서 최대 혼탁도를 나타내었으며, 이는 복합체 형성시간이 경과됨에 따라 증가되었다. Case of using the cationic GA titration, a mixed solution is also exhibited a maximum opacity in the CS / GA weight ratio of 0.1, which was increased as the complexing time. 그러나, 예상대로, 음이온성(anionic) GB는 pH7.4에서 CS와 함께 코아세르베이트를 형성하지는 않았다. However, as expected, anionic (anionic) GB did not form a coacervate with CS at pH7.4.

Bungenberg de Jong 은 상분리(Phase separation) 현상을 보고한 바 있는데, 이는 2개의 대전된 분자들이 상호작용을 하고 용매가 미약한 생중합체 상(biopolymer phase)을 형성한다는 것이다 (Kimberly EB, Arthritis & Rheumatism (1998) 2185-2195). Bungenberg de Jong is phase separated (Phase separation) there reported the phenomenon bar, which is that the two charged molecules interact and solvent forms a phase the weak raw polymer (biopolymer phase) (Kimberly EB, Arthritis & Rheumatism ( 1998) 2185-2195). 생중합체들간의 주된 상호작용은 pH와 이온농도값에 따른 정전기 의존성이며, 복합 코아세르베이트에 영향을 주는 현저한 요인은 전하이다. The primary interaction between the raw polymer is a static dependency according to the pH and ionic concentration value, is a significant factor that affects the complex coacervate is a charge.

도 2는 점도 및 유량계(rheometer)로 측정한 GA와 CS 코아세르베이트간의 겔형성시간을 도시한다. Figure 2 shows the gel-forming time between a CS and GA coacervate measured by viscosity and flow meter (rheometer). GA와 CS로 형성된 코아세르베이트 혼합물에 대해서, 25℃에서 점도가 급상승하였다. For the coacervate mixture formed by GA and CS, it was rising, the viscosity at 25 ℃. 그러나, 혼합물이 37℃로 가열되었을 때, 점도가 현저히 감소되고 코아세르베이트 겔이 졸 상태로 변환되었다. However, when the mixture was heated to 37 ℃, and the viscosity is markedly reduced the coacervate gel was converted into a sol state. 젤라틴이 온도 상승에 따라 점도의 감소를 나타내는 포지티브 열-감응성 바이오폴리머이기 때문에, 젤라틴의 단백질 사슬 활동도(mobility)는 37℃에서 증가하였으며, 이는 GA와 CS간의 코아세르베이트 겔 파괴를 초래한다. Gelatin is a positive column that indicates the decrease in the viscosity with the temperature rise - because it is sensitive biopolymers, Protein chain activity of gelatin (mobility) was increased from 37 ℃, which results in gel destruction coacervate between GA and CS. 이러한 결과에 이르기까지 본 방법을 사용하여 나머 지 실험을 수행하였다. Using this method, from these results it was carried out the remaining experiments.

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2. 네거티브 온도-가역적 메틸셀룰로스 (MC) 겔의 제조 2. The negative-temperature-reversible methylcellulose (MC) Preparation of the gel

상기와 같은 특성을 가지는 복합 코아세르베이트를 약물전달 시스템, 특히 인시튜 형성 겔에 적용시키기 위해서, 상기 복합체는 안정해야 하고 체온에서 순간 점성 겔을 형성할 수 있어야 한다. In order to apply a complex coacervate having the same characteristics as the drug delivery system, especially in-situ gel formation, the complex must be capable of forming a viscous gel time at body temperature and must be stable. MC겔을 혼입형 복합 코아세르베이트와 함께 주사용 제형으로 테스트하였다. The MC gel with a mixed composite coacervate was tested as injectable formulation. 실온에서 MC 수용액은 투명한 졸 상태이다. MC aqueous solution at room temperature is a clear sol. 약 50℃로 가열하면, 용액은 불투명한 겔이 된다. When heated to about 50 ℃, the solution is an opaque gel. 편의상, MC 겔화 온도는 농도를 조절하거나 예컨대 중합체, 고분자 전해질 또는 염과 같은 첨가제를 사용하여 저하시킬 수 있다. For convenience, MC gelation temperature may adjust the density or decreased, for example by using an additive such as a polymer, polymer electrolyte, or salt thereof. MC 농도를 증가시켜 겔화 온도를 체온 이하로 저하시키는 방법은 점도를 제한하게 되어 취급이 어려워져 바람직하지 않다. A method for increasing the concentration of MC lower the gelation temperature to below the body temperature is to limit the viscosity which is not preferable handling becomes difficult.

겔화 온도를 저하시킬 목적으로, 예컨대 AS와 같은 염석 염을 첨가하는 것은 MC 수용액의 겔화 온도를 저하시키는 간단하고도 효과적인 방법이다. For the purpose of lowering the gelling temperature, for example to add a salting-out salt such as AS is a simple and effective way to lower the gelling temperature of MC solution.

도 3은 2중량% MC 용액의 겔화 온도를 AS농도의 함수로서 도시한 것이다. 3 is a gelling temperature of 2 wt.% MC solution was plotted as a function of the concentration of AS. AS농도가 상승함에 따라, 겔화 온도는 급격히 저하되어 MC가 5% 및 9%일 때 겔화 온도는 각각 37 ℃ 및 29 ℃가 된다. As the AS concentration increases, the gelling temperature is rapidly decreased when the MC by 5% and 9%, the gelling temperature is a 37 ℃ and 29 ℃ respectively.

2.2. 2.2. 복합 코아세르베이트를 함유하는 온도-가역적 겔의 최적화 Temperature containing complex coacervate-optimization of the reversible gel

GA-CS 복합 코아세르베이트를 함유하는 온도-가역적 겔을 제조하기 위해, 다양한 비율의 GA 및 CS 혼합물들을 AS가 9% 함유된 2중량% MC 용액에 첨가하여, 체온 부근의 온도에서 졸 상태로부터 겔 상태로 변성시켰다. GA-CS temperature containing complex coacervate - to produce a reversible gel, and AS is added to the 2 wt.% MC solution containing 9% of GA and CS mixtures of various ratios, gel from the sol state at a temperature near the body temperature, It was modified with.

시판되는 GA에는 분자량 분포가 불균일하기 때문에, 체온 부근의 온도에서 안정한 겔을 형성하기가 어렵다. GA is commercially available is because the molecular weight distribution is non-uniform, it is difficult to form a stable gel at a temperature near the body temperature. 이러한 목적으로, 에탄올 용해에 의해 고분자량 GA를 제조하였고 이것을 사용하여 MC 겔을 함유하는 복합 코아세르베이트를 제조하였다. To this end, the high-molecular weight was prepared by dissolving in ethanol GA to prepare a complex coacervate to use it contains a MC gel.

도 4a는 pH7.4의 PBS에서 다양한 농도의 고분자량 GA (HMw GA) 및 CS의 혼탁도 측정 적정곡선을 도시한 것이다. Figure 4a illustrates the different concentrations of high molecular weight GA (GA HMw) and measuring the titration curve turbidity of CS in PBS pH7.4. 고분자량 GA (HMw GA)를 사용하여 적정할 때, 혼합용액은 최대 혼탁도를 나타내며, 이는 복합체 형성 시간에 따라 상승한다. The high molecular weight when titrated using a GA (HMw GA), the mixed solution represents the maximum turbidity, which rises as the complexing time.

도 4b에서, HMw GA/CS의 안정한 복합 코아세르베이트가 적정 중량비 1에서 형성됨에 따라 혼탁도는 급격히 상승한다. In Figure 4b, and turbidity it is rapidly increased in accordance with the stable complex coacervate of HMw GA / CS is formed at an appropriate weight ratio of 1. 유의적인 점은, MC를 코아세르베이트와 혼합했을 때, 혼탁도가 코아세르베이트보다 높았다는 점이며, 이는 복합 코아세르베이트 형성에 대한 MC의 시너지 효과를 입증하는 것이다. Significant point is, when mixing the coacervate and the MC, and that the turbidity is higher than the coacervate, which proves the synergy effect of MC on the complex coacervate formation.

코아세르베이트 유무와 관련된 다양한 겔 제형의 농도를 25℃ 와 37℃에서 비교하였다. The concentration of various gel formulations was compared in the presence or absence relating to coacervate 25 ℃ and 37 ℃. 최적 비율의 CS/GA코아세르베이트 유무와 관련된 MC및 AS 혼합용액은 25℃에서 졸 상태였고, 37℃에서 안정한 겔 상태였다. MC and AS mixed solution related to CS / GA coacervate presence or absence of the optimum ratio in the sol was 25 ℃, was a stable gel at 37 ℃. 그러나, 코아세르베이트의 겔 농도는 보통의 겔보다 낮았으며, 이는 젤라틴에 의해 탄력성이 증가되었기 때문인 것으로 추정되었다. However, the coacervate gel concentration was lower than is usually a gel, which was estimated to be due to the increased resiliency by the gelatin.

3 시험관 내 방출 연구 3 In vitro studies released

3.1. 3.1. FITC-BSA 방출시험 FITC-BSA release test

도 7에 도시된 바와 같이, 겔로부터 모델 단백질 FITC-BSA의 방출 프로필에서는 초기의 최소 방출로부터 25일간에 걸쳐 지속적인 방출 패턴을 시사하였다. 7, the release profile of the model protein, FITC-BSA from the gel, suggesting a sustained release pattern over a 25 days from the initial minimum emissions. CS와 GA를 다양한 비율로 포함하는 겔(gel)들중에서는 방출 속도에 있어서 현저한 차이가 없었지만, 코아세르베이트를 함유한 조합 겔로부터의 방출속도는 통상의 MC 및 AS 겔보다 약간 빠르며, 이는 점도측정으로부터 예견되었던 바이다. Among the gel (gel) containing the CS and GA at various ratios are I did not have a significant difference in the release rate, the release rate from the combination gel containing the coacervate is slightly faster than conventional MC and AS gel, which from the viscosity measurement bayida been foreseen. 그러나, 코아세르베이트를 함유한 조합 겔로부터의 방출특성이 장기간에 걸쳐 지속적인 패턴을 나타내고 겔이 더욱 탄력적으로 되어 피하주사 후에 통증과 염증유발을 줄일 수 있게 된다는 것은 언급할 필요가 있다. However, the release properties from the combination gel containing the coacervate represents a continuous pattern over a long period of time the gel is more resilient after subcutaneous injection To be able to reduce pain and inflammation, it is necessary to mention. 방출시험의 약 30일 후, 겔은 투명한 용액으로 변환된다. After about 30 days of the release test, the gel is converted to a clear solution.

3.2. 3.2. 젤라틴 A 방출시험 Gelatin A release test

FITC-BSA 방출 및 점도 결과에서는, GA와 CS 코아세르베이트의 혼입이 보통의 MC 겔에 비해 MC 겔의 점도를 저하시키고, FITC-BSA 방출을 증가시키는 것으로 시사되었으므로, 모델 단백질의 방출속도는 안정한 복합 코아세르베이트가 대전된 고분자 전해질과 함께 형성되어 MC겔에 부수적으로 첨가될 때 지체될 수 있다는 가설이 성립될 수 있다. The FITC-BSA release and viscosity results because suggested that for the incorporation of GA and CS coacervate compared to normal MC gel and reduce the viscosity of the MC gel, increasing the FITC-BSA released, the release rate of the model protein is stable complex coacervate is formed with the charged polyelectrolyte has a hypothesis that can be delayed when the attendant added to the MC gel can be established.

이러한 가설을 테스트하기 위해, GA/CS 코아세르베이트를 함유하는 MC 조합 겔로부터 모델 단백질로서의 GA의 방출속도를 측정하였다. To test this hypothesis, it was measured as the rate of release of model proteins from GA MC combination gel containing a GA / CS coacervate. 도 6에 도시된 바와 같이, 코아세르베이트를 CS/GA 비율 0.1로 함유하는 MC 조합 겔로부터 GA의 방출속도는, 보통의 MC 겔보다 느리고, 코아세르베이트를 비-최적(non-optimum) 비율로 함유하는 MC 조합 겔보다 훨씬 느리다. , The release rate of the GA the coacervate from the MC combination gel containing a CS / GA ratio of 0.1, as shown in Figure 6, the slow, coacervate than normal MC gel ratio - MC containing the optimal (non-optimum) ratio much slower than the combined gel. 감소된 방출속도는 단백질 조절방출에 대한 복합 코아세르베이트 및 온도-가역적 겔의 상승적 효과를 시사한다. The reduced release rate is a complex coacervate and the temperature of the protein controlled release - suggesting a synergistic effect of the reversible gel.

4. 생체 내 겔 디포 형성 (In vivo gel depot formation) 4. The living body forming a gel depot within the (In vivo depot gel formation)

도 8에 도시된 바와 같이, 26GX게이지 주사기를 사용하여 다양한 MC 겔 제형들[(a) MC+AS, (b) MC+AS+GA, and (c) MC+AS+CS/GA(=0.1)]을 래트의 등에 피하주사하고, 곧 구형 디포의 형성을 관찰하였다. As it is shown in Figure 8, using the 26GX gauge syringe various MC gel formulations [(a) MC + AS, (b) MC + AS + GA, and (c) MC + AS + CS / GA (= 0.1 ) a subcutaneous injection or the like in the rat, which was soon observed the formation of a spherical depot. 디포의 형태와 굳기는 코아세르베이트를 함유(MC+AS+CS/GA(=0.1))하는 MC 조합 겔과 함께 견실히 유지되었다. Depot forms and the hardness was maintained Hi solid with a combination gel containing MC (MC + AS + CS / GA (= 0.1)) the coacervate.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. The present invention will be described in more detail through the following examples. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다. But it is not intended to limit the scope of the invention to such embodiments.

<실시예> <Example>

재료 및 시약 Materials and Reagents

메틸셀룰로오스(MC, M n = 86,000, 점도 = 4,000 cps), 젤라틴 타입 A (GA, PI = 8.6, 산-처리된 조직 (Bloom No. 300)으로부터 유래된 돼지 가죽에서 채취), 젤라틴 타입 B (GB, PI = 4.7, from 산-처리된 조직 (Bloom No. 300)으로부터 유래된 소 가죽에서 채취), 콘드로틴(chondroitin) 6-황산염(sulfate)(CS, 상어 연골조직으로부터 유래됨), 플루오레세인 이소티오시안산염으로 콘주게이트된 우혈청알부민(FITC-BSA), 및 황산암모늄(AS)을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. Methyl cellulose (MC, M n = 86,000, viscosity = 4,000 cps), gelatin type A (GA, PI = 8.6, acid-treated tissue (obtained from a pig skin-derived from Bloom No. 300)), Type B gelatin ( GB, PI = 4.7, from acid-treated tissue taken from the leather derived from (Bloom No. 300)), corned rotin (chondroitin) 6- sulfate (sulfate) (CS, being derived from shark cartilage), fluoro the fluorescein-isothiocyanate conjugated with a cyanate bovine serum albumin (FITC-BSA), and ammonium sulfate (aS) was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 모든 다른 화합물들은 분석용 등급이었다. All other compounds were analytical grade.

실시예 1. 복합 코아세르베이트 형성 및 혼탁도( turbidity ) 측정 Example 1: composite coacervate formation and turbidity (turbidity) measurement

1.1. 1.1. 고분자량 젤라틴 용액의 제조 And producing a molecular weight gelatin solution

변형된 에탄올 탈용매법(ethanol desolvation method)에 따라 에탄올 고분자량 젤라틴 용액을 제조하였다. Ethanol high molecular weight gelatin solution in accordance with the modified ethanol desolvation method (ethanol desolvation method) was prepared. GA를 50℃의 PBS에 용해시키고, 같은 분량의 에탄올을 가하여 용매를 휘발시킨 후 고분자량 젤라틴을 침전시켰다. GA was dissolved in 50 of PBS and ℃, evaporation of the solvent was added to the same volume of ethanol to precipitate the high molecular weight gelatin. 상층액을 따라내고 침전물을 50℃의 PBS에 재용해시켰다. Decanted the supernatant and the precipitate redissolved in 50 ℃ PBS.

1.2. 1.2. 복합 코아세르베이트 형성 및 혼탁도(turbidity) 측정 Complex coacervate formation and turbidity (turbidity) measurement

GA 또는 4 중량% 고분자량 GA를 pH 7.4, 50℃의 PBS에 1시간동안 용해시켰다. A GA or GA 4% by weight of a high molecular weight is dissolved for one hour in pH 7.4, PBS for 50 ℃. pH 7.4의 PBS 중의 CS를 다양한 중량 비율로 젤라틴 용액과 혼합하였다 (CS/GA = 0.002, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 및 1.0). Was mixed with a gelatin solution of pH 7.4 PBS by CS in different weight ratios (CS / GA = 0.002, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 and 1.0). 혼합물 용액의 혼탁도 증가를 450 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다(DU 730, Life science UV/Vis spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). An increase in turbidity of the mixture solution was measured by the absorbance at 450 nm (DU 730, Life science UV / Vis spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

실시예 2. 온도 가역적 복합 코아세르베이트 조합 겔의 제조 Example 2. Preparation of a reversible complex coacervate temperature combinations gel

2.1. 2.1. 메틸셀룰로오스 수용액의 제조 Preparation of methyl cellulose aqueous solution

MC 분말을 90℃로 예열된 필요량 절반 가량의 인산염 완충 식염수(PBS)에 분산시키고 완전히 젖을 때까지 저어서 순수 0.3-2.5 중량% MC 용액을 제조하였다. The MC powder was prepared stir pure 0.3-2.5 wt% MC solution until the dispersion in the required amount of phosphate buffered saline (PBS), about half of the pre-heated to 90 ℃ were completely wet. 잔여 분량의 냉 PBS를 첨가하고 혼합물을 빙냉조에서 30분간 서서히 교반하여 무색 투명한 용액을 제조하였다. By the addition of cold PBS and the amount of the remaining 30 minutes slowly stirred on an ice naengjo the mixture to prepare a colorless transparent solution. 용액을 잘 흔들어 냉동하였다. The solution was frozen shake.

2.2.열가역적 복합 코아세르베이트 조합 겔의 제조 2.2 Preparation of the heat reversible complex coacervate combination of gel

25-60℃ 온도범위에 걸쳐서 5분 간격으로 0.5℃씩 온도를 상승시키면서 튜브 전환법(tube inverting method)에 의해 0.3-2.5 중량% MC 수용액의 겔화 온도를 측정하였다. Over a period of 25-60 ℃ temperature range it was measured from 0.3 to 2.5% by weight of the gelling temperature of MC aqueous solution by the tube conversion method (inverting tube method), while raising the temperature by 0.5 ℃ at 5-minute intervals. 염석 염작용제 AS를 MC 용액에 가하여 동일한 방법으로 유의적 젤라틴 겔화 온도를 측정하였다. A salting-out agent added salt AS in MC solution was measured significantly gelatin gelation temperature in the same way.

조합 겔을 제조하기 위해, 양이온성 GA 및 음이온성 CS로 이루어진 복합 코아세르베이트를 AS함유 MC용액에 가하였다. To prepare the combination of a gel, a complex coacervate made of a cationic and an anionic CS GA was added to the AS-containing MC solution. 혼합 용액을 실온에서 5-10분간 와동시키고 37°C 의 수조에서 인큐베이션하였다. 5-10 minutes to a mixture at room temperature, vortex and incubated in a 37 ° C water bath.

실시예 3. 겔 형성 및 점도 측정 Example 3: gel-forming and viscosity measurement

박동성 혈류계 (Bohlin, Malvern, UK)를 사용하여, 0-60℃의 온도범위 이내에서 원추형 및 평판형 기하학적(cone and plate geometry) 방법으로 다양한 온도에서의 겔 형성 및 점도 측정을 수행하였다. Using a pulsatile blood flow system (Bohlin, Malvern, UK), it was performed to form the gel and measuring the viscosity at different temperatures within the temperature range of 0-60 ℃ the cone and plate type geometry (cone and plate geometry) method. 시료(500㎕)는 500㎛ 간격을 두고 분리된 2 개의 20mm 평행 플레이트 사이에 두었다. Sample (500㎕) was placed between two 20mm parallel plate with a gap separating the 500㎛.

실시예 4. 생체 내 방출특성 연구 Example 4. Study in vivo release characteristics

조합 겔들로부터 코아세르베이트 형성된 GA 및 FITC-BSA의 방출 특성을 37℃에서 측정하였다. GA and the release characteristics of FITC-BSA coacervate formed from the combination geldeul was measured at 37 ℃. 4 중량% 고분자량 GA와 0.4 중량% CS로부터 조합 겔을 제조하고, 9 중량% AS 를 함유하는 2 중량% MC와 공동-제형화하였다. 4% by weight of high molecular weight with 0.4% GA and 2 parts by weight to prepare a gel from a combined weight% CS, and containing 9% by weight of AS cavity MC were formulated. 겔 수용액에 FITC-BSA를 첨가하였다. The FITC-BSA was added to the gel solution. 시료 바이알(vial)를 37℃의 수조에 놓아 두어서 겔을 형성시키고, pH 7.4의 미리 가온시킨 PBS를 덮은 후 150rpm으로 진동시켰다. Sample vial (vial) and the formation and release by placing the gel in a water bath at 37 ℃, and then covered with PBS were pre-warmed at pH 7.4 was vibrated in 150rpm. 예정 시간 간격에, 매질을 방출하여 흘려보내고 새 완충액으로 교체하였다. At the scheduled time interval, sluices to release the medium was replaced with a new buffer. UV 스펙트로포토미터로 단백질 농도를 측정하였다. A UV spectrophotometer to measure the protein concentration.

실시예 5. 생체 내 실험 Example 5. In vivo experiments

염산케타민(90mg/kg)과 염산크실라진(5mh/kg)을 근육내 투여(90mg/kg)하여 Sprague-Dawley 래트(200-250g, SLC, 일본 도쿄)를 마취시켰다. A ketamine hydrochloride (90mg / kg) and hydrochloric acid xylanase binary (5mh / kg) administered to Sprague-Dawley rats (90mg / kg) (200-250g, SLC, Tokyo, Japan), the muscles were anesthetized. 이 실험동물의 모든 취급 및 관리는 미국 국립보건원(National Institute of Health) 발행 "실험동물의 관리와 활용에 관한 안내서(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"(NIH 간행물 85-23, 1985 개정)에 따라 수행하였다. All handling and management of these animals is the US National Institutes of Health (National Institute of Health) publication "Guide on the Management and Use of Laboratory Animals (the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)" (NIH publication 85-23, 1985 was carried out in accordance with amended).

다양한 제형((a) MC+AS, (b) MC+AS+GA, 및 (c) MC+AS+CS/GA (0.1)) 의 샘플(0.5 ml)을 26G X 1/2 게이지의 멸균된 피하주사용 주사기로 래트의 등에 피하주사하고, 주사 후에 회수하였다. Various formulations ((a) MC + AS, (b) MC + AS + GA, and (c) MC + AS + CS / GA (0.1)) Samples (0.5 ml) in a sterile 26G X 1/2 gauge of a hypodermic syringe such as hypodermic of the rats, which was then recovered after injection.

도 1는 젤라틴 타입 A 및 타입 B와 CS 사이의 혼합물의 혼탁도 측정용 적정을 나타내는 그래프이다. Figure 1 is a graph showing the titration for measuring turbidity of the mixture between gelatin type A and type B and CS. 도 1a는 젤라틴 A를 도 1b는 젤라틴 B를 사용하여 25℃의 PBS(pH7.4)중의 다양한 농도에서 젤라틴과 CS혼합물의 혼탁도 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. Figure 1a to Figure 1b gelatin A is represented by the graph in FIG measured turbidity of gelatin and CS mixture in various concentrations in PBS (pH7.4) at 25 ℃ using gelatin B. ( ● : 6시간, ○ : 12시간, ▼ : 24시간 ) (●: 6 hours, ○: 12 hours, ▼: 24 hours)

도 2는 25℃ 및 37 ℃에서 혈류계에 의한 점도 및 겔 형성시간 측정한 그래프이다. Figure 2 is a graph showing the viscosity and gel formation time measurement by the rheometer at 25 ℃ and 37 ℃. 점도 및 젤 형성 시간은 스트레인이 탄성 성분으로서의 탄성 고체내에서 회수될 때의 에너지의 탄성적 축적을 표현하는 저장계수, 및 흐름의 영구 변형을 통해 에너지의 점성 소실(손실)을 표현하는 손실계수로 나타낸다. The viscosity and gel formation time in the loss factor of the strain to express viscous dissipation or loss of energy through a permanent deformation of the storage modulus, and flows representing the elastic storage of energy when the number of times in the as elastic solid elastomeric component It represents.

도 3은 MC 용액 겔화 온도에 미치는 AS 농도의 영향을 나타낸다. Figure 3 shows the impact of concentration on the MC solution AS gelling temperature. AS 농도에 대한 2% MC 용액의 겔화 온도를 함수로 나타낸 그래프이다. A graph showing the 2% gelling temperature of MC solution concentration as a function of the AS.

도 4는 고분자량 젤라틴 및 CS에 의한 복합 코아세르베이트 형성시 시간 경과에 따르는 혼탁도를 측정한 그래프이다. Figure 4 is a graph measuring the turbidity according to the time when forming the composite by the coacervate high molecular weight gelatin and CS. 도 4a는 PBS(pH7.4) 중의 다양한 농도에서 고분자량 젤라틴 및 CS 코아세르베이트 혼합물의 혼탁도를 시간 경과에 따라( ●:10min, ○:30min, ▼:1h, △:3h, ■:6h, □:12h, ◆:1d, ◇:2d ) 나타낸 것이고, 도 4b는 복합 코아세르베이트 및 온도 감응성 겔의 조합물의 혼탁도 측정 막대 그래프이다. Figure 4a PBS (pH7.4) and at various concentrations following the turbidity of the molecular weight gelatin and CS coacervate mixture to the time of the (●: 10min, ○: 30min, ▼: 1h, △: 3h, ■: 6h, □ : 12h, ◆: 1d, ◇: 2d) will shown, Figure 4b is a combination of opacity of the complex coacervate and a thermosensitive gel is measured histogram. ( 1 : HMw GA, 2: HMw GA/AS, 3 : MC/AS, 4 : HMw GA/MC, 5: HMw GA/MC/AS, 6 : CS/HMw GA(1), 7 : CS/HMw GA(1)/AS, 8 : CS/HMw GA(1)/MC/AS, 9 : CS/HMw GA(0.1), 10 : CS/HMw GA(0.1)/AS, 11 : CS/HMw GA(0.1)/MC/AS, 12 : CS/HMw GA(0.01), 13 : CS/HMw GA(0.01)/AS, 14 : CS/HMw GA(0.01)/MC/AS) (1: HMw GA, 2: HMw GA / AS, 3: MC / AS, 4: HMw GA / MC, 5: HMw GA / MC / AS, 6: CS / HMw GA (1), 7: CS / HMw GA (1) / AS, 8: CS / HMw GA (1) / MC / AS, 9: CS / HMw GA (0.1), 10: CS / HMw GA (0.1) / AS, 11: CS / HMw GA ( 0.1) / MC / AS, 12: CS / HMw GA (0.01), 13: CS / HMw GA (0.01) / AS, 14: CS / HMw GA (0.01) / MC / AS)

도 5는 온도 함수로서의 점도 및 겔 형성 시간을 나타내는 그래프이다. 5 is a graph showing the viscosity and gel formation time as a function of temperature. 25℃ 및 37 ℃에서 코아세르베이트 유무에 따른 다양한 겔 제형들의 점도를 나타낸다. At 25 ℃ and 37 ℃ shows the viscosity of various gel formulations according to the presence or absence coacervate. 도 5a는 MC/AS로 이루어진 겔 제형의 점도를 도 5b는 CS/HMw GA/MC/AS(0.4% HMw GA, CS/HMw GA(1), 2% MC, 9% AS)로 이루어진 겔 제형의 점도를 나타낸다. Figure 5a is a gel formulation comprising the viscosity of the gel formulation consisting of MC / AS in Figure 5b CS / HMw GA / MC / AS (0.4% HMw GA, CS / HMw GA (1), 2% MC, 9% AS) a represents the viscosity.

도 6. 젤라틴 방출을 시험한 결과를 나타내는 그래프이다. Figure 6. The graph shows the results of testing the release gelatin. GA와 CS간의 최적비 0.1로 코아세르베이트를 함유하는 MC조합 겔로부터 GA의 방출속도를 MC 겔로부터의 방출속도와 비교한 것이다. MC from the combination gel containing the coacervate to an optimum ratio of 0.1 between the GA and CS compares the release rate of the GA and the release rate from the MC gel. (●:HMw GA/MC/AS, ○: CS/HMw GA(2)/MC/AS, ▼: CS/HMw GA(1)/MC/AS) (●: HMw GA / MC / AS, ○: CS / HMw GA (2) / MC / AS, ▼: CS / HMw GA (1) / MC / AS)

도 7은 HMw GA-CS 코아세르베이트를 함유하는 네거티브 열감응성 겔의 방출시험결과를 도시한 것이다. Figure 7 shows the emission test results for the negative heat-sensitive gel containing the coacervate HMw GA-CS. 4% 젤라틴을 사용하였다. 4% gelatin were used. (△: HMw GA/MC/AS, ● CS/HMw GA(1)/MC/AS, ▼ CS/HMw GA(0.5)/MC/AS, ○ CS/HMw GA(0.1)/MC/AS, ■ CS/HMw GA(0.05)/MC/AS, □ CS/HMw GA(0.01)/MC/AS, ◆MC/AS) (△: HMw GA / MC / AS, ● CS / HMw GA (1) / MC / AS, ▼ CS / HMw GA (0.5) / MC / AS, ○ CS / HMw GA (0.1) / MC / AS, ■ CS / HMw GA (0.05) / MC / AS, □ CS / HMw GA (0.01) / MC / AS, ◆ MC / AS)

겔로부터 FITC-BSA 모델단백질의 방출특성, 25일간의 지속성 방출패턴을 시사함 Release characteristics of FITC-BSA model protein from the gel, also suggest the persistence of the release pattern 25 days

도 8은 열가역성 복합 코아세르베이트 겔인 다양한 MC 겔 제형((a) MC/AS, (b) MC/AS/GA, (c) MC/AS/CS/HMw GA(1))들을 래트의 등에 피하주사하였을 때 관찰되는 구형의 디포 형성의 사진이다. 8 is a heat reversible complex coacervate gel various MC gel dosage form ((a) MC / AS, (b) MC / AS / GA, (c) MC / AS / CS / HMw GA (1)) subcutaneous injection of the back of the rat when a photo of a depot form of the observed spherical.

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Claims (17)

  1. (a) 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류로 이루어진 복합 코아세르베이트 및 (b) 염석 염을 함유하는 네거티브 온도 가역성 다당류의 조합으로 이루어지는 약물 전달용 겔로서, 상기 양전하를 띠는 단백질은 젤라틴, 소 이자 트립시노겐, 달걀 리소자임, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 피브로넥틴, 아그레칸 및 카제인로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 음전하를 띠는 다당류는 콘드로이틴 황산염, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루로난, 데르마탄 설페이트 및 케라탄 설페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 염석 염은 SO 4 2- , HPO 4 2- , F - , Cl - , Br - , NO3 - , I - , ClO 4 - 및 SCN - 로부터 선택되는 호프마이스터 시리즈 음이온을 포함하는 염석염으로부터 선택되고, 상기 네거티브 온도 가역성 다당류는 메틸 셀룰로스, 히드록시프로 (A) band for positive charge is a gel for drug delivery comprising a combination of a negative-temperature reversible polysaccharide containing a complex coacervate and (b) a salting-out salt consisting of polysaccharide bands of protein and negative charges, the protein band of the positive charge is gelatin, small and trypsinogen, egg lysozyme is selected from basic fibroblast growth factor, fibronectin, ah upgrade Khan and a group consisting of casein, polysaccharides strip the negative charge of chondroitin sulfate, heparin, heparan I as sulfate, hyaluronic, der dermatan sulfate, and Ke is selected from the group consisting of sulfate, rattan, the salting out salt is SO 4 2-, HPO 4 2-, F -, Cl -, Br -, NO3 -, I -, ClO 4 - and SCN - selected from which is selected from the salting out salt containing hop Meister anion series, the negative temperature reversible polysaccharide is methyl cellulose, hydroxypropoxyl 메틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸셀룰로스, 카라기난 및 스클레로글루칸로 이루어지는 셀룰로스 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔. Methyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, carrageenan and Klee's gel for drug delivery, characterized in that the cellulose derivative is selected from consisting of a glucan.
  2. 제 1 항에 있어서, 약물은 단백질 제제인 것을 특징으로 하는 겔. The method of claim 1, wherein the drug is a gel characterized in that the protein preparation.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 양전하를 띠는 단백질은 젤라틴인 것을 특징으로 하는 겔. 3. A method according to claim 1 or 2 wherein the belt is positively charged protein gel, characterized in that the gelatin.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 음전하를 띠는 다당류는 콘드로이틴 6-황산염인 것을 특징으로 하는 겔. 3. A method according to claim 1 or 2, wherein the polysaccharides are negatively charged gel is characterized in that the chondroitin 6-sulfate.
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  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 셀룰로스 유도체는 메틸셀룰로스인 것을 특징으로 하는 겔. 3. A method according to claim 1 or 2, wherein the cellulose derivative is a gel, characterized in that methylcellulose.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염석염은 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 겔. 3. A method according to claim 1 or 2, wherein the salting out salt is a gel, characterized in that ammonium sulphate.
  8. (a) 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 다당류를 혼합하여 복합 코아세르베이트를 형성하는 단계; (A) the strip has a positive charge to form a complex coacervate by mixing the polysaccharide is a protein band with a negative charge;
    (b) 단계 (a)의 복합코아세르베이트를 염석 염을 함유하는 네거티브 온도 가역성 다당류에 혼합하는 단계를 포함하는 약물 전달용 겔의 제조방법으로서, 상기 양전하를 띠는 단백질은 젤라틴, 소 이자 트립시노겐, 달걀 리소자임, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 피브로넥틴, 아그레칸 및 카제인로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 음전하를 띠는 다당류는 콘드로이틴 황산염, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루로난, 데르마탄 설페이트 및 케라탄 설페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 염석 염은 SO 4 2- , HPO 4 2- , F - , Cl - , Br - , NO3 - , I - , ClO 4 - 및 SCN - 로부터 선택되는 호프마이스터 시리즈 음이온을 포함하는 염석염으로부터 선택되고, 상기 네거티브 온도 가역성 다당류는 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 에틸히드록시에 (B) A method for producing a gel for drug delivery comprising the step of mixing the complex coacervate of step (a) the negative-temperature reversible polysaccharide containing a salting-out salt, the protein band of the positive charge is gelatin, bovine and trypsinogen , egg lysozyme, basic fibroblast growth factor, fibronectin, ah upgrade Khan and is selected from the group consisting of casein, polysaccharides strip the negative is I as chondroitin sulfate, heparin, heparan sulfate, hyaluronic, der dermatan sulfate and Kane Ratan is selected from the group consisting of sulfate, the salting out salt is SO 4 2-, HPO 4 2-, F -, Cl -, Br -, NO3 -, I -, ClO 4 - and SCN - Hope Meister series anion selected from It is selected from the salting-out salt, the negative temperature reversible polysaccharide containing the methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, ethyl hydroxyethyl 틸셀룰로스, 카라기난 및 스클레로글루칸로 이루어지는 셀룰로스 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. Butyl cellulose, carrageenan and a method of manufacturing a gel for drug delivery, characterized in that the switch in Klee selected from cellulose derivatives comprising the glucan.
  9. 제 8 항에 있어서, 단계 (b) 이후에 목적하는 약물을 혼합하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. The method of claim 8 wherein step (b) the drug delivery method of producing a gel, characterized in that for mixing the drug of interest in the future.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 약물은 단백질인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. The method of claim 8 or claim 9 wherein the drug is a process for producing a gel for drug delivery, characterized in that protein.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 양전하를 띠는 단백질은 젤라틴인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. Claim 8 or claim 9, wherein the protein has a positive charge band A method of manufacturing a gel for drug delivery, characterized in that the gelatin.
  12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 음전하를 띠는 다당류는 콘드로이틴 6-황산염인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. Claim 8 or claim 9, wherein the polysaccharides are negatively charged the process for producing a gel for drug delivery, characterized in that chondroitin 6-sulfate.
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  14. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 셀룰로스 유도체는 메틸셀룰로스인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. The method of claim 8 or claim 9, wherein the cellulose derivative is a method of producing a gel for drug delivery, characterized in that methylcellulose.
  15. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 염석염은 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 겔의 제조방법. Claim 8 or claim 9, wherein the salting out salt is a method for producing a gel for drug delivery, characterized in that ammonium sulphate.
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