KR100783491B1 - 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터 - Google Patents

프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성 측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 포함하는 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성 측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터는 별도의 복잡한 과정을 거치지 않고도 세포의 형질전환 효율에 따른 프로모터 활성 측정 결과의 오류를 간편하게 보정함으로써 프로모터 활성을 단시간 내에 정확하게 측정할 수 있다.
프로모터, 벡터, 형광 단백질 유전자

Description

프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성 측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터{Vector for evaluating the activity of promoter, evaluating method using the same and promoter isolated by the method}
도 1은 본 발명에 따른 프로모터 활성 측정용 벡터 pRedEGFP의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 벡터를 이용하여 마우스 CD1d 프로모터의 활성을 측정한 결과이다.
A: 본 발명의 벡터에 삽입된 DNA 단편
B: 본 발명의 벡터로 형질전환한 Bcl-1 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다. TA는 녹색 형광 발현 정도를 붉은색 형광 발현 정도로 나누어 산출한 전사활성도이다.
C: 붉은색 형광을 나타내는 세포인 평형선 위쪽의 세포들의 녹색 형광 발현 정도를 나타낸 히스토그램이다.
도 3은 공지된 pCAT-인핸서 벡터를 이용하여 마우스 CDld 프로모터의 활성을 측정한 결과이다.
A: pCAT-인핸서 벡터에 삽입된 DNA 단편
B 및 C: pCAT-인핸서 벡터로 형질전환한 세포의 추출물을 CAT 효소 반응시킨 후 TCL로 분석한 결과이다.
CAT 컨트롤(-): 프로모터 부위가 없는 벡터
CAT 컨트롤(+): SV40 프로모터가 포함된 벡터
본 발명은 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성 측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 포함하는 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용한 프로모터 활성 측정방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터에 관한 것이다.
단백질의 합성은 DNA에 암호화된 유전 정보가 RNA로 복사되는 전사(transcription) 과정을 통해 개시된다. 상기 전사는 유전자의 상류에 위치한 프로모터에 RNA 중합효소가 결합함으로써 시작된다. 모든 프로모터의 염기서열은 완전히 동일하지 않지만 공통된 형태를 갖고 있는데 이러한 염기서열을 공통염기서열(consensus sequence)이라 한다. 대부분 프로모터들은 공통염기서열의 실제 염기서열 및 전사 개시점과의 거리에서 차이가 있다. 이러한 다양성이 특정 프로모터 에서 전사가 시작되는 빈도, 즉 프로모터의 강도(promoter strength)를 결정하는 것으로 인식되고 있다.
이러한 프로모터는 재조합 단백질 생산의 효율성을 결정하는 중요 인자 중 하나이다. 따라서 다양한 미생물에서 강력하고 특이적인 프로모터를 검색하는 기술이 개발되고 있다. 그러한 기술 중 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 리포터 벡터(reporter vector)를 이용하는 방법이다. 상기 리포터 벡터는 생화학적 효소반응 등으로 쉽게 반응산물을 확인할 수 있는 리포터 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있다. 상기 유전자는 오직 단백질을 암호화하는 부위만 포함하고 있으며 유전자의 전사에 필요한 프로모터는 포함되어 있지 않으므로, 연구자가 조사하고자 하는 DNA 단편을 리포터 유전자의 상류에 삽입한 후 리포터 유전자로부터 전사 및 번역되어 생성된 단백질의 양을 측정함으로써 프로모터 활성을 측정할 수 있다. 상기 리포터 단백질의 양은 리포터 단백질이 합성되어 있는 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 제조한 다음 상기 추출물에 효소반응을 위한 기질을 첨가하여 반응 정도를 분석함으로써 측정할 수 있다.
한편, 프로모터 활성을 조사하기 위해서는 상기 리포터 벡터를 세포에 유전자 도입(transfection)시키는 과정을 거쳐야 한다. 상기 과정은 세포의 종류, 벡터 DNA 크기, 순도, 연구자의 기술적 숙련도 등에 따라 매우 크게 영향을 받기 때문에 실험 조건에 따라 상이한 결과가 발생한다. 따라서 리포터 벡터를 이용하여 프로모터 활성을 측정하는 경우 벡터 DNA가 세포내로 전달되는 효율에 따라 리포터 단백질의 량에 차이가 나게 된다. 그러므로 이를 보정하기 위해서는 또 다른 종류의 리포터 벡터를 동시에 형질전환시킴으로써 형질전환 효율을 별도로 측정하여야 하는 번거로움이 있다. 이러한 방법은 프로모터 활성 측정용 리포터 벡터와 형질전환 효율 측정용 리포터 벡터의 DNA가 동일한 비율로 세포에 전달 될 것이라는 것을 전제로 하고 있다. 그러나 DNA를 세포에 강제로 도입하는 과정은 모든 세포에서 동일한 비율로 일어날 수 없다. 따라서 별도의 형질전환 효율 측정용 리포터 벡터를 이용한다 하더라도 형질전환 효율에 따른 프로모터 활성 측정 결과의 오류를 보정하기에는 많은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 형질전환 효율에 따른 프로모터 활성 측정 결과의 오류를 효과적으로 보정할 수 있으면서도 보다 간편하고 정확하게 프로모터 활성을 측정할 수 있는 방법을 연구하던 중 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 하나의 벡터에 포함하고 있어서 형질전환 효율에 따른 프로모터 활성 측정 결과의 오류를 보정하기 위한 별도의 과정을 거치지 않고도 간편하게 단 시간 내에 프로모터 활성을 정확하게 측정할 수 있는 벡터 시스템을 개발하고 상기 벡터 시스템을 이용하여 새로운 프로모터를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로 모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 하나의 벡터에 포함하고 있는 프로모터 활성 측정용 벡터, 이를 이용하여 프로모터 활성을 측정하는 방법 및 상기 방법에 의해 선별된 프로모터를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 하나의 벡터에 포함하고 있는 프로모터 활성 측정용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 프로모터 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 프로모터를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터는 벡터가 세포 내로 형질전환되는 효율을 측정할 수 있는 리포터 유전자와 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 리포터 유전자를 하나의 벡터에 포함하고 있는 듀얼 리포터 벡터(dual reporter vector)인 것을 특징으로 한다. 이러한 형태의 벡터는 본 발명자들에 의해 처음으로 개발된 것이다.
상기 "리포터 유전자"는 목적으로 하는 유전자의 발현을 고감도로 용이하게 관찰하는데 사용되는 유전자를 말한다. 보다 구체적으로 리포터 유전자는 목적 유전자의 발현 정도에 따라 그 발현이나 생산 정도가 조절되어 목적 유전자의 발현을 직접적으로 검출하는 것을 대신하여 사용되며, 직접적으로 또는 간접적으로 표준방법에 의해 용이하게 이의 활성 또는 생산 정도를 검출할 수 있는 특징이 있다. 본 발명에서는 상기 리포터 유전자로는 형광 단백질 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 형광 단백질 유전자는 살아있는 세포에서 유전자의 발현 여부, 발현 단백질의 위치 및 이동 경로를 보고하는 리포터로서 광범위하게 사용되고 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터는 제1의 형광 단백질의 전사조절 프로모터, 제1의 형광 단백질 유전자, 폴리 A 시그널 서열, 다중 클로닝 부위(multi cloning site), 제2의 형광 단백질 유전자 및 폴리 A 시그널 서열이 순차적으로 연결되어 있고, 복제원점과 항생제 저항성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제1의 형광 단백질 유전자는 벡터 DNA가 세포에 도입되었는지 여부를 측정하기 위해 사용된다. 상기 제1의 형광 단백질 유전자는 상류에 전사조절 프로모터를 가지고 있어서 본 발명에 따른 벡터의 DNA가 세포내로 도입되게 되면 상기 제1의 형광 단백질 유전자가 발현된다.
상기 제1의 형광 단백질 유전자로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으 며 예를 들어, GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자; EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein) 유전자; DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein) 유전자; 및 상기 형광 단백질들의 여러 변이체들로서 CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein) 및 YFP(Yellow Fluorescent Protein) 등이 있다. 바람직하게는 DsRed 유전자 또는 EGFP 유전자를 사용할 수 있다. 상기 DsRed 유전자가 도입된 세포는 DsRed 단백질을 발현되어 붉은색 형광이 나타내고 EGFP 유전자가 도입된 세포는 EGFP 단백질이 발현되어 녹색 형광을 나타낸다. 이러한 표현형으로부터 본 발명의 벡터로 형질전환이 된 세포만을 용이하게 선별할 수 있다.
상기 제1의 형광 단백질 유전자의 전사조절 프로모터로는 상기 유전자의 상류에 위치해 있으면서 상기 유전자의 전사를 촉진하여 발현시키는 작용을 한다. 상기 프로모터로는 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 본 발명의 벡터로 형질 전환하고자 하는 대상이 되는 세포의 종류에 따라 결정할 수 있다. 즉, 예를 들면 본 발명의 벡터로 포유동물 세포를 형질전환하고자 하는 경우에는 포유동물 세포에서 강력한 활성을 나타내는 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, SV40 프로모터, EF-1α 프로모터 등과 같이 동물 세포에서 발현이 확인된 여러 종류의 바이러스 프로모터들을 사용할 수 있다. 바람직하게는, CMV 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터로 식물세포 를 형질전환하고자 하는 경우에는 식물 세포에서 강력한 활성을 나타내는 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 프로모터의 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(Cauliflower mosaic virus 35S promoter) 등이 있다.
상기 제2의 형광 단백질 유전자는 측정하고자 하는 후보 DNA 단편이 프로모터 활성을 나타내어 상기 유전자의 전사를 촉진하는지 여부를 관찰하고 그 정도를 분석하기 위해 사용되는 유전자이다. 상기 제2의 형광 단백질 유전자는 상류에 프로모터를 가지고 있지 않는 대신 다중 클로닝 부위가 존재하여 상기 다중 클로닝 부위에 삽입되는 프로모터의 활성 정도에 따라 그 발현량이 조절되므로 삽입되는 프로모터 활성을 정확하게 분석할 수 있다
상기 제2의 형광 단백질 유전자로는 당 업계에 공지된 형광 단백질을 사용할 수 있으며 상기 제1의 형광 단백질 유전자와의 구별을 위해 다른 종류를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제1의 형광 단백질 유전자로서 붉은색 형광을 발현하는 DsRed를 사용하는 경우 제2의 형광 단백질 유전자로는 녹색 형광을 발현하는 EGFP를 사용할 수 있다. 반대로 제1의 형광 단백질 유전자로서 녹색 형광을 발현하는 EGFP를 사용하는 경우 제1의 형광 단백질 유전자로는 붉은색 형광을 발현하는 DsRed를 사용할 수 있다.
상기 다중 클로닝 부위는 여러 종류의 제한효소(restriction enzyme)들이 인식할 수 있는 부위를 말하며, 제2의 형광 단백질 유전자의 상류에 위치해 있고 분 석하고자 하는 프로모터가 삽입될 수 있다. 본 발명에서는 다양한 제한 효소 부위를 가진 공지의 여러 가지 벡터의 다중 클로닝 부위 중 어느 것을 사용해도 무방하다.
폴리 시그널 서열로는 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 종류를 사용할 수 있다. 예를 들면 SV40 폴리 A 시그널 서열, 소태아 성장 호르몬(Bovine growth hormone) 폴리 A 시그널 서열 등이 있다.
상기 복제원점으로는 진핵세포에서 작동하는 복제원점, 원핵세포에서 작동하는 복제원점을 함께 사용하거나 또는 진핵세포와 원핵세포에서 모두 복제할 수 있는 복제원점을 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 복제원점의 예로는 진핵세포의 경우 SV40 복제원점을 사용할 수 있고 원핵세포의 경우 pUC 복제원점, pRR322 복제원점 및 pMB1 복제원점을 사용할 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 벡터가 제대로 작동하는지를 판별할 수 있게 하는 표지 역할을 수행하는 선별 마커 유전자(selectable marker gene)로서 기능하며 통상적으로 당 업계에서 선별 마커로 사용되는 공지의 모든 유전자가 사용될 수 있다. 예를 들면, 진핵세포의 경우 네오마이신 저항성 유전자를 사용할 수 있고 원핵세포의 경우 가나마이신을 사용할 수 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터는 도 1에 나타낸 바와 같은 개열지도를 갖는다. 즉, 본 발명의 프로모터 활성 측적용 벡터는 진핵세포의 복제원점인 SV40, 가나마인신/네오마이신 저항성 유전자(Kan/Neo), 원핵세포의 복제원점인 pUC, CMV 프로모터, DsRed2 유전자, SV40 폴리 A 시그널, 다중 클로닝 부위, EGFP 유전자 및 SV40 폴리 A 시그널을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 프로모터 활성 측적용 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터로 형질 전환할 수 있는 세포로는 조사대상 프로모터가 작동하는 것으로 추정되는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들면, 원핵세포에서 작동하는 것으로 추정되는 프로모터의 활성을 측정하기 위해서는 형질 전환 세포로서 원핵세포를 이용할 수 있고 진핵세포에서 작동하는 것으로 추정되는 프로모터의 활성을 측정하기 위해서는 형질 전환 세포로서 진핵세포를 이용할 수 있다. 이때 본 발명의 벡터에 포함되는 제1의 형광 단백질 유전자의 프로모터도 형질 전환 대상이 되는 세포의 종류에 따라 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 벡터로 형질전환할 수 있는 세포는 특별히 한정되지 않으며 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 세포가 통상적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 공지의 진핵 및 원핵세포들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 세포 및 생쥐 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원 숭이 세포 및 조직배양된 인간 세포 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 생쥐 B 세포의 일종인 Bcl-1 세포를 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 벡터로 세포를 형질전환하게 되면 본 발명에 따른 벡터의 DNA가 도입된 모든 세포는 제1의 형광 단백질 유전자가 발현되게 된다. 상기 형광 단백질 유전자의 발현은 용이하게 식별할 수 있다. 즉, 세포를 추출물 상태로 제조하지 않고도 살아있는 상태에서 유세포 분석기 또는 형광 현미경을 이용하여 형광 단백질의 존재유무를 관찰함으로써 본 발명의 벡터 DNA가 도입된 세포와 도입되지 않은 세포로 구분할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 벡터의 제2의 형광 단백질 유전자의 상류에 위치한 다중 클로닝 부위에 프로모터 활성을 가지는 단편이 삽입되면 상기 유전자의 전사가 촉진되어 상기 형광 단백질이 발현되게 된다. 상기 형광 단백질의 발현도 형광 현미경이나 유세포 분석기 등을 이용하여 용이하게 식별할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 벡터의 다중 클로닝 부위에 프로모터 활성을 측정하고자 하는 DNA 단편을 삽입하고 이를 이용하여 세포를 형질전환한 다음 세포에서 제1의 형광 단백질 유전자의 발현 여부를 유세포 분석기 또는 형광 현미경으로 분석하여 본 발명의 벡터 DNA가 도입되어 제1의 형광 단백질이 존재하는 세포만을 선별한 후 제2의 형광 단백질 유전자의 발현 정도를 동일한 방법으로 분석함으로써 벡터 DNA의 도입 단계에서 발생하는 형질전환 효율에 따른 오류를 보정하면서 분석하고자 하는 프로모터 활성을 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 원리를 기초로 하여 본 발명의 일 실시예에서 프로모터 활성을 측정하고자 하는 DNA 단편을 본 발명에 따른 벡터의 BamHI 부위에 삽입하고 이를 이용하여 생쥐 BCl-1 세포를 형질전환시켰다. 상기 벡터에서 형질전환 효율을 측정하기 위한 제1의 형광 단백질 유전자로는 붉은색 형광을 발현하는 DsRED를 사용하였고, 프로모터 활성을 측정하기 위한 제2의 형광 단백질 유전자로는 녹색 형광을 발현하는 EGFP를 사용하였다. 상기 형질전환체를 유세포 분석기로 분석하여 붉은색 형광을 발현하는 세포만을 선별한 후 상기 세포들의 녹색 형광 발현 정도를 측정하여 이를 붉은색 형광 발현 정도로 나눈 값을 전사활성도로 나타냈다(실시예 1 참조). 그 결과, 본 발명의 방법에 따라 측정된 프로모터의 활성이 종래의 방법과 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다(비교예 1 참조).
따라서 본 발명은 본 발명의 벡터를 이용한 프로모터의 활성 측정 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 (a) 후보 DNA 단편을 본 발명에 따른 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하는 단계;
(b) 상기 벡터로 세포를 형질전환하는 단계;
(c) 상기 형질전환된 세포의 형광 정도를 측정하여 제1의 형광 단백질 유전자가 발현되는 세포만을 선별하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 세포에서 제2의 형광 단백질 유전자의 발현 정도를 측정하고 이를 제1의 형광 단백질 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 제2의 형광 단백질 유전자의 발현 정도와 제1의 형광 단백질 유전자의 발현정도의 비교는 제2의 형광 단백질 유전자의 발현 정도를 제1의 형광 단백질 유전자의 발현정도로 나누어 전사활성도를 산출하는 방법을 사용할 수 있다.
상기에서 세포의 형광 정도는 유세포 분석기나 형광 현미경을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다. 유세포 분석기를 이용하는 경우 세포 속에서 발현된 형광 단백질은 유세포 분석기를 통과하는 동안 기계에서 발사한 레이저에 의해 자체적으로 형광을 내고 기계 장치는 각 세포의 형광 정도를 검출하여 화면에 표시해 준다. 일반적으로 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석하기 위해서는 특별히 형광 항체로 염색한 후 분석을 수행하나 본 발명의 경우에는 형질전환한 세포를 전처리하거나 세포 추출물로 제조하는 등의 과정이 필요하지 않으며 단순히 세포를 수거한 후 유세포 분석기를 이용하여 형광 정도만을 측정하기 때문에 세포를 염색하거나 전처리 및 추출물의 제조를 위한 시약을 필요로 하지 않고 분석에 소요되는 시간도 수초에서 수분 정도로 획기적으로 단축되는 효과가 있다.
상기와 같은 본 발명의 프로모터 활성 측정 방법을 이용하면 신규한 프로모터를 선별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 생쥐 CD1d의 프로모터로 추정되는 5' 상류 부위 의 DNA 단편을 본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터에 클로닝한 후 제한효소로 처리하여 연속적으로 절단함으로써 다양한 길이의 DNA 단편을 포함하는 벡터를 제조한 다음 본 발명의 프로모터 활성 측정 방법에 따라 프로모터 활성을 측정하였다(실시예 2 참조). 그 결과, CD1d의 프로모터로 추정되는 DNA 단편 중에서 서열번호 2의 염기서열을 가지는 부분이 프로모터 활성을 나타내는 데 있어서 필수적인 부분임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
따라서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 선별된 프로모터를 제공한다. 바람직하게는 상기 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명에 따른 프로모터 활성 측정용 벡터의 제작
pDsRed2-N1 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)의 다중 클로닝 부위를 제거하여 불필요한 효소절단이 일어나지 않도록 하기 위하여, 상기 벡터를 NheI 및 AgeI으로 절단하고 벡터의 말단부를 클리나우(Klenow) 효소를 이용하여 채워 넣은 후 결합시켰다. 그 다음 상기 벡터를 Af1II로 절단하고 다시 말단부를 클리나우 효소로 채 워 넣었다. pEGFP-N1 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)를 NheI과 AF1II로 절단하여 EGFP와 다중 클로닝 부위를 포함하는 1048bp의 단편을 수득하고 클리나우 효소로 말단 돌출부를 채워 넣었다. 상기 단편을 먼저 준비해 둔 pDsRed2-N1의 Af1II 부위에 클로닝하였다. 각 구성요소들의 방향과 순서는 제한효소 절단을 통해 확인하였다. 이렇게 제조된 벡터를 pRedEGFP라 명명하였다(도 1).
<실시예 2>
본 발명에 따른 벡터를 이용한 프로모터의 활성 측정
상기 실시예 1에서 제조한 벡터 pRedEGFP를 이용하여 프로모터 활성을 측정하였다. 즉, 상기 벡터 pRedEGFP의 BamHⅠ 부위에 생쥐 CD1d의 프로모터로 추정되는 5'상류 부위 약 1.3kb의 단편(서열번호 1)을 클로닝한 다음 KpnI과 SacI으로 절단하고 엑소뉴클레아제 Ⅲ(exonuclease Ⅲ, Life Technologies, Grand Island, NY)를 이용하여 연속적으로 절단시켜 다양한 길이로 절단한 몇 개의 서로 다른 프로모터 길이를 가지는 벡터를 제조하였다. 상기 각각 다른 길이의 프로모터 부위를 포함하는 플라스미드 DNA를 퀴아젠 맥시 컬럼(Qiagen Maxi column, Valencia, CA)을 이용하여 분리하였다. 상기에서 분리한 플라스미드 DNA 20㎍을 800㎕의 Bcl-1 세포(ATCC, cat# TIB-197)(2×107 cells/ml)에 960μfi/300 V의 조건으로 전기충격을 가해 도입하였다. 이때, 대조군으로 DNA 단편이 삽입되지 않은 벡터를 상기 세포 에 동일한 방법으로 도입하였다. 상기 형질전환된 세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지에서 24시간 동안 유지시켰다. 그 다음 상기 세포를 수거하고 PBS(potassium buffered saline)으로 세척한 후 유세포분석기(FacsCalibur, BD Bioscience, San Jose, CA)를 이용하여 분석하여 전방산란(Forward Scatter)과 측방산란(Side Scatter)의 두 가지 파라미터로부터 살아있는 세포만을 수득하고 나머지 세포들은 분석에서 제외하였다. 그 다음 상기에서 수득한 살아있는 세포를 대상으로 FL1(fluorescence 1)과 FL2(fluorescence 2) 분석을 통해 녹색 형광 및 붉은색 형광의 정도를 조사하였다.
그 결과, 전체 세포 중 붉은색 형광을 나타내는 세포의 비율은 약 5% 내외로 형질전환 효율이 높지 않았으나 붉은색 형광을 내는 세포와 그렇지 않은 세포를 명확하게 구분할 수 있었다. 녹색 형광을 나타내는 세포들은 거의 대부분 붉은색을 나타내는 세포들과 중복되었다. 상기에서 붉은색 형광은 본 발명의 벡터에 의해 DNA가 도입된 모든 세포에서 나타나며, 녹색 형광은 CD1d 프로모터가 작동되는 세포에서만 나타난다. 즉, 유세포 분석결과에서 나타난 도트 플롯(dot plot)에서 하나의 점은 하나의 세포에 해당하는데 각 점에서 붉은 형광의 정도와 녹색 형광의 정도가 정비례 관계를 나타내었다. 이는 제1의 형광 단백질 유전자의 발현량(즉, 다시 말해 세포에 DNA가 형질도입된 양)에 비례해서 제2의 형광 단백질 유전자가 발현되었음을 보여주는 것이다. 따라서 녹색 형광 정도를 붉은색 형광 정도로 나누어 전사활성도를 산출하게 되면 세포에 도입되는 DNA 양이 다르다 할지라도 동일한 전사활성도를 가지게 된다. 이것은 본 발명의 프로모터 활성 측정용 벡터가 DNA 형질 도입의 효율성 여부와 관계없이 일정하게 작동할 수 있음을 입증해 준다.
이에 본 발명자들은 붉은색 형광을 나타내는 세포들만을 분석대상으로 선택한 후 상기 세포들의 녹색 형광 발현 정도(MFI, mean fluorescence intensity)를 붉은색 형광 MFI 값으로 나누어 전사활성도(TA, transcription activity)를 산출할 수 있다(TA=Green MFI/Red MFI).
분석결과, CD1d의 프로모터로 추정되는 5'상류 부위의 약 1.3kb의 DNA 단편의 경우(-1340 내지 -1) 강력한 전사활성(TA=36)을 나타냈고, -799 및 -708까지의 DNA 단편은 전사활성이 매우 낮게 나타났으며 -646까지의 DNA 단편은 1.3kb 단편에 비해서는 전사활성이 낮게 나타났으나 -799 및 -708까지의 DNA 단편에 비해 전사 활성이 증가한 것으로 나타났다. 따라서 -799 내지 -646사이 부위를 포함하는 DNA 단편은 프로모터의 전사활성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한, -430까지의 부위(서열번호 2)는 전사조절에 있어서 필수적인 부위를 포함하고 있는 것으로 판단되었다. 대조군으로 사용했던 프로모터를 삽입하지 않은 벡터의 경우에는 전사활성이 거의 나타나지 않았다(TA=0.8)(도 2).
<비교예 1>
종래의 벡터를 이용한 프로모터 활성 분석
본 발명에 따른 벡터를 이용하여 분석한 프로모터 활성을 종래의 벡터를 이 용하여 분석한 프로모터 활성과 비교하였다.
이를 위해 먼저, 상기 실시예 2와 동일한 DNA 단편들을 pCAT®3-인핸서 벡터(Promega, Madison, WI)에 클로닝하였다. 상기 벡터를 Bcl-1 세포(ATCC, cat# TIB-197)에 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이때, 세포의 형질전환율에 따른 오류를 보정하기 위해 β-갈락토시다아제 발현 벡터로 동시에 형질전환하였다. 48시간 후에 세포를 수거하여 세포 추출액을 제조한 다음 β-갈락토시다아제 활성을 제조사의 프로토콜에 따라 측정하여 세포분획의 부피를 맞춘 후 CAT의 활성을 제조사의 프로토콜에 따라 TLC를 이용하여 측정하였다.
실험 결과, 1.3kb 단편을 삽입한 경우에 가장 강한 반응 밴드가 나타남을 확인하였으며 -708, -799까지의 프로모터 부위를 삽입한 경우는 역시 전사활성도가 매우 낮게 나타났다(도 3). 이는 본 발명의 벡터를 이용하여 프로모터 활성을 측정한 경우와 동일한 결과이다.
상기한 바와 같이, 프로모터가 있는 제1의 형광 단백질 유전자와 프로모터가 없는 제2의 형광 단백질 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터는 별도의 복잡한 과정을 거치지 않고도 세포의 형질전환 효율에 따른 프로모터 활성 측정 결과의 오류를 간편하게 보정함으로써 프로모터 활성을 단시간 내에 정확하게 측정할 수 있는 효 과가 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. CMV 프로모터, 적색 형광 단백질 유전자, 폴리 A 시그널 서열, 다중 클로닝 부위, 녹색 형광 단백질 유전자 및 폴리 A 시그널 서열이 순차적으로 연결되어 있고, 복제원점과 항생제 저항성 유전자를 포함하는 프로모터 활성 측정용 벡터.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 도 1의 개열지도는 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 삭제
  7. (a) 후보 DNA 단편을 제1항의 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하는 단계;
    (b) 상기 벡터를 세포에 도입하여 형질전환하는 단계;
    (c) 상기 형질전환된 세포의 형광 정도를 측정하여 적색 형광 단백질 유전자가 발현되는 세포만을 선별하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 선별된 세포에서 녹색 형광 단백질 유전자의 발현 정도를 측정하여 이를 적색 형광 단백질 유전자의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는 프로모터의 활성 측정방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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