KR100777025B1

KR100777025B1 - Ｍｊ1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한부위 특이적 인테그레이션 방법

Info

Publication number: KR100777025B1
Application number: KR1020040107077A
Authority: KR
Inventors: 장효일; 최효숙
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20060068401A; US20060134788A1; CN101072878B; CN101072878A; US7273757B2; JP2006166903A; WO2006065103A1

Abstract

본 발명은 장내 구균 잠재성 파지(Enterococcus temperate bacteriophage ΦFC1)에 내재한 인테그라제(integrase)인 MJ1을 함유하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 세포에서 다른 요인 없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(integration)을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션(excision)은 일으키지 않는 MJ1 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 인간세포에서의 부위 특이적 인테그레이션 기능은 포유 동물 세포에서 유전자 치료에 이용될 수 있으므로 의료 산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

인테그라아제, MJ1, 박테리오 파지, 부위 특이적 인테그레이션(integration), 익시션(excision)

Description

ＭＪ1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 부위 특이적 인테그레이션 방법 {Recombinant vector containing MJ1 gene and method of site-specific integration using the same}

도 1A는 290bp attB 유전자를 포함하며 CMV 프로모터가 있는 pcB 벡터이다.

도 1B는 739bp attP 유전자를 포함하며 CMV 프로모터가 없으며 GFP를 리포터(reporter)로 갖는 pGP(-) 벡터이다.

도 1C는 MJ1 유전자를 포함하는 pcMJ1 벡터이다.

도 1D는 624bp attL 유전자를 포함하며 CMV 프로모터가 있는 pcL 벡터이다.

도 1E는 404bp attR 유전자를 포함하며 CMV 프로모터가 없으며 GFP를 리포터로 갖는 pGR(-) 벡터이다.

도 1F는 pcB, pGP(-) 그리고 pcMJ1을 함께 코트랜스펙션(cotransfection) 시켰을때 인테그레이션(integratiom)에 의해 생성되는 재조합 벡터이다.

도 1G는 pcL, pGR(-) 그리고 pcMJ1을 함께 코트랜스펙션시켰을때 익시션에 의해 생성되는 재조합 벡터이다.

도 2는 293 세포에서의 MJ1의 발현을 나타낸다.

도 3은 293 세포에서의 삽입 실험 결과의 콘포컬 마이크로스코프(confocal microscope) 이미지이다.

도 4A의 Y축은 세포수, X축은 GFP의 발현정도로 MJ1이 발현하지 않았을 때의 이미지이다.

도 4B의 Y축은 세포수, X축은 GFP의 발현정도로 MJ1이 발현했을 때의 이미지이다.

도 4C는 도 4A와 4B의 수치값을 정량화한 그래프이다.

도 5는 293 세포에서의 익시션(excision) 실험 결과의 콘포컬 마이크로스코프 이미지이다.

본 발명은 장내 구균 잠재성 파지(Enterococcus temperate bacteriophage ΦFC1)에 내재한 인테그라제(integrase)인 MJ1을 함유하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 세포에서 다른 요인 없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(integration)을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션(excision)은 일으키지 않는 MJ1 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법에 관한 것이다.

박테리오파지 φFC1은 Enterococcus faecalis(KBL703)를 UV 인덕션(UV-induction)을 통한 용원성 스트레인(strain)의 배양을 통해서 처음 발견되었다. Phage φFC1은 부위 특이적인 기작을 통해 숙주 염색체로 삽입된다. 파지 φFC1에 내재한 인테그라아제 MJ1은 파지 접합 부위인 attP의 상부에 위치해 있으며 465-아 미노산 폴리펩타이드를 코딩(coding)한다. KBL703의 지표 스트레인인 KBL707의 염색체에서 발견한 박테리아 접합 부위인 attB는 attP와 함께 실제로 MJ1이 결합하는 부위로 스트랜드(strand) 교환이 일어난다. MJ1에 의해 attB와 attP는 각 부위를 반씩 공유함으로써 attL과 attR로 나뉘며 그 사이에는 파지 지노믹(genomic) DNA가인테그레이션되게 된다.

이미 본 발명자들은 MJ1을 이 콜라이(E.coli)에서 과발현, 정제함으로써 생체외 제조합 실험을 통해 분자간 삽입 재조합(intermolecular integrative recombination)의 촉매 여부와 다른 숙주 내에서의 활동성 유지 여부 등을 알아보았으며 결과적으로 MJ1이 다른 요인의 도움 없이 단독으로 재조합을 촉매함을 확인하였고, E.coli에서도 활동성이 유지됨을 밝혔다.

본 발명에서는 MJ1 인테그라아제를 인간 세포에서 발현시켜서 attP와 attB간의 인테그레이션이 실제로 일어나는지 그 활동성을 살펴보았다. 생체내 실험에서 MJ1에 의한 부위 특이적 인테그레이션을 증명하기 위해 attP와 attB를 포함하는 벡터를 MJ1 발현 벡터와 함께 인간 배아 신장 세포인 HEK293 세포에 코트랜스펙션(cotransfection) 시켰으며 그린 플루오레센트 프로테인(green fluorescent protein)(GFP)을 리포터(reporter)로 사용했다. 콘포컬 마이크로스코피(confocal microscopy)와 FACS analysis를 통해 살펴 본 결과 MJ1을 포함하는 플라스미드를 모 트랜스펙션 한 셀 라인(cell line) 에서 GFP가 발현되었으며, 이는 다른 보조 단백질 없이도 MJ1에 의한 인테그레이션이 세포 내에서 일어났다는 것을 보여준다. 또한 attR과 attL을 포함하는 벡터를 가지고 같은 실험 방법을 통해 MJ1에 의한 익 시션을 살펴 봤을 때 인테그레이션 실험과는 대조적으로 GFP의 발현이 전혀 나타나지 않았으며, 이것은 MJ1에 의한 익시션은 일어나지 않았음을 보여준다.

본 발명의 상기와 같은 점들을 감안하여 안출된 것으로, 일반적으로 다른 종에서 유래한 인테그라아제는 인테그레이션과 익시션의 기능을 동시에 가져 치료적 유전자의 전달(therapeutic gene delivery)의 효율성 면에서 문제가 있었으나, 이러한 점을 개선하여 원하는 유전자를 효율적으로 인테그레이션시킬 수 있는 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법을 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기와 같은 목적은 장내 구균 잠재성 파지(Enterococcus temperate bacteriophage ΦFC1)에 내재한 인테그라제(integrase)인 MJ1이 E.coli에서 파지 접합 부위(phage attachment site)인 attP와 박테리아 접합 부위(bacteria attachment site)인 attB에 작용해 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(site-specific integration)을 일으킨다는 것을 확인하고, 인간 세포에서 염색체 외 벡터 실험(extrachromosomal vector based system)을 통해 MJ1이 다른 요인 없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(integration)을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션(excision)은 일으키지 않는다는 것을 확인하고, MJ1 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 이를 이용한 인터그레이션 방법을 개발함으로써 달성하였다.

본 발명에서는 장내 구균 잠재성 파지 ΦFC1(Enterococcus temperate bacteriophage ΦFC1)에 내재한 인테그라제(integrase)인 MJ1이 이 콜라이(E.coli)에서 파지 접합 부위(phage attachment site)인 attP와 박테리아 접합 부위(bacteria attachment site)인 attB에 작용해 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(site-specific integration)을 일으킨다는 것을 확인하고, 인간 세포에서 염색체 외 벡터 실험(extrachromosomal vector based system)을 통해 MJ1이 다른 요인 없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션(integration)을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션(excision)은 일으키지 않는다는 것을 규명하였다. MJ1에 의한 이 콜라이(E.coli) 뿐만 아니라 인간세포에서의 부위 특이적 인테그레이션 기능은 포유 동물 세포에서 유전자 치료에 이용될 수 있어 의료 산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

본 발명에서 attP는 파지의 접합부위(attachment site; 738bp)를, attB는 박테리아의 접합부위(290bp)를 의미하며, attL과 attR은 상기 attP와 attB의 각 strand 교환에 의해 부위-특이적으로 재조합(site-specific recombination)된 attL(404bp), attR(624bp)의 DNA를 의미한다(이하 ‘attP’, ‘attB’, ‘attL’, ‘attR’ 라 약칭한다).

본 발명은 박테리아, 박테리오 파지와 플라스미드를 배양하는 단계; 동물 세포로의 트랜스펙션(transfection)을 위한 부위 특이적 삽입 플라스미드를 제조하는 단계; 인간배아 신장세포 라인 293의 트렌스펙션과 플루오레센스 활동성을 측정하는 단계; 리버스 트랜스크립션 PCR (RT- PCR)을 수행하는 단계; FACS 어낼리시스(analysis)를 수행하는 단계; attP와 attB의 삽입(integration)과 attL과 attR의 익시션(excision)을 확인하는 단계로 구성이 된다.

본 발명의 MJ1 유전자는 한국 특허출원 제2002-0003196호에서 개시된 바 있는 것이다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용·효과를 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1: 박테리아, 박테리오파지와 플라스미드의 배양

본 발명에서 사용된 박테리아 스트레인(strain)과 플라스미드는 하기 표 1에서 언급되었다. 엔테로코커스 파에칼리스 KBL 703(Enterococcus faecalis KBL 703) 스트레인과 KBL 707 스트레인은 Todd Hewitt broth(THB: Difco Co., U.S.A)에서 쉐이킹(shaking) 하지 않고 37℃에서, 이 콜라이(E.coli)인 DH5α는 LB에서 쉐이킹한 상태에서 37℃에서 키웠다. 잠재성 파지인 φFC1은 Enterococcus faecalis KBL 703에서 UV-조사를 통해 인덕션(induction)과 퓨리피케이션(purification)을 하였다.

본 발명에 사용된 박테리아와 플라스미드

스트레인 또는 플라스미드		특징
Enterococcus faccalis	KBL707	φFC1 파지 원래의 용원성 스트레인
Enterococcus faccalis	KBL703	φFC1 파지의 지표 스트레인
Escherichia coli	DH5α	supE44,△lacU169,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1
플라스미드	pcDNA3	mammalian cell expression vector,Amp^r,Neo^r,replicative ori of Col1,promoter of CMV,T7,Sp6,SV40
	pEGFP-N1	mammalian cell expression vector,Kan^r,Neo^r,replicative ori of pUC,promoter of CMV,HSV,TK,SV40_e,GEP exp
	pG(-)	pEGFP-N1 deleting P_CMV
	pGP(+)	pEGFP-N1 carrying 739bp attP fragment
	pGP(-)	pG(-) carrying 739bp attP fragment
	pcB	pcDNA3 carrying 290bp attB fragment
	pGR(-)	pG(-) carrying 404bp attR fragment
	pGR(+)	pEGFP-N1 carrying 404 attR fragment
	pcL	pcDNA3 carrying 624bp attL fragment
	pcMJ1	pcDNA3 carrying mj1

실시예 2: 동물 세포로의 트랜스펙션(transfection)을 위한 부위 특이적 삽입 플라스미드의 제조

약 1500 bp의 MJ1 인테그라아제 유전자와 290, 347 bp의 attB, attL 유전자를 PCR로 합성하여 pcDNA3(Invitrogen)에 HindIII와 EcoRI, HindIII와 BamHI site를 이용하여 클로닝해서 pcMJ1(도 1C 참조)과 pcB, pcL(도 1A, 1D 참조)을 만들었으며 사용된 프라이머는 표 2와 같다. pGP(-)와 pGR(-) (도 1B, 1E 참조)를 만들기 위해 먼저 pEGFP-N1(Clontech, Palo Alto, CA)에 AseI과 BglII site를 이용하여 CMV promoter 부분을 딜리션(deletion) 한 뒤 클레노우(Klenow)를 이용하여 블런트 앤드(blunt end)를 만들었다. 그리고 각 끝을 라이게이션(ligation) 시킨뒤 HindIII와 BamHI site를 이용해서 739와 624 bp의 attP와 attR의 PCR 산물을 클로닝하였다.

본 발명에 사용된 합성 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)

	센스(sense)	안티센스(antisense)
MJ1	CGGGATCCATGAAACGTGCAGCATTG	CGGAATTCACCGAATGCATGTTCGTA
attP	CGGAATTCACCGAATGCATGTTCGTA	GCGTTAACTGCCAATATAGC
attB	CGGCCATTGAATTAGGGTGTCGAAT	CGGATTGCCAGATGGATGAT
attL	CGCAAGCTTGAAACGTTAAAAACTTTTAAT	CGGGATCCCGGCCATTGAATTAGGGTGTC
attR	CGCAAGCTTCGGATTGCCAGATGGATGATT	CGGGATCCGAAGATCTTGTTCTCGAGCAT
MJ1RT	GGAAATCAATTAGGGCTTTT	TCGTTATGCTTCTTGGAAAT
GAPDH	CATCTCTGCCCCCTCTGCTG	CGACGCCTGCTTCACCACCT

실시예 3 : 인간배아 신장세포라인 293의 트렌스펙션과 플루오레센스 활동성 측정

인간 배아 신장 세포 라인 293은 DMEM에 10%의 FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)으로 키웠다. 썹콘플루언트(Subconfluent)한 40~60%의 cell에 각각 10ug의 플라스미드 DNA를 칼슘 포스페이트 방법(calcium phosphate method)을 이용하여 60mm 컬쳐 플레이트(culture plate)에 트렌스펙션하였다. 각각의 트렌스펙션된 세포는 트렌스펙션한 지 72시간 이후 자이스 콘포컬 마이크로스코피(Zeiss confocal microscopy)를 이용해 100배율의 상태에서 GFP의 플루오레센스 활동성을 측정했다.

실시예 4: 리버스 트랜스크립션 PCR (RT- PCR)의 수행

상기 실시예 1의 pcMJ1을 293T에 트랜스펙션한 세포로부터 토탈 RNA를 분리 한 뒤 슈퍼 스크립트 Ⅱ RNaseH-리버스 트랜스크립타아제(Superscript II RNaseH-reverse transcriptase)(Invitrogen)와 Taq 폴리머라아제(Taq polymerase)(Promega)를 이용하여 리버스 트랜스크립션(reverse transcription) 과 PCR을 수행했으며 primer sequence는 표 2와 같다. PCR은 94℃에서 5분, 25 cycle로 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 68℃에서 30초로 수행되었으며 PCR product는 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 과 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색해서 보았다. 도 2에서와 같이 MJ1 인테그라아제는 동물세포에서 발현이 잘 일어난 것을 PCR 산물의 밴드를 통해서 확인하였으며 GADPH 유전자의 발현 정도는 인터널 콘트롤(internal control)로 사용하였다.

실시예 5 : FACS 어낼리시스(analysis)의 수행

각각의 셀 라인(cell line)은 트랜스펙션한 지 72시간 후 하베스트(harvest) 하고 PBS로 두 번 씻어 0.1% BSA와 0.05% NaN₃로 고정시켜서 FACS 어낼리시스를 수행하였다.

이하에서는, 본 발명의 상기 실시예의 결과를 확인하는 실험 결과를 개시한다.

실험예 1 : attP와 attB의 삽입(integration)과 attL과 attR의 익시션(excision) 의 확인

pcB와 pGP(-), pcL과 pGR(-)을 각각 pcMJ1이 있을 때와 없을 때로 구분 해 코트랜스펙션(contransfection) 시켰으며 pGP(-)와 pGP(+)를 각각 단독으로 트랜스펙션해서 이를 네거티브(negative)와 포지티브(positive) 컨트롤(control)로 수행했다(도 3E). pcB는 attB를 포함하며 프로모터(promoter)를 가지고 있고 pGP(-)는 attP를 포함하며 프로모터를 가지고 있지 않는다. 또한 pGP(-)는 GFP가 리포터 유 전자(reporter gene)로 있지만 프로모터가 없기에 단독으로는 발현할 수 없다. 그러나 두 플라스미드 DNA가 가지고 있는 attP와 attB가 MJ1에 의해 인테그레이션(integration)이 일어나면 pREC-I(도 1F)와 같은 플라스미드가 만들어져서 GFP가 CMV 프로모터에 의해 발현하게 된다. 마찬가지로 익시션(excision) 또한 pGR(-) 단독으로는 프로모터가 없기 때문에 GFP가 발현되지 않지만 MJ1에 의해 attL과 attR 사이에서 익시션이 일어나게 되면 pREC-E(도 1G)와 같은 플라스미드가 만들어져서 현미경으로 GFP의 발현을 관찰 가능하게 된다. 도 3A는 pGP(-)와 pcB에 포함된 attP와 attB 사이에서 MJ1에 의한 부위 특이적인 인테그레이션으로 인해 재조합 팔라스미드인 pREC-I가 생성되었으며 그 결과로 GFP가 발현되었다. 반면에 MJ1을 함께 트랜스펙션 하지 않은 세포에서는 인테그레이션이 일어나지 않아 GFP의 발현도 보이지 않았다. 또한 이는 도 3의 (C)와 (D)에서 보이는 것과 같이 프로모터에 의한 것이 아니며 MJ1에 의한 것임을 알 수 있다. 이러한 인테그레이션의 정도를 수치적으로 확인하기 위해 상기 실시예의 FACS 어낼리시스(analysis)를 수행했으며 그 결과, 도 4와 같은 결과를 얻을 수 있었다. (A)와 (B)는 도 3에서와 마찬가지로 pcB와 pGP(-)에 함유된 attB와 attP가 MJ1에 의해 인테그레이션이 일어나는 것을 GFP 발현으로 확인한 것이며 (B)에서와 같이 발현정도가 증가된 것을 볼 수 있다. 그 정도는 (C)에서와 같이 약 3배 이상이 차이가 났다. 같은 방법으로 MJ1에 의한 익시션을 살펴 본 결과 도 5의 (A)와 (B)에서 보이는 것과 같이 MJ1의 발현에는 상관없이 GFP의 발현이 관찰되지 않았다. (C)는 파시티브 컨트롤이다. 이는 MJ1에 의해 attL과 attR 사이에 익시션이 일어나지 않음으로 인해 pREC-E와 같은 재조합 플 라스미드가 생성되지 않았음을 보여준다.

상기 실시예 및 실험예에 따라 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KBL 703 의 잠재성 박테리오파지(temperate bacteriophage)인 φFC1에 내재한 mj1 유전자를 함유한 발현 벡터 pcMJ1를 인간 세포에서 발현시켰을 때 다른 요인없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션은 일으키지 않는 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KBL 703 의 잠재성 박테리오파지(temperate bacteriophage)에 내재한 MJ1 인테그라아제를 함유한 재조합 벡터 및 이를 이용한 인테그레이션 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 인간 세포에서의 부위 특이적 인테그레이션은 다른 요인없이 단독으로 부위 특이적 인테그레이션을 일으키나 그와는 대조적으로 익시션은 일으키지 않는 뛰어난 효과가 있으므로, 이는 유전자 치료 및 의약품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

삭제
유전자를 동물세포에 인테그레이션(integration)하는 방법에 있어서,

MJ1 유전자를 포함하며, 도 1c의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pcMJ1, attB 유전자를 포함하며, 도 1a의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pcB 및 attP 유전자를 포함하며, 도 1b의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pGP(-)를 함께 인체에서 유래한 세포주에 트랜스펙션(transfection)하는 것을 특징으로 하는, 인체에서 유래한 세포주에서의 부위 특이적 인테그레이션(site-specific integration) 방법.
제2항에 있어서, 상기 인체에서 유래한 세포주는 인간 배아 신장 세포주 293임을 특징으로 하는 인체에서 유래한 세포주에서의 부위 특이적 인테그레이션(site-specific integration) 방법.