KR100775034B1 - 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법 - Google Patents

환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100775034B1
KR100775034B1 KR1020060094909A KR20060094909A KR100775034B1 KR 100775034 B1 KR100775034 B1 KR 100775034B1 KR 1020060094909 A KR1020060094909 A KR 1020060094909A KR 20060094909 A KR20060094909 A KR 20060094909A KR 100775034 B1 KR100775034 B1 KR 100775034B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibiotic
environmental sample
culturing
medium
sample
Prior art date
Application number
KR1020060094909A
Other languages
English (en)
Inventor
박준홍
오향균
이재진
조윤상
최문석
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to KR1020060094909A priority Critical patent/KR100775034B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100775034B1 publication Critical patent/KR100775034B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법에 관한 것으로, 저영양성 미생물을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 환경시료의 항생제 내성 미생물 유해성을 진단할 수 있고, 동일한 시료에 대해 항생제를 첨가하거나 그렇지 않은 마이크로플레이트를 동시에 이용하므로 항생제 내성에 진단을 체계적이고 정량적으로 할 수 있고, 음용수나 지하수에 국한되지 않고 다양한 환경시료의 분석도 가능하도록 하기 위해 고영양성 배지(LB)를 선택해서 다양하게 희석한 배지를 제작사용하고, 상대적으로 미생물 수가 많을 수 있는 시료를 다양한 비율로 희석 배양하여 정량적 분석이 가능하게 하는 효과가 있다.
환경시료, 저영양성 미생물, 항생제 내성, 마이크로플레이트, 미생물 유해성

Description

환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법{A method for isolating and culturing antibiotic-registant oligotrophic bacteria in environmental sample and diagnosing its harmfulness}
도 1은 본 발명의 기술의 특징을 도시한 도식화이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 돼지분뇨시료에서 저영양성 항생제 내성 세균의 분리배양능을 검증한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 황사 빗물과 축산폐수를 이용한 항생제 내성에 의한 미생물 유해성을 평가한 그래프이다.
본 발명은 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 물 환경시료를 항생제가 투여된 저영양성 배지에 도입하여 항생제 내성을 지닌 저영양성 미생물을 분리 배양하고, 이로부터 항생제 내성에 의한 시료의 유해성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
자연 상태에 존재하는 대부분의 미생물은 저영양성 상태에서 살고 있는데, 이들은 고영양 환경에 노출되면 생장하지 않을 수도 있다. 기존의 미생물 유해성 분석을 위한 배양 분리 방법들은 고영양성 배지를 사용하기 때문에 환경시료에 존재하는, 저영양성 상태의 미생물들을 배양 분리해 낼 수 없었다(Colwell, R.R. et al. 1985, Bio . Technol . 3, 817-820; Torsvik et al . 2002, Curr . Opin . Microbiol. 5, 240-245).
이러한 기존 미생물 배양 방법의 한계성을 극복하기 위해 황경숙 외 2인은 대한민국 특허 제0494373호에서 음용지하수 내 저영양성 세균의 분리방법을 제시하였다. 상기 특허는 음용수 내 미생물 유해성 진단을 위한 검사 방법 개발을 목적으로 하고 있어 저영양성 세균들에 의한 보건유해성에 대한 정보를 제공하지 못하였다. 즉, 최근 항생제 노출에 따른 내성 미생물에 대한 유해성 평가의 중요성에도 불구하고 항생제 내성을 지닌 저영양성 미생물을 효과적으로 분리, 검측하지 못한다. 또한 하천수나 초기강우수와 같은 다양한 물 환경 내 미생물 유해성 진단이 중요함에도 불구하고 상기 특허는 음용지하수 내 미생물 분리 배양에 한정되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 물 환경 시료에서 미생물 유해성 진단을 하기 위한 항생제 내성 저영양성 미생물의 배양 분리하는 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은 영양배지를 순차적으로 희석시킨 마이크로플레이트를 제작하고 각 웰에 항생제를 첨가한 다음, 다양한 물 환경시료의 원액 또는 희석액을 플레이트에 분주하여 배양하고, 상기 배양 플레이트에서 자란 콜로니 수를 측정 하여 검사표에 기재하고, 상기 환경시료의 유해성을 진단함으로써 달성하였다.
본 발명은 항생제를 포함한 저영양성 배지 마이크로플레이트의 제작단계; 상기 플레이트에 다양한 환경시료를 첨가하여 배양하는 단계; 저영양성 항생제 내성 세균수 측정 및 유해성 평가 단계로 구성된다.
본 발명은 LB 영양배지를 100~10-4로 희석시킨 LB 고체배지에 테트라사이클린, 앰피실린, 리팜피신(rifampicin) 또는 카나마이신(kanamycin)에서 선택된 1종의 항생제를 첨가하여 제조된 마이크로플레이트에 환경시료의 원액 또는 희석액을 도입하여 배양하는 단계를 포함하는 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양방법을 제공함을 특징으로 한다.
상기 환경시료는 음용수, 지하수, 하천수, 축산폐수 또는 초기강우수를 포함하는 물 환경시료임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 LB 영양배지를 100~10-4로 희석시킨 LB 고체배지에 테트라사이클린, 앰피실린, 리팜피신(rifampicin) 또는 카나마이신(kanamycin)에서 선택된 1종의 항생제를 첨가하여 제조된 마이크로플레이트에 환경시료의 원액 또는 희석액을 도입하여 배양하고, 상기 플레이트에서 자란 콜로니 수를 세고, 항생제 포함 배지에서 자란 항생제 내성 미생물 수와 항생제 미포함 배지 내 미생물 수를 비교하여 환경시료의 미생물 유해성을 진단하는 환경시료에서 항생제 내성에 의한 미생물 유해성을 진단하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 첫째, 저영양성 미생물을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 환경시료의 항생제 내성 미생물 유해성을 진단할 수 있고, 둘째, 동일한 시료에 대해 항생제를 첨가하거나 그렇지 않은 마이크로플레이트를 동시에 이용하므로 항생제 내성에 진단을 체계적이고 정량적으로 할 수 있고, 셋째, 음용수나 지하수에 국한되지 않고 다양한 환경시료의 분석도 가능하도록 하기 위해 고영양성 배지(LB)를 선택해서 다양하게 희석한 배지를 제작사용하고, 넷째, 상대적으로 미생물 수가 많을 수 있는 시료를 다양한 비율로 희석 배양하여 정량적 분석이 가능하게 하는 효과가 있다(도 1 참조).
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 항생제를 포함하는 저영양성 배지 플레이트의 제작 및 미생물 배양
다양한 환경시료들은 저영양성 뿐만 아니라 고영양성 미생물들을 동시에 포함하고 있으므로 이들을 함께 배양하기 위해서 일반적인 고영양성 배지인 LB 배지를 선정하였다. 배지 내 영양성 정도를 변화시키기 위해서 LB 영양배지를 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4으로 각각 희석시키고 아가(agar)와 혼합하여 고체배지(마이크로플레이트)를 제작하였다. 항생제 내성을 지닌 저영양성 미생물을 배양 분리하기 위해, 상기 희석 저영양성 LB 배지에 테트라사이클린을 투여하여 항생제가 함유된 저영양성 플 레이트를 제작하였다. 플레이트 웰내 배지에 투여된 항생제 농도는 100㎍/㎖이었다.
미생물 수가 많은 시료라고 여겨질 경우에는 시료를 무세균 완충액(buffer)과 섞어 다양한 농도로 희석시킨 후 플레이트에 분주하였다. 플레이트 웰 내 배지에 분주된 희석시료의 양은 0.6㎕/cm2 일때 콜로니 분리와 정량화가 가능하였으므로 24-웰 플레이트의 경우 1.2㎕의 희석시료를 웰당 분주한 후 배지표면에 고르게 분포시켰다. 이렇게 준비된 플레이트를 25℃에서 6일간 배양한 후에 플레이트에 자란 콜로니 수를 카운팅하였다. 이때 영양성 정도가 다양한 배지에서 자란 미생물에 대한 정량적 정보를 얻기 위해 LB 희석비율이 각기 다른 플레이트에서 자란 콜로니 수를 본 발명자들이 개발한 검사표(표 1 참조)에 기재하였다. 같은 시료 내 항생제 내성에 의한 미생물 유해성을 진단하기 위해, 항생제를 함유한 플레이트에서 자란 미생물 콜로니 수를 상기와 같은 방식으로 기재하였다.
검사표
시료 배지 시료 희석 비율
100 10-1 10-2 10-3 10-4…
항 생 제 비 첨 가 L B 희 석 비 율 100
10-1
10-2
10-3
10-4
항 생 제 첨 가 L B 희 석 비 율 100
10-1
10-2
10-3
10-4
실험예 1: 돼지분뇨를 이용한 저영양성 항생제 내성 세균의 분리배양
상기 실시예 1에서 제작한 마이크로플레이트를 이용하여 환경시료로서 돼지분뇨를 사용하고, 항생제로 테트라사이클린을 사용하여 상기 실시예 1의 방법에 따라 저영양성 미생물을 분리하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 돼지분뇨시료에서 저영양성이면서 테트라사이클린 내성을 갖는 미생물의 존재를 확인하였다.
실험예 2: 물 환경시료를 이용한 저영양성 항생제 내성 세균의 분리배양
환경시료로서, 하천수, 황사 빗물 및 축산폐수를 사용하였고, 실험방법은 실시예 1과 같다.
Figure 112006070983445-pat00001
표 2에 나타난 바와 같이, 하천 수(청계천시료)에서는 항생제 내성 미생물이 항생제를 포함한 플레이트에서 검출되지 않았지만, 황사 빗물과 축산폐수에서는 항생제 내성 미생물이 검출되었다. 항생제 내성 미생물의 존재는 미생물 유해성이 상대적으로 높다는 것을 의미하므로, 이 결과는 다양한 물 환경시료에서 미생물 유해성 진단에 본 발명이 효과적으로 활용될 수 있음을 보이고 있다.
실험예 3: 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단
실험예 2의 결과를 토대로 미생물 유해성을 정량적으로 비교하고 진단하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 미생물 유해성이 높다고 확인된 축산폐수와 황사 빗물 내 항생제 내성 미생물에 의한 유해성 정도를 비교한 결과, 총 항생제 내성 미생물 수로 보면 황사의 유해성은 축산폐수의 그것에 비해서 낮다. 반면 배양된 전체 미생물 중 항생제 내성을 가진 미생물의 비율로 보면 황사 빗물의 미생물 유해성이 높은 것을 알 수 있다. 이는 같은 양의 미생물이 인체에 노출 시, 황사 빗물의 유해성이 축산폐수보다 높다는 것을 의미하고, 이러한 정량화된 정보들은 미생물 유해성 관리를 위한 보건 환경정책 기준설정에 활용될 수 있다.
실험예 4: 돼지분뇨에서 다양한 항생제를 사용하여 저영양성 내성 미생물 확인
저영양성 배지(10-3 LB 희석배지)를 이용하여 돼지분뇨(untreated), 저장액비(fermented) 및 고온호기성소화처리(ATAD)된 시료 내에서 테트라사이클린, 앰피실린, 리팜피신(rifampicin), 카나마이신(kanamycin) 내성 저영양성 미생물을 분리하고자 하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 돼지분뇨와 저장액비 시료에서 항생제 내성 미생물의 존재를 확인하였다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법에 관한 것으로, 저영양성 미생물을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 환경시료의 항생제 내성 미생물 유해성을 진단할 수 있고, 동일한 시료에 대해 항생제를 첨가하거나 그렇지 않은 마이크로플레이트를 동시에 이용하므로 항생제 내성에 진단을 체계적이고 정량적으로 할 수 있고, 음용수나 지하수에 국한되지 않고 다양한 환경시료의 분석도 가능하도록 하기 위해 고영양성 배지(LB)를 선택해서 다양하게 희석한 배지를 제작사용하고, 상대적으로 미생물 수가 많을 수 있는 시료를 다양한 비율로 희석 배양하여 정량적 분석이 가능하게 하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 환경산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (3)

  1. 저영양성 미생물 분리 배양방법에 있어서,
    LB 영양배지를 100~10-4로 희석시킨 LB 고체배지에 테트라사이클린, 앰피실린, 리팜피신(rifampicin) 또는 카나마이신(kanamycin)에서 선택된 1종의 항생제를 첨가하여 제조된 마이크로플레이트에 환경시료의 원액 또는 희석액을 도입하여 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환경시료는 음용수, 지하수, 하천수, 축산폐수 또는 초기강우수임을 특징으로 하는 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양방법.
  3. LB 영양배지를 100~10-4로 희석시킨 LB 고체배지에 테트라사이클린, 앰피실린, 리팜피신 또는 카나마이신에서 선택된 1종의 항생제를 첨가하여 제조된 마이크로플레이트에 환경시료의 원액 또는 희석액을 도입하여 배양하고,
    상기 플레이트에서 자란 콜로니 수를 세고,
    항생제 포함 배지에서 자란 항생제 내성 미생물 수와 항생제 미포함 배지 내 미생물 수를 비교하여 환경시료의 미생물 유해성을 진단함을 특징으로 하는 환경시 료에서 항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법.
KR1020060094909A 2006-09-28 2006-09-28 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법 KR100775034B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060094909A KR100775034B1 (ko) 2006-09-28 2006-09-28 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060094909A KR100775034B1 (ko) 2006-09-28 2006-09-28 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100775034B1 true KR100775034B1 (ko) 2007-11-09

Family

ID=39061547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060094909A KR100775034B1 (ko) 2006-09-28 2006-09-28 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100775034B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR890010212A (ko) * 1987-12-01 1989-08-07 조셉 엠.버닉 항생제 내성 시험 분석방법
KR100494373B1 (ko) 2003-01-29 2005-06-10 황경숙 음용지하수 내 저영양세균의 분리방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR890010212A (ko) * 1987-12-01 1989-08-07 조셉 엠.버닉 항생제 내성 시험 분석방법
KR100494373B1 (ko) 2003-01-29 2005-06-10 황경숙 음용지하수 내 저영양세균의 분리방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gekenidis et al. Antibiotic-resistant indicator bacteria in irrigation water: high prevalence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli
Leclercq et al. A multiplayer game: species of Clostridium, Acinetobacter, and Pseudomonas are responsible for the persistence of antibiotic resistance genes in manure‐treated soils
Zhou et al. Temporal succession of water microbiomes and resistomes during carcass decomposition in a fish model
Guo et al. Insights into the amplification of bacterial resistance to erythromycin in activated sludge
Easton et al. Die‐off of pathogenic E. coli o157: h7 in sewage contaminated waters 1
Kang et al. High diversity and abundance of cultivable tetracycline-resistant bacteria in soil following pig manure application
Ibekwe et al. Potential pathogens, antimicrobial patterns and genotypic diversity of Escherichia coli isolates in constructed wetlands treating swine wastewater
Klotz et al. Seasonal occurrence and carbapenem susceptibility of bovine Acinetobacter baumannii in Germany
Hernandez et al. Using the wax moth larva Galleria mellonella infection model to detect emerging bacterial pathogens
Yang et al. Contribution of environmental factors on the distribution of antibiotic resistance genes in agricultural soil
Abdulrazzaq et al. Efficiency of hichrome Enterococcus faecium agar in the isolation of Enterococcus spp. and other associated bacterial genera from water
Wang et al. Antibiotic resistance genes on the Qinghai-Tibet Plateau above an elevation of 5,000 m
CN112961805B (zh) 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用
Amoafo et al. Antibiotic resistance and phylogenetic profiling of Escherichia coli from dairy farm soils; organic versus conventional systems
Kim et al. Interplays between cyanobacterial blooms and antibiotic resistance genes
Doğruöz-Güngör et al. ENZYME PROFILES AND ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF BACTERIA ISOLATED FROM THE KADIINI CAVE, ALANYA, TURKEY.
KR100775034B1 (ko) 환경시료에서 저영양성 항생제 내성 미생물의 분리배양 및항생제 내성에 의한 미생물 유해성 진단방법
Glaeser et al. Cultivation of vancomycin-resistant enterococci and methicillin-resistant staphylococci from input and output samples of German biogas plants
Devos et al. Evaluation of nested PCR assays for the detection of Legionella pneumophila in a wide range of aquatic samples
Cerezer et al. Phylogenetic Analysis of Stenotrophomonas spp. Isolates Contributes to the Identification of Nosocomial and Community‐Acquired Infections
Gattinger et al. A comparative approach to confirm antibiotic-resistant microbes in the cryosphere
Rueanghiran et al. Species diversity and antimicrobial susceptibility properties of Staphylococcus isolated from broiler feces in selected farms, Thailand
CN113512601A (zh) 用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法
Ishaq et al. Risk assessment and biofilm formation of bacterial communities associated with drinking water distribution system
Iloghalu et al. Evaluation of multi-drug resistant E. coli from drinking water sources in a tertiary institution

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120917

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130829

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140902

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150828

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160830

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170825

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180829

Year of fee payment: 12