KR100769669B1 - 메틸 유제놀을 함유하는 잿빛 곰팡이병 방제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Methyl eugenol을 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea Pers: Fr.) 방제용 조성물에 관한 것이다. 상기의 methyl eugenol 조성물은 methyl eugenol과 methyl eugenol에 대해 0.5~4배(v/v)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 조성물은 실제 포장에 적용시 Methyl eugenol의 농도가 10~1,000ppm이 되도록 물로 희석하여 마이크로 에멀젼의 상태로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 0.5~7배(v/v)의 동결방지제, 0.1~0.2배(v/v)의 산화방지제 및 항균활성 보조제로서 NaHCO₃를 추가로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 methyl eugenol을 함유하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물은 천연물로서 인체에 무해한 에센셜 오일을 주성분으로 하며, 약해가 없고, 방제효과가 탁월하다. 따라서, 이제까지 항균활성이 알려져 있으면서도 농업에 실질적으로 이용이 어려웠던, 에센셜 오일을 농업분야에 적용할 수 있도록 한다.

잿빛 곰팡이 병균(Botrytis cinerea), 에센셜 오일, methyl eugenol, 딸기, 방제, 계면활성제, 천연물질

Description

메틸 유제놀을 함유하는 잿빛 곰팡이병 방제용 조성물{A Composition comprising methyl eugenol for control of Botrytis cinerea}

도 1은 세신의 에탄올 추출물을 여러 가지 용매를 사용하여 순차적으로 희석한 분획분의 항균활성을 나타내는 사진.

도 2는 각종 에센셜 오일의 농도별 잿빛 곰팡이병균에 대한 항균활성을 보여주는 그래프.

도 3은 에센셜 오일에 의해 잿빛 곰팡이병균 균사의 세포질이 유출되는 것을 보여주는 현미경 사진.

도 4는 다양한 농도의 에센셜 오일을 함유한 PDA 배지에서 잿빛 곰팡이병균 균사의 생장억제율을 나타내는 그래프.

도 5는 고추종자 발아에 미치는 에센셜 오일의 약해 유무를 보여주는 사진.

도 6은 딸기 과육에 미치는 에센셜 오일의 약해 유무를 보여주는 사진.

도 7은 항균활성 보조제의 잿빛 곰팡이병균에 대한 항균활성을 보여주는 그래프.

도 8은 수확 하루 전에 에센셜 오일 제제를 처리한 후 수확하여 상온에 보관하면서 잿빛곰팡이병 이병률을 관측한 사진.

도 9는 에센셜 오일의 경시적 안정성을 보여주는 그래프.

본 발명은 잿빛 곰팡이병 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에센셜 오일을 주성분으로 하는 잿빛 곰팡이병 방제용 조성물에 관한 것이다.

잿빛 곰팡이병균은 전 세계적으로 발생하여 과채류를 비롯한 다양한 작물의 수확 전·후에 막대한 경제적 피해를 야기하는 대표적인 다범성 균이다. 이 병원균은 잎, 줄기, 꽃과 과실 및 뿌리 등 작물의 모든 부위에 발생하며 특히 시설하우스에서 재배하는 작물에 피해가 매우 크다(Elad, Proceeding Symposium International Production et Protection Integrees en Culture Horticole. IAV Agadir, Morocco, 518, 1997). 잿빛 곰팡이 병균은 병원균이면서도 부생적 생활을 하는 특성(Rosslenbroich and Stuebler, Crop Protection. 19, 557-561, 2000)때문에 노화된 조직이나 상처 또는 다른 병에 의해 피해를 받은 조직에서 2차적인 감염을 일으킨다. 잿빛 곰팡이병균은 내구체인 균핵을 형성함으로써 화학농약 및 각종 부적당한 환경에서 생존할 수 있으며, 토양 및 죽은 식물체 잔해물에서도 다년간 병원성을 유지할 수 있다. 이들은 4℃ 정도의 낮은 온도에서도 생장이 가능하고, 다습할 경우에는 대발생하기 때문에, 겨울철 시설하우스에서 야간의 온도 저하 때문에 환기를 시키지 못할 경우 저온 다습한 조건이 형성되어 잿빛곰팡이병이 대발 생하며 큰 경제적 손실을 일으킨다. 또한 수확된 과실을 보관하는 저온창고에서도 쉽게 발생하고 Penicillium병과 함께 저장과실에 심각한 손실을 끼치고 있다.

딸기는 과실의 물리적인 상태(Gilles, Hofchen Brife 12, 141-170, 1959)와 유전형(Daugaard, Biol. Agric. Hort. 16, 351-361, 1999; Hebert et al., Acta Hortic. 567, 659-661, 2002)에 따라 잿빛곰팡이병에 대한 감수성이 다르지만 본질적으로 저항성을 가진 품종은 없다. 잿빛 곰팡이 병균에 의한 딸기 잿빛곰팡이병은 주로 개화기에 감염되며 수확기가 지나 과숙한 상태에서 수확했을 경우에도 많이 발생한다(Powelson, Phytopathology 50, 491-494, 1960; Bristow et al., Ann. App. Biol. 109, 545-554, 1986). 즉, 잿빛 곰팡이 병균은 기주의 방어장벽이 사라지거나, 침입성 자극이 발생할 때까지 잠복한 후 침입의 호조건이 되면 침입한다는 것이다(Terry, et al., Biology and Technology. 31, 201-212, 2004).

잿빛 곰팡이 병균은 유전적 변이가 용이하기 때문에 약제에 대한 저항성을 비교적 쉽게 획득할 수 있다. 그 예로 benzimidazole계 농약의 빈번한 사용은 저항성균의 발생을 촉진시켰으며, 단일약제의 지속적인 사용으로 저항성균의 우점화가 이루어졌다. 특히 Elad (Plant pathology. 41, 41-46, 1991)는 benzimidazoles, dicarboximides, diethofencarb 및 sterol biosynthesis inhibitors와 같은 약제에서 짧은 기간 내에 저항성균이 발생하였다고 보고하였으며, Yarden (Phytopathology. 32, 1478-1483, 1993)은 잿빛곰팡이병균이 point mutation을 통해 β-tubulin 합성 저해 약제에 저항성을 획득한다고 보고하였다. 우리나라에서도 1972년에 benzimidazole계 살균제가 등록된 이래 1984년에 백 등( 농자원개발연구소 농자원개발논집. 9, 35-44, 1984)이 저항성균의 출현 및 그 발생 빈도가 매년 증가양상을 보인다고 하였다. 또한, 김 등(균학회소식지. 9(1), 54-66, 1997)은 dicarboximide계 살균제에 대한 저항성균과 여러 계통 약제에 대해 저항성을 갖는 다중저항성균을 보고하였다.

저항성균의 발생 빈도가 늘어감에 따라 딸기 재배시 여러 계통 약제의 교호 처리가 불가피해졌으며, 약제 처리량도 늘어나 농가에 막대한 경제적 손실을 야기하게 되었다. 최근 선진국을 비롯한 국내 시장에서 농약을 처리하지 않은 과채류 등이 소비자들에게 선호되고 있으며, 그에 따라 저농약, 무농약, 천연물 농약, 미생물 농약 재배법 등이 각광받고 있다. 그러나 저농약, 무농약 농법은 그 재배법이 까다롭고 많은 인력을 필요로 하며 갑작스런 병해충 발생에 대해 무방비 상태로 노출되는 결정적인 단점이 있어 널리 보급되지 않았다. 이에 반해 천연자원을 이용하는 천연물 농약이나 미생물 농약의 개발은 아직까지는 여러 가지 보완해야 할 문제점이 남아 있으나, 그들 본연의 우수한 병 방제 효능을 적극 활용할 뿐만 아니라 소비자를 비롯한 인류의 기본적 요구사항인 생태계 보존을 비롯한 인류의 건강과 보다 나은 미래를 위해 반드시 이루어져야 할 것이다.

에센셜 오일은 식물의 표피나 엽육 조직에서 분화된 세포 외 특정공간에 저장되어 있는 끓는 온도가 낮은 기름성 물질이며 공기 중에 쉽게 휘산되어 인간의 후각을 통해 인지 될 수 있는 저 분자량의 액상 혼합체로(Evans, Pharmacognogy 14th Edition. WB Saunders company Ltd, 1998; 송 등, 한국국제농업개발학회지. 11(1), 107-125, 1998) 주로 냉침법(maceration), 온침법(digestion), 냉흡수법(enfleurage), 용매추출(solvent extraction), 초임계 유체추출(supercritical fluid extraction : SFE), 프로라솔(Florasols) 등의 방법으로 추출된다(정 등, 한국작물학회지. 48(S), 41-48, 2003). 에센셜 오일은 고대로부터 음식의 부패를 막기 위한 향신료로 사용되었다는 기록이 많이 남아 있다. 이것은 오래 전부터 에센셜 오일의 광범위한 항균활성효과가 인지되어 활용되었다는 것을 말해준다(Kim et al., J. Agric. Food Chem. 43, 2839-2845, 1995; Packiyasothy and Kyle, Food Mirobiol. 62, 139-148, 2002; Alzoreky and Nakahara, J. Food Microbiol. 80, 223-230, 2002). 1977년에 에센셜 오일과 그 유도체들의 항균활성실험을 통해 에센셜 오일과 그 유도체 중 60% 정도는 균류를 억제하고, 30% 정도는 세균을 억제한다고 밝혀진 이후(Chaurasia and Vyas, J. Res. India Med. Yoga Homeopath. 1977, 24-26, 1977) 각종 문헌에서 terpenes이나 terpenoids가 세균, 균류, 바이러스, 원생동물에 강력한 항균활성을 갖으며, 특정 해충 및 특정 식물병원균에 대해 살충, 항균활성을 갖는다는 사실도 알려졌다. 한편 Ultee 등(Applied and Environmental Microbiology 68(4), 1561-1568, 2002)은 식중독 병원균인 Bacillus cereus에 에센셜 오일을 처리하여 항균활성 기작을 밝혀냈으며, thymol 처리에 의해 Aspergillus parasiticus의 aflatoxin 생성이 억제됨이 보고되었다. 최근 에센셜 오일의 폭넓은 항균작용과 관련하여 Nostro 등(FEMS microbiology letters 230, 191-195, 2004)은 에센셜 오일이 약제 내성의 유무에 상관없이 모든 포도상구균에 강력한 항균활성을 나타낸다고 밝혀냈다. 또한 부패하기 쉬운 식품의 보존성을 늘리기 위해 에센셜 오일을 이용하고, 적용범위를 넓히기 위한 시도가 여러 나라에서 이루어지고 있다.

이와 같이 뛰어난 항균활성을 인정받아 오래 전부터 식품 보존제로서 사용된 에센셜 오일은 친환경 농산물을 선호하는 소비자의 요구와 친환경적인 농약의 개발이라는 시대적 소명아래 식물병 방제분야에서도 점진적으로 연구가 이루어지고 있다. 그러나 방제 시 나타나는 약해로 인하여 농업 현장에서 에센셜 오일을 직접 적용한 사례는 거의 없었으며, 최근 Ji 등(Plant Disease. 89, 497-500, 2005)이 토마토 세균성 시들음병을 방제하기 위하여 에센셜 오일을 최초로 포장에 사용한 사례만이 유일하다. 이렇듯 에센셜 오일의 실질적인 농업적 활용은 식품분야에 비하여 거의 이루어지지 못하고 있는 실정이며 농업적 활용을 위해서는 약해로 인한 문제들을 해결하여야만 한다. 그동안 뛰어난 항균활성을 인정받고도 농업분야에서 활용되지 못한 에센셜 오일을 실질적으로 농업 분야에 효과적으로 적용할 수 있다면 화학농약의 오·남용으로 인한 생태계 파괴, 잔류 독성 문제, 각종 저항성 균주의 출현 등의 문제를 해결할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 에센셜 오일을 이용하여 약해가 없고, 인체에 독성이 없으면서도, 잿빛 곰팡이병에 대해 내성을 유발하지 않아 방제효과가 높은 잿빛곰팡이병 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 약해를 유발하지 않으면서 잿빛 곰팡이병을 효율적으로 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 Methyl eugenol과 methyl eugenol에 대해 0.5~4배(v/v)의 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물에 관한 것이다.

Methyl eugenol은 31종의 약용식물을 대상으로 ethanol 추출물의 잿빛 곰팡이 병균에 대한 항균활성을 검증한 결과 항균활성이 가장 뛰어난 세신의 ethanol 추출물에 포함된 것과 동일한 물질로 동정된 에센셜 오일이다. Methyl eugenol은 젤리, 빵, 비알콜성(비발효) 맥주, 껌, 사탕, 푸딩 및 아이스크림의 향료로써 사용되고 있는 에센셜 오일로써 상온에서 맑은 노란색을 띠는 액체이며 끓는점은 254.7℃, 녹는점 -4℃이다. 장미, 피멘토, 바실, 히아신스, 시트로넬라, 아니스, 계피꽃, black berry essence, 바나나, 후추 등으로부터 얻어지며 1일 섭취 권장량은 0.26㎎/㎏이다.

Methyl eugenol은 in vitro 검정에서 다른 에센셜 오일인 carvacrol, thymol, eugenol처리구와 마찬가지로 잿빛 곰팡이 병균의 균사 선단부 및 균사 곳곳에 큰 손상을 입혔으며 이로 인해 세포질도 유출시켰으나, 다른 에센셜 오일보다 in vitro 검정에서 잿빛 곰팡이 병균에 대한 항균활성이 매우 낮았다.

그러나, 에센셜 오일을 물과 혼합하여 딸기 과실에 살포한 in vivo 실험에서 는 처리구간의 편차가 크긴 하지만 methyl eugenol 처리구들이 대체적으로 carvacrol, thymol, eugenol 처리구들에 비하여 방제가가 높게 나타나 in vitro와는 정반대의 결과를 보여주었다. Carvacrol, thymol 및 eugenol 처리구들은 고농도 살포시 무처리구에 비하여 잿빛곰팡이병이 더 많이 발생하였으며, 저농도 처리구 역시 고농도 처리구보다 감염률은 낮았지만 in vitro에서와 같은 높은 항균활성을 보이지 않았다.

농도가 높을수록 병발생률이 증가된다는 점은 에센셜 오일이 고농도에서 약해를 일으킬 수 있다는 것을 말해준다. 이에 고추 종자 발아 실험을 통한 약해 검정으로 고농도의 에센셜 오일이 뿌리털 형성을 억제한다는 것을 확인하였으며, 딸기과실에 대한 약해 검정에서는 methyl eugenol을 제외한 고농도의 에센셜 오일들이 연약한 딸기과실 표피에 연화성 약해를 일으켰다. 이러한 약해 문제는 에센셜 오일의 농업적 적용에 관한 연구에서 대부분 언급되고 있지 않다. 단지 Arras and Usal(Journal of Food Protection 64(7), 1025-1029, 2001) 만이 에센셜 오일에 의한 과실의 손상을 언급하였는데, 이러한 약해 때문에 그 동안 에센셜 오일의 농업적 적용이 이루어지지 않았던 이유가 아닐까 추정된다. 따라서 in vitro에서는 항균활성이 낮았으나 약해를 일으키지 않으며, in vivo에서는 그 효과가 현저히 뛰어난 methyl eugenol을 함유한 조성물을 잿빛 곰팡이 병균의 방제의 용도로 사용할 수 있다.

그러나 상기의 methyl eugenol은 물과 섞이지 않으므로 균일한 농도의 도포 가 매우 어려우며 희석되지 않은 덩어리가 분무되어 약해를 유발하거나, 물만 분무되어 방제효과가 나타나지 않을 우려가 있다. 따라서 상기의 methyl eugenol 조성물은 methyl eugenol에 대해 0.5~4배(v/v)의 계면활성제를 함유하는 조성물을 물로 희석하여 제조한 마이크로 에멀젼(emulsion)의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 계면활성제는 methyl eugenol을 유화시키기 위한 것으로 양이 너무 적으면 methyl eugenol이 완전히 유화되지 않아 균일한 농도로 도포하기가 어려우며, 계면활성제의 양이 너무 많으면 딸기 과실이나 잎의 기공을 막아 생육억제를 초래할 수 있다. 계면활성제는 저농도로 사용하였을 때 인체에 무해한 것이라면 어느 것이나 무방하며, 특히 식용으로 사용할 수 있을 만큼 안전성이 확인된 계면활성제가 더욱 바람직하다. 하기 실시예에서는 식용 계면활성제의 하나인 tween 20을 사용하여 에센셜 오일을 유화시켰으나 이에 한정되는 것은 아니며, Polyoxyethylene(Eethylene oxide(EO) 몰수 1~20) sorbitan alkylate(C=12~18, 포화지방산과 불포화지방산 포함), Polyoxyethylene(EO 몰수 25~50) castor oil, Polyoxyehtylene(EO 몰수 10~25) tristyrylphenyl ether 및 Calcium dodecylbenzene sulfonate로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 계면활성제를 사용할 수 있다. 계면활성제를 이용한 조성물의 제조는 에센셜 오일의 약해를 해결해주며, 에센셜 오일의 특성을 최대한 발휘하게 하여 그들의 농업적 적용을 가능케 해주는 핵심적인 요소라 할 수 있다.

상기 조성물은 methyl eugenol에 대해 0~7배(v/v)의 동결방지제를 추가로 함유할 수 있다. 동결방지제로서는 Glycerin, etheyleneglycol, propyleneglycol, urea, ethyl alcohol로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 동결방지제를 사용하는 것이 바람직하다. 동결 방지제는 겨울철 하우스 내에서 야간에 온도가 저하될 경우, 조성물이 결빙되는 것을 방지하기 위한 것으로 동결의 우려가 없는 경우에는 첨가하지 않아도 무방하다. 동결방지제의 사용량은 methyl eugenol 조성물의 항균활성에 크게 영향을 미치지는 않으나, methyl eugenol의 7배 이하로 사용하여도 충분한 동결방지 효과를 얻을 수 있으므로 0.5~7배(v/v)를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 Methyl eugenol, 계면활성제, 동결방지제로 구성된 혼합물을 이용하여 잿빛 곰팡이 병균을 방제할 때 methyl eugenol의 농도는 10~1,000ppm이 되도록, 보다 바람직하게는 10~100ppm이 되도록 물에 희석하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물을 딸기 포장에 처리하였을 때 1,000ppm까지 외관상 약해가 발생하지 않았으며 딸기 과실의 당도와 경도 또한 무처리구에 비해 큰 차이가 없었다. 그러나 방제 효과는 고농도보다 저농도의 경우 더욱 현저하여 methyl eugenol이 200ppm인 경우에는 100ppm보다 방제효과가 훨씬 낮았다. Thymol이나 eugenol 처리구에서는 in vitro에서와 같은 강력한 항균활성을 확인할 수 없었다. 또한 수확 하루 전에 에센셜 오일 제제를 처리하였을 때 딸기의 저장성이 크게 향상되었고, 특히 methyl eugenol 처리구에서 딸기 잿빛곰팡이병 억제율이 매우 높게 나타났다. In vitro와 상반된 이러한 결과들은 아직까지 밝혀지지 않은 methyl eugenol의 항균활성 기작이 있거나 실험에 선택된 methyl eugenol의 농도가 딸기에는 약해를 주지 않지만 병원균에는 치명적인 항균활성을 나타내는 유효한 농도일 수 있다는 점을 시사한다.

상기 mehtyl eugenol의 조성물은 에센셜 오일의 안정성을 획득하기 위하여 methyl eugenol의 0.1~0.2배(v/v)의 산화방지제를 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 산화방지제로는, Butylated hydroxytoluene(BHT)과 같이 일반적으로 산화방지 효과가 있다고 알려져 있고, 독성이 적은 것이면 어떤 것을 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명에 의한 잿빛 곰팡이 방제용 조성물은 항균활성 보조제로서 NaHCO₃를 추가로 함유할 수 있다. 항균활성 보조제로 NaHCO₃, neem oil, 분자량 30만 이상의 chitosan을 선발하여 항균 효과를 검증하였다. 이 중 neem oil은 thymol, eutenol 또는 methyl eugenol 조성물 모두의 항균활성을 저하시켰다. 분자량 30만 이상의 chitosan은 에센셜 오일과 조합하였을 때 약간의 효과 증진은 있으나 chitosan 자체의 처리 농도가 고농도이기 때문에 실제 포장에 적용 시 많은 양의 chitosan을 용해하여야 하고, 처리 시 과일의 표면이 경화되는 등의 문제점이 발생한다. 그러나 NaHCO₃는 그 자체만으로도 항균활성이 뛰어났으며 에센셜 오일과 조합하였을 때도 방제효과가 증가했고 특히 methyl eugenol과 조합될 경우 두드러진 방제효과의 상승을 나타냈다.

상기 에센셜 오일 제제의 안정성은 빛을 차단한 상태에서 60℃ 항온기에서 4주 후까지도 항균활성이 나타나 매우 안정적인 것으로 판명되어 상용 천연물 농약 으로서 사용도 가능한 것을 확인할 수 있었다.

Nostro 등(2004)의 연구에 따르면 carvacrol과 thymol은 포도상구균(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis)의 약제 내성에 상관없이 강력한 항균활성을 나타낸다고 한다. 이것은 에센셜 오일의 항균활성 기작이 포도상구균의 약제 내성과 관련 없는 세포막 손상 또는 ATP 합성저해 기작에 관여하기 때문이다. 이러한 관점에서 약제 저항성 잿빛곰팡이병의 방제도 에센셜 오일을 통해서 가능하게 될 것으로 생각된다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서 물질의 추출과 open column chromatography용 용매는 Merck의 1급 시약을 사용하였으며 항균활성 검정에 사용한 배지는 PDA(Potato dextrose agar, Difco, USA)를 사용하였다. 회전 감압농축기는 N-1000 (Eyela, Japan)을, open column chromatography용 silica gel은 Merck사의 Silica gel 60 (70~230 mesh, column chromatography용, Germany)을, LH-20 column chromatography용 resin은 Sephadex^TM사의 LH-20 (Column chromatography용, Sweden)을, octadecyl silane (ODS)는 Merck사의 LiChroprep RP-18 (40~63㎛, Column chromatography용, Germany)이 사용되었으며, TLC plate는 Silica gel 60 F254 (Merck, Germany), LCK18F Silica Gel 60Å (Whatman, UK)를 사용하였다. 분자량 측정에는 LC-MS (Liquid chromatograph / mass spectrometer)를 이용하였고 기기는 HP 1100 series LC/MSD (USA)를 사용하였다.

실시예 1 : 잿빛곰팡이병균에 항균활성이 있는 약용식물의 선정

1) 약용식물체로부터 시료의 추출

표 1의 사용된 31가지의 약용 식물을 약재방앗간의 분쇄기로 곱게 분쇄시켰다. 시료 100g씩을 70% (V/V) 에탄올 5L에 각각 넣고 상온에서 3시간 진탕배양 하여 3회 추출하였다. 추출물을 모아서 거즈와 filter paper를 이용하여 여과한 다음 회전 감압농축기를 이용하여 ethanol을 완전히 제거하고 동결건조하여 시료로 사용하였다.

2) 잿빛곰팡이병균에 대한 항균 활성 검정

하기 실시예에서 항균활성 검정을 위한 딸기 잿빛곰팡이병균 Botrytis cinerea는 2004년 충남 논산시 연무읍의 딸기 시설하우스에서 분리한 CNU-BC 30 (mycelium type)과 CNU-BC 40 (spore type)을 사용하였다.

상기 실시예에서 제조한 식물체 추출물의 시료를 5㎎/㎖의 농도로 각각 PDA에 혼합하여 고압멸균 시킨 후 9㎝의 petri dish에 분주하여 배지를 만들었다. 준비된 배지에 PDA에 전배양된 잿빛 곰팡이병균 균사 선단부 5㎜씩을 접종하고 22℃ 항온기에서 4일간 배양한 뒤 무처리구와의 균사생장률을 비교측정하여 항균활성을 검정하고 그 결과를 표 1에 기재하였다.

표 1에서 볼 수 있듯이 31가지 식물은 2종이 90% 이상, 5종이 70~90%, 4종이 50~70%, 6종이 30~50%, 7종이 30% 미만의 잿빛 곰팡이 병균에 대한 생육억제 효과를 나타내었으며, 6종은 오히려 생육촉진 효과를 나타내었다. 따라서 잿빛 곰팡이병균에 대한 항균활성이 가장 뛰어났던 세신(족도리, Asarum sieboldii)을 본 실험의 재료로 선발하였다.

실시예 2 : 잿빛 곰팡이병균에 항균활성을 갖는 물질의 분리

1) 세신 ethanol 추출물의 용매 분획

실시예 1의 1) 방법에 따라 제조된 세신의 100% ethanol 추출물 200g을 증류수 500mL에 녹인 뒤 hexane, ethyl ether, chloroform, ethyl acetate 및 butanol을 각각 3000mL씩 사용하여 순차적으로 추출하고 분획하였다. 각 용매의 분획분을 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 감압증류된 용매 분획분을 각각의 용매 2mL에 녹인 후 paper disc(Toyo, 8㎜, Japan)에 50㎕씩 점적한 뒤 상온에서 용매를 완전히 증발시킨 후 PDA 배지에 잿빛곰팡이 병균과 2㎝거리를 두고 올려놓았다. 상기 배지를 22℃ 항온기에서 배양한 결과를 도 1에 도시하였으며, 도 1의 clear zone의 길이로 항균활성 유무를 판단하였다.

도 1의 A는 상기 용매 분획분의 대조구로 세신 추출물을 처리하지 않고 잿빛 곰팡이균을 22℃ 항온기에서 5일간 배양한 후의 사진이다. 도 1의 B는 상기 방법에 의해 각 용매의 분획분과 함께 잿빛 곰팡이균을 60일 배양한 후의 사진으로, 1과 2는 hexane 분획분, 3은 chloroform 분획분, 4는 ethyl acetate 분획분, 5는 물 분획분의 paper disc를 표시한다. 60일 후에도 clear zone이 선명하게 존재하여 세신의 ethanol 추출물의 강력한 항균활성을 나타내고 있으며 특히 hexane 분획분이 가장 강력한 항균활성을 보여주었다.

2) Silica gel open column chromatography

실리카겔 200g을 hexane 100%로 현탁하여 컬럼(50×300㎜)에 충진시킨 후, 상기 1)에서 제조된 세신의 hexane 추출물 6.4g을 hexane:ethyl ether 20:0→18:2→16:4→14:6→12:8→10:10→8:12→6:14→4:16→2:18→0:20을 각 200mL씩 순차적으로 사용하여 용출하여 분획하였다. 이하, 용매의 비율은 모두 부피비를 의미한다. 각 분획을 1)과 동일한 방법에 의해 항균활성을 측정한 결과 590mg을 얻은 hexane:ethyl ether 18:2 분획물의 항균활성이 가장 강한 것을 확인할 수 있었다.

항균활성이 높은 상기 분획물을 다시 silica gel open column chromatography(50×60㎜)로 hexane : ethyl ether 20:0→19:1→18:2→17:3→16:4→15:5→14:6→13:7→12:8→11:9→10:10을 각 200mL으로 용출하여 분획하였다. 상기 분획에 대해, 1)과 동일한 방법에 의해 항균활성을 측정한 결과 항균활성이 강한 분획물 320mg을 얻었다.

3) LH-20 column chromatography

항균활성 분획을 더욱 정제하기 위하여 LH-20 column chromatography를 실시하였다. Sephadex^TM사의 LH-20을 methanol 100%로 현탁하여 컬럼(20×700㎜)에 충진시킨 후 2)단계에의 2차 silica gel open column chromatography를 통하여 얻어진 항균활성 분획을 100% methanol로 용출하여 소량씩 분획하였다. 상기 1)과 동일한 방법에 의해 항균활성을 측정하여 항균활성을 나타내는 분획을 수거하고 감압증류하여 항균활성 물질을 분리하였다.

4) ODS thin layer chromatography

분리된 항균활성 물질 10mg을 ethyl ether 1mL에 녹인 후 ODS TLC plate에 2㎕ 씩 점적한 후 각각 60, 70, 80, 85, 90, 100%의 함수 methanol를 사용하여 전개하였다. p-anisaldehyde 발색 시약을 사용하여 TLC 상의 물질의 분리도를 확인한 결과, 85%의 함수 methanol을 전개용매로 사용한 TLC에서 물질의 분리가 가장 잘 이루어졌다. TLC 상에 분리된 spot을 수거하여 100% methanol에 용출시켜 1)과 동일한 방법에 의해 항균활성을 검정한 결과 R _f 0.6 의 spot이 항균활성을 갖고 있음을 확인하였다.

5) ODS column chromatography

다량의 항균 활성 물질을 얻기 위해서 4)에서 확립된 조건에 따라 ODS column(50×300㎜) chromatography로 85% methanol의 용매계를 사용하여 항균활성 물질을 분리 정제하였다.

실시예 3 : 항균활성 물질의 동정

1) 세신에 함유된 에센셜 오일의 특성 확인

식물에서 분리되는 항균활성물질 중 hexane과 같은 용매에 녹는 지용성 성분은 에센셜 오일로 알려져 있다. 세신에 함유되어 있는 것으로 알려진 에센셜 오일(김 등, 1999) 중 methyl eugenol, safrole을 선정하여 실시예 2의 1)과 동일한 방법에 의해 항균활성 효과의 유무를 검정하였다. Methyl eugenol은 Aldrich사(미국)으로부터, safrole은 Sigma사(스위스)로부터 각각 구입하였다. 검정 결과 methyl eugenol은 항균활성을 나타내었으나 safrole은 항균활성이 없었다.

2) 본 발명의 세신 유래의 항균물질의 동정

실시예 2의 4) 또는 5)에서 얻은 항균활성 물질과 methyl eugenol을 ODS TLC 상에 나란히 점적한 후 85% methanol로 전개하고 p-anisaldehyde로 발색한 결과 두 물질의 R _f 값이 0.6으로 동일한 것을 확인하였다. 항균활성을 분석하였던 PDA 배지에서 본 발명에 의한 추출물과 methyl eugenol의 수거 부분을 현미경으로 관찰한 결과 역시, 두 개의 샘플 모두에서 세포질 유출 현상이 관찰되었다.

또한, 상기 두 가지 시료를 HP 1100 series LC/MSD(USA)를 사용하여 분자량을 측정한 결과 분자량이 178로 모두 동일하여, 본 발명에서 세신으로부터 분리, 정제한 항균활성물질은 [화학식 1]의 methyl eugenol로 동정하였다.

실시예 4 : 에센셜 오일의 in-vitro 항균활성

1) 에센셜 오일의 종류에 따른 항균활성 비교

상기 실시예에서 분리된 물질이 methyl eugenol로 동정됨에 따라, methyl eugenol과 항균활성을 갖는 것으로 알려진 에센셜 오일인 carvacrol, thymol, eugenol, safrole 및 cymene을 알드리치사 또는 시그마사로 부터 구입하여 항균활성을 비교하였다.

PDA 배지 상에 4㎝거리를 두고 한쪽에는 잿빛 곰팡이병균의 균사선단부를 접종하고, 다른 한쪽에는 carvacrol, thymol, eugenol, methyl eugenol, safrole, cymene을 methanol로 희석하여 50, 250, 500, 750, 1㎎씩 함유되도록 각각의 paper disc에 흡수시켰다. 상기 paper disc를 실온에서 15분간 방치하여 methanol를 모두 증발시킨 후 배지 위에 치상하였다. 22℃ 항온기에서 상기 배지를 3일간 배양하고 무처리구와의 균사 생장률을 비교 측정하여 각 에센셜 오일의 농도별 항균활성 효과를 평가하고 그 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이 carvacrol과 thymol은 750㎍/disc의 농도에서 60%이상, methyl eugenol과 eugenol은 50% 이상의 균사생육억제 효과가 있었고 농도가 높아질수록 항균활성이 높았다. Safrole도 농도가 높아질수록 항균활성이 높아지는 경향이 있지만 carvacrol과 thymol에 비하여 상대적으로 낮았다. 한편 특이하게도 cymene은 농도가 높아질수록 항균활성효과가 낮아졌다. 따라서 동일 농도일 때 항균활성효과가 뛰어난 carvacrol, thymol, eugenol, methyl eugenol이 잿빛곰팡이병 방제제로써 이용 가능함을 확인하였다.

2) 항균활성 특성

에센셜 오일들의 항균활성 특성을 관찰하기 위하여 상기 1)의 실험에서 clear zone이 나타난 부분에 methylene blue를 떨어뜨리고, methylene blue가 흡수되는 양상을 현미경을 통해 관찰하였다(도 3). 도 3에서 확인할 수 있듯이 항균활성을 보이는 에센셜 오일 처리구에서 균사 선단부 및 균사에 균열이 생기며 이러한 부위를 통하여 세포질이 유출되는 현상이 관찰되었으며 세포질이 유출된 부분의 균사는 비어있었다.

3) 에센셜 오일 함유 배지의 잿빛곰팡이 병균 생육억제

상기 1)에서 균사생육 억제율이 높았던 carvacrol, thymol, eugenol, methyl eugenol과 tween 20을 각각 6:4의 중량비로 혼합하여 에센셜 오일이 배지와 잘 섞이도록 하였다. 상기 혼합물을 에센셜 오일이 10, 50, 100ppm의 농도가 되도록 PDA 배지에 첨가하고 고압멸균하여 에센셜 오일 함유 PDA 배지를 제조하였다. 상기 배지에 잿빛 곰팡이병균의 균사 선단부 5mm를 접종하여 22℃에서 4일간 배양한 후 무처리구와의 균사생장률을 비교하여 균사생장 저해율을 검정하여 도 4에 도시하였다. Carvacrol, thymol, eugenol은 10ppm에서도 31%이상 균사의 생장을 억제하였으며 50ppm이상의 농도에서 carvacrol과 thymol은 81%이상, eugenol은 65%이상 균사의 생육을 억제하였다. methyl eugenol은 10ppm의 농도에서 16%, 100ppm에서는 43%의 생육억제 효과를 보여 carvacrol, thymol, eugenol에 비하여 그 효과가 비교적 낮음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 에센셜 오일 제제의 활성 검정

1) 에센셜 오일의 고농도 직접 살포

고농도 에센셜 오일의 직접적인 딸기 잿빛곰팡이병 방제 효과를 검정하기 위해 딸기(cv. 사찌노까)를 70% ethanol로 표면소독한 후 멸균수로 3회 씻고 tray에 4개씩 넣어서 준비하였다. 잿빛 곰팡이병균의 포자를 6×10⁴spores/㎖의 농도로 20㎕를 딸기 화탁에 접종하였다. carvacrol, thymol, eugenol 또는 methyl eugenol을 5,000 또는 10,000ppm의 농도로 각각 멸균수에 섞어 용액을 제조한 후 살포하기 직전에 격렬히 흔들어서 분무기를 이용하여 상기 방법에 의해 준비된 딸기에 각각 약 2mL 씩 살포하였다. 뚜껑을 덮어 22℃ 항온기에서 4일간 방치한 후 무처리구와 에센셜 오일 처리구의 이병률(Diseased rate)와 방제가(Control value)를 조사하여 표 2에 나타내었다. 이병률과 방제가는 각각 하기 방법에 의해 계산하였다.

이병률 = 딸기 과실 1개에서 병에 걸린 면적(%)

방제가 = [1-(처리구의 이병률/무처리구의 이병률)]*100(%)

표 2에서 carvacrol과 thymol 처리구는 특이하게도 배지상에서의 분석결과와는 달리 대조구에 비하여 100~400% 이상의 병이 진전되었으며, eugenol과 methyl eugenol 처리구는 무처리구에 비하여 병 억제 효과가 있는 것도 있었지만 처리구간의 유의성이 매우 낮게 나와 결과에 대한 신뢰성이 낮았다. 이러한 결과는 고농도의 에센셜 오일을 처리하였을 경우 병방제 효과보다는 병진전 효과 또는 약해가 일어날 가능성이 있음을 말해준다.

2) 에센셜 오일의 저농도 직접 살포

carvacrol, thymol, eugenol 또는 methyl eugenol 용액을 100 또는 200ppm의 농도로 제조한 것을 제외하고는 1)과 동일한 방법에 의해 에센셜 오일을 잿빛 곰팡이병균의 포자가 접종된 딸기에 각각 2mL씩 살포하였다. 딸기에 에센셜 오일을 분무 처리한 후 뚜껑을 덮고 22℃ 항온기에서 4일간 둔 후 딸기의 잿빛곰팡이병에 대한 이병률을 조사하여 표 3에 도시하였다.

저농도로 에센셜 오일을 물에 희석하여 직접 처리하였을 경우 carvacrol은 고농도 처리구에 비하여 병억제 현상이 발생하였지만 여전히 병도 진전시켰는데 특히 100ppm과 200ppm 간에 효과의 차이가 매우 심하였으며 thymol의 경우 딸기 과실 표면에 약해를 일으키는 것 같았다. Eugenol 처리구는 농도가 낮아졌을 경우 병이 더욱 진전되었으며, methyl eugenol 처리구는 농도가 낮아짐에 따라 병방제 효과가 월등히 좋아졌다.

실시예 6 : 약해검정

in vitro에서 적은 농도에서도 강력한 항균활성을 나타내었던 에센셜 오일들을 딸기에 직접 적용하였을 때 오히려 병진전 효과가 나타났고, 실험 처리구간의 편차가 컸다. 이러한 현상은 에센셜 오일의 약해가 물에 섞이지 않는 특성으로 인해 표출된 것으로 추정되어 에센셜 오일의 약해 유무를 검정하였다.

1) 고추 종자 발아에서의 약해 검정

고추 종자(cv.부광, Seminis)를 증류수에 하룻밤 침지시켰다. Petri dish에 filter paper를 깔고 5㎖의 증류수를 넣은 뒤 침지시킨 고추 종자를 가장자리 쪽으로 10개씩 놓았다. carvacrol, thymol, eugenol 또는 methyl eugenol을 ethanol에 녹인 다음 500 또는 1,000㎍/disc의 농도가 되도록 paper disc에 점적한 뒤 상온에서 ethanol을 완전히 증발시키고 고추 종자가 놓인 petri dish의 가운데에 놓았다. 뚜껑을 덮은 후 25℃ 항온기에서 고추 종자가 발아할 때까지 배양한 후 그 일예를 도 5에 나타내었다. 도 5의 A는 대조구; B는 thymol 500㎍/disc 처리구; C는 뿌리털이 형성된 고추종자의 발아체, D는 뿌리털이 생성되지 않은 고추종자의 발아체를 나타낸다.

대조구에서는 고추종자가 90%이상 발아한 반면, 에센셜 오일 처리구들은 약 70% 정도 발아하였으며, 발아된 고추종자에서 뿌리털이 전혀 발생하지 않았다. 이는 에센셜 오일이 주근과 같은 두꺼운 조직에는 해가 덜하지만 뿌리털과 같은 미세한 세포조직에서 매우 민감하게 작용하기 때문으로 생각된다.

2) 딸기 과실에서의 약해 검정

carvacrol, thymol 또는 methyl eugenol을 ethanol에 녹인 뒤 100, 50, 10㎎/filter paper의 농도가 되도록 각각 filter paper(90㎜, Toyo, Japan)에 흡수시킨 다음 상온에서 ethanol을 완전히 증발시킨 뒤, 600㎖들이 플라스틱 용기에 상처가 없는 딸기 과실(cv. Akihime) 4개씩과 함께 넣고 밀봉하였다. 20℃ 항온기에서 10일동안 외관을 관찰하고 그 사진을 도 6에 개시하였다.

도 6에서 A는 각 에센셜 오일 처리 후 4일째, B는 10일째의 사진이다. 도 6에서 확인할 수 있듯이 methyl eugenol을 제외한 carvacrol 또는 thymol 처리구는 처리 4일 후부터 딸기 과육의 변색이 나타났으며, 10일 후에는 과육의 완전한 탈색 및 당질과 같은 성분의 용탈이 일어났다. 그러나 특이하게도 methyl eugenol 처리구는 변색이나 당질과 같은 성분의 용탈이 전혀 일어나지 않아 외관상 약해가 전혀 없음을 확인하였다. 따라서 제형화하지 않은 순수 methyl eugneol의 경우 비록 병 방제효과는 약하지만 식물체에 미치는 영향은 매우 적다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7 : 효과적인 제형의 개발

에센셜 오일은 물과 섞이지 않는 특성으로 인하여 에센셜 오일을 물에 희석하여 분사할 경우 에센셜 오일만이 분사되면 약해가 날 수 있고, 물만이 분사될 경우 전혀 항균활성 효과가 없는 문제점이 있다. 따라서 에센셜 오일이 물에 완전히 섞여 작은 입자로 고르게 분사될 수 있도록, 식용 계면활성제인 tween 20과 ethanol을 사용하여 제형에 관한 실험을 실시하였다.

먼저 각 에센셜 오일과 tween 20 및 ethanol을 1:1:8, 1:2:7, 1:3:6, 1:4:5, 1:5:4의 부피비로 섞어 각각 stock 용액을 만들고 상기 용액을 물에 1,000배 희석하여 물에 완전히 섞이는지를 확인하였다. 계면활성제에 의한 유화는 계면활성제가 부족하면 oil 성분이 물과 섞이지 않게 되며, 계면활성제의 양이 증가함에 따라 우윳빛이 되었다가, 계면화성제가 충분하면 투명하게 된다. Eugenol과 methyl eugenol은 tween 20의 비율이 1:2:7 이상(최종 농도 200ppm)가 되면 물과 투명하게 혼합되었으나, thymol은 tween 20이 1:3:6이상의 농도(최종 농도 300ppm)가 되어야만 투명하게 되었다. 따라서 잿빛곰팡이병균의 방제를 위한 에센셜 오일의 최적의 제형은 에센셜 오일:tween 20:ethanol이 1:3:6의 부피비로 혼합된 조성물로 정하였다.

상기 비율로 혼합된 조성물을 물에 1,000배 희석하여(에센셜 오일의 최종 농도 100ppm) 딸기(cv. Akihime)에 일주일에 1회씩 3주간 처리하고 외관상 약해 유무를 확인한 결과 세가지 에센셜 오일 모두 외관상 약해를 나타내지 않았다.

딸기의 당도는 thymol 처리구에서 9.23±0.48(%), eugenol 처리구에서 11.50±2.05(%), methyl eugenol 처리구에서 9.10±0.21(%)로써 무처리구의 당도인 10.33±1.17(%)와 비교하여 큰 차이가 나지 않았다. 경도는 thymol 처리구에서 125.59±5.24g/Φ5mm, eugenol 처리구에서 118.89±5.21g/Φ5mm, methyl eugenol 처리구에서 118.59±1.38g/Φ5mm로 측정되어 무처리구의 경도인 114.07±2.82g/Φ5mm에 비하여 에센셜 오일 처리구들의 경도가 약간씩 증가하였으며 그 중 thymol 처리구의 경도가 가장 많이 증가하였다.

상기의 방법에 의한 방제 시, 딸기의 방제효율을 측정하여 표 4에 기재하였다. 표 4에 기재된 바와 같이 methyl eugenol의 처리구에서는 62.7%의 방제효과가 나타나, in vitro에서 항균활성이 좋았던 thymol이나 eugenol에 비해 in vivo에서는 오히려 효과가 더 좋았다.

따라서 상기의 에센셜 오일의 유화제 제형은 살포에 따른 약해나 당도 및 경도의 감소가 전혀 없었으며, Methyl eugenol의 경우에는 특히 높은 방제 효과를 나타내었다. 상기 제형은 물에 1,000배로 희석하였을 때 유화(油化)가 나타나므로 추후 계면활성제의 양의 더 늘리게 되면 보다 미세한 입자의 에센셜 오일 제제가 만들어질 수 있을 것이다. 이에 따라 보다 적은 양의 에센셜 오일 도포를 통해서도 효과적인 병방제가 가능할 것으로 기대된다.

실시예 8 : 항균활성 보조제의 선발

에센셜 오일 제제와 함께 사용하면서 항균활성 효과를 증진시킬 수 있는 항균활성 보조제의 선발을 위하여 NaHCO₃, 분자량 30만 이상의 키토산, neem oil의잿빛 곰팡이병균에 대한 항균활성을 검정하였다. NaHCO₃는 5, 2 또는 1㎎/㎖, 분자량 30만 이상의 키토산은 10, 5 또는 2㎎/㎖, neem oil은 2, 1 또는 0.5㎎/㎖의 농도가 되도록 PDA 배지에 섞고 고압멸균하여 항균활성검정용 배지를 만들었다. 그 후에 잿빛 곰팡이병균의 균사 선단부 5mm을 접종하고 22℃ 항온기에서 4일간 배양한 후 균사생장률로 항균활성을 측정하여 도 7에 도시하였다. 도 7의 A는 NaHCO₃; B는 Neem oil(5% Tween 20 함유); C는 키토산의 항균활성을 보여주는 그래프이다.

NaHCO₃은 항균활성이 가장 높아 1㎎/㎖의 농도에서도 균사 63.6%, 포자 57.4의 항균활성을 보였다. Neem oil은 1㎎/㎖보다 농도가 진하여도 항균활성은 증가하지 않고 균사 36.4%, 포자 29.8%의 억제율을 보였다. 분자량 30만 이상의 키토산은 항균활성이 가장 낮아 10㎎/㎖의 농도에서 균사 48.1%, 포자 29.8%의 항균활성을 나타내었다. 따라서 에센셜 오일 제제의 항균활성 보조제로서 사용될 농도를 NaHCO₃는 1㎎/㎖, 분자량 30만 이상의 키토산은 10㎎/㎖, neem oil은 1㎎/㎖로 결정하였다.

실시예 8 : 포장 실험을 통한 에센셜 오일 제제의 항균활성 검정

1) 에센셜 오일의 농도별 항균활성

충남 공주의 계룡면 딸기 시설하우스(200평)에서 Akihime품종으로 에센셜 오일 제제의 활성을 검정하였다. 실험 전에 먼저 이병 잔재물을 제거하고 하엽을 모두 따준 후 관주하여 주었다. Thymol, eugenol 또는 methyl eugenol을 상기 실시예 7에서 사용된 비율로 에센셜 오일 stock 용액(에센셜 오일 100,000ppm)을 만든 후 포장에서 살포하기 전에 500배(200ppm), 1,000배(100ppm) 및 2,000배(50ppm) 희석하여 농약살포기를 이용하여 처리하였다. 대조약제로는 딸기 잿빛곰팡이병 방제제로 상용되고 있는 깨끄탄(diethofencarb 25% + carbendazim 25%)을 1,000ppm으로 처리하였다. 에센셜 오일 제제는 3일 간격 2회 살포하였으며 깨끄탄은 7일 간격 1회 살포하였다. 딸기는 처리구당 50포기씩 난괴법 3반복으로 배치하였다. 상기의 제제 및 대조약제의 마지막 처리 7일 후 이병률을 조사하여 표 5에 기재하였다.

Thymol 200ppm에서, eugenol 50ppm에서, methyl eugenol 100ppm에서 각각 81.5%, 63.8%, 82.5%의 최대 방제가를 나타내었다. 대조약제 깨끄탄의 방제가는 90.9%이었다. 이처럼 100ppm의 낮은 농도에서도 높은 방제효과를 나타내는 것은 추후 천연물 농약 제조시 매우 커다란 장점으로 작용할 것이라 생각된다.

2) 에센셜 오일과 항균활성 보조제의 조합

1)과 동일한 시설포장에서 동일 품종, 동일 방법을 사용하여 하기 제제의 활성을 검정하였다. 1)에서 제조한 각 에센셜 오일의 stock 용액(에센셜 오일의 유효 농도 100,000ppm)을 포장에서 살포하기 전에 2,000배(50ppm)로 희석하고 항균활성 보조제로써 NaHCO₃, 분자량 30만 이상의 키토산 또는 neem oil을 각각 1,000ppm, 10,000ppm, 1,000ppm이 되도록 첨가하여 농약살포기를 이용하여 살포하였다. 대조약제로는 깨끄탄을 1,000ppm으로 살포하였다. 또한 대조를 위하여 NaHCO3, 키토산, neem oil, tween 20 및 ethanol을 각각 표 6의 농도에 따라 살포하였다. 각 제제의 마지막 처리 7일 후에 이병률을 조사하여 표 6에 기재하고 방제가를 계산하였다.

표 6은 각 항균활성 보조제 단독 또는 에센셜 오일 제제와 조합하여 처리하였을 때의 이병률과 방제가를 나타낸다. 활성 보조제로 NaHCO₃ (1,000ppm)이나 neem oil(1,000ppm), 분자량 30만 이상의 chitosan(10,000ppm), tween 20(300ppm), 또는 ethanol(600ppm)만을 처리하였을 때는 각각 28.9%, 20.9%, 33.3%, -1.1%, 0.3%의 방제가가 나타났다.

하지만 표 6의 조합에 따라 각 항균활성 보조제들과 각각의 에센셜 오일 제제를 조합하여 처리한 결과, 50ppm의 낮은 농도 처리에 의해서도 methyl eugenol은 보조제를 첨가하지 않았을 때는 방제가가 67.0%였던 것에 비해(표 5) NaHCO₃, neem oil 및 chitosan 처리 시의 방제가는 각각 71.4%, 44.2%, 65.2%로 NaHCO₃와 chitosan은 방제효과를 상승시켰으나, neem oil은 상승효과 보다는 저해효과를 나타내었다. Thymol은 단독 처리시에는 방제가가 38.1%이었으나, NaHCO₃, neem oil 또는 chitosan과 조합한 경우에는 각각 47.8, 30.7, 50.1%의 방제가를 보여 NaHCO₃와 chitosan은 소폭의 효력증진 효과를 나타내었지만 neem oil은 methyl eugenol의 처리조합 때와 마찬가지로 저해효과가 나타났다. Eugenol은 NaHCO₃, neem oil 또는 chitosan과의 조합 시 각각 36.8%, 25.8%, 26.5%의 방제가를 보여 단독처리시의 방제가 63.8%보다 그 어느 것을 섞어도 방제효과의 감소만이 나타난다는 것을 확인하였다.

3) 저장성 향상을 위한 에센셜 오일 제제 처리

딸기(cv. Akihime) 수확 하루 전에 에센셜 오일 : tween 20 : ethanol (1:3:6, V/V/V)의 각 에센셜 오일 제제를 100ppm의 농도로 처리하고 수확하였다. 각각의 에센셜 오일을 처리하여 수확한 딸기를 별도의 tray에 18~20개씩 넣은 뒤 9일간 상온에 보관하면서 잿빛곰팡이병의 발생률을 조사하였으며, 9일 후의 사진을 도 8에 개시하였다. 도 8의 A는 thymol 처리구, B는 eugenol 처리구, C는 methyl eugenol 처리구이며 D는 에센셜 오일을 처리하지 않은 대조구이다. 특이한 것은, eugenol과 methyl eugenol, 무처리구에서 각각 1반복씩 털곰팡이(Mucor sp.)가 발생하였으나 thymol 처리구에서는 발생하지 않았다.

표 7은 에센셜 오일 처리구 및 대조구의 이병률과 그로부터 계산한 방제가를 보여준다. methyl eugenol처리는 방제가가 71.6%로 매우 우수한 방제효과가 있었다. 그러나 thymol은 -11.1%로 오히려 병이 더 발생하는 양상을 나타냈다.

실시예 9 : 에센셜 오일 제제의 경시적 안정성 검정

에센셜 오일 : tween 20 : ethanol (1:4:5, V/V/V) 유화제 형태 에센셜 오일의 항균활성의 안정성을 검정하였다. 즉, 50ml falcon tube에 에센셜 오일 제제를 넣고 호일로 감싸 빛을 차단시킨 뒤 60℃ dry oven에 넣고 일주일 간격으로 PDA 배지에 50, 100, 200ppm의 농도로 섞은 다음 B. cinerea를 접종하여 22℃ 항온기에서 4일간 배양한 뒤 균사생장률을 측정하였으며, 이를 도 9의 그래프로 나타내었다. 도 9의 A는 thymol; B는 eugenol; C는 methyl eugenol에 대한 경시적 안정성을 나타내는 그래프이다. 도 9에서 확인할 수 있듯이 thymol, eugenol, methyl eugenol 제제 모든 처리 농도에서 4주 후까지 안정적으로 항균활성을 유지하였다.

이상과 같이 본 발명에 의한 methyl eugenol을 함유하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물은 천연물로서 인체에 무해한 에센셜 오일을 주성분으로 하며, 약해가 없고, 방제효과가 탁월하다. 따라서, 이제까지 항균활성이 알려져 있으면서도 농업에 실질적으로 이용이 어려웠던, 에센셜 오일을 농업분야에 적용할 수 있도록 한다.

또한, 본 발명에 의한 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물은 항균활성 기작이 약제 내성과 관련 없는 세포막 손상에 관여하기 때문에 약제 내성을 유발하지 않을 것으로 기대된다.

Claims (7)

1. Methyl eugenol을 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   methyl eugenol에 대해 0.5~4배(v/v)의 계면활성제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 계면활성제는 tween 20인 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   methyl eugenol에 대해 0.5~7배(v/v)의 동결방지제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛곰팡이병균 방제용 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   항균활성 보조제로서 NaHCO₃를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛 곰팡이 병균의 방제용 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   methyl eugenol에 대해 0.1~0.2배(v/v)의 산화방지제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 잿빛 곰팡이 병균의 방제용 조성물.
7. Methyl eugenol의 농도가 10~1,000ppm이 되도록 물로 희석하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 의한 조성물을 이용한 잿빛 곰팡이 병균의 방제 방법.

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