KR100759488B1 - 인공 피부 생산을 위한 키토산­폴록사마­무세포 진피복합체의 제조방법 - Google Patents

인공 피부 생산을 위한 키토산­폴록사마­무세포 진피복합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 폴록사마를 함유한 유기용매에 트리에틸아민과 아크릴로일 클로라이드를 첨가하고 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 필터링하여 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거한 다음, 헥산 또는 에테르 용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 형성시키는 단계; (c) 상기 형성된 폴록사마 마크로마를 건조시키는 단계; 및 (d) 상기 제조된 폴록사마 마크로마에 키토산 및 무세포 진피를 첨가하여 혼합한 다음, 여기에 광개시제를 첨가하고, UV를 조사하여 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체는 수소결합을 통해 안정화된 키토산과 폴록사마에 세포나 조직과 높은 친화성을 갖는 무세포 진피를 도입함으로써, 높은 기계적 강도와 매우 높은 생체 적합성을 가지고, 뛰어난 상처 치료 능력과 조직 재생 능력을 가지고 있어 인공피부로의 적용에 효과적이다.
키토산, 폴록사마 마크로마, 무세포 진피, 복합체

Description

인공 피부 생산을 위한 키토산­폴록사마­무세포 진피 복합체의 제조방법 {Method for Preparing Chitosan­Poloxamer­Acellular dermis Semi-Interpenetrating Polymer Networks for Artificial Skin Production}
도 1은 키토산의 화학식을 도시한 것이다.
도 2는 폴록사마의 화학식을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 폴록사마 마크로마의 합성과정을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 Semi-interpenetrating Polymer Networks의 구조를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 폴록사마 마크로마의 H-NMR 스펙트럼을 이용한 화학구조분석도를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 키토산-폴록사마 복합체의 FT-IR 분광광도계를 이용한 화학구조분석도를 도시한 것이다 (a:키토산, b:폴록사마 마크로마, c:키토산-폴록사마 (1/1) 혼합, d:키토산-폴록사마 (1/1) 복합체).
도 7은 본 발명에 따른 키토산, 키토산-폴록사마 혼합, 키토산-폴록사마 복합체의 압축강도를 도시한 그래프이다 (a:키토산, b:키토산-폴록사마 (1/1) 혼합, c:키토산-폴록사마 (1/1) 복합체, d:키토산-폴록사마 (1/2) 복합체, e:키토산-폴록 사마 (1/3) 복합체).
도 8은 본 발명에 따른 조직배양접시, 키토산, 키토산-폴록사마 복합체에서 섬유아세포의 부착정도를 시간별로 나타낸 그래프이다 (a:조직배양접시, b:키토산, c:키토산-폴록사마 (1/1) 복합체, d:키토산-폴록사마 (1/2) 복합체, e:키토산-폴록사마 (1/3) 복합체).
도 9은 본 발명에 따른 조직배양접시, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 섬유아세포의 부착정도를 시간별로 나타낸 그래프이다 (a:조직배양접시, b:키토산-폴록사마 (1/1) 복합체, c:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체, d:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체, e:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5), f:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체).
도 10은 본 발명에 따른 키토산-폴록사마 복합체와 키토산-폴록사마-무세포진피 복합체에서 섬유아세포의 성장형태를 비교한 위상차 현미경 사진이다 (a: 키토산-폴록사마 복합체, b:키토산-폴록사마-무세포진피 복합체).
도 11은 본 발명에 따른 조직배양접시, 키토산-폴록사마 복합체, 키토산-폴록사마 무세포 진피 복합체에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다 (a:조직배양접시, b:키토산-폴록사마 (1/1) 복합체, c:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체, d:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체, e:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5), f:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체).
도 12는 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 섬유아세포의 성장을 측정한 그래프이다 (a:조직배양접시, b:키토산-폴록사마 (1/1) 복합 체, c:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체, d:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체, e:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5), f:키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체).
발명의 분야
본 발명은 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 폴록사마를 함유한 유기용매에 트리에틸아민과 아크릴로일 클로라이드를 첨가하고 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 필터링하여 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거한 다음, 헥산 또는 에테르 용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 형성시키는 단계; (c) 상기 형성된 폴록사마 마크로마를 건조시키는 단계; 및 (d) 상기 제조된 폴록사마 마크로마에 키토산 및 무세포 진피를 첨가하여 혼합한 다음, 여기에 광개시제를 첨가하고, UV를 조사하여 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
발명의 배경
피부는 외부로부터 생체를 보호하는 최전선에 위치한 기관으로서 피부가 손 상을 입게 되면 위험한 상황에 노출되기 쉽다. 피부의 기능은 복잡하여 인공적으로 제조된 피부 대체물은 피부가 가지는 기능을 모두 수행할 수는 없지만, 상처를 보호할 수는 있다. 인공피부는 임상적인 관점에서 일시적으로 발생된 피부의 상처를 보호할 목적으로 사용되는 일시적 피복형(temporary skin equivalent)과 영구부착을 목적으로 사용되는 영구생착형(permanent skin equivalent)으로 분류할 수 있다. 상기 일시적 피복형은 창상피복재, 동종피부, 타가배양피부 등으로 실제로 피부를 대행할 수 있으며, 창상피복재는 화상이나 외상 등으로 손상을 입은 피부가 회복할 때까지 일시적으로 환부를 보호하는 것으로, 체내로부터의 수분 누출 방지, 삼출액의 흡수 및 외부로부터 잡균 침입과 감염을 방지한다. 또한, 영구생착형은 자신의 건강한 피부로부터 채취한 섬유아세포 또는 각화세포를 시험관내에서 배양하여 피부구조의 일부를 구축하는 것으로서 자가배양 피부라고도 하며, 배양 피부 또는 체내 이식용으로 이용되고 있다.
조직공학의 기술은 실제 인간의 조직과 유사하게 만들어진 인공조직을 개발했다. 이 인공조직은 천연 고분자와 합성 고분자로 구성된 다양한 종류의 지지체에 적당한 세포와 결합되어 이루어진다. 천연 고분자 가운데 하나인 키토산은 자연계에 존재하는 아미노폴리사카라이드의 일종으로, 글루코사민과 아세틸 글루코사민으로 구성된 천연고분자로 자연에서 가장 풍부한 다당류이다. 키틴은 연간 70억톤으로 추정되는 양의 새우와 게 같은 갑각류로부터 쉽게 얻을 수 있는데, 게, 새우의 껍질과 오징어뼈, 곰팡이, 버섯류 및 세균 등의 미생물의 세포벽에 함유되어 있는 키틴을 탈아세틸화되어 얻어지는 천연물질이며, 독성이 없고, 생분해가 가능하여 생체친화성을 가지며, 세포의 결합 및 생체조직배양, 항균성, 지혈작용 등의 생체학적 특성과 콜레스테롤 저하작용, 장내대사작용, 면역증강에 의한 항암작용, 간기능 개선 및 혈당저하작용, 중금속 해독작용 등의 생리작용을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 키토산의 적용분야는 약물 전달 시스템, 크로마토그래피의 재료, 외과용 수술실, 조직공학용 지지체, 상처도포제 등 여러 가지 다양한 분야에서 폭넓게 사용 및 연구되고 있다. 특히, 키토산은 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성을 유도하고, 빠르게 진행시킴으로써 상처피부의 탄력성을 가속화시키며, 항상성을 유지시키고, 조직재생을 촉진한다. 게다가, 키토산은 세균 및 곰팡이에 대한 항균효과가 있다. 이러한 이유에서 키토산은 조직공학용 지지체로서 중요한 생체재료 중 하나로 평가되어지고 있다. 키토산는 세포외 기질의 구성성분들과 성장인자의 특이적인 상호작용과 더불어 그들의 생분해성과 생체 적합성은 피부, 간, 뼈, 연골의 치료와 같은 조직공학 분야에서 적용을 용이하게 한다. 그러나 키토산 자체는 낮은 기계적 강도를 가지고 있어, 조직공학적 인공피부로서 적용하는데 어려움이 있다. 최근 연구들에서는 폴리 비닐 피롤리돈, 폴리 카프로락톤, 폴리 에틸렌 글라이콜, 콜라겐 등 다른 합성, 천연 고분자들과의 혼합이나 가교를 통해 낮은 기계적 강도를 극복하고자 하는 노력들이 보고되어지고 있으나, 인공피부로서 필요한 정도의 기계적 강도를 제공하지 못하고 있다.
키토산을 이용한 인공피부에 관련된 종래 특허로는 '창상 피복재 및 조직공학 구조체용 중화 키토산 스폰지 제조방법 및 이에 의해 제조된 중화 키토산 스폰지'(한국특허 등록번호 10-0608192, 2006.07.26)와 '키틴 또는 키토산의 나노섬유( 초극세섬유)를 구성성분으로 하는 부직포'(한국특허 등록번호 10-0545404, 2006.01.16) 등이 있다. 그러나 상기 특허들은 많은 수산기를 함유하여 친수성을 지닌 키토산이 중요한 세포나 조직과의 충분한 친화력을 갖지 못하여 세포 부착 능력이 떨어져, 세포의 생존율이 감소되는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 종래기술의 단점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 수소결합을 통해 안정화된 키토산과 폴록사마에 세포나 조직과 높은 친화성을 갖는 무세포 진피를 도입한 인공피부가 높은 기계적 강도와 매우 높은 생체 적합성을 가지고, 뛰어난 상처 치료 능력과 조직 재생 능력을 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 높은 기계적 강도와 세포 및 조직의 친화도가 향상된 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 유효성분으로 함유하는 인공피부를 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 폴록사마를 함유한 유기용매에 트리에틸아민과 아크릴로일 클로라이드를 첨가하고 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 필터링하여 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거한 다음, 헥산 또는 에테르 용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 형성시키는 단계; (c) 상기 형성된 폴록사마 마크로마를 건조시키는 단계; 및 (d) 상기 제조된 폴록사마 마크로마에 키토산 및 무세포 진피를 첨가한 혼합한 다음, 여기에 광개시제를 첨가하고, UV를 조사하여 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 벤젠(benzene), 이산화디에틸렌(dioxane), 테트라 하이드로 퓨란(tetrahydrofuran, THF), N,N-디메틸포름아미드(n,n-dimethylformamide, DMF) 및 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 구성되는 그룹으로 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계 다음에 상기 형성된 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광개시제는 2.2-디메톡시-2페닐 아세토페논 및/또는 N-비닐 피롤리돈을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산 및 폴록사마 마크로마의 혼합비는 1:1인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무세포 진피는 상기 키토산 1중량부에 대하여 0.01 ~ 1중량부로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산은 분자량이 5000 ~ 1000000 g/㏖이고, 탈아 셀티화도가 50 ~ 98 %인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, SIPNs (Semi-Interpenetrating Polymer Networks) 구조로 형성되는 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체 및 상기 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 유효성분으로 함유하는 인공피부를 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명에서 사용된 키토산의 화학식을 도시한 것으로, 키토산은 자연계에 존재하는 아미노폴리사카라이드의 일종으로, 글루코사민과 아세틸 글루코사민으로 구성된 천연고분자로 자연에서 풍부한 다당류이다. 상기 키토산은 키틴을 탈아세틸화시킨 것으로, 독성이 없고, 생분해가 가능하여 생체친화성을 가지며, 세포의 결합 및 생체조직배양, 항균성, 지혈작용, 생체적합성 등의 생체학적 특징콜레스테롤 저하작용, 장내대사작용, 면역증강에 의한 항암작용, 간기능 개선 및 혈당저하작용, 중금속 해독작용 등의 생리작용을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 키토산은 분자량이 5000 ~ 1000000 g/㏖인 것이 바람직하며, 탈아세틸화도는 50 ~ 98% 인 것이 바람직하다. 일반적으로, 탈아세틸화도는 50%이상이 되어야 키토산으로 되고, 탈아세틸화도 99%이상의 키토산은 매우 얻기 어려우며, 키토산의 분자량이 1,000g/㏖이하인 경우, 올리고당으로 고분자로서 키토산의 특성이 감소된다. 또한, 용매로서는 아세틱 산 수용액(1wt%)이 사용된다.
도 2는 폴록사마의 화학식을 도시한 것으로, 상기 폴록사마는 폴리에틸렌 옥 사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드로 구성된 블록 공중합체로, 3도 화상의 치료시에 피부 대용으로 사용되고있다. 상처치료과정에서 비극성의 폴록사마는 상처치료를 가속화시킨다고 보고되고 있으며, 정확한 메카니즘이 밝혀지지는 않았지만 상피성장인자(EGF)을 자극시킴에 의한 것으로 알려져 있다. 또한, 폴록사마 수용성젤은 의학, 약학, 화장품과 같은 다양한 생의학적 분야에서 사용된다.
본 발명에서 사용되는 무세포 진피는 염증반응을 제거하기 위해 탈세포화된 인간의 진피로, 병원성이 없는 시체의 피부로부터 얻어지며, 피부 조직에서 콜라겐 다발의 분포와 구성을 손상시키지 않는 확실한 방법을 통해 동결건조되어 제조된다.
본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 제조하기 위하여, 우선 다음과 같은 방법으로 폴록사마 마크로마를 제조한다. 폴록사마를 유기용매가 들어있는 둥근 플라스크에 녹인다. 상기 유기용매는 벤젠(benzene), 이산화디에틸렌(dioxane), 테트라 하이드로 퓨란(tetrahydrofuran, THF), N,N-디메틸포름아미드(n,n-dimethylformamide, DMF) 및 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 구성되는 그룹으로 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 폴록사마를 함유한 유기용매에 트리에틸아민과 아크릴로일 클로라이드를 첨가하고 교반시킨 다음, 상기 교반액을 필터링을 하여 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거하고, 헥산 또는 에테르 용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 얻는다 (도 3).
상기 형성된 폴록사마 마크로마에 키토산을 첨가하거나, 폴록사마 마크로마와 키토산에 무세포 진피를 첨가하여 혼합 용액을 제조한 다음, 상기 혼합 용액에 2.2-디메톡시-2페닐 아세토페논과 N-비닐 피롤리돈을 함유한 광개시제를 첨가하고, LWUV lamp에 노출시켜 UV를 조사하고, 동결건조시켜 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 수득한다. 상기 키토산-폴록사마 복합체는 높은 점성으로 인해 키토산 및 폴록사마 마크로마의 혼합비는 1:1의 비율이 바람직하며, 상기 키토산 1중량부에 대하여 상기 무세포 진피는 0.01 ~ 30중량부로 첨가하며, 보다 바람직한 첨가비율은 0.01 ~ 1중량부이다. 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서는 키토산, 폴록사마 및 무세포 진피를 1:1:1의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 상기 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 염기용액에 10분간 넣어준 후 증류수로 세척한다.
상기 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법에 사용된 동결건조는 재료를 동결시킨 다음 높은 진공장치 내에서 액체상태를 거치지 않고, 기체상태의 증기로 승화시켜 건조하는 방법으로, 일반의 건조방법보다 훨씬 고품질의 제품을 얻을 수 있고, 동결된 상태에서 수분이 제거되므로 건조된 제품은 가벼운 필름구조 형태를 가지며, 현재 식품과 제약, 미생물의 건조에 이용되는 고품질의 상품을 얻을 수 있는 건조방법으로, 예비동결, 승화건조, 탈습건조의 3단계 건조 처리된다.
도 4는 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 Semi-interpenetrating Polymer Networks의 구조를 도시한 것으로, 폴록사마 마크로마의 UV 가교를 통해 제조된 폴록사마 네트워크와 키토산, 무세포 진피를 포함한 SIPNs 시스템을 보여주 고 있다. 상기 키토산과 폴록사마 네트워크가 SIPNs(Semi-Interpenetrating Polymer Networks) 구조를 가지고, 상기 SIPNs 구조 내 무세포 진피가 고정되어 있다. SIPNs(Semi-interpenetrating polymer networks) 즉, 복합체는 하나 또는 그 이상의 고분자들이 가지 또는 선형의 네트워크를 구성하는 것으로 정의되는데, 일반적으로 이 네트워크는 수용성 고분자를 방사선이나 화학적 방법을 통한 가교방법 또는 가교제를 이용한 친수단량체의 중합 방법으로 형성되며, 상기 복합체 구조를 통하여 네트워크의 기계적 강도가 향상되며, 상 분리가 되는 재료들을 혼합시킬 수 있다. 본 발명에 따른 키토산, 무세포 진피와 함께 폴록사마 마크로마에 의한 네트워크 구조 형성은 조직공학적 인공피부로서 키토산 스폰지의 기계적 강도를 증가시키고, 세포 및 조직과의 친화도를 향상시킨다. 키토산의 기계적 강도 향상을 위해 폴록사마 마크로마로부터 제조되는 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에 SIPNs 시스템을 도입하기 위하여 폴록사마의 에틸렌 옥사이드의 양 말단 수산화기를 아크릴화시켜 폴록사마 마크로마를 만들어, 복합체의 형성을 위해 키토산과 무세포 진피의 존재 하에서 이를 가교시키며, 상기 SIPNs 시스템이 도입된 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체는 높은 기계적 강도와 세포나 조직과 높은 친화성을 갖는 무세포 진피를 도입함으로써 뛰어난 상처 치료 능력과 조직 재생 능력을 가지는 환경을 만들어 인공피부로 적용이 효과적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않을 것이다.
실시예 1: 폴록사마 마크로마의 합성
폴록사마 407(25.2g, 2m㏖)를 75㎖ 벤젠이 들어있는 라운드 플라스크에 녹이고, 트리에틸아민(0.59㎖, 4.23m㏖)과 아크릴로일 클로라이드(0.34㎖, 4.18m㏖)를 첨가하고, 80℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 후, 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거하기 위해 필터링을 한 후, 헥산용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 얻고, 제조된 폴로사마 마크로마를 24시간 동안 40℃에서 건조시켜 제조하였다.
실시예 2: 키토산- 폴록사마 - 무세포 진피 복합체의 제조
아세틱 산 수용액(1wt%)을 용매로 사용하여 100㎎ 2.2-디메톡시-2페닐 아세토페논과 1㎖의 N-비닐 피롤리돈을 함유한 광개시제 25㎕을 1 wt-% 키토산에 1, 2 및 3wt-% 폴록사마 마크로마와 무세포 진피 0.01, 0.1, 0.5 및 1 wt-%를 혼합한 용액에 첨가하였고, 상기 무세포 진피는 ShebaTM, 한스바이오메드를 이용하였다. 그리고 5분간 LWUV lamp에 노출시켜 UV를 조사한 다음, 동결건조시켜 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 제조하였다. 상기 제조된 복합체를 2 wt-% NaOH용액에 30분간 넣어준 후 증류수로 충분히 세척하였다. 상기 LWUV lamp는 Toshiba Chemical Lamp FL 20 LB로, wave range, 300-400㎚; maximum intensity, 360㎚인 것을 사용하였다.
실시예 3: 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 복합체의 스펙트럼 분석
(1) H- NMR 스펙트럼
실시예 2에서 제조된 키토산-폴록사마 복합체에 대한 H-NMR 스펙트럼은 AVAVCE 600 분광기(Bruker, Rheinstten, Germany)로 600㎒에서 측정하였다 (도 5). 상기 핵자기 공명(H-NMR)측정을 통해 폴록사마 마크로마가 합성된 것을 알 수 있었으며, 도 5에 도시한 바와 같이, 폴리프로필렌 옥사이드의 메틸기를 통한 전형적인 수소 신호는 폴록사마의 1.19ppm에 나타났고, 폴록사마 마크로마 양말단의 아크릴레이트에 있는 수소는 6.02~6.50ppm에서 나타났다. 상기 H-NMR 분석을 통해 폴록사마 마크로마는 폴록사마의 말단 수신기(-OH)와 아크릴로일 클로라이드사이의 반응을 통해 합성된 것을 알 수 있었으며, 폴록사마 마크로마의 치환정도는 87.2%로 계산되었다. 상기 키토산-폴록사마 복합체 형성 후 미반응 폴록사마는 수산화나트륨용액과 증류수로 세척하여 제거하였다.
(2) FT - IR 스펙트럼
적외선 분광기(FT-IR) 분광 광도계는 Nicoloet Magna 550 series Ⅱ 분광기(Midac, Atlanta, GA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 키토산의 수산화기와 -NH기의 신축진동이 3000 ~ 3600㎝-1에서 겹치기 때문에, 500 ~ 2000㎝-1 에 초점을 맞춰 측정하였다 (도 6).
도 6은 본 발명에 따른 키토산-폴록사마 복합체의 FT-IR 분광광도계를 이용한 화학구조분석도를 도시한 것으로, (a)는 키토산이고, (b)는 폴록사마 마크로마 이고, (c)는 키토산-폴록사마(1/1) 혼합이고, (d)는 키토산-폴록사마(1/1) 복합체이다. FT-IR 분광광도계를 통해 키토산-폴록사마 복합체에서 키토산과 폴록사마의 분자간 수소결합 및 가능한 상호작용을 확인할 수 있었으며, 도 6에 도시한 바와 같이, 분자간 상호작용은 복합체가 제조되는 동안 두 고분자 사이에서 일어나는데, 복합체 형성 후, 키토산의 C=O와 폴록사마의 수산화기사이의 수소결합이 일어남을 알 수 있었다. 이는 폴록사마가 첨가되기 전, 키토산과 비교해 키토산과 폴록사마의 C-O 신축진동이 중첩되어 나타난 결과로 볼 수 있으며, 키토산과 폴록사마의 혼합에 이은 키토산-폴록사마 복합체의 형성은 이들 사이에 분자간 수소결합을 유발함을 알 수 있었다.
키토산의 아마이드와 아민 밴드는 1630과 1524㎝-1에 각각 나타났고, 폴록사마 주쇄의 C-O 신축진동의 에스테르 피크는 1152와 1090㎝-1에서 나타났다. 상기 복합체는 SIPNs 형성 후, 키토산(1630㎝-1)의 C=O 신축진동은 1633㎝-1로 조금 높이 나타났는데, 이는 키토산의 C=O와 폴록사마의 -OH사이의 수소결합이 일어났음을 알 수 있다. 1110㎝-1 주변의 피크는 폴록사마의 특징적인 밴드인 C-O-C 신축진동을 나타내는데, 도 6의 (c)와 (d)에서 보는 바와 같이, 각각 1108과 1106㎝-1 을 나타내고 있다. 이것은 도 6의 (a)에서 나타난 1090㎝-1 보다 높은데, 폴록사마가 더해지기 전 키토산과 비교해 볼때, 키토산과 폴록사마의 C-O 신축진동의 중첩되어 나타 난 결과이다. 이 결과들을 통해, 키토산과 폴록사마의 혼합에 따른 SIPNs의 형성은 이들 사이에 분자간 수소 결합을 유발함을 알 수 있었다.
실시예 4: 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 - 무세포 진피 복합체의 성질 분석
(1) 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 복합체의 기계적 강도
기계적 강도는 상처도포제와 인공피부와 같은 의학 분야 적용인 경우 다양한 종류의 스트레스를 견뎌내기 위해 가장 중요한 요소이다. 키토산, 폴록사마 마크로마, 키토산-폴록사마 복합체의 압축강도는 Minimat(Rheometric Scientic, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 측정하였다 (도 7).
도 7은 본 발명에 따른 키토산, 키토산-폴록사마 혼합, 키토산-폴록사마 복합체의 압축강도를 도시한 그래프로, (a)는 키토산이고, (b)는 키토산-폴록사마 (1/1) 혼합이고, (c)는 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체이고, (d)는 키토산-폴록사마 (1/2) 복합체이고, (e)는 키토산-폴록사마 (1/3) 복합체이다. 도 7에 도시한 바와 같이, 같은 조건에서 제조된 키토산-폴록사마 혼합과 키토산-폴록사마 복합체의 압력에 대한 저항은 주목할 만한 차이를 보여주는데, 이는 폴록사마 마크로마의 네트워크 형성 때문으로 볼 수 있다. 또한 키토산-폴록사마 복합체에서 폴록사마 함량의 증가에 따라 가교 밀도의 증가때문에 압축강도 역시 증가하였다. 이를 통해 복합체 형성에 의해, 키토산-폴록사마 복합체에서 폴록사마 함량에 따라 기계적 강도가 현저한 차이가 있음을 알 수 있다.
(2) 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 복합체의 세포 부착실험
키토산-폴록사마 복합체에서의 세포부착과 키토산과 조직배양접시에서의 세포부착을 시간에 따라 비교하였으며, 그 결과는 도 8에 도시한 바와 같다. 도 8은 조직배양접시, 키토산, 키토산-폴록사마 복합체에서 섬유아세포의 부착정도를 시간별로 나타낸 그래프로, (a)는 조직배양접시이고, (b)는 키토산, (c)는 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체이고, (d)는 키토산-폴록사마 (1/2) 복합체이고, (e)는 키토산-폴록사마 (1/3) 복합체이다.
키토산과 키토산-폴록사마 복합체는 조직배양접시와 비교시, 낮은 세포 친화력을 가졌으며, 이를 통해 많은 수산기를 가지고 있는 키토산과 수용성 겔인 폴록사마의 높은 친수성이 키토산-폴록사마 복합체의 세포 부착에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 세포부착은 표면 접촉각, 그 재료의 표면의 전하, 알기닌-글리신-아스파르트산 그룹과 같은 서열 또는 표면결에 의존하거나, 키토산-폴록사마 복합체에서 세포부착은 SIPNs에서의 폴록사마 마크로마양의 증가에 따라 증가하였는데, 이는 그 세포의 거동이 가교밀도 증가에 따른 물리적 변화 때문임을 의미한다. 분자 움직임의 최초영향에 의한 생체적합성 정도는 그 재료의 형태상의 정렬정도와 결정도에 의존한다.
무세포 진피의 추가가 세포부착에서 어떤 영향을 주는지 확인하고자, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서의 세포부착을 시간에 따라 비교하였으며, 그 결과는 도 9에 도시한 바와 같다. 도 9는 본 발명에 따른 조직배양접시, 키토산-폴록 사마-무세포 진피 복합체에서 섬유아세포의 부착정도를 시간별로 나타낸 그래프로, (a)는 조직배양접시이고, (b)는 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체이고, (c)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체이고, (d)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체이고, (e)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5)이고, (f)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체이다.
상기 무세포 진피는 키토산-폴록사마 복합체와 세포간의 친화력을 높이기 위해 사용되었으며, 높은 점성으로 인해 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체로 고정하여 진행하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 세포부착 정도는 키토산-폴록사마 복합체와 비교했을 때 충분히 증가되는 것을 알 수 있다. 또한, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 세포부착은 무세포진피의 양이 증가함에 따라 증가하였는데, 이는 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 무세포 진피의 존재가 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있으며, 상기 무세포 진피는 인간 무세포 진피가 실제적인 세포외기질의 환경을 제공한다.
섬유아세포는 이 복합체의 생체적합성측정에서 무세포진피의 효과를 분석하기 위해 키토산-폴록사마 복합체와 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 4일간 배양하였다. 본 발명에 따른 키토산-폴록사마 복합체와 키토산-폴록사마-무세포진피 복합체에서 섬유아세포의 성장형태를 비교하기 위하여 위상차 현미경 사진으로 관찰하였으며, 이는 도 10에 도시한 바와 같다. (a)는 키토산-폴록사마 복합체이고, (b)는 키토산-폴록사마-무세포진피 복합체이며, (a)의 키토산-폴록사마 복합체 보다 (b)의 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 세포들이 더 널리 분포하고 있다. 무세포 진피가 없는 키토산-폴록사마 복합체 표면의 세포는 클러스터(세포들의 덩어리)를 이루고 있는데, 이를 통해 세포가 이 복합체와의 친화 정도 보다 세포 간의 친화 정도가 더 높은 것을 알 수 있다. 클러스터 형성시, 재료에 안정적으로 부착된 세포에 비해 세포의 괴사가 더욱 빨리 진행되며, 세포의 재기능을 하지 못하며, 낮은 생체적합성과 세포 독성을 가지고 있는 것을 알 수 있다. 도 10의 위상차 현미경 사진은 도 9의 결과를 뒷받침하고 있으며, 키토산-폴록사마-무세포진피 복합체에서 무세포 진피의 도입은 세포부착을 증가시키는 것을 알 수 있다.
(3) 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 - 무세포 진피 복합체의 세포 독성
본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 세포독성을 테스트 하기 위하여, Lactate dehydrogenase (LDH) 분석을 하였다 (도 11).
LDH는 세포질에 존재하는 안정된 효소로, 세포 용해(cell lysis)시 나오며, 상기 LDH를 통하여 세포의 생존율 분석 통해 재료의 독성을 평가할 수 있다. 도 11은 조직배양접시, 키토산-폴록사마 복합체, 키토산-폴록사마 무세포 진피 복합체에서의 세포 독성을 나타낸 그래프로, (a)는 조직배양접시이고, (b)는 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체이고, (c)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체이고, (d)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체이고, (e)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5)이고, (f)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체이다. 도 11에 도시한 바와 같이, 키토산-폴록사마 복합체와 키토산-폴록사마-무세포 진피의 복합체 모두 전체적으로 낮은 세포독성을 보이고 있으며, 무세포 진피의 함유량이 증가함에 따라 보다 높은 생존능력을 보여주고 있다. 상기 결과는 세포 부착과 세포 형태가 세포의 생존, 성장, 기능에 영향을 줄 수 있는 것을 알 수 있으며, 인공피부 시스템을 위한 복합체의 조직공학적 적용에 있어 중요하다.
(4) 본 발명에 따른 키토산- 폴록사마 - 무세포 진피 복합체에서 섬유아세포의 성장 측정
조직공학용 인공피부로의 가치를 평가하기 위해 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 섬유아세포의 성장을 4일간 측정하였다 (도 12). 도 12에 도시한 바와 같이, (a)는 조직배양접시이고, (b)는 키토산-폴록사마 (1/1) 복합체이고, (c)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.01) 복합체이고, (d)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.1) 복합체이고, (e)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/0.5)이고, (f)는 키토산-폴록사마-무세포 진피(1/1/1) 복합체이다.
(f)의 1% 무세포 진피가 포함된 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 경우, 조직배양접시와 유사한 세포성장을 보여주고 있는데, 이는 무세포 진피의 추가로 세포 적합성, 우수한 세포 성장을 보이고 있으므로 조직공학용 인공피부의 적용에 있어 키토산-폴록사마-무세포 진피의 우수성을 알 수 있다.
본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 무세포 진피의 존재는 세포 부착과 세포 생존율 평가에서 주목할 만한 결과를 보여주고 있으며, 상 기 실시예 결과는 인공피부 적용에 있어, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체가 뛰어난 효과와 잠재력 있는 재료임을 증명해주고 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 높은 기계적 강도와 세포 및 조직의 친화도가 향상된 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체는 수소결합 통해 안정화된 키토산과 폴록사마에 세포나 조직과 높은 친화성을 갖는 무세포 진피를 도입하여, 높은 기계적 강도와 매우 높은 생체 적합성을 가지고, 뛰어난 상처 치료 능력과 조직 재생 능력을 가지고 있어 조직공학용 인공피부로의 적용에 효과적이다. 상기 무세포 진피는 실제 세포외기질의 환경을 제공하여, 상기 복합체와 세포간의 친화력을 향상시켜 세포 부착을 증가시키며, 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서의 세포들은 클러스터를 형성하지 않고, 널리 분포하고 있어 세포의 안정적인 부착이 가능하며, 이에 세포의 생존율 역시 증가하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체에서 무세포 진피의 도입을 통해 세포의 안정적인 부착으로 세포 성장이 우수하여, 각종 피부질환과 화상, 창상, 찰과상 등의 피부 상처를 보호 또는 치료하는 목적에 효과적으로 사용할 수 있으며, 피부로 영구부착하는 영구생착형 인공피부로의 적용도 가능하다.

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 인공 피부 생산을 위한 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체의 제조방법:
    (a) 폴록사마를 함유한 유기용매에 트리에틸아민과 아크릴로일 클로라이드를 첨가하고 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응액을 필터링하여 트리에틸아민-하이드로클로라이드를 제거한 다음, 헥산 또는 에테르 용액에 넣어 폴록사마 마크로마를 형성시키는 단계;
    (c) 상기 형성된 폴록사마 마크로마를 건조시키는 단계; 및
    (d) 상기 제조된 폴록사마 마크로마에 키토산 및 무세포 진피를 첨가하여 혼합한 다음, 여기에 광개시제를 첨가하고, UV를 조사하여 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 형성하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 벤젠(benzene), 이산화디에틸렌(dioxane), 테트라 하이드로 퓨란(tetrahydrofuran, THF), N,N-디메틸포름아미드(n,n-dimethylformamide, DMF) 및 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계 다음에 상기 형성된 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 광개시제는 2.2-디메톡시-2페닐 아세토페논 및/또는 N-비닐 피롤리돈을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 키토산 및 폴록사마 마크로마의 혼합비는 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 무세포 진피는 상기 키토산 1중량부에 대하여 0.01 ~ 1중량부로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 키토산은 분자량이 5000 ~ 1000000 g/㏖이고, 탈아셀티화도가 50 ~ 98 %인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의해 제조되고, 키토산과 폴록사마 네트워크가 SIPNs(Semi-Interpenetrating Polymer Networks) 구조를 가지고, 상기 SIPNs 구조 내 무세포 진피가 고정되어 있는 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체.
  9. 제8항의 키토산-폴록사마-무세포 진피 복합체를 유효성분으로 함유하는 인공피부.
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WO2017074093A1 (ko) * 2015-10-28 2017-05-04 주식회사 시지바이오 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 창상 피복재 및 이의 제조 방법

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