KR100755931B1 - Methods for overexpression of mannose binding lectin and formulation - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의 사용에 관한 것이다. 특히 본 발명은 미생물 감염 시 보체계를 활성화시킴으로 미생물 감염을 예방 및 치료할 수 있는 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질을 제제화하는 방법을 제공한다. The present invention relates to a mass production method of a polymeric mannose-bound lectin and the use of a mannose-bound lectin recombinant protein prepared by the above method. In particular, the present invention provides a method for formulating a mannose-binding lectin recombinant protein that can prevent and treat microbial infection by activating the complement system during microbial infection.
만노스 결합형 렉틴, 보체계, 방어, B형 간염바이러스 pre S, 사스Mannose bound lectin, complement system, defense, hepatitis B virus pre S, SARS
Description
도 1a 및 1b는 형질전환체 CHO MBL/D1-3에서 생산된 재조합 MBL단백질을 정제하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 확인한 것이고,1a and 1b are purified by recombinant MBL protein produced in transformant CHO MBL / D1-3 confirmed by SDS-PAGE and Western blot,
도 2a 및 2b는 MBL단백질이 당쇄화된 단백질인 preS 또는 만난(mannan)에 특이적으로 결합함을 나타내는 그래프이고, 2A and 2B are graphs showing that MBL protein specifically binds to preS or mannan, a glycosylated protein,
도 3은 재조합 MBL단백질에 의한 C4 활성화를 나타내는 그래프이고,3 is a graph showing C4 activation by recombinant MBL protein,
도 4는 PLGA-preS 나노파티클의 형태를 도식화한 그림이고,4 is a diagram illustrating the shape of PLGA-preS nanoparticles,
도 5은 PLGA-preS 파티클에 재조합 MBL단백질이 결합함을 확인한 그래프이고, 5 is a graph confirming that the recombinant MBL protein binds to PLGA-preS particles,
도 6은 재조합 MBL단백질이 PLGA-preS 파티클에 결합하여 C4를 활성화함을 확인한 그래프이고,6 is a graph confirming that the recombinant MBL protein binds to PLGA-preS particles to activate C4,
도 7은 사스 코로나바이러스 감염에서의 MBL 재조합 단백질의 효과를 확인한 그래프이고,7 is a graph confirming the effect of MBL recombinant protein in SARS coronavirus infection,
도 8은 사스 코로나바이러스를 감염시킨 FRhk-4세포를 위상차 현미경 (phase contrast microscope)으로 관찰한 사진이다. FIG. 8 is a photograph of FRhk-4 cells infected with SARS coronavirus observed with a phase contrast microscope. FIG.
[발명이 속하는 기술분야][TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION]
본 발명은 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의 제제화에 관한 것으로, 보다 상세하게는 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질을 이용하여 보체계를 활성화시키므로써 미생물 감염 시 체내 방어시스템을 활성화시켜 질병을 치료 할 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a mass production method of a polymeric mannose-bound lectin and to the formulation of a mannose-binding lectin recombinant protein. It is about how to activate the disease can be cured.
[종래기술][Private Technology]
만노스 결합형 렉틴(Mannose Binding Lectin: 이하 "MBL"이라 함)은 선천성 면역을 담당하고 있는 혈청단백질로, 32 kD의 분자량을 갖는다. MBL의 N' 말단부위에는 짧은 시스테인 다분포 부위(Cysteine Rich Region)가, 연이어 콜라겐 도메인이 있으며, C'말단부위에는 탄수화물 인식 도메인(CRD: C-type carbohydrate recognition domain)이 있다. 상기 콜라겐 도메인은 세 개의 분자가 삼중나선 구조를 형성하므로, 세 개의 MBL 분자가 하나의 복합체를 만들게 한다. 이러한 복합체는 다시 N'말단 부위의 시스테인에 의한 이황화결합(-s-s-)을 통하여 여섯 개가 결합되어 총 18개의 MBL로 이룬 거대 분자를 형성시킨다.Mannose Binding Lectin (hereinafter referred to as "MBL") is a serum protein responsible for innate immunity and has a molecular weight of 32 kD. The short cysteine rich region (Cysteine Rich Region) at the N 'end of the MBL, followed by the collagen domain, and the C-type carbohydrate recognition domain (CRD) at the C' end. Since the collagen domain has three molecules forming a triple helix structure, three MBL molecules make one complex. These complexes, in turn, combine six via the disulfide bond (-s-s-) by cysteine at the N 'terminal to form a macromolecule consisting of a total of 18 MBL.
또한 MBL의 콜라겐 도메인은 여러 개의 다른 단백질을 부착시킬 수 있다. 대표적인 것으로는 MASP(MBL Associated Serine Protease)-1 및 -2가 있다. The collagen domain of MBL can also attach several other proteins. Representative examples are MBL Associated Serine Protease (MASP) -1 and -2.
MBL은 구조적인 면에서 보체계(Complement System)의 C1q 와 흡사하고, 기능 적인 면에 있어서도 C1q와 유사하여 보체계를 활성화시킨다. 또한 C1q와 같이 고분자형의 MBL이 보체를 활성화 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 외부에서 침입한 미생물은 표면에 존재하는 단백질의 독특한 당화형태 (Glycosylation Pattern)를 인식해서 결합하는 CRD를 통하여 MBL과 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 세린 프로테아제의 전구체인 MASP-1과 MASP-2를 활성화시키고, 보체계의 C4와 C2를 분해하여 보체계를 활성화시키는 것이다. 이때 MBL은 숙주에서 나타나는 당쇄패턴이과 다른 당쇄패턴을 갖는 분자에만 결합할 수 있으며, 또한 칼슘이 필수적으로 존재하여야 한다. 또한 MBL은 C1q와 달리 IgM이나 IgG가 결합되지 않은 외부침입자를 식세포에 의하여 식균(Phagocytosis) 되도록 할 수 있어, MBL은 우리 몸의 제 1차 방어에 아주 중요한 역할을 하며 동시에 후천성 면역 반응을 유도하는데도 중요한 역할을 한다.MBL is structurally similar to C1q of Complement System and functionally similar to C1q to activate complement system. It is also known that MBL of high molecular weight like C1q can activate complement. In other words, microorganisms invading from outside form complexes with MBL through CRD, which recognizes and binds to the unique glycosylation pattern of proteins on the surface. The complex activates MASP-1 and MASP-2, precursors of serine proteases, and activates the complement system by decomposing C4 and C2 of the complement system. At this time, MBL can bind only to molecules having a sugar chain pattern different from that of the sugar chain pattern appearing in the host, and calcium must be present. Also, unlike C1q, MBL can phagocytosis externally invaders that are not IgM or IgG bound by phagocytes. MBL plays an important role in the body's first defense and at the same time induces an immune response. Plays an important role.
한편, 식균작용을 하는 세포로는 중성백혈구(Neutrophile)과 대식세포(Macrophage)가 있다. 이들 세포는 외부에서 침입한 미생물이나 이물질을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포는 APC(Antigen Presenting Cell)로 작용하여, 항원 또는 NK 세포나 T-세포에서 분비되는 인터페론 감마에 의해 활성화되어 TNF나 IL-12를 분비하므로써 후천성 면역반응을 유도한다. 또한 APC는 함유하고 있는 항원을 T-림포사이트에 통보하여 후천성 면역반응을 유도한다.On the other hand, phagocytic cells include neutrophils (Neutrophile) and macrophages (Macrophage). These cells play an important role in removing microorganisms and foreign substances from outside. In particular, macrophages act as an APC (Antigen Presenting Cell), and are activated by antigen or interferon gamma secreted from NK cells or T-cells to induce an acquired immune response by secreting TNF or IL-12. APC also informs T-lymphocytes of the antigen it contains to induce an acquired immune response.
보체계의 활성화는 면역학적인 측면에서 동물의 몸을 방어한다는 의미에서 매우 중요하다. 먼저, 보체계를 이루는 단백질 중 일부는 옵소닌(Opsonin)으로 작용하여 직접 미생물 세포의 표면에 결합함으로써 대식세포나 중성백혈구에 의한 식 균작용을 도와준다. 다음으로, 일부 활성화된 단백질들은 막 공격성 복합체(Membrane Attacking Complex: MAC)를 형성하여, 침입한 미생물을 직접 분해하기도 한다. 그 외에도, 활성화 과정에서 생성된 보체 단백질 절편은 강한 염증반응을 일으키는 사이토카인의 분비를 촉진시키므로써, 백혈구를 침입자가 존재하는 곳으로 모이게 한다.The activation of the complement system is very important in the sense of defending the animal's body from an immunological point of view. First, some of the proteins that make up the complement system act as opsonin (Opsonin) directly to the surface of the microbial cells to help phagocytosis by macrophages or neutrophils. Next, some activated proteins form a membrane attacking complex (MAC), which directly degrades the invading microorganisms. In addition, complement protein fragments produced during activation promote the secretion of cytokines, which cause a strong inflammatory response, thereby collecting leukocytes into the presence of invaders.
이와 같이 MBL은 선천성 면역 반응과 후천성 면역 반응에 매우 중요한 역할을하기에, 혈액 속에 존재하는 MBL은 그 양에 따라 개체의 저항력에 큰 영향을 미친다. MBL은 유전적 변이로 결핍되거나 소량만 발현될 수 있다. 일예로, MBL 유전자에 잘 알려진 3가지 점 돌연변이 중 하나가 발생된 경우, MBL 분자간의 복합체 형성이 이루어지지 않아 MBL 기능을 수행할 수 없다. 또한 MBL 유전자의 프로모터 부위에 돌연변이가 있는 경우, 발현되는 MBL 양이 달라질 수 있다.As such, MBL plays a very important role in the innate and acquired immune responses, and the amount of MBL present in the blood has a great effect on the individual's resistance. MBL may be deficient in genetic variation or expressed in small amounts. For example, when one of three well-known point mutations occurs in the MBL gene, complex formation between MBL molecules does not occur, and thus MBL function cannot be performed. In addition, when there is a mutation in the promoter region of the MBL gene, the amount of MBL expressed may vary.
특히, 갓난아기나 또는 면역 억제제를 처방받은 사람들 중 MBL 수준이 낮은 군에서는 병원성 미생물에 감염될 확률이 높다. 또한 MBL은 B형 및 C형 간염바이러스 감염에도 적지 않은 영향을 주는 것으로 알려져 있다. B형 간염바이러스 감염 환자를 대상으로 한 연구보고 논문(Hakozaki Y. et al, Liver 2002, 22, 29-34)에 의하면, B형 간염바이러스의 감염상태가 전격형 감염(Fulminant Infection) 상태로 되어 위기상태로 진전되는 환자들의 경우 혈장에 MBL의 양이 3 ug/㎖ 이상이면 사망률이 0 %이고, 1.5 ug/㎖ 이면 사망률이 54 %이며, 0.5 ug/㎖ 이하이면 사망률이 거의 80 % 이상에 달하는 것으로 알려져 있다. 이 연구 결과는 B형 간염바이러스 보균자의 혈액내 MBL의 양이 질환의 진전에 중요한 영향을 미침을 나타내는 것이 다. 또한 중국 사람을 대상으로 실시한 연구에서, MBL 양이 낮은 사람은 혈액속에 감염성 B형 바이러스 숫자가 MBL 양이 많은 사람에 비해 훨씬 많다는 것이 보고된 바 있다.In particular, infants or those who have been prescribed immunosuppressants are more likely to be infected with pathogenic microorganisms in low MBL levels. MBL is also known to have a significant effect on hepatitis B and C infection. According to a research report (Hakozaki Y. et al, Liver 2002, 22, 29-34) of patients with hepatitis B virus infection, the infection status of hepatitis B virus is in the state of complete infection. For patients who progress to a crisis, mortality is 0% if the amount of MBL in the plasma is greater than 3 ug / ml, mortality is 54% at 1.5 ug / ml, and mortality is greater than 80% at 0.5 ug / ml or less. It is known to reach. The results of this study indicate that the amount of MBL in hepatitis B carriers has a significant impact on disease progression. In addition, studies in Chinese people have reported that people with low levels of MBL have a higher number of infectious type B viruses in their blood than those with high levels of MBL.
MBL과 관련성이 보고된 질환은 감염성 질환에 한정되지 않고, 매우 다양하게 보고되고 있다(표 1).Diseases reported to be associated with MBL are not limited to infectious diseases, but are reported in a wide variety (Table 1).
종래기술의 문제점은 고분자형 MBL의 대량생산 체계가 되어있지 않다는 것이다. 이를 해결하기 위하여, 본 발명은 고분자형 MBL을 대량 생산할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.The problem with the prior art is that there is no mass production system of polymeric MBL. In order to solve this problem, the present invention aims to provide a transformant capable of mass-producing a polymeric MBL.
또한 본 발명은 MBL 결합성을 가지는 pre S를 이용하여 MBL 생산균주 배양액으로부터 MBL을 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. In addition, an object of the present invention is to provide a method for purifying MBL from MBL producing strain culture using pre S having MBL binding.
또한 본 발명은 pre S를 이용하여 MBL의 기능을 활성화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Another object of the present invention is to provide a method of activating the function of MBL using pre S.
또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 보체계를 활성화시키는 용도로 제제화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. It is also an object of the present invention to provide a method for formulating the MBL recombinant protein for use in activating the complement system.
또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 보체계 활성화를 통하여 해당 질환의 예방 및 치료하는 용도로 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a MBL recombinant protein for the purpose of preventing and treating the disease through activation of the complement system.
또한 본 발명의 MBL 재조합 단백질을 사스 코로노바이러스 감염을 억제할 수 있는 용도로 제공하는 것을 목적으로 한다. It is also an object of the present invention to provide the MBL recombinant protein of the present invention for suppressing SARS coronovirus infection.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 pMSG 벡터의 NheI 및 BglII 제한효소 인식부위에 MBL(Mannose Binding Lectin) 유전자가 발현가능하도록 삽입된 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a transformant transformed with a vector inserted to express a Mannose Binding Lectin (MBL) gene at a Nhe I and Bgl II restriction enzyme recognition site of a pMSG vector.
또한 본 발명은 상기 형질전환체로부터 생산된 MBL 재조합 단백질을 제공한다.The present invention also provides an MBL recombinant protein produced from the transformant.
또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물을 제공한다.The present invention also provides a complement system activation composition comprising the MBL recombinant protein as an active ingredient.
본 발명은 (a) B형 간염 바이러스 preS가 부착된 기질을 충진하여 MBL정제용 컬럼을 제조하고, (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음 MBL이 포함된 시료를 칼슘 이온존재하에 컬럼에 투입하여 MBL을 상기 B형 간염 바이러스 preS에 특이적으로 결합시키고 및 (c) 상기 MBL이 결합된 컬럼에 EDTA 또는 EGTA가 포함된 완충액을 흘려주어 MBL을 용출시키는 것을 포함하는 MBL 정제방법을 제공한다.The present invention (a) hepatitis B virus preS is filled with a substrate attached to prepare a MBL purification column, (b) equilibrating the column and then the MBL containing sample is added to the column in the presence of calcium ion MBL MBL It specifically binds to the hepatitis B virus preS and (c) provides a MBL purification method comprising eluting MBL by flowing a buffer containing EDTA or EGTA to the MBL bound column.
본 발명은 MBL 재조합 단백질을 사람 또는 동물에 투여하여 보체계를 활성화 시키는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of activating the complement system by administering a recombinant MBL protein to a human or animal.
본 발명은 B형 간염바이러스 pre S, 당쇄화된 단백질, 당쇄화된 펩타이드, 당쇄물(glycosyl moiety) 및 만난으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 물질이 부착된 나노 파티클 및 상기 물질에 결합된 MBL 단백질을 포함하는 보체계 활성화용 나노 파티클을 제공한다.The present invention is hepatitis B virus pre S, glycosylated protein, glycated peptide, glycosyl moiety and nanoparticles attached to at least one selected from the group consisting of mannan and MBL protein bound to the material It provides a nanoparticle for the complement system activation including a.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 동물의 보체계를 활성화시킬 수 있는 방법을 연구하던 중, MBL 과정(pathway)에 의하여 보체계 활성화를 유도하기 위하여 고분자형 MBL을 동물세포에서 대량생산할 수 있는 시스템을 확립하였다. The inventors of the present invention, while studying a method for activating the complement system of animals, established a system capable of mass production of macromolecular MBL in animal cells in order to induce the complement system activation by the MBL process (pathway).
본 발명의 MBL 형질전환체는 숙주세포에 pMSG-MBL 벡터가 형질도입된 것이다. 상기 pMSG-MBL 벡터는 베타 글로빈 유전자의 MAR 인자(Nuclear matrix attachment region element) 역방향체 및 SV40 바이러스의 poly-A와 가스트린(gastrin) 유전자의 전사종결인자 조합체를 포함하는 pMGS(KCCM 10202) 벡터에 MBL cDNA(Gene Bank NM_000242)가 삽입된 것이다. 본 발명의 숙주세포는 통상적인 동물세포이며, 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary), 간세포(human hepatocyte), 및 HEK(human embryonic kidney) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포이다.MBL transformant of the present invention is a pMSG-MBL vector is transduced into the host cell. The pMSG-MBL vector is a MBL in a pMGS (KCCM 10202) vector comprising a MAR matrix (Nuclear matrix attachment region element) reverse of beta globin gene and a transcription terminator combination of poly-A and gastrin gene of SV40 virus. cDNA (Gene Bank NM_000242) is inserted. The host cell of the present invention is a conventional animal cell, preferably a cell selected from the group consisting of Chinese hamster ovary (CHO), human hepatocytes, and human embryonic kidney (HEK) cells.
본 발명에서는 일실시예로, CHO 세포에 pMSG-MBL 벡터를 도입하여 형질전환체를 제조하였고, 상기 형질전환체는 MTX 존재하에 적응시켜, 다량의 MBL 재조합 단백질을 발현하는 형질전환체를 선별하였다. 선별한 형질전환체는 CHO MBL/D1-3 로 명명하고, 2003년 5월 16일자로 대한민국 대전에 소재한 유전자은행 (Korean Collection for Type Culture)에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10472BP를 부여받았다.In one embodiment of the present invention, a transformant was prepared by introducing a pMSG-MBL vector into CHO cells, and the transformant was adapted in the presence of MTX to select a transformant expressing a large amount of MBL recombinant protein. . The selected transformants were named CHO MBL / D1-3, and deposited on May 16, 2003, with the Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea, and was given accession number KCTC 10472BP.
본 발명의 MBL 형질전환체에서 생산되는 MBL 재조합 단백질은 인간유래의 천연 MBL과 유사하게 다중중합체(multimerization) 형태를 가진 고분자형이다. MBL은 모노머로는 선천성 면역체계를 활성화하는 성질을 갖지 못하므로 고분자(oligomer)형태로 만들어지는 것이 매우 중요하다. 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL 단백질은 기존의 시도와는 차별되게 천연 MBL단백질과 유사한 다중중합체 형태를 갖는다. 또한 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL단백질은 형질전환체로부터 발현율이 매우 높으며, 형질전환체는 생산클론으로 활용이 가능하다. MBL recombinant protein produced in the MBL transformant of the present invention is a polymer type having a multimerization form similar to human-derived native MBL. Since MBL does not have the property of activating the innate immune system as a monomer, it is very important to be made in the form of an oligomer. The recombinant MBL protein provided by the present invention has a multipolymer form similar to natural MBL protein, which is different from the existing trials. In addition, the recombinant MBL protein provided by the present invention has a very high expression rate from the transformant, and the transformant can be used as a production clone.
본 발명의 MBL 재조합 단백질은 B형 간염 바이러스 preS의 결합성을 이용하여 MBL 형질 전환체의 배양액으로부터 정제할 수 있다. MBL 정제방법은 (a) B형 간염 바이러스 preS가 부착된 기질을 충진하여 컬럼을 제조하고, (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음 재조합 MBL단백질이 포함된 시료를 칼슘 이온존재 하에 컬럼에 투입하여 재조합 MBL단백질을 상기 B형 간염 바이러스 preS에 특이적으로 결합시키고 및 (c) 상기 MBL 재조합 단백질이 결합된 컬럼에 EDTA 또는 EGTA가 포함된 완충액을 흘려주어 재조합 MBL단백질을 용출시키는 것을 포함한다. MBL recombinant protein of the present invention can be purified from the culture of MBL transformant using the binding of hepatitis B virus preS. MBL purification method (a) hepatitis B virus preS is attached to the substrate to prepare a column, (b) equilibrating the column, and then the sample containing the recombinant MBL protein is added to the column in the presence of calcium ion MBL protein specifically binds to the hepatitis B virus preS, and (c) eluting the recombinant MBL protein by flowing a buffer containing EDTA or EGTA to the column to which the MBL recombinant protein is bound.
상기 (a) 단계에서, 상기 기질은 통상의 친화성 크로마토그래피에 사용되는 기질일 수 있으며, 그 예로 세파로즈가 있다.In the step (a), the substrate may be a substrate used in conventional affinity chromatography, for example Sepharose.
상기 (b) 단계에서, 컬럼의 평형화는 MBL 재조합 단백질을 B형 간염 바이러스 preS와 결합시킬 때 사용하는 동일 용액 또는 완충액을 컬럼에 흘려주어 실시할 수 있다. MBL 재조합 단백질을 B형 간염 바이러스 preS와 결합시킬 때 칼슘이온 존재하에 실시하는 것이 좋으며, 이때 칼슘의 농도는 2 내지 20 mM인 것이 바람직하다. MBL 재조합 단백질이 포함된 시료는 MBL 형질전환의 배양배지 또는 MBL 형질전환체 용혈물로부터 수득한 상청액일 수 있다.In the step (b), the column equilibration may be performed by flowing the same solution or buffer used to bind the MBL recombinant protein with hepatitis B virus preS to the column. When combining the MBL recombinant protein with hepatitis B virus preS, it is preferable to carry out in the presence of calcium ions, wherein the concentration of calcium is preferably 2 to 20 mM. The sample containing the MBL recombinant protein may be a supernatant obtained from the culture medium of MBL transform or MBL transformant hemolyte.
상기 (c) 단계에서, MBL 재조합 단백질의 용출은 칼슘이온이 비포함된 EDTA 또는 EGTA 완충액을 사용하여 실시된다. 상기 완충액은 EDTA 또는 EGTA가 2 내지 10 mM로 포함된 완충액, 예를 들면 증류수 또는 Tris-Cl일 수 있다. In step (c), the elution of MBL recombinant protein is performed using EDTA or EGTA buffer containing no calcium ions. The buffer may be a buffer containing 2-10 mM EDTA or EGTA, for example distilled water or Tris-Cl.
상기 (c) 단계 이후에 용출물은 동결건조하거나, 투석후 동결건조하여 정제된 MBL 재조합 단백질을 수득할 수 있다.After step (c), the eluate may be lyophilized or lyophilized after dialysis to obtain purified MBL recombinant protein.
본 발명의 상기 MBL 재조합 단백질 정제방법은, 형질전환체로부터 생산된 MBL 재조합 단백질이외에도 천연의 생체시료로부터 MBL을 정제하는데 사용할 수 있다. 상기 생체시료로는 혈액, 플라즈마 또는 혈청(serum)이 사용될 수 있다.The MBL recombinant protein purification method of the present invention, in addition to the MBL recombinant protein produced from the transformant can be used to purify MBL from natural biological samples. The biological sample may be blood, plasma or serum.
본 발명의 MBL 재조합 단백질은 의학적인 용도로 사용하여 선천성 또는 후천성 MBL 결핍 환자에게 처방할 수 있으며, 그 외 방어시스템 증강을 위한 용도로 사용할 수 있다. 또한 표 1에서 열거된 질환을 포함하는 MBL단백질과 관련이 있는 질환의 예후를 개선하는데 사용할 수 있다. MBL recombinant protein of the present invention can be used for medical purposes and prescribed to patients with congenital or acquired MBL deficiency, and can be used for other defense system enhancement. It can also be used to improve the prognosis of diseases associated with MBL proteins, including the diseases listed in Table 1.
또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약리학적으로 허용가능한 담체나 단백질 안정화제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 담체로는 증류수, 식염수 또는 글리세린을 사용할 수 있으며, 단백질 안정화제로는 소르비톨, 글루코스, 슈크로즈, 트레할로스, 말토스, 알부민, 아미노산(일예로, 라이신, 글리신)이 있다. 상기 담체 또는 단백질 안정화제는 각각 상기 조성물에 3 내지 30 중량%로 포함될 수 있다.The present invention also provides a complement system activation composition comprising the MBL recombinant protein as an active ingredient. The composition may further comprise a pharmacologically acceptable carrier or protein stabilizer. As the carrier, distilled water, saline or glycerin may be used, and protein stabilizers include sorbitol, glucose, sucrose, trehalose, maltose, albumin, and amino acids (for example, lysine and glycine). The carrier or protein stabilizer may be included in the composition of 3 to 30% by weight, respectively.
상기 조성물은 동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 비경구 처방하는 것이다. 더욱 바람직하기로는 상기 조성물을 피내, 피하, 근육내, 동맥내 또는 정맥내 주사하는 것이다. 상기 조성물의 제형은 유제, 액제, 산제, 정제 또는 과립제일 수 있으며, 고체인 경우 사용직전 담체에 용해시켜 사용할 수 있다. The composition can be administered orally or parenterally to the animal, preferably parenterally. More preferably, the composition is injected intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraarterial or intravenous. The formulation of the composition may be an emulsion, a liquid, a powder, a tablet or a granule, and in the case of a solid, may be dissolved in a carrier immediately before use.
본 발명의 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물은 또한 MASP-1 또는 MASP-2를 더욱 포함할 수 있다. 상기 MASP-1 또는 MASP-2는 천연에서 분리한 단백질이거나 이들을 포함한 단백질조성물일 수 있으며, 또는 재조합 단백질일 수 있다. MSAP-1 또는 MASP-2는 단독 또는 모두 상기 조성물에 포함될 수 있다. 상기 MASP-1 및 MASP-2는 MBL에 의한 보체계 활성을 더욱 촉진시킬 수 있다.Complementary activation composition comprising the MBL recombinant protein of the present invention as an active ingredient may also further comprise MASP-1 or MASP-2. The MASP-1 or MASP-2 may be a protein isolated from nature or a protein composition including them, or may be a recombinant protein. MSAP-1 or MASP-2 may be included alone or in all of the above compositions. The MASP-1 and MASP-2 may further promote the complement system activity by MBL.
또한 본 발명은 B형 간염바이러스 pre S가 부착된 나노 파티클 및 상기 pre S에 결합된 MBL 단백질을 포함하는 나노 파티클을 제공한다. 상기 나노 파티클은 리포솜 또는 PLGA이며, 10 ㎚ 내지 10 ㎛ 직경을 갖는 것이다. 상기 리포솜 또는 PLGA에는 preS 외에도 MBL이 붙을 수 있는 당쇄화된 단백질, 펩타이드 또는 만난(mannan)이 부착될 수 있다. In another aspect, the present invention provides a nanoparticle comprising a hepatitis B virus pre S attached nanoparticles and MBL protein bound to the pre S. The nanoparticles are liposomes or PLGA and have a diameter of 10 nm to 10 μm. The liposomes or PLGA may be attached to glycated proteins, peptides or mannans that can be attached to MBL in addition to preS.
본 발명의 MBL 단백질이 부착된 나노 파티클은 MBL을 안정성 있는 형태로 사용할 수 있고, MBL 단백질을 활성화된 상태로 제공할 수 있으므로, 바이러스, 박테 리아, 곰팡이 등의 미생물에 의한 감염성질환을 치료할 수 있는 용도로 광범위하게 제공될 수 있다. 특히 MBL 단백질은 사스(SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome) 코로나바이러스(Coronavirus)의 감염을 현저히 억제시키므로, 본 발명의 MBL 단백질이 부착된 나노 파티클은 사스를 예방 및 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있다. Nanoparticles attached to the MBL protein of the present invention can use the MBL in a stable form, and can provide the MBL protein in an activated state, it can treat infectious diseases caused by microorganisms such as viruses, bacteria, fungi, etc. It can be provided for a wide range of purposes. In particular, MBL protein significantly inhibits the infection of SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) Coronavirus (Coronavirus), the MBL protein attached nanoparticles of the present invention can be used for the purpose of preventing and treating SARS.
또한 본 발명은 MBL을 유효성분으로 포함하는 사스 예방 및 치료 조성물을 제공한다. 상기 MBL은 야생형 MBL이거나 MBL 재조합 단백질이다. 상기 조성물은 약리학적으로 허용가능한 담체나 단백질 안정화제를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 담체 또는 단백질 안정화제는 각각 상기 조성물에 3 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 조성물은 동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 비경구 처방하는 것이다. 더욱 바람직하기로는 상기 조성물을 피내, 피하, 근육내, 동맥내 또는 정맥내 주사하는 것이다. 상기 조성물의 제형은 유제, 액제, 산제, 정제 또는 과립제일 수 있으며, 고체인 경우 사용직전 담체에 용해시켜 사용할 수 있다. The present invention also provides SARS prevention and treatment composition comprising MBL as an active ingredient. The MBL is wild type MBL or MBL recombinant protein. The composition may further include a pharmacologically acceptable carrier or protein stabilizer, and the carrier or protein stabilizer may be included in the composition in an amount of 3 to 30 wt%, respectively. The composition can be administered orally or parenterally to the animal, preferably parenterally. More preferably, the composition is injected intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraarterial or intravenous. The formulation of the composition may be an emulsion, a liquid, a powder, a tablet or a granule, and in the case of a solid, may be dissolved in a carrier immediately before use.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, examples of the present invention will be described. The following examples are only for illustrating the present invention and the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1: MBL 형질전환체 및 MBL 재조합 단백질 제조Example 1 Preparation of MBL Transformant and MBL Recombinant Protein
1-1. 발현벡터 제작 1-1. Expression vector production
사람의 간세포 cDNA 라이브러리로부터 PCR법으로 수득한 MBL cDNA를 pEZ 벡터에 클로닝하여 pEZ-MBL 2-5를 제조하였고, MBL cDNA 염기서열을 보고된 MBL 염기 서열과 비교, 확인하였다(Gene Bank NM_000242). 이를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 PCR을 실시하여 약 750 bp의 MBL cDNA를 증폭하였다. 프라이머 각각은 제한효소 인식서열과 코작 서열(Kozak sequence)을 포함하고 있어 암호화부위 전체를 증폭시킨다. MBL cDNA는 pMSG 벡터(대한민국 특허 출원 10-2000-0043996)에 클로닝하여 pMSG-MBL을 제조하였고, 삽입된 MBL 염기서열을 확인하였다.MBL cDNA obtained by PCR from human hepatocyte cDNA library was cloned into pEZ vector to prepare pEZ-MBL 2-5, and the MBL cDNA sequence was compared with the reported MBL sequence and confirmed (Gene Bank NM_000242). As a template, PCR was performed using primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 to amplify about 750 bp of MBL cDNA. Each primer contains a restriction enzyme recognition sequence and a Kozak sequence, which amplifies the entire coding region. MBL cDNA was cloned into pMSG vector (Korean Patent Application 10-2000-0043996) to prepare pMSG-MBL, and the inserted MBL sequence was confirmed.
1-2. 형질 도입 (Transfection)1-2. Transfection
1-2-1. 발현 플라스미드 DNA 준비 1-2-1. Expression Plasmid DNA Preparation
pMSG-MBL을 대장균에 형질도입한 다음, 형질전환주를 100 ug/㎖의암피실린이 첨가된 100 ㎖의 LB 배지에서 배양하고, QIAPREP 플라스미드 미디 키트 (Quiagen, 미국)를 이용하여 pMSG-MBL DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 Sca I 제한효소로 절단하여 선형화시키고, QIAQuick PCR 정제키트 (Quiagen, 미국)로 분리하여 사용하였다. pMSG-MBL was transfected into Escherichia coli, and then the transformants were cultured in 100 ml LB medium added with 100 ug / ml ampicillin and pMSG-MBL DNA was prepared using the QIAPREP plasmid midi kit (Quiagen, USA). Separated. The isolated DNA was cleaved with Sca I restriction enzyme and linearized, and separated and used by QIAQuick PCR purification kit (Quiagen, USA).
1-2-2. 숙주세포 준비1-2-2. Host cell preparation
CHO DG44(dhfr-/dhfr-)숙주세포를 10 % cFBS가 첨가된 α-MEM배지에서 배양한 다음 헤마사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하였다. 2 x 105의 세포를 10 % cFBS가 첨가된 α-MEM배지에 분주하고, CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. CHO DG44 (dhfr - / dhfr - ) by culturing a host cell in a medium containing 10% α-MEM was then added cFBS is measured the number of cells by using the H. Masai Sat meter. 2 x 10 5 cells were dispensed into α-MEM medium to which 10% cFBS was added and incubated for one day in a CO 2 incubator.
1-2-3. 형질전환 1-2-3. Transformation
pMSG-MBL 벡터 2 ㎍을 DosperTM 5.3 ㎕, pDCH1P 벡터(DHFR 유전자를 가지고 있는 플라스미드, Venolia, L. et al., 1987, Somat. Cell Mol. Genet. 13, 491-501) DNA 16 ng과 혼합하여 상온에서 45분 반응시키고, 이를 숙주 세포에 첨가하였다. 37 ℃에서 6시간 배양한 후 배지를 제거하고, 새로운 10 % cFBS를 포함하는 α-MEM배지를 3 ㎖/웰 첨가하여 다시 배양하였다. 2~3일 후, 형질전환된 세포들이 충분히 자랐을 때 트립신을 처리한 다음 세포(4 x 1005/well)에 10 % dFBS를 포함하는 α-MEM (w/o)를 2 ㎖ 첨가하여 배양하였다. 2~3일 간격으로 배지를 교환하면서 현미경으로 세포의 상태와 단일 콜로니 생성여부를 관찰하였고, 10일 후에 초기 적응된 세포들을 얻을 수 있었다.2 μg of pMSG-MBL vector was mixed with 5.3 μl of Dosper ™ and pDCH1P vector (plasmid with DHFR gene, Venolia, L. et al., 1987, Somat. Cell Mol. Genet . 13, 491-501) DNA 16 ng The mixture was allowed to react at room temperature for 45 minutes and added to the host cell. After incubation at 37 ° C. for 6 hours, the medium was removed and cultured again by adding 3 ml / well of α-MEM medium containing fresh 10% cFBS. After 2-3 days, when the transformed cells were fully grown, trypsin-treated and then cultured by adding 2 ml of α-MEM (w / o) containing 10% dFBS to the cells (4 x 100 5 / well). . Microscopic changes of the medium at intervals of 2 to 3 days were observed under the microscope and the state of cells and the production of single colonies. After 10 days, the cells were initially adapted.
1-3. MBL 발현 세포주의 선별 및 발현량 증폭1-3. Selection of MBL expressing cell line and amplification of expression level
초기 적응된 세포들을 얻은 후, 배지내 MTX(methotrexate) 농도를 단계적으로 증가시켜 도입 유전자의 증폭을 유도하였다. After initial adapted cells were obtained, amplification of the transgene was induced by increasing the concentration of MTX (methotrexate) in the medium step by step.
세포를 4 x 105 세포/웰로 분주하고, 10 nM MTX가 첨가된 배지(α-MEM + 10 % dFBS)에서 배양하였다. 2-3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하고, 이를 분주하여 동일한 방법에 따라 100 nM MTX가 첨가된 배지에서 적응시킨 다음 다시 1 uM MTX 조건에서 적응시켰다. 발현 증폭 과정을 거치면서 각 단계마다 웨스턴 블롯을 수행하여 MBL 발현량의 변화를 관찰하였다. MBL은 배지에 함유된 MTX 농도가 높아짐에 따라 발현량이 증가하였다. 이에 1 uM MTX 조건에서 적응된 세포군으로부터 단일 세포주를 분리하고자 하였다. Cells were aliquoted at 4 × 10 5 cells / well and cultured in medium (α-MEM + 10% dFBS) with 10 nM MTX added. Cultures were exchanged at intervals of 2-3 days, aliquoted and adapted in medium supplemented with 100 nM MTX following the same method and then again in 1 uM MTX conditions. Western blots were performed at each stage during the expression amplification process to observe changes in MBL expression levels. MBL expression increased with increasing MTX concentration in the medium. Therefore, we tried to isolate a single cell line from the cell population adapted under 1 uM MTX conditions.
1-4. 단일 세포주 분리 1-4. Single cell line isolation
MBL 발현 효율이 높은 단일 세포주 선별을 위하여, 1 uM MTX 배양조건에서 적응된 세포들을 0.5 세포/웰로 96-웰 평판에 분주하고 배지(α-MEM + 10 % dFBS + 1 uM MTX)에서 배양하였다. 약 2주 후 단일 콜로니가 형성되면 24-웰 평판으로 옮기고 계속적으로 배양하여 충분한 수의 세포로 증식시킨 다음 일부는 동결보관하고, 일부는 웨스턴 블롯으로 세포간의 발현을 비교하였다. 다량의 MBL을 발현시키는 것으로 확인된 단일세포 D1-3 형질전환체를 세포주로 선별하였다.For selection of single cell lines with high MBL expression efficiency, cells adapted in 1 uM MTX culture conditions were dispensed into 96-well plates at 0.5 cells / well and cultured in medium (α-MEM + 10% dFBS + 1 uM MTX). After about two weeks, when a single colony was formed, it was transferred to a 24-well plate, continuously cultured, propagated to a sufficient number of cells, some were cryopreserved, and some were compared between cells by Western blot. Single cell D1-3 transformants identified to express large amounts of MBL were selected as cell lines.
도 1은 정제된 재조합 MBL 단백질의 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴블롯(B)이다. 레인 1은 비변성조건에서 정제된 재조합 MBL 단백질이고, 레인 2는 변성조건에서 정제된 재조합 MBL 단백질이고, 레인 3은 비변성조건에서 인간 혈장으로부터 일부 정제한 천연 MBL 이고, 레인 4는 변성조건에서 인간 혈장으로부터 일부 정제한 천연 MBL이며, M은 분자크기마커이다. 형질전환체에서 발현된 MBL 재조합 단백질은 비변성조건에서 전기영동한 결과 인체 유래의 천연 MBL과 유사한 다중합체(multimerization) 양상을 나타내었다(도 1). 1 is SDS-PAGE (A) and Western blot (B) of purified recombinant MBL protein.
1-5. 형질전환체에서의 MBL 재조합 단백질 발현율 확인 1-5. Expression of MBL Recombinant Protein in Transformants
형질전환체 CHO MBL/D1-3의 MBL 재조합 단백질 발현효율을 분석하였다. 세포 각각을 5 X 105 로 T25 플라스크에 분주하여 배지(α-MEM(w/o) + 10 % dFBS)에서 배양하였다. 세포가 약 90 %의 컨플루언시(confluency)에 이르렀을 때, 용액(α-MEM(w/o) + 5 % dFBS) 3 ㎖을 첨가하고 4일 배양 후 회수하였다. 배양액을 10 배 희석하여 웨스턴 블롯을 수행하여 천연 MBL과 비교한 결과 평판배양시 MBL 재조합 단백질 발현율은 약 50 ㎍/106cells/day이었다. The expression efficiency of MBL recombinant protein of transformant CHO MBL / D1-3 was analyzed. Each of the cells was aliquoted into a T25 flask at 5 × 10 5 and incubated in medium (α-MEM (w / o) + 10% dFBS). When the cells reached about 90% confluency, 3 ml of solution (α-MEM (w / o) + 5% dFBS) was added and recovered after 4 days of incubation. When the culture solution was diluted 10-fold and Western blot was compared with native MBL, the expression rate of MBL recombinant protein in plate culture was about 50 μg / 10 6 cells / day.
실시예 2: MBL 재조합 단백질 정제Example 2: MBL Recombinant Protein Purification
2-1. preS-세파로즈 컬럼 제조 2-1. preS-Sepharose Column Manufacturing
CNBr로 활성화된 세파로즈4B 파우더 1 g을 1 mM HCl에 녹인 후 여러 번 세척하였다. preS를 리간드로 사용하기 위하여 6.4 mg pre S단백질을 커플링 완충액(0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH8.3)에 0.5 내지 10 mg/ml이 되도록 녹였다. 세파로즈4B 수지를 pre S용액에 섞어 상온에서 2시간동안 반응시킨 후, 블롯킹 완충액(0.1 M TrisCl, pH 8.0)로 옮겨서 다시 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 세파로즈 결합된 preS를 웨스턴블롯으로 확인한 결과, 반응한 양이 모두 결합되었음을 알 수 있었다. 이를 컬럼에 충진하여 재조합 MBL단백질 정제에 사용하였다.1 g of CNBr-activated Sepharose 4B powder was dissolved in 1 mM HCl and washed several times. In order to use preS as a ligand, 6.4 mg pre S protein was dissolved in coupling buffer (0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH8.3) to 0.5-10 mg / ml. Sepharose 4B resin was mixed with pre S solution and reacted at room temperature for 2 hours, then transferred to blocking buffer (0.1 M TrisCl, pH 8.0) and reacted at room temperature for 2 hours. After washing, the Sepharose bound preS was confirmed by Western blot, and the reaction amount was found to be all bound. It was packed into a column and used for purification of recombinant MBL protein.
2-2. MBL 재조합 단백질 정제2-2. MBL Recombinant Protein Purification
MBL 재조합 단백질은 B형 간염바이러스의 pre S와 강한 결합력을 나타내므로, 이러한 성질을 이용하여 정제하였다. MBL recombinant protein has a strong binding ability with the pre S of hepatitis B virus, it was purified using this property.
preS-세파로즈로 충진된 컬럼을 결합 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05 % Tween 20)로 평형화시켰다. 재조합 MBL 단백질 배양배지를 컬럼에 로딩하여 MBL을 흡착시켰다. 결합 완충액으로 컬럼을 수차례 세척한 다음, Ca 이온이 무첨가된 용출 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA)을 컬럼에 통과 시켜 MBL을 용출시켰다. 용출물을 SDS-PAGE에서 확인한 결과 99.9 %의 순도를 갖는 MBL 재조합 단백질이 정제되었다(도 1).Columns filled with preS-Sepharose were equilibrated with binding buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.05% Tween 20). Recombinant MBL protein culture medium was loaded onto the column to adsorb MBL. The column was washed several times with binding buffer, and then MBL was eluted by passing elution buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) without Ca ions through the column. The eluate was confirmed by SDS-PAGE and the MBL recombinant protein having a purity of 99.9% was purified (FIG. 1).
실시예 3: MBL 재조합 단백질의 생물학적 활성 검증Example 3: Validation of Biological Activity of MBL Recombinant Protein
MBL 재조합 단백질의 생물학적 기능은 칼슘 이온 존재하에서 만노실레이티드 단백질에 결합하는지 여부 및 보체계(Complement) 활성화 여부를 측정하여 확인하였다. The biological function of the MBL recombinant protein was confirmed by measuring the binding to the mannosylated protein and complement activation in the presence of calcium ions.
3-1. 만노실레이티드 단백질에 결합실험3-1. Binding to Mannosilicated Proteins
3-1-1 만난 결합 실험3-1-1 Met Bonding Experiment
50 mM 카르보네이트-바이카르보네이드 완충액에 용해시킨 만난을 웰 당 1 ug이 되도록 Nunc Maxisorp Immunoplate에 넣고, 4 ℃에서 하룻밤동안 방치하여 코팅하였다. 세척 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05 % Tween-20, pH 7.6)으로 4회 세척한 후, 0.2 % BSA로 상온에서 1 시간 동안 블롯킹하였다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 결합 완충액(20 mM Tris, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.1 % BSA, 0.05 % Tween-20, pH7.6)에 용해시킨 MBL단백질 1 ug을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음 마우스 단일클론 항-인간 MBL8F6를 1:100으로 상온에서 2시간 반응시켰다. 항-마우스 IgG-HRP를 1:1500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 150 ul OPD 용액을 넣고 20분간 발색시켰다. 이후 50 ul의 3 M HCl을 가한 다음 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 OD값을 측정하였다 (도2). Mannan dissolved in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer was placed in Nunc Maxisorp Immunoplate to 1 ug per well and left overnight at 4 ° C. for coating. After washing four times with washing buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.05% Tween-20, pH 7.6), it was blocked with 0.2% BSA for 1 hour at room temperature. Wash three times with washing buffer, add 1 ug of MBL protein dissolved in binding buffer (20 mM Tris, 1 M NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.1% BSA, 0.05% Tween-20, pH7.6) at room temperature. The reaction was carried out for a time. After washing six times with washing buffer, mouse monoclonal anti-human MBL8F6 was reacted at 1: 100 at room temperature for 2 hours. After anti-mouse IgG-HRP was diluted 1: 1500 and reacted at room temperature for 1 hour, 150 ul OPD solution was added and developed for 20 minutes. Then, 50 ul of 3 M HCl was added, and then the OD value was measured using an ELISA plate reader at 492 nm (FIG. 2).
3-1-2 HBV PreS을 이용한 결합 실험Binding experiment using 3-1-2 HBV PreS
Nunc Maxisorp Immunoplate에 만난 대신 B형 간염바이러스의 재조합 preS 단백질을 웰 당 1 ug이 되도록 넣고, 3-1-1과 같은 조건에서 재조합 MBL단백질의 결합 실험을 수행하였다. 사용한 재조합 pre S 단백질은 사카로마이세스 세레비지아에서 발현하여, 고당쇄화된 형태로 정제되었다(PCT 출원 PCT/KR02/00820). Instead of meeting the Nunc Maxisorp Immunoplate, the recombinant preS protein of hepatitis B virus was added to 1 ug per well, and the binding experiment of the recombinant MBL protein was performed under the same conditions as in 3-1-1. The recombinant pre S protein used was expressed in Saccharomyces cerevisiae and purified in highly glycated form (PCT Application PCT / KR02 / 00820).
도 2a는 만난 및 pre S 에 대한 인간 혈장 MBL의 결합성을 나타낸 것이고, 2b는 재조합 MBL 단백질의 결합성을 나타낸 것이다. MBL는 당쇄된 preS 및 만난에는 결합하는데 반해, BSA에는 결합하지 않았다. 또한 재조합 MBL은 인간 혈장 MBL과 같이 만난 및 preS에 결합하였으므로 개발된 재조합 MBL단백질은 천연 MBL과 같은 활성을 보인다.Figure 2a shows the binding of human plasma MBL to met and pre S, 2b shows the binding of recombinant MBL protein. MBL binds to the glycated preS and met but not to BSA. In addition, since recombinant MBL is bound to met and preS like human plasma MBL, the developed recombinant MBL protein shows the same activity as natural MBL.
3-2. 보체계 활성화 실험3-2. Complement system activation experiment
3-2-1 천연MBL단백질과 재조합 MBL단백질을 이용한 C4 활성화3-2-1 C4 Activation Using Natural MBL Protein and Recombinant MBL Protein
Nunc Maxisorp Immunoplate에 웰당 1 ug의 만난으로 코팅하고, 각각 1 ug의 천연 MBL 단백질 또는 재조합 MBL 단백질과 MASP 단백질 공급원으로 MBL이 없는 MBL-결핍 혈청을 1/100이 되도록 넣고, 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음 500 ng C4를 넣고, 상온에서 2시간 반응시켰다. C4b 침전(deposit)을 측정하기 위하여 항-C4 항체-HRP를 1:1500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 150 ul OPD 용액을 넣고 20분간 발색시켰다. 50 ul의 3 M HCl를 가한 다음 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다(표 2). Nug Maxisorp Immunoplate was coated with 1 ug of metran per well, and 1 ug of natural MBL protein or recombinant MBL protein and MASP protein source were added with 1/100 of MBL-deficient serum to 1/100 and bound for 2 hours at room temperature. I was. After washing six times with washing buffer, 500 ng C4 was added, and reacted at room temperature for 2 hours. In order to measure C4b deposition, anti-C4 antibody-HRP was diluted 1: 1500 and reacted at room temperature for 1 hour. Then, 150 ul OPD solution was added and developed for 20 minutes. 50 ul of 3 M HCl was added and the OD value was measured with an ELISA plate reader at 492 nm (Table 2).
표 2에서와 같이, 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL 단백질은 만난 결합후 천연 MBL 단백질과 유사한 수준으로 C4를 활성화시킴을 확인할 수 있다. As shown in Table 2, it can be seen that the recombinant MBL protein provided in the present invention activates C4 at a level similar to that of the native MBL protein after binding.
3-2-2. pre S를 이용한 C4 활성화 실험3-2-2. C4 activation experiment using pre S
Nunc Maxisorp Immunoplate에 재조합 pre S 단백질을 웰 당 1 ug이 되도록 코팅한 후, 3-2-1과 같은 조건에서 재조합 MBL 단백질을 결합시켜 C4 활성화 실험을 수행하였다. After the recombinant pre S protein was coated to 1 ug per well on the Nunc Maxisorp Immunoplate, C4 activation experiments were performed by binding the recombinant MBL protein under the same conditions as 3-2-1.
표 3에서와 같이 재조합 MBL단백질은 만난에 결합한 상태에서 뿐 아니라 preS단백질에 결합한 상태에서도 C4를 활성화시킬 수 있다. 또한 재조합 MBL단백질은 만난에 비해 pre S 단백질에 결합되었을 때 보다 높은 C4 활성화를 유도함을 알 수 있었다. As shown in Table 3, recombinant MBL protein can activate C4 not only in the bound state but also in the preS protein. In addition, recombinant MBL protein was found to induce higher C4 activation when bound to the pre S protein compared to met.
도 3은 재조합 MBL 단백질에 의한 C4 활성화를 나타낸 것이다. 재조합 MBL단백질은 농도에 의존적으로 C4 활성화를 유도하였다. 3 shows C4 activation by recombinant MBL protein. Recombinant MBL protein induced C4 activation in a concentration dependent manner.
실시예 4: MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 보체계 활성화 조성물Example 4: Complementary system activating composition comprising MBL recombinant protein as an active ingredient
4-1. preS 단백질이 부착된 PLGA 나노파티클의 제조4-1. Preparation of PLGA Nanoparticles with PreS Protein Attached
분자량이 1,000 내지 100,000인 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))를 메탄올이나 메틸클로라이드와 같은 유기용매에 녹이고, SDS 또는 Tween 용액에 분산시켰다. 이를 하룻밤동안 강하게 혼합하여 나노 파티클을 제조하였다 (HS Yoo et al, J. Pharm Sci 2001, 90, 194-201; HS Yoo et al, Pharm Res, 1999, 16, 1114-1118). X-PEG-Y의 형태로 이종기능의 반응기(heterofunctional reaction group)를 갖는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)를 사용하여 나노 파티클의 반응기(-OH 또는 -COOH)에 접합시켰다(도 4). PLGA (poly (D, L-lactic-co-glycolic acid)) having a molecular weight of 1,000 to 100,000 was dissolved in an organic solvent such as methanol or methyl chloride and dispersed in SDS or Tween solution. Nanoparticles were prepared by strong mixing overnight (HS Yoo et al,
상기 X 및 Y는 각각 서로 다르게 하기 화학식 1 내지 4로 표현되는 반응기이며, X는 나노 파티클에 접합시키고, Y에는 pre S를 접합시킨다. X and Y are different from each other represented by the following
(화학식 1)(Formula 1)
(화학식 2)(Formula 2)
(화학식 3)(Formula 3)
(화학식 4)(Formula 4)
Y 링커는 preS의 라이신, 알지닌의 ε-아민이나 N-말단 아민과 결합하거나, C-말단 또는 ε-카르복실산과 결합한다. The Y linker binds to lysine of preS, ε-amine or N-terminal amine of arginine, or C-terminal or ε-carboxylic acid.
도 4는 preS가 부착된 형태의 나노 파티클을 나타낸 것이다. A는 preS가 부착된 형태의 나노파티클이고, B는 용액상태에서 여러 개의 preS가 나노파티클의 바깥쪽에 부착된 형태를 나타내고 있다. 이때 N-말단 쪽을 부착한 것을 PLGA-preS(N)우로, C-말단을 부착한 것을 PLGA-preS(C)라 명명하였다. Figure 4 shows the nanoparticles of the preS attached form. A shows nanoparticles in the form of preS attached, and B shows a number of preS attached to the outside of the nanoparticles in solution. At this time, the N-terminal side was attached as PLGA-preS (N), and the C-terminal was attached as PLGA-preS (C).
4-2. PLGA-preS를 이용한 결합 실험4-2. Binding experiments using PLGA-preS
재조합 MBL단백질과 PLGA-preS가 결합하는지를 부착상태에서 확인하였다. It was confirmed whether the recombinant MBL protein and PLGA-preS bind at the attachment state.
Nunc Maxisorp Immunoplate에 PLGA-preS 또는 재조합 MBL단백질을 코팅하였으며, 이후 실험은 실시예 3에서와 같은 방법으로 수행하였다. The Nunc Maxisorp Immunoplate was coated with PLGA-preS or recombinant MBL protein, after which the experiment was performed in the same manner as in Example 3.
도 5는 MBL 단백질의 PLGA-preS와의 결합성을 나타낸 것으로, 5a는 MBL 단백질이 코팅된 플레이트에 PLGA-preS를 반응시킨 것이고, 5b는 PLGA-preS가 코팅된 플레이트에 MBL을 반응시킨 것이다. 재조합 MBL 단백질은 PLGA-preS의 나노파티클 형태에서도 preS에 결합함을 확인할 수 있었다. Figure 5 shows the binding of MBL protein with PLGA-preS, 5a is a reaction of PLGA-preS on the plate coated with MBL protein, 5b is a reaction of MBL on the plate coated with PLGA-preS. Recombinant MBL protein was confirmed to bind to preS even in the nanoparticle form of PLGA-preS.
4-3. PLGA-preS를 이용한 C4 활성화 실험 4-3. C4 activation experiment using PLGA-preS
재조합 MBL단백질이 PLGA-preS에 부착된 상태에서 C4 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다. Whether recombinant MBL protein induces C4 activation in the state attached to PLGA-preS was confirmed.
Nunc Maxisorp Immunoplate에 PLGA-preS(N)과 PLGA-preS(C)를 웰당 각각 0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 ul씩 넣어 코팅하였다. 여기에 500 ng 재조합 MBL 단백질과 MBL 결핍성 혈청을 넣어 반응시켰다. PLGA-preS (N) and PLGA-preS (C) were coated on Nunc Maxisorp Immunoplate with 0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25 and 50 ul per well, respectively. 500 ng recombinant MBL protein and MBL deficient serum were added thereto.
도 6은 PLGA-preS에 결합된 MBL단백질에 의한 C4 활성화를 나타낸 것이다. 도 6에서, 나노 파티클 상태의 preS는 C4 활성화를 유도함을 확인할 수 있다. Figure 6 shows C4 activation by MBL protein bound to PLGA-preS. In FIG. 6, it can be seen that preS in the nanoparticle state induces C4 activation.
4-4. 용액상태에서 PLGA-preS 결합에 의한 C4 활성화 실험4-4. C4 activation experiment by PLGA-preS binding in solution
PLGA-preS와 MBL을 10 mM CaCl2이 있는 조건에서 용액상태에서 3시간 동안 반응시켰다. PLGA-preS-MBL 복합체를 측정하기 위하여, 반응물은 항-preS2 항체 500 ng/웰로 코팅된 Nunc Maxisorp Immunoplate에 넣고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰을 세척한 다음 항-MBL-바이오틴 항체를 1:5,000으로 희석하여 가하고, 상온에서 90분간 반응시켰다. 익스트라비딘-HRP(Sigma, USA)를 1:2,500으로 가한 다음 상온에서 50분간 반응시켰다. 150 ul OPD 용액을 넣어 20분간 발색시키고, 50 ul 3 M HCl로 반응을 중지시켰다. 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다(표 4). 이때 음성 대조군으로 PLGA-preS와 재조합 MBL을 5 mM EDTA 조건으로 용액상에서 반응시켰다. PLGA-preS and MBL were reacted for 3 hours in solution under the condition of 10 mM CaCl 2 . To determine the PLGA-preS-MBL complex, the reaction was placed in Nunc Maxisorp Immunoplate coated with 500 ng / well of anti-preS2 antibody and allowed to react for 2 hours at room temperature. After washing each well, the anti-MBL-biotin antibody was diluted 1: 5,000, and reacted at room temperature for 90 minutes. Extravidin-HRP (Sigma, USA) was added at 1: 2,500 and reacted for 50 minutes at room temperature. 150 ul OPD solution was added for 20 minutes, and the reaction was stopped with 50 ul 3 M HCl. OD values were measured with an ELISA plate reader at 492 nm (Table 4). At this time, PLGA-preS and recombinant MBL were reacted in solution under 5 mM EDTA as a negative control.
표 4에서, PLGA-preS-MBL 복합체는 10 mM CaCl2조건에서 형성됨을 확인할 수 있었다.In Table 4, it was confirmed that the PLGA-preS-MBL complex is formed under 10 mM CaCl 2 conditions.
실시예 5: MBL 재조합 단백질에 의한 사스 코로나 바이러스 (SARS-CoV)의 중화검정Example 5 Neutralization Assay of SARS Corona Virus (SARS-CoV) by MBL Recombinant Protein
MEM배지에 원숭이 콩팥세포 FRhk-4를 접종하여 배양한 다음 여기에 MBL 재조합 단백질을 처리한 다음 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)를 감염시켰다. MBL 재조 합 단백질은 2.5 ㎍/㎖에서부터 4-fold로 희석하여 사용하였다.MEM medium was inoculated with monkey kidney cells FRhk-4, and then treated with MBL recombinant protein, and then infected with SARS-CoV. MBL recombination protein was used diluted from 2.5 μg / ml to 4-fold.
사스 코로나바이러스는 사스 환자로부터 직접 분리한 것을 사용하였다(Ksiazek TG et. al., "A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome" N Engl J Med 2003; 348(20): 1953-1966; Peiris JS et. al., "Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome" Lancet 2003; 361(9366): 1319-1325)SARS coronavirus was used directly isolated from SARS patients (Ksiazek TG et. Al., "A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome" N Engl J Med 2003; 348 (20): 1953-1966; Peiris JS et al., "Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome" Lancet 2003; 361 (9366): 1319-1325).
사스 코로나바이러스의 감염 여부는 PCR방법으로 확인하였다. 프라이머는 SARS-CoV에 특이적인 프라이머를 이용하였고, 정량적 Real-time PCR법을 실시하였다. 대조군으로는 MBL 재조합 단백질을 처리하지 않은 상태에서 SARS-CoV를 감염시킨 FRhk-4 세포를 사용하였다. The infection of SARS coronavirus was confirmed by PCR. As primers, primers specific for SARS-CoV were used, and quantitative real-time PCR was performed. As a control, FRhk-4 cells infected with SARS-CoV without treatment with MBL recombinant protein were used.
도 7은 사스 코로나바이러스 감염에서의 MBL 재조합 단백질의 효과를 확인한 그래프이다. 도 7의 그래프에서, 대조군에서 증식된 바이러스의 PCR 정량값을 100으로 둔 것이다. MBL 재조합 단백질을 처리한 경우 처리농도에 의존적으로 사스 코로나바이러스 감염이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 특히 MBL 재조합 단백질을 2.5 ㎍/㎖로 처리하였을 때 바이러스의 증식이 약 15 % 이하로 억제되었다. Figure 7 is a graph confirming the effect of MBL recombinant protein in SARS coronavirus infection. In the graph of FIG. 7, the PCR quantitative value of the virus propagated in the control group is 100. It was observed that SARS coronavirus infection was suppressed depending on the treatment concentration when the MBL recombinant protein was treated. In particular, when the 2.5L / ml of the MBL recombinant protein was treated, the proliferation of the virus was suppressed to about 15% or less.
도 8은 사스 코로나바이러스를 감염시킨 FRhk-4세포를 위상차 현미경 (phase contrast microscope)으로 관찰한 사진이다. 도 8에서, MBL 재조합 단백질을 처리하지 않은 대조군에서는 건강한 세포가 관찰되지 않으나, 재조합 MBL이 처리된 실험군에서는 건강한 세포를 관찰할 수 있었다. FIG. 8 is a photograph of FRhk-4 cells infected with SARS coronavirus observed with a phase contrast microscope. FIG. In FIG. 8, healthy cells were not observed in the control group not treated with the MBL recombinant protein, but healthy cells were observed in the experimental group treated with the recombinant MBL.
따라서, 본 발명의 MBL은 사스 코로나바이러스의 숙주 감염성을 억제하는 효 과가 있으며, 이에 사스 치료제로 개발가능하다. Therefore, the MBL of the present invention has an effect of inhibiting the host infectivity of SARS coronavirus, it can be developed as a SARS treatment.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 보체계를 활성화시켜 체내 방어시스템을 강화시킬 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 만노스 결합형 렉틴은 만노스 결합형 렉틴의 결핍 또는 기능상실, 보체계 약화를 유도하는 질환 및 병원성 미생물 감염시 체내 방어기작을 활성화시키는 용도로 적용할 수 있다.As mentioned above, the present invention provides compositions and methods that can activate the complement system to enhance the body's defense system. Therefore, the mannose-binding lectin of the present invention can be applied for the purpose of activating the body's defense mechanism in the event of deficiency or loss of mannose-binding lectin, disease leading to weakening of the complement system, and pathogenic microbial infection.
<110> DOBEEL CORP <120> OVEREXPRESSION METHOD OF MANNOSE BINDING LECTIN AND RECOMBINAT PROTEIN OF MANNOSE BINDING LECTIN <130> dpp20030817kr <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctagctagcc accatgtccc tgtttccatc actc 34 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gaagatctca gatagggaac tcacagacg 29 <110> DOBEEL CORP <120> OVEREXPRESSION METHOD OF MANNOSE BINDING LECTIN AND RECOMBINAT PROTEIN OF MANNOSE BINDING LECTIN <130> dpp20030817kr <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctagctagcc accatgtccc tgtttccatc actc 34 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gaagatctca gatagggaac tcacagacg 29
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