KR100744755B1 - Purification of melittin from bee venom - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 얻어진 분획물의 280nm에서의 흡광도를 나타낸 그래프. 1 is a graph showing the absorbance at 280nm of the fraction obtained in the process of separating the melittin from bee venom according to Example 1 of the present invention.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 분획물의 전기영동결과를 나타낸 도면. Figure 2 is a view showing the electrophoresis result of the fraction obtained in Example 1.
본 발명은 봉독에서 멜리틴(melittin)을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 꿀벌의 독낭에서 추출된 봉독에서 멜리틴을 분리하는 과정에서 알러지 발생의 원인 효소인 포스포립파제 A2(phospholipase A2; 이하 'PLA' 라 한다)가 함유되지 않도록 하여 이를 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있도록 한 봉독을 이용한 멜리틴의 분리방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for isolating melittin (melittin) from bee venom, and more particularly, phospholipase A 2 (phospholipase), an enzyme causing allergy in the process of isolating melittin from bee venom extracted from bee venom sac. A 2 (hereinafter referred to as 'PLA') relates to a method for separating melittin using bee venom that prevents allergens from occurring when used in bee acupuncture.
예로부터 민간에서는 벌침요법 혹은 봉침요법이라 하여 이미 오래 전부터 살아있는 벌을 환부나 경혈에 자극하여 질병을 치료하는 방법을 사용해 왔으며, 현재에도 상당수의 양봉가가 시술하고 있는 것으로 알려지고 있다. Since ancient times, bee sting therapy or bee sting therapy has been used to treat diseases by stimulating living bees to affected or acupuncture points for a long time, and it is known that many beekeepers are still performing the procedure.
그러나, 벌을 그대로 잡아 경혈에 사용하는 직침법의 경우 시술 상황에서 벌의 움직임에 의해 정확한 취혈이 어려울 뿐만 아니라 이러한 방법은 계절이나 벌의 일령에 따라 지니고 있는 독의 함량 변화가 많아 자극량의 정량적 객관화가 곤란하다는 문제점이 있다. However, in the case of the direct acupuncture method, which is used to hold a bee as it is, it is difficult to accurately collect blood due to the movement of the bee during the procedure. There is a problem that objectification is difficult.
이러한 문제점을 보완하고자 살아 있는 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 봉독을 전기 자극등으로 추출하여 건조한 후 정제 가공한 다음, 이를 질병과 유관한 부위 및 경혈에 주입함으로써 자침의 효과와 벌의 독이 지니고 있는 생화학적 약리 작용을 질병의 치료에 이용하는 봉약침요법이 현재 널리 사용되고 있다. To compensate for this problem, bee venom in living bee sac is extracted by electric stimulation, dried and purified, and then injected into the area and acupuncture points related to the disease. Bee acupuncture, which uses pharmacological action in the treatment of diseases, is now widely used.
봉독의 주요 성분은 약 40가지로 펩타이드, 탄수화물, 효소, 아미노산, 지방 등으로 나누어 볼 수 있으며, 이 중 중요한 역할을 하는 펩타이드로는 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 아돌라핀(adolapin)을 들수 있으며, 이중에서 멜리틴은 건조 봉독의 약 50%를 차지하는 주성분으로 진통 소염작용이 매우 우수하다. There are about 40 main components of bee venom, which can be divided into peptides, carbohydrates, enzymes, amino acids, fats, etc. Among them, the most important peptides are melittin, apamin, and adolafine. Among these, melittin is the main ingredient that accounts for about 50% of dry bee venom and has excellent analgesic and anti-inflammatory effect.
이러한 봉약침요법의 약리작용은 소염작용, 진통작용, 면역계의 조절작용, 혈액순환 촉진작용, 항암작용 등이 있어서 임상적으로 요추간판탈출증, 근위축증, 류마티스 관절염, 슬관절염 등에 유효한 것으로 보고되고 있다. The pharmacological action of beacon acupuncture is anti-inflammatory, analgesic, immune system regulation, blood circulation, anti-cancer activity and clinically reported to be effective in lumbar disc herniation, muscular dystrophy, rheumatoid arthritis, arthritis.
그러나, 치료의 과정에서 발생하는 다양한 형태의 알러지 반응은 시술자나 환자에게 있어서 부담으로 작용하며, 특히 봉독에 대한 과민성을 지닌 경우에 발생 하는 전신즉시형 반응인 과민성 쇼크(anaphylactic shock)는 봉약침 시술에서 가장 큰 장애가 되고 있다. 봉독의 알러지 반응에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 효소들로서, 특히 PLA가 주요 알러지 유발 효소로 알려져 있다. 특히 PLA는 효소성분의 대부분을 차지하는 물질로, 봉독에 민감한 사람들의 90% 정도에서 이에 대한 IgE 항체가 발견된다. However, various types of allergic reactions occurring in the course of treatment are burdensome to the operator or patient, and anaphylactic shock, a systemic immediate response that occurs especially when the person is hypersensitive to bee venom, is treated with bee acupuncture. Has become the biggest obstacle in the world. The most important role in bee venom allergy is enzymes, especially PLA is known as the major allergen. In particular, PLA is a substance that accounts for most of the enzyme components, IgE antibodies are found in about 90% of people susceptible to bee venom.
이에 봉약침을 임상에서 사용하면서 발생할 수 있는 알러지를 원천적으로 차단할 수 있는 방법이 연구 개발 중에 있으나, 봉독에서 멜리틴은 건물량 기준으로 약 40~50% 함유되어 있으며, PLA는 약 10~12% 함유되어 있어, 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 PLA가 함유되는 문제가 있다. Therefore, the method of blocking the allergy that may occur while using bee sting in clinical use is under research and development, but in bee venom melittin contains about 40-50% by dry weight basis, and PLA is about 10-12% There is a problem that PLA is contained in the process of separating the melittin from bee venom.
이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해소하기 위하여 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 알러지 발생의 원인 효소인 PLA가 함유되지 않도록 함으로서 이를 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있도록 한 방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다. In order to solve the above problems, the present inventors do not contain PLA, which is an enzyme causing allergy in the process of separating melittin from bee venom, thereby preventing the occurrence of allergy when using it for bee sting therapy. It was found and completed the present invention.
따라서 본 발명은 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 알러지 발생의 원인 효소인 PLA가 함유되지 않도록 하여 이를 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있도록 한 봉독을 이용한 멜리틴의 분리방법을 제공하는데 그 목적이 있다. Therefore, the present invention uses bee venom to prevent allergens from being generated when using it for bee sting therapy by not containing PLA, which is an enzyme causing allergy in the process of separating melittin from bee venom in bee venom. The purpose is to provide a method for separating melittin.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 봉독을 추출하고, 상기 추출된 봉독을 완충용액에 넣은 다음 원심분리하여 지질표층을 제거한 후 상등액을 분리하고, 분리한 상등액은 암모늄아세테이트를 증류수에 녹인 후 아세트산을 가하여 pH 3.0~4.0으로 조절한 초산염 완충용액을 전개용매로 사용하여 겔 필트레이션 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)하여 멜리틴이 함유된 분획물을 얻고, 이 분획물을 동결건조하는 봉독을 이용한 멜리틴의 분리방법에 있어서, 상기 겔 필트레이션 크로마토그래피하여 분리된 멜리틴을 전개용매로 염산용액을 사용하여 2차 겔 필트레이션 크로마토그래피를 하여 탈염된 분획물을 얻고, 얻어진 분획물에 NaOH를 가하여 중화시킨 후 동결건조하는 것을 특징으로 하는 봉독을 이용한 멜리틴의 분리방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention extracts the bee venom contained in the bee sac of bees, the extracted bee venom is placed in a buffer solution, and then centrifuged to remove the lipid surface layer, and the supernatant is separated, and the separated supernatant is ammonium acetate. Was dissolved in distilled water, and acetic acid was added to obtain a fraction containing melittin by gel filtration chromatography using an acetate buffer solution adjusted to pH 3.0 to 4.0 as a developing solvent, and the fraction was freeze-dried. In the method of separation of melittin using bee venom, the gel melit chromatography was used to obtain desalted fractions by performing secondary gel filtration chromatography on the separated melittin using hydrochloric acid as a developing solvent. Melitin using bee venom, characterized in that the neutralization by the addition and lyophilization And it provides separation methods.
이하 본 발명에 따른 봉독에서 멜리틴을 분리하는 방법에 대하여 좀더 상세하게 설명하면 다음과 같다. Hereinafter, a method for separating melittin from bee venom according to the present invention will be described in more detail.
봉약침요법에 사용시 알러지 발생이 없도록 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 분리된 멜리틴에 PLA가 함유되지 않도록 하기 위하여 본 발명에서는 먼저 봉독을 완충용액에 넣은 다음 원심분리하여 지질표층을 제거한 후 상등액을 취하는 과정을 거치게 된다. In the present invention, in order to prevent PLA from being contained in the melittin separated in the process of separating the melittin from bee venom so as not to cause allergies when using bee venom therapy in the present invention, the bee venom is first put in a buffer solution, and then centrifuged to remove the lipid surface layer. The process is taken.
상기에서 봉독은 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 것을 추출하여 얻어진 것으로서 용이하게 구입하여 사용할 수 있다. Bee venom is obtained by extracting what is contained in the bee venom sac, and can be easily purchased and used.
이때, 봉독의 원심분리 과정에서 사용되는 완충용액은 겔 필트레이션 크로마토그래피에서 멜리틴의 분리를 용이하게 하기 위한 이유에서 산성 pH에서 완충능력을 갖는 것을 사용하면 되는 데, 바람직하게는 구입이 용이한 초산염 완충용액을 사용하는 것이 좋다. 특히 상기 초산염 완충용액은 암모늄아세테이트를 증류수에 녹인 후 아세트산을 가하여 pH 3.0~4.0으로 조절한 것을 사용하는 것이 좋다. 상기 초산염 완충용액에는 이온강도를 조절하기 위하여 선택적으로 염화나트륨을 추가로 더 첨가할 수도 있으며, 염화나트륨의 첨가시 그 농도는 1M 이하가 되도록 하면 된다. In this case, the buffer solution used in the centrifugation process of bee venom may be one having a buffering capacity at an acidic pH for the purpose of facilitating the separation of the melittin in the gel filtration chromatography. It is recommended to use acetate buffer solution. In particular, the acetate buffer solution is dissolved in ammonium acetate distilled water and then used to adjust the pH to 3.0 to 4.0 by adding acetic acid. The acetate buffer solution may optionally further add sodium chloride in order to control the ionic strength, the concentration of sodium chloride may be 1M or less.
완충용액에 첨가되는 봉독은 그 첨가량을 반드시 한정할 필요는 없으며, 작업의 편의성을 고려하여 봉독은 완충용액 100중량부에 대하여 5~20중량부 첨가하는 것이 좋다. The bee venom added to the buffer solution is not necessarily limited to the addition amount, and in consideration of the convenience of operation, the bee venom may be added in an amount of 5 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the buffer solution.
원심분리는 공지된 기술을 적용하면 용이하게 실시할 수 있는 것으로서, 상술한 바와 같이 봉독을 완충용액에 넣고 원심분리하면 표층에는 지질이 형성되고, 바닥에는 일부 침전물이 가라앉아 분리된다. 따라서 표층에 형성된 지질을 제거한 다음 상등액을 채취한다. Centrifugation can be easily carried out by applying a known technique. As described above, when bee venom is placed in a buffer solution and centrifuged, lipids are formed on the surface layer, and some precipitate is settled on the bottom. Therefore, the supernatant is collected after removing the lipid formed on the surface layer.
이렇게 채취한 상등액은 겔 필트레이션 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)하여 멜리틴을 분리하게 된다. 여기서 겔 필트레이션 크로마토그래피는 물질을 분리할 때 일반적으로 사용되는 방법으로서, 고정상은 당해 분야에서 널리 사용되고 있는 세파덱스, 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 겔 필트레이션 크로마토그래피에서 전개용매의 선택이 매우 중요한데, 본 발명에서는 봉독의 원심분리과정에서 사용된 완충용액을 전개용매로 사용하였다. 즉, 암모늄아세테이트를 증류수에 녹인 후 아세트산을 가하여 pH 3.0~4.0으로 조절한 초산염 완충용액을 사용하였다. 마찬가지로 이 초산염 완충용액에는 이온강도를 조절하기 위하여 염화나트륨을 추가로 더 첨가할 수도 있다. The supernatant thus obtained is subjected to gel filtration chromatography to separate melittin. Here, gel filtration chromatography is a method generally used to separate materials, and the stationary phase may be one selected from Sephadex, agarose or polyacrylamide which are widely used in the art. The choice of developing solvent is very important in gel filtration chromatography. In the present invention, the buffer used during centrifugation of bee venom was used as the developing solvent. That is, ammonium acetate was dissolved in distilled water, and then acetate solution was used to adjust the acetate buffer solution to pH 3.0-4.0. Likewise, additional sodium chloride may be added to this acetate buffer to control the ionic strength.
겔 필트레이션 크로마토그래피 과정에서 얻어지는 분획물에서 멜리틴의 함유는 표준시료와의 전기영동 등을 통해 확인할 수 있으며, 필요에 따라서는 다양한 확인방법이 접목될 수 있다. 확인된 멜리틴이 함유된 분획물은 별도로 취한 후 동결건조하면 알러지를 일으키는 PLA 효소가 함유되지 않은 멜리틴을 얻을 수 있게 된다. The content of melittin in the fraction obtained in the gel filtration chromatography process can be confirmed by electrophoresis with a standard sample, and various identification methods may be combined as necessary. The identified melittin-containing fractions are taken separately and lyophilized to obtain melittin free of allergic PLA enzymes.
동결건조는 공지된 방법을 적용하면 용이하게 실시할 수 있는 것에 해당되며, 동결건조하여 얻어진 멜리틴은 봉약침요법에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 분리된 멜리틴은 알러지를 유발하는 원인 효소인 PLA가 함유되어 있지 않아 봉약침요법시 부작용을 크게 줄일 수 있게 된다. Lyophilization corresponds to those that can be easily carried out by applying a known method, and the melittin obtained by lyophilization can be used for bee acupuncture. In particular, the melittin isolated in accordance with the present invention does not contain PLA, which causes the allergy causing enzymes can greatly reduce the side effects of bee acupuncture.
이때, 전술한 겔 필트레이션 크로마토그래피하여 분리된 멜리틴에는 비교적 낮은 농도의 암모늄 아세테이트와 NaCl이 포함되어 있으므로 동결건조하기 직전에 제거하는 과정을 더 거치는 것이 좋다. 바람직하게는 전개용매로 염산용액을 사용하여 2차 겔 필트레이션 크로마토그래피를 하여 탈염된 분획물을 얻고, 얻어진 분획물에 NaOH를 가하여 중화시킨 후 동결건조하는 것이 좋다. At this time, since the melittin separated by the above-mentioned gel filtration chromatography contains a relatively low concentration of ammonium acetate and NaCl, it is preferable to further remove the process just before lyophilization. Preferably, a desalted fraction is obtained by secondary gel filtration chromatography using hydrochloric acid as a developing solvent, and neutralized by adding NaOH to the obtained fraction, followed by freeze-drying.
위와 같은 과정을 거치면 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 알러지 발생의 원인 효소인 PLA가 함유되지 않도록 할 수 있을 뿐만 아니라 효과적으로 멜리틴을 분리해낼 수 있어, 분리된 멜리틴을 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있는 효과를 얻을 수 있다. If you go through the above process not only does not contain PLA, the enzyme that causes allergies in the process of separating melittin from bee venom, but also effectively isolates melittin. It is possible to obtain an effect that can prevent the occurrence of the source.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are only presented to aid the understanding of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
<실시예 1><Example 1>
3.854g의 ammonium acetate와 29.22g NaCl을 700㎖의 증류수에 녹인 후 초산을 가하여 pH 4.0으로 조절한 후 증류수를 1ℓ가 될 때까지 가하여 초산염 완충용액을 제조하였다. 3.854 g of ammonium acetate and 29.22 g of NaCl were dissolved in 700 ml of distilled water, acetic acid was added to adjust the pH to 4.0, and distilled water was added until 1 l to prepare acetate buffer solution.
이와는 별도로 봉독 5g을 상기 제조한 초산염 완충용액 45㎖에 넣은 다음 3,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 지질 표층을 제거하고 상등액을 분리해 내어 이 중 15㎖를 초산염 완충용액으로 평형화된 Sephadex G-50 superfine column(2.5 ㅧ 120cm)에 주입하였으며 용출액을 10㎖씩 분획하여 수집하였다. Separately, 5 g of bee venom was added to 45 ml of the acetate buffer prepared above, centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes, the lipid surface layer was removed, the supernatant was separated, and 15 ml of this was equilibrated with acetate buffer. Sephadex G-50 A superfine column (2.5 × 120 cm) was injected and the eluate was collected by fractionation of 10 ml.
<실험예 1>Experimental Example 1
상기 실시예에서 얻어진 각 분획의 흡광도를 280nm에서 측정하였으며, 측정된 흡광도의 결과는 도 1에 나타내었다. The absorbance of each fraction obtained in the above example was measured at 280 nm, and the results of the measured absorbance are shown in FIG. 1.
도 1의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이 겔 필트레이션 크로마토그래피를 실시한 결과 먼저 용출되는 흡광도가 상대적으로 작은 피크와 그 다음으로 용출되는 홉광도가 큰 피크로 분리됨을 알 수 있다. As can be seen from the results of FIG. 1, gel filtration chromatography shows that the first eluted absorbance is separated into a relatively small peak and the next eluted hop has a large peak.
<실험예 2>Experimental Example 2
도 1의 결과를 토대로 하여 볼 때 작은 피크는 PLA로 추정되며, 큰 피크는 멜리틴으로 추정된다. 따라서 이를 확인하기 위하여 크로마토그래피에서 얻어진 25~28번 분획물과 29~31과 분획 32~38들을 합한 후 각각의 분획물과, 봉독, 및 표 준멜리틴시료(sigma)와 표준PLA시료(sigma)를 각각 PU-PAGE로 분석하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. Based on the results of FIG. 1, the small peak is estimated to be PLA and the large peak is estimated to be melittin. Therefore, to confirm this, fractions 25-28 obtained from chromatography, 29-31, and fractions 32-38 were combined, and each fraction, bee venom, standard melittin sample (sigma) and standard PLA sample (sigma) were added. Each was analyzed by PU-PAGE, and the results are shown in FIG. 2.
여기서, PU-PAGE(Propionic acid/urea-polyacrylamide gel electrophoresis)는 Chettibi와 Lawrence(1989)의 방법에 따라 22.5% acrylamide gel을 사용하였으며, 전기영동 후 0.025% Commassie brilliant blue R250으로 염색하였다.PU-PAGE (Propionic acid / urea-polyacrylamide gel electrophoresis) used 22.5% acrylamide gel according to the method of Chettibi and Lawrence (1989), and stained with 0.025% Commassie brilliant blue R250 after electrophoresis.
도 2의 PU-PAGE에서 보는 바와 같이 분획 25~28(B)은 표준PLA(F)와 일치함을 알 수 있으며, 분획 32~38(D)은 표준멜리틴(E)과 일치함을 알 수 있다. As shown in the PU-PAGE of Figure 2 it can be seen that fractions 25-28 (B) are consistent with the standard PLA (F), fractions 32-38 (D) are consistent with the standard melittin (E). Can be.
<실시예 2><Example 2>
상기 실시예 1에서 얻어진 32~38의 멜리틴 함유 분획물을 0.1mM 염산 용액으로 평형화된 Sephadex G-25 superfine column(2.5cm ㅧ 70cm)에 주입하여 0.1mM 염산 용액으로 용출시켜 분획을 채취한 후 280nm에서 흡광도를 측정한 후 melittin이 존재하는 분획에 0.1M NaOH를 가하여 pH7.0으로 중화한 후 동결건조하였다.The 32-38 melittin-containing fractions obtained in Example 1 were injected into a Sephadex G-25 superfine column (2.5 cm ㅧ 70 cm) equilibrated with 0.1 mM hydrochloric acid solution, eluted with 0.1 mM hydrochloric acid solution, and fractions were collected. After absorbance was measured at 0.1M NaOH was added to the fraction containing melittin was neutralized to pH 7.0 and lyophilized.
상기와 같은 방법으로 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 경우 5g의 봉독으로부터 1.08g의 melittin을 분리할 수 있었으며, 분리된 멜리틴은 도2에서 보는 바와 같이 봉독의 주성분 중의 하나인 PLA를 검출할 수 없었다. 따라서 본 발명에 따른 방법으로 봉독으로부터 멜리틴을 분리하게 되면 알러지 발생의 원인 효소인 PLA가 함유되지 않게 되므로 분리된 멜리틴을 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있게 된다. When the melittin was separated from bee venom in the above manner, 1.08 g of melittin could be separated from 5 g of bee venom, and the isolated melittin could not detect PLA, which is one of the main components of bee venom, as shown in FIG. . Therefore, when the melittin is separated from bee venom by the method according to the present invention, PLA is not contained as an enzyme causing allergy, and thus the allergy can be prevented at the time of using the isolated melittin in bee acupuncture.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 꿀벌의 독낭에서 얻어지는 봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 과정에서 알러지 발생의 원인 효소인 PLA가 함유되지 않도록 하여 이를 봉약침요법에 사용시 알러지 발생을 원천적으로 방지할 수 있도록 한 봉독의 정제방법을 제공하는 유용한 효과가 있다.As described above, the present invention does not contain PLA, which is an enzyme causing allergy in the process of separating melittin from bee venom obtained from bee venom, so that it can be prevented from allergies when used in bee acupuncture. There is a useful effect of providing a method for purifying bee venom.
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