KR100739232B1 - Pleuropterus ciliinervis extracts showing apoptosis inhibitive effect - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아폽토시스 저해 활성을 나타내는 나도하수오 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나도하수오 추출물 또는 에모딘이 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 밝힘으로써, 나도하수오 추출물, 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유한 약학적 조성물이 아폽토시스의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to nadohasuo extract exhibiting apoptosis inhibitory activity, and more particularly, by showing that nadohasuo extract or ememodine has apoptosis inhibitory activity, nadohasuo extract, ememodine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Pharmaceutical composition containing as an active ingredient can be used for the prevention and treatment of inflammatory diseases caused by increased apoptosis, acquired immunodeficiency syndrome, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke and liver diseases caused by toxic substances such as alcohol. To a red composition.
나도하수오(Pleuropterus ciliinervis), 아폽토시스, 에모딘(emodin)Pleuropterus ciliinervis, apoptosis, emodin
Description
본 발명은 아폽토시스 저해 활성을 나타내는 나도하수오 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나도하수오 추출물 또는 에모딘이 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 밝힘으로써, 나도하수오 추출물, 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유한 약학적 조성물이 아폽토시스의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to nadohasuo extract exhibiting apoptosis inhibitory activity, and more particularly, by showing that nadohasuo extract or ememodine has apoptosis inhibitory activity, nadohasuo extract, ememodine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Pharmaceutical composition containing as an active ingredient can be used for the prevention and treatment of inflammatory diseases caused by increased apoptosis, acquired immunodeficiency syndrome, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke and liver diseases caused by toxic substances such as alcohol. To a red composition.
아폽토시스 또는 프로그램화 세포 사멸(programmed cell death, PCD)은 광범위한 생물학적 체계에서 손상되었거나 원치않는 세포를 자발적으로 자기-제거(self-elimination)하기 위한 기본적인 세포내 과정이다. 아폽토시스의 과정을 통하여 사멸한 세포의 내용물은 세포외로 유리되지 않아 다른 세포들에 손상을 주 지 않기 때문에 아폽토시스는 기관 발달, 조직 재형성, 세포내 항상성 유지 및 비정상적이고 손상된 세포의 제거에 필수적인 기작이다. Apoptosis or programmed cell death (PCD) is the basic intracellular process for spontaneous self-elimination of damaged or unwanted cells in a wide range of biological systems. Apoptosis is an essential mechanism for organ development, tissue remodeling, maintenance of intracellular homeostasis and removal of abnormal and damaged cells because the contents of cells that have died through the process of apoptosis are not extracellularly released and do not damage other cells. .
상기와 같이, 생물체내에서 중요한 역할을 담당하는 아폽토시스 과정은 반드시 정해진 프로그램에 따라 정교하게 조절되어야 하는데, 만약 아폽토시스가 저해되면 암, 자가면역질환(autoimmune disease) 및 바이러스 감염질환과 같은 질병이 유도되며[Kerr et al., Br. J. Cancer, 26, 239-257, 1972], 아폽토시스가 부적절하게 증가되면, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환과 같은 질병이 유도된다. As mentioned above, the apoptosis process, which plays an important role in living organisms, must be precisely regulated according to a predetermined program. If apoptosis is inhibited, diseases such as cancer, autoimmune disease and viral infectious diseases are induced. Kerr et al., Br. J. Cancer, 26, 239-257, 1972], Inappropriately increasing apoptosis leads to diseases such as acquired immunodeficiency, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke, and liver diseases caused by toxic substances such as alcohol.
아폽토시스가 진행되는 초기의 세포는 세포 연합(cell junctions)의 손상, 세포막의 물집형성(blebbing) 및 세포 수축(shrinkage) 등과 같은 현상이 유도되고 후기로 진행되면서 크로마틴 응집(chromatin aggregation), 세포질 및 핵 농축(cytoplasm and nuclei condensation), 마이토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)의 손실, 원형질막 조성의 변화 및 아폽토시스 체(apoptotic body) 형성 등이 유도되어 전체적으로 형태학적 및 생화학적 변화를 거친다. 아폽토시스의 최종 결과로서 나타나는 올리고뉴클레오좀(oligonucleosome) 형태의 DNA 절편화(DNA fragmentation)는 아폽토시스를 겪는 세포의 전형적인 생화학적 특징이다[Green D. R., and Reed, J. C., Science, 281, 1309-1312, 1998].Early cells undergoing apoptosis develop chromatin aggregation, cytoplasm, and the like, which are induced during late stages of damage such as cell junctions, blebbing of cell membranes, and cell shrinkage. Nuclear enrichment (cytoplasm and nuclei condensation), loss of mitochondrial membrane potential, changes in plasma membrane composition, and apoptotic body formation are induced to undergo morphological and biochemical changes throughout. DNA fragmentation in the form of oligonucleosomes, the final result of apoptosis, is a typical biochemical feature of cells undergoing apoptosis [Green DR, and Reed, JC, Science, 281, 1309-1312, 1998].
현재 많은 아폽토시스 관련 연구결과, 아폽토시스에 관여하는 주요한 역할자(key players)와 기작이 다양한 생물체에서 밝혀지고 있다. 대표적으로, 포유동물 세포에서는 세포성 시스테인 프로테아제(cystein protease)의 일종인 캐스페 이즈(caspase)가 아폽토시스 기작을 조절하는데 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 상기 캐스페이즈는 아미노산 배열의 상동성에 따라 추정된 진화 계통수에 의하여 ICE(interlukin 1 converting enzyme), CPP32, ICH-1을 중심으로 하는 세 가지 형태로 구분될 수 있다.Many apoptosis-related studies have now identified key players and mechanisms involved in apoptosis in a variety of organisms. Representatively, in mammalian cells, caspase, a type of cellular cysteine protease, is known to play an important role in regulating apoptosis mechanism, which is estimated based on the homology of amino acid sequence. According to the evolutionary phylogenetic tree can be divided into three types centered on ICE (interlukin 1 converting enzyme), CPP32, ICH-1.
캐스페이즈(caspase)는 수용체-매개성 신호 전달기작(receptor-mediated signal transduction), 성장인자의 결핍(depletion of growth factors), 산화적 스트레스(oxidative stress), DNA 손상 및 세포-세포(cell-cell) 또는 세포-기질 결합(cell-matrix interaction)의 붕괴 등을 포함하는 다양한 자극에 의해 활성화되어 폴리(ADP-라이보스)중합효소(poly(ADP-ribose) polymerase, RARP), 라민(lamine), 사이토케라틴(cytokeratins) 및 캐스페이즈-활성화 DNase 억제제(ICAD) 등과 같은 세포성 단백질들을 분해함으로써 아폽토시스 형성을 유도한다[Cryns, V., and Yuan, J., Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998]. Caspases may be receptor-mediated signal transduction, depletion of growth factors, oxidative stress, DNA damage and cell-cells. ) Or activated by a variety of stimuli, including disruption of cell-matrix interactions, poly (ADP-ribose) polymerase (RARP), lamine, Induces apoptosis formation by breaking down cellular proteins such as cytokeratins and caspase-activated DNase inhibitors (ICADs) [Cryns, V., and Yuan, J., Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998].
아폽토시스에 관한 활발한 연구결과, 지금까지 최소한 14 개의 서로 다른 부류에 속하는 캐스페이즈가 포유동물에서 밝혀졌으며, 이들이 모두 아폽토시스의 개시와 실행에 중추적인 역할을 하는 아스파르트산(aspartic acid) 잔기 이후의 펩타이드 기질을 절단함으로써 아폽토시스를 유발함이 보고되었다[Nunez et al., Oncogene, 17, 3237-3245, 1998].Active studies of apoptosis have shown that in mammals caspases belonging to at least 14 different classes so far, all of which are peptide substrates after aspartic acid residues, which play a pivotal role in the initiation and execution of apoptosis. Has been reported to induce apoptosis by cleaving (Nunez et al., Oncogene, 17, 3237-3245, 1998).
아폽토시스 유도 활성을 가지는 물질은 비정상적인 세포의 조절되지 않은 성장 및 확산이 일어나는 각종 암에서 세포 사멸을 유도하는 데 사용할 수 있는 것으로 보고되고 있다[Siegel, D.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 6;95(1),162-6, 1998].Substances with apoptosis inducing activity have been reported that can be used to induce cell death in various cancers where uncontrolled growth and proliferation of abnormal cells occurs [Siegel, D.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 6; 95 (1), 162-6, 1998].
이에 반해, 이러한 아폽토시스 저해 활성을 가지는 화합물은 염증 질환, 특히 아폽토시스 증가로 인한 염증질환[Lee et al., BBRC, 302, 539-544, 2003],후천성 면역결핍증[Donnerer J., Pharmacology, 269, 197-204, 2003], 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경퇴행성질환[Li et al., FEBS Lett., 21, 261-269, 2004], 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환[Gotz et al., J.Neurosci. Res., 56, 420-426, 1999], 알콜 등 독성물질로 인한 간질환[Vanesa et al., Life Sci., 24, 683-692, 2005]의 치료 및 예방에 이용될 수 있다고 보고되고 있다.In contrast, compounds with such apoptosis inhibitory activity are inflammatory diseases, especially inflammatory diseases caused by increased apoptosis [Lee et al., BBRC, 302, 539-544, 2003], acquired immunodeficiency [Donnerer J., Pharmacology, 269, 197-204, 2003], neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease [Li et al., FEBS Lett., 21, 261-269, 2004], ischemic diseases including stroke [Gotz et al., J. Neurosci . Res., 56, 420-426, 1999], and it has been reported that it can be used for the treatment and prevention of liver diseases caused by toxic substances such as alcohol [Vanesa et al., Life Sci., 24, 683-692, 2005]. .
그리고, 에모딘은 대황 등에서 추출된 바 있는 화합물로서, 종래에 캐스페이즈를 활성화시켜 아폽토시스를 유도하는 물질로 알려져 있었고[Lee,H.Z., Br. J. Pharmaco., 134(5), 1093-1103, 2001; Srinivas et al., Eur. J. Pharmaco., 473(2/3), 117-125, 2003; Shieh et al., Life Sciences, 74(18), 2279, 2004], 아폽토시스를 저해할 수 있다는 사실은 아직까지 보고된 바 없었다.Emodine is a compound that has been extracted from rhubarb and the like, and is known as a substance that activates cascade and induces apoptosis [Lee, H.Z., Br. J. Pharmaco., 134 (5), 1093-1103, 2001; Srinivas et al., Eur. J. Pharmaco., 473 (2/3), 117-125, 2003; Shieh et al., Life Sciences, 74 (18), 2279, 2004], have not been reported to inhibit apoptosis.
이에 본 발명자들은 아폽토시스 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 탐색한 결과, 나도하수오(Pleuropterus ciliinervis)로부터 유효성분을 분리하였고, 이에 대한 이화학적 분석을 실시하여, 상기 유효성분이 다음 화학식 I로 표시되는 에모딘(emodin)임을 밝히고, 에모딘이 종래에 보고된 바 없는 아폽토시스 저해 활성을 나타내는 것을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors searched for a substance having apoptosis inhibitory activity from natural products, and separated the active ingredient from Pleuropterus ciliinervis , and carried out a physicochemical analysis thereof, wherein the active ingredient is represented by the following formula I The present invention was completed by revealing that it is (emodin) and revealing that emodin exhibits apoptotic inhibitory activity that has not been reported before.
에모딘은 각종 암에서 세포 사멸을 유도하는 데에 사용할 수 있다고 종래에 보고되고 있었으나, 본 발명에서는 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 최초로 밝혀, 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환, 알콜 등 독성물질로 인한 간질환의 치료 및 예방에 이용될 수 있음을 처음으로 제시하였다.Emodine has been reported previously that it can be used to induce cell death in various cancers, but the present invention was first found to have apoptosis inhibitory activity, inflammatory diseases caused by increased apoptosis, acquired immunodeficiency disease, neurodegenerative diseases, stroke Ischemic diseases, including alcohol, for the first time to be used for the treatment and prevention of liver diseases caused by toxic substances.
또한, 본 발명은 나도하수오를 메탄올 추출 및 에틸아세테이트 추출과 크로마토그래피를 이용하여 아폽토시스 저해활성을 가지는 화합물을 분리하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.It is also an object of the present invention to provide a method for separating compounds having apoptosis inhibitory activity from Nado sewage using methanol extraction, ethyl acetate extraction and chromatography.
또한, 본 발명은 상기 에모딘 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 저해제용 약학적 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for apoptosis inhibitors containing the emodin or the pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
본 발명은 나도하수오(Pleuropterus ciliinervis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 그 특징으로 한다.The present invention is selected from the group consisting of inflammatory diseases, acquired immunodeficiency syndrome, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke, and liver diseases caused by toxic substances such as alcohol and inflammatory diseases due to increased apoptosis containing Pleuropterus ciliinervis extract as an active ingredient. It is characterized by a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases.
또한, 본 발명은 나도하수오로부터 아폽토시스 저해 활성을 가진 추출물을 제조하고, 유효성분을 분리하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized by another method for preparing an extract having apoptosis inhibitory activity from Nado sewage, and separating the active ingredient.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.
본 발명은 나도하수오 추출물, 에모딘(emodin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이, 아폽토시스의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 나도하수오 추출물, 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention is Nado sewage extract, emodin or pharmaceutically acceptable salts thereof, inflammatory diseases caused by increased apoptosis, acquired immunodeficiency syndrome, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke and toxic substances such as alcohol By revealing that it can be usefully used for inhibiting or preventing liver disease, etc., it relates to a pharmaceutical composition containing nadohasuo extract, emodine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
먼저, 나도하수오로부터 아폽토시스 저해 활성을 갖는 나도하수오 추출물을 제조하는 방법은 나도하수오를 채취하여 절단하여, 메탄올로 40 ~ 50 시간 환류추출하고 감압여과한 후, 에틸아세테이트로 추출하여 나도하수오 추출물을 제조한다.First, a method for producing a nado sewage extract having apoptosis inhibitory activity from nado sewage is obtained by cutting the nado sewage, cutting it under reflux for 40 to 50 hours with methanol, filtering under reduced pressure, and then extracting with ethyl acetate to prepare the nado sewage extract. do.
또한, 나도하수오로부터 에폽토시스 저해 활성을 갖는 유효성분을 분리하는 방법은 다음과 같다.In addition, a method of separating the active ingredient having an apoptosis inhibitory activity from Nado sewage is as follows.
1) 상기와 같이 나도하수오 추출물 제조하는 단계;1) preparing nado sewage extract as described above;
2) 상기 나도하수오 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 겔 여과 크로마토그래피 (gel filtration chromatography)를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및2) collecting the active fraction by dissolving the Nado sewage extract in methanol and then performing gel filtration chromatography; And
3) 상기 활성분획을 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 아폽토시스 저해 활성의 유효성분을 얻는 단계로 이루어진다.3) The active fraction is separated by high pressure liquid chromatography, the solvent is removed with a reduced pressure dryer, and freeze-dried to obtain an active ingredient of apoptosis inhibitory activity.
상기 단계를 보다 구체적으로 설명하면, 먼저, 에틸아세테이트로 추출한 나도하수오 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)를 수행하여 활성분획을 모은다. In more detail, the nado sewage extract extracted with ethyl acetate is first dissolved in methanol, and then active fractions are collected by performing Sephadex LH-20 gel column chromatography.
그리고 나서, C18 칼럼과 물-아세토나이트릴(acetonitrile) 용출 용매(20% 아세토나이트릴~100% 아세토나이트릴, 30분)를 이용하는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 활성분획을 분리하여 유지시간 33 분대의 활성분획으로부터 아폽토시스 저해 활성을 갖는 유효성분을 얻는다.The active fraction was then separated by high pressure liquid chromatography using a C18 column and a water-acetonitrile eluting solvent (20% acetonitrile to 100% acetonitrile, 30 minutes). An active ingredient having apoptosis inhibitory activity is obtained from an active fraction of retention time of 33 minutes.
이렇게 얻어진 유효성분에 대하여 ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometer), 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법으로 이화학적 특성을 분석한 결과, 상기 화합물은 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.As a result of analyzing the physicochemical properties of the active ingredient obtained by the method such as electron spray ionization mass spectrometer (ESI-MS), nuclear magnetic resonance spectra, it was confirmed that the compound had the following physicochemical properties.
1) 물질 성상: 분말 2) 분자량: 2701) Material Property: Powder 2) Molecular Weight: 270
3) 분자식: C15H10O5 4) 질량분석치(M-H): 269(m/z) 3) Molecular formula: C 15 H 10 O 5 4) Mass spectrometry (MH): 269 ( m / z )
또한, 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화합물은 하기 화학식 1의 에모딘(emodin) 또는 1,3,8-트리하이드록시-2-메틸-안트라퀴논으로 알려진 화합물로 판명되었다.In addition, hydrogen nuclear magnetic resonance spectra and carbon nuclear magnetic resonance spectra obtained by using methanol (CD 3 OD) as a solvent, and the compound was found to be emodin of Formula 1 or 1,3,8- It was found to be a compound known as trihydroxy-2-methyl-anthraquinone.
[화학식 1][Formula 1]
본 발명은 나도하수오 추출물, 화학식 1로 표시되는 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 저해제용 약학적 조성물을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a pharmaceutical composition for apoptosis inhibitors containing Nadohasuo extract, emodin represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명에서 사용한 에모딘은 나도하수오 등의 천연물에서 분리시키거나, 통상적인 유기 합성법으로 제조될 수 있다.Emodine used in the present invention can be isolated from natural products such as nado sewage, or can be prepared by conventional organic synthesis.
이러한 나도하수오 추출물 또는 에모딘은 아폽토시스의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있는 아폽토시스 저해 활성이 뛰어난 것으로 확인되었다.The nado sewage extract or emodine may be useful for inhibiting or preventing inflammatory diseases, acquired immunodeficiency, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke, and liver diseases caused by toxic substances such as alcohol, etc. due to an increase in apoptosis. It was confirmed that the apoptosis inhibitory activity is excellent.
한편, 본 발명의 유효성분인 에모딘은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 에모딘은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. On the other hand, the active ingredient of the present invention emodine can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, the salt is an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Emodines can form pharmaceutically acceptable acid addition salts according to methods conventional in the art. Free acid and inorganic acid may be used as the free acid, and hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, and fumaric acid may be used as the organic acid. (fumaric acid), formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, galluxuronic acid, embonic acid, glutamic acid or aspartic acid Can be used.
따라서, 본 발명의 나도하수오 추출물, 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.Therefore, the composition containing the nadohasuo extract of the present invention, emodine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is an inflammatory disease due to increased apoptosis, acquired immunodeficiency, neurodegenerative diseases, ischemic diseases including stroke and alcohol, etc. It can be used for the prevention or treatment of liver disease caused by toxic substances.
본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. The compositions of the present invention may be administered orally or parenterally, for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically, during clinical administration and may be used in the form of general pharmaceutical formulations.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캅셀 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캅셀제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.Pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated for oral administration, for example tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, prepared powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. formulated as elixirs. Binders such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin for preparation in formulations such as tablets and capsules; Excipients such as dicalcium phosphate; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax. In the case of the capsule formulation, in addition to the substances mentioned above, it contains a liquid carrier such as fatty oil.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비 경구로 투여할 수 있으며, 비 경구 투 여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally, and oral administration is by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection injection. To formulate into a non-oral dosage form, the compound of formula 1 is mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which is formulated in unit dosage forms of ampoules or vials.
화학식 1로 표시되는 에모딘의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.The effective dose of emodine represented by Formula 1 is generally 1 to 50 mg / day per kg of adult patient weight, preferably 5 to 20 mg / day, 1 at regular time intervals as determined by the physician or pharmacist. It may be administered several times a day, preferably two to three times a day.
또한, 에모딘에 대하여 급성독성 실험을 한 결과, MLD(mouse lethal dosage) 값이 500 mg/kg 이상으로 매우 안정하였다.In addition, as a result of acute toxicity test for emodin, MLD (mouse lethal dosage) value was very stable more than 500 mg / kg.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 나도하수오 추출물의 제조Example 1 Preparation of Nadohasuo Extract
아폽토시스 기작을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위하여, 본 발명자들은 나도하수오로부터 추출물을 제조하였다.In order to search for compounds capable of modulating apoptosis mechanisms, the inventors prepared extracts from Nadohasuo.
먼저, 일신약품에서 구입한 나도하수오 1 kg을 100% 메탄올로 48 시간 동안 추출하여 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하여 나도하수오 추출물을 제조하였다.First, 1 kg of nado sewage purchased from Ilshin Chemical was extracted with 100% methanol for 48 hours, concentrated under reduced pressure, and extracted with ethyl acetate to prepare nado sewage extract.
실시예 2: 아폽토시스 저해 활성 유효성분의 분리Example 2 Isolation of Apoptosis Inhibitory Activity
아폽토시스 기작을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위하여, 본 발명자들은 추출 및 크로마토그래피를 이용하여 나도하수오로부터 화합물을 분리하였다.In order to search for compounds capable of modulating apoptosis mechanisms, the inventors used extraction and chromatography to separate compounds from Nadohasuoh.
먼저, 실시예 1에서와 같이 제조한 나도하수오 추출물을 농축하여, 농축물질을 2 ㎖의 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모았다. 상기 활성분획을 물-아세토나이트릴(20% 아세토나이트릴 ~ 100% 아세토나이트릴, 30분) 용출용매로 이용하는 고압액체 크로마토그래피(컬럼: C18, 유속: 1.5 ㎖/분, 220 nm 검출)를 수행하여 유지시간 33 분대의 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 화학식 1의 화합물 3.0 ㎎을 얻었다.First, the Nado sewage extract prepared as in Example 1 was concentrated, and the active material was collected by dissolving the concentrate in 2 ml of methanol and performing Sephadex LH gel column chromatography. High pressure liquid chromatography (column: C18, flow rate: 1.5 mL / min, 220 nm detection) using the active fraction as an elution solvent for water-acetonitrile (20% acetonitrile to 100% acetonitrile, 30 minutes) An active fraction of 33 minutes holding time was separated, and the solvent was removed by a vacuum dryer, and the residue was lyophilized to obtain 3.0 mg of the compound of Formula 1.
실시예 3: 실시예 2에서 얻어진 화합물의 이화학적 특성 분석Example 3: Physicochemical Characterization of the Compound Obtained in Example 2
실시예 2에서 얻어진 화학식 1로 표시되는 화합물의 이화학적인 특성을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA), 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. NMR 실험은 각 시료를 듀트로 메탄올(CD3OD) 용매로 녹여 5 ㎜ NMR tube에서 측정하였으며, 각 용매의 피이크를 내부 표준물질로 하거나 TMS(tetramethylsilane)의 피이크를 기준으로 하여 화학이동을 측정하였다. 상기 화합물에 대하여 물질의 성상, 분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적인 특성을 갖는 것으로 확인되었다.In order to analyze the physicochemical properties of the compound represented by Formula 1 obtained in Example 2, the inventors of the present invention have carried out electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA, and hydrogen and carbon nuclear magnetic resonance spectra. Etc. were used. In the NMR experiment, each sample was dissolved in methanol (CD 3 OD) solvent and measured in a 5 mm NMR tube. The chemical shift was measured based on the peak of each solvent or the peak of TMS (tetramethylsilane). . As a result of analyzing the property, molecular weight, molecular formula and mass of the compound, the compound of the present invention was found to have the following physical and chemical properties.
그 결과, 화학식 1의 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 270이며 분자식은 C15H10O5로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)-는 269(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 에모딘(emodin) 또는 1,3,8-트리하이드록시-2-메틸-안트라퀴논으로 알려진 화합물로 판명되었다.As a result, the material property of the compound of Formula 1 was powder, the molecular weight was 270, the molecular formula was confirmed as C 15 H 10 O 5 , and the mass spectrometry (MH) − of the compound was 269 ( m / z ). Hydrogen nuclear magnetic resonance spectra and carbon nuclear magnetic resonance spectra of methanol (CD 3 OD) as a solvent, together with the physicochemical properties, were found to be emodin or 1 according to the present invention. It was found to be a compound known as 3,8-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone.
<NMR 데이터><NMR data>
화학식 1의 화합물Compound of Formula 1
13C NMR (CD3OD) δ 21.2, 106.3, 109.6, 119.2, 119.8, 123.1, 123.6, 140.7, 142.2, 142.5, 158.5, 160.0, 162.1, 187.0 13 C NMR (CD 3 OD) δ 21.2, 106.3, 109.6, 119.2, 119.8, 123.1, 123.6, 140.7, 142.2, 142.5, 158.5, 160.0, 162.1, 187.0
실험예 1: 나도하수오 추출물 및 이로부터 분리된 에모딘의 아폽토시스 저해 활성 측정Experimental Example 1 Determination of Apoptosis Inhibitory Activity of Nadohasuo Extract and Emodine Isolated therefrom
실시예 1에서 얻은 나도하수오 추출물과 에모딘의 아폽토시스 저해효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간혈액암 세포주인 U937 세포를 이용하여 하기와 같은 생체외 실험을 수행하였다.In order to measure the apoptosis inhibitory effect of Nadohasuo extract and Emodine obtained in Example 1, the present inventors performed the following in vitro experiment using U937 cells, a human blood cancer cell line.
U937 세포를 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 5X106 세포/웰이 될 때까지 배양한 후 아폽토시스 유도물질인 에토포사이드 10 ㎍/㎖ 및 본 발명의 화합물을 1 내지 100 ㎍/ml의 농도로 상기 U937 세포에 처리하고 5 % CO2 - 95 % 공기조건으로 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하여 아폽토시스 저해효과를 비교하였다. 이 때, 에토포사이드만 처리한 세포를 양성대조군으로 이용하고, 에토포사이드 및 본 발명의 나도하수오 추출물 및 에모딘 모두를 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 사용하였다. 5시간 후 현미경으로 U937 세포의 모양을 관찰하여 아폽토시스 여부를 1 차 판정하고, 원심분리하여 얻은 세포를 이용하여 DEVD-AFC(Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)를 기질로 캐스페이즈-3 활성을 측정하였다. 양성대조군(에토포사이드만 처리한 경우)의 캐스페이즈-3 활성과 음성대조군(에토포사이드, 나도하수오 추출물 및 에모딘을 처리하지 않은 경우)의 캐스페이즈-3 활성을 기준으로 본 발명의 화합물이 나타내는 아폽토시스 저해효과를 결정하여 하기 표 1에 나타내었다.U937 cells were cultured in 96-well microplate until 5 × 10 6 cells / well, and then 10 μg / ml of apoptotic inducer etoposide and 1 to 100 μg / ml of the compound of the present invention. apoptosis inhibitory activity was compared to culture for 5 h at 37 ℃ with 95% air condition-concentration process on the U937 cells and 5% CO 2 in. At this time, cells treated with only etoposide were used as the positive control group, and cells without treatment with both etoposide and the nado sewage extract and ememodine of the present invention were used as the negative control group. After 5 hours, the shape of U937 cells was observed under the microscope to determine apoptosis. ) Was used to measure caspase-3 activity. The compounds of the present invention exhibit the caspase-3 activity of the positive control group (only treated with etoposide) and the caspase-3 activity of the negative control group (untreated with etoposide, nadohasuo extract and emodine). Apoptosis inhibitory effects were determined and shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타나 있듯이, 에토포사이드에 의하여 유도된 U937 세포의 아폽토시스에 대한 나도하수오 추출물과 에모딘의 저해 활성 농도(IC50, 50%의 저해효과를 나타내는데 요구되는 농도)는 각각 65.5, 10.0 ㎍/㎖이며 표준 비교물질인 PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)의 저해 활성 농도인 15.0 ㎍/㎖로 나타나, 본 발명에 따른 나도하수오 추출물 및 에모딘은 표준 비교물질인 PDTC보다 우수한 아폽토시스 저해효과를 가짐을 알 수 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 에모딘은 생체외에서 아폽토시스를 저해할 수 있는 천연물 유래의 화합물임을 확인할 수 있었다.As shown in Table 1, the inhibitory activity concentrations of Nadohasuo extract and emodine (IC 50 , 50% of the inhibitory effect required to show the inhibitory effect) on apoptosis of 937 cells induced by etoposide were 65.5 and 10.0 μg, respectively. / Ml and the inhibitory activity concentration of 15.0 ㎍ / ㎖ of PDTC (pyrrolidine dithiocarbonate) as a standard comparative material, it can be seen that Nado sewage extract and emotein according to the present invention has a superior apoptosis inhibitory effect than PDTC as a standard comparative material there was. From the above results, it was confirmed that the emodine of the present invention is a compound derived from a natural product capable of inhibiting apoptosis in vitro.
실험예 2: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험Experimental Example 2: Oral Administration of Rats Acute Toxicity Test
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 에모딘을 각각 0.5 % 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.Acute toxicity test was performed using 6-week-old SPF SD rats. Two animals per group were suspended orally in a dose of 1 g / kg / 1 ml by emulsification in 0.5% methylcellulose solution each. After administration of the test substance, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological and hematological examinations were performed. Necropsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities. As a result, there were no clinical symptoms or deaths in all animals treated with the test substance, and no toxicity change was observed in weight change, blood test, blood biochemistry test, autopsy findings, etc. As a result, all of the tested compounds did not show toxic changes up to 500 mg / kg in rats, and the minimum lethal dose (LD 50 ) was determined to be a safe substance of 500 mg / kg or more.
상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 에모딘은 우수한 아폽토시스 저해효과를 나타내어 아폽토시스 저해제용 약학적 조성물로 제제될 수 있었다.As confirmed above, the emodine of the present invention represented by Formula 1 exhibited an excellent apoptosis inhibitory effect and thus could be prepared as a pharmaceutical composition for apoptosis inhibitors.
제제예 1: 시럽제의 제조Formulation Example 1 Preparation of Syrup
본 발명의 화학식 1로 표시되는 에모딘 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2 %(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. A syrup containing 2% (weight / volume) of an active ingredient of emodine and a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by Chemical Formula 1 of the present invention was prepared by the following method.
에모딘의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르빈산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.Acid addition salts of emodin, saccharin and sugars were dissolved in 80 g of warm water. After the solution was cooled, a solution consisting of glycerin, saccharin, spices, ethanol, sorbic acid and distilled water was prepared and mixed. Water was added to this mixture to 100 ml. The addition salt can be replaced with other salts according to the examples.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.The components of the syrup are as follows.
에모딘 · 염산염 ................. 2 gEmodine hydrochloride ..... 2 g
사카린 ......................... 0.8 gSaccharin ......................... 0.8 g
당 ............................ 25.4 gSugar ............... 25.4 g
글리세린 ....................... 8.0 gGlycerin ......................... 8.0 g
향미료 ........................ 0.04 gSpice .............. 0.04 g
에탄올 ......................... 4.0 gEthanol ......................... 4.0 g
소르빈산 ....................... 0.4 gSorbic Acid ............... 0.4 g
증류수 .......................... 정량Distilled Water .....................
제제예 2: 정제의 제조Formulation Example 2: Preparation of Tablet
유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.A tablet containing 15 mg of active ingredient was prepared by the following method.
에모딘 · 염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10 % 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제를 제조하였다. 250 g of emodin-hydrochloride were mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch and 32 g of colloidal silicic acid. 10% gelatin solution was added to the mixture, which was then ground and passed through a 14 mesh sieve. It was dried and tablets were prepared by adding 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate.
제제예 3: 주사액제의 제조Formulation Example 3: Preparation of Injection
유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. Injection solution containing 10 mg of the active ingredient was prepared by the following method.
에모딘 · 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켜 주사액제를 제조하였다.1 g of emodin-hydrochloride, 0.6 g of sodium chloride and 0.1 g of ascorbic acid were dissolved in distilled water to make 100 ml. The solution was placed in a bottle and heated at 20 ° C. for 30 minutes to sterilize to prepare an injection solution.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 나도하수오 추출물 및 이로 부터 분리된 에모딘은 독성은 없고 우수한 아폽토시스 저해효과를 나타내므로 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중을 포함한 허혈성 질환 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다. As described above, the nado sewage extract and the emodine isolated therefrom according to the present invention have no toxicity and exhibit excellent apoptosis inhibitory effects, and thus, ischemic diseases including inflammatory diseases, acquired immunodeficiency disorders, neurodegenerative diseases, and strokes due to increased apoptosis. It can be usefully used for inhibiting or preventing liver diseases caused by diseases and toxic substances such as alcohol.
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