KR100713714B1 - 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을유효성분으로 포함하는 항암제 - Google Patents
티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을유효성분으로 포함하는 항암제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포의 생존과 성장을 효과적으로 억제하며, 세포내 철 이온을 농도를 감소시켜 HIF-α와 C/EBPα의 발현을 증가시키고, 암세포의 DNA 손상을 일으킨다. 또한, 세포 사멸(apoptosis) 관련 유전자의 발현을 유도하여 암세포의 세포 사멸을 유도하고, 세포 분화를 효과적으로 촉진함으로 항암제로 유용하게 사용할 수 있다.
티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산), 인간 전골수성 백혈병 세포
Description
도 1은 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)에 의한 암세포주의 성장률을 나타낸 도면이고,
● : 대조군 ○ : 티론 0.1 mM
▼ : 티론 0.5 mM ▽ : 티론 1 mM
■ : 티론 3 mM □ : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
도 2는 티론에 의한 암세포주의 CBPI를 나타낸 도면이고,
T3: 티론 3 mM T3+FeCl3 : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
도 3은 티론에 의한 암세포주의 HIF-1α와 C/EBPα 발현 조사를 나타낸 도면이고,
C : 대조군 T1 : 티론 0.5 mM
T0.5+FeCl3 : 티론 0.5 mM+FeCl3 20 μM
도 4는 티론에 의한 암세포주의 세포 분화 조사를 나타낸 도면이고,
C : 대조군 T1 : 티론 0.5 mM
T0.5+FeCl3 : 티론 0.5 mM+FeCl3 20 μM
도 5는 티론에 의한 암세포주의 DNA 손상 조사를 나타낸 도면이고,
C : 대조군 T1 : 티론 1 mM
T3 : 티론 3 mM T3+FeCl3 : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
도 6은 티론에 의한 암세포주의 세포 생존률을 나타낸 도면이고,
● : 대조군 ○ : 티론 0.5 mM
▼ : 티론 1 mM ▽ : 티론 3 mM
■ : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
도 7은 티론에 의한 암세포주의 세포 사멸도를 나타낸 도면이고,
C : 대조군 T1 : 티론 1 mM
T3 : 티론 3 mM T3+FeCl3 : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
T3+H5 : 티론 3 mM+H2O2 5 μM T3+H10 : 티론 3 mM+H2O2 10 μM
T3+H15 : 티론 3 mM+H2O2 15 μM T3 + H30 : 티론 3 mM+H2O2 30 μM
도 8은 티론에 의한 암세포주의 세포 사멸 관련 유전자 발현을 나타낸 도면이고,
C : 대조군 T1 : 티론 1 mM
T3 : 티론 3 mM T3+FeCl3 : 티론 3 mM+FeCl3 20 μM
도 9는 티론과 항암제에 의한 암세포주의 세포 사멸도를 나타낸 도면이고,
C : 대조군 Cis : 시스플라틴 15 μM
T1 : 티론 1 mM T1+Cis : 티론 1 mM+시스플라틴 15 μM
T3 : 티론 3 mM T3+Cis : 티론 3 mM+시스플라틴 15 μM 이다.
본 발명은 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 세포의 생장 및 성장을 억제하며, 세포의 분화를 촉진하고, 철 이온을 고갈시켜 암세포 내 HIF-1α와 C/EBPα를 활성화하고, 세포 사멸 유전자의 발현을 유도하여 세포 사멸을 일으키므로, 항암제로서 유용하게 사용할 수 있다.
백혈병은 악성 혈액학적 질환의 대부분을 차지하며, 급성 또는 만성으로 발병된다. 정상적인 골수에서는 아구가 여러 종류의 혈액 세포(백혈구, 적혈구, 혈소판)로 분화(미성숙한 세포가 성숙한 세포로 성장하는 것) 되는 세포를 만든다. 급성 백혈병은 백혈구로 분화되는 아구가 종양화(암화)되는 질병으로, 백혈구 특히 과립구라 불리는 세포로 분화되어야 할 아구가 암화되어 비정상적으로 증가한다. 이 때문에 골수는 정상적인 혈액 세포를 거의 만들 수 없게 되는데 종양화된 아구( 백혈병 세포)만으로 점유되고, 종양화된 아구는 정상 백혈구로 분화할 수 없다. 백혈병 세포는 불멸성을 가져 골수에서 다수로 존재하며, 말초 혈액 내로 침범한다. 이러한 백혈병 세포들은 세포 사멸 현상이 일어나지 않으며, 세포의 분화 또한 억제한다(Canello G. et al. Cancer Principles and Practice of Oncology 1427-1438, 1982; Domen J. Apoptosis 6:239-252, 2001). 상기 암세포의 왕성한 성장과 증식에 있어 철 이온의 존재는 필수적이다. 암세포는 철을 이용하여 세포 내 하이드록시 라디칼을 형성하고, 숙주 세포의 활성을 억제하여 무한 성장을 가능하게 한다(Toyokuni S. Free Radical Biol . Med . 20:553-566, 1996; Weinberg, E.D. Lancet 1:1399-1400, 1989). 철 이온은 암세포뿐 아니라 모든 생물의 성장, 증식, 분화, 생존에 필요하며, ATP 합성을 위한 전자전달계, DNA 합성을 위한 리보뉴클레오타이드 환원효소의 활성, 세포 분열, 세포 주기의 진행과 같이 세포 내 다양한 생리작용에 관여한다. 이로 인하여 암세포는 정상세포보다 더욱 철 이온을 필요로 한다(Crichton R.R. and Ward R.J. Biochemistry 31:11255-11264,1992; Green D.A. et al. W.E., Clin . Cancer Res. 7:3574-3579, 2001). 따라서 암세포 내 철 이온을 제거하게 되면, 암세포의 성장과 증식을 억제되고 세포 사멸효과를 나타내게 된다(Kim B.S. Cell Immunol . 220:96-106, 2002).
최근 연구에서는 세포 내 철의 결핍뿐 아니라 저산소 상태(hypoxia)의 유도는 HIF-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha)를 안정화를 유도할 수 있다고 보고하고 있다. HIF-1α는 에너지 대사와 관련된 다양하고 중요한 생리 작용, 세포분화, 철 이온의 항상성 유지, 신생 혈관 형성과 같은 기능뿐만 아니라, 세포 사멸현 상과 관련된 다양한 유전자와의 상호작용, 세포의 분화를 유도하는 기능을 수행한다(Wang G.L. and Semenza G.L. Blood 82:3610-3615, 1993; Semenza G.L. Nat. Rev. Cancer 3:721-732 2003; Greijer A.E. and Wall, E. J. Clin . Pathol . 57:1009-1014, 2004; Xue Z.H. Biochem Biophys Res Commun . 15:1140-1145, 2005). 또한, 세포 내 철 이온의 결핍으로 증가된 세포 내 HIF-1α가 백혈병 세포 내에 존재하는 C/EBP-α(CCAAT/enhancer binding protein alpha)의 전사활성을 증가시킴으로써 백혈병 세포의 분화를 유도할 수 있다고 보고되었다(Jaakkola P. et al. Science 292:468-472 2001; Huang, Y. Leukemia 17:2065-2073, 2003). 이러한 이유로 많은 연구자들은 철 또는 철과 관련된 세포 내 단백질을 제어하여 암세포의 사멸 효과를 나타내는 철 킬레이트 효과를 갖는 물질을 찾거나 개발하려 노력하고 있다. 그러나 현재까지 암세포에서 생리적으로 중요한 기능을 수행하는 철의 활성을 제어할 수 있는 철 킬레이트 물질들 중 단지 몇 종류만이 임상시험에 사용되었으며, 이들 중 단지 한 종류(디페리옥사민; deferrioxamine)만이 암치료에 사용되고 있다(Dena A. Clinical Cancer Research 7:3574-3579, 2001; Donfrancesco A, Cancer Res. 50:4929-4930, 1990).
티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)은 수용성, 세포 내 투과성, 항산화 기능뿐만 아니라 금속이온 킬레이트 효과가 있음에도 불구하고, 현재까지 단순히 중금속 중독이나 항산화제로써만 사용 중이며, 현재까지 암치료와 관련된 연구에 이용되지 않고 있는 실정이다(Jones M.M., CRC Crit Rev Toxicol 21:209-233, 1991; Melvin C. Free Radical Biol . Med 39:925-936, 2005).
이에 본 발명자들은 금속 이온 킬레이트 효과 및 항산화 효과를 갖는 티론 (4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 이용하여 인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포의 성장을 억제하고 세포의 분화와 사멸을 유도함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 항암제로서 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 유효성분으로 포함하는 백혈병 세포주의 세포 분화제를 제공한다.
또한, 본 발명은 티론을 유효성분으로 포함하는 HIF-1α 활성제를 제공한다.
또한, 본 발명은 티론을 유효성분으로 포함하는 C/EBPα 활성제를 제공한다.
또한, 본 발명은 티론을 유효성분으로 포함하는 암세포 사멸 유도제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 티론을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포에 금속 킬레이터이며 항산화제로 사용되는 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 처리하였고, 티론과 함께 FeCl3를 처리하여 암세포의 성장률을 조사하였다. 그 결과, 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포주에서는 세포의 성장을 완전히 저해하였고, FeCl3를 티론과 함께 처리했을 때에는 세포 성장률이 정상으로 회복되는 것이 관찰되었다(도 1 참조). 이후, 티론에 의한 인간 전골수성 백혈병 세포주의 성장, 세포 분열 및 세포 독성 정도를 알아보기 위해 CBPI(cytokinesis-block proliferation index)를 측정하였다. 그 결과, 6시간까지는 커다란 변화가 없었지만, 24시간 이후 티론을 단독 처리한 군에서는 유의적으로 CBP값이 감소하였다(도 2 참조). 이를 통해 처리 시간에 따라 암세포의 성장이 영향받음을 알 수 있다.
본 발명의 발명자들은 티론에 의한 HIF-1α와 C/EBPα의 발현을 RT-PCR, 웨스턴 블롯 방법, 형광 항체의 형광 강도 측정을 통하여 조사하였다. HIF-1α는 세포 내 철 이온이 감소하면서 증가하는데, HIF-1α는 백혈병 세포주 내 C/EBPα의 전사 활성을 증가시켜 세포 분화를 유도하였다. 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 HIF-1α의 발현을 유도함을 유전자 레벨(도 3A 참조), 단백질 레벨(도 3B 참조), 생체 내 레벨(도 3C 참조)에서 확인되었다. 증가한 HIF-1α가 세포 내의 C/EBPα의 발현도 증가시킴을 확인하였다(도 3A 및 3B 참조). C/EBPα 유전자는 2 개의 시작 코돈(start codon)이 존재하여 이 두 곳 모두 강한 프로모터를 가지므로 유전자 발현시 임의적으로 두 군데 모두 발현이 이루어져 42 kDa와 30 kDa의 C/EBPα의 발현을 볼 수 있다(도 3B 참조). 또한, FeCl3를 함께 처리하였을 때 티론에 의한 발현 유도 현상이 사라졌다. 이를 통해 티론에 의한 암세포 내 철 이온의 감소는 세포 분화와 관련된 유전자의 발현 증가를 유도함을 알 수 있다.
본 발명자들은 실제 티론이 인간 전골수성 백혈병 암세포주의 세포 분화를 유도하는지 조사하기 위해 세포 분화 표지자인 CD11b와 CD14의 발현 양상을 형광 항체를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 티론을 처리했을 때 CD11b와 CD14의 발현이 증가하였으며, FeCl3를 처리했을 때 티론의 효과가 사라짐이 관찰되었다(도 4A 참조). 상기 현상을 광학현미경으로 관찰하였을 때, 티론을 처리하면 세포의 핵이 작아지면서 다면체를 형성하고 세포질의 비율이 증대되는 분화 현상이 관찰되었다(도 4B 참조). 이를 통해 티론에 의한 암세포 내 철 이온의 감소는 세포의 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 티론이 암세포의 DNA를 손상시키는지 여부를 조사하였다. 그 결과, 티론에 의해 소핵의 빈도가 증가하며(도 5A 참조), DNA 분절이 증가되었음을 확인하였다(도 5B 및 5C 참조). 티론과 함께 FeCl3를 처리하였을 때, DNA의 손상이 감소되는 현상이 관찰되었다. 이를 통해, 티론은 처리 시간뿐 아니라 티론의 처리 농도에 의존적으로 DNA를 손상시킴을 알 수 있다.
본 발명자들은 티론에 의한 인간 전골수성 백혈병 세포주의 세포 생존률을 조사하였다. 그 결과, 암세포의 생존률이 대조군 또는 FeCl3를 처리해준 군과 비교했을 때 감소함이 관찰되었다(도 6 참조). 이를 통해, 금속 이온 킬레이트인 티론은 세포 성장뿐 아니라 세포 생존에도 영향을 미침을 알 수 있다.
이후 본 발명자들은 티론에 의한 세포 사멸도를 조사하였다. 티론을 처리한 후 DNA를 추출하여 전기 영동을 한 결과 세포 사멸(apoptosis)로 인한 특이적 DNA절단 현상인 래더 패턴(ladder pattern)을 보였다(도 7A 참조). 또한, FACS 조사 결과, 티론을 암세포에 처리시, 세포 사멸이 대조군보다 3-5배 증가하였다(도 7B 참조). 티론의 화학적 특성은 항산화 효과와 금속 이온 킬레이트 효과를 가진다. 이에 본 발명자들은 티론에 의한 세포 사멸 효과가 철 이온의 킬레이트 효과뿐만 아니라 세포 내 극도로 낮아진 활성 산소종 수준에 의한 효과를 보기 위하여 외부에서 H2O2 소량을 처리하였다. 그 결과, 티론 3 mM+H2O 15 μM 처리시 세포 사멸이 어느 정도 감소하는 것을 관찰하였다. 이러한 현상은 철의 활성산소종 생성이 어느 정도 세포 사멸의 회복에 기여할 가능성이 있으나 주된 원인은 활성산소종 때문이 아니라 다른 기능에 의한 것임을 알 수 있다(도 7C 참조).
본 발명자들은 티론에 의한 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 세포 사멸(apoptosis) 유도와 관련된 유전자 p21, Bax, Bcl-2, PARP의 발현을 조사하였고, 상기 발현과 관련된 Caspase-3의 활성도를 측정하였다. 그 결과, 티론은 상기 유전자의 발현을 유도하며(도 8A 참조), caspase-3 활성도를 증가시켰다(도 8B 참조). 또한, 티론의 농도가 증가될수록 상기 유전자의 발현 유도와 caspase-3의 활성 도를 증가시켰다. 이를 통해 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 세포 사멸(apoptosis) 유도 유전자의 발현을 유도하여 프로그램된 세포 사멸(programed cell death)을 유도함을 알 수 있었다.
본 발명자들은 암세포의 DNA 변형을 유도하는 것으로 알려진 항암제 시스플라틴과 티론을 함께 처리하여 암세포의 세포 사멸을 조사하였다. 그 결과, 티론과 시스플라틴을 단독으로 처리하는 경우보다, 티론과 시스플라틴을 함께 처리하였을 때 암세포 사멸 현상이 2배 정도 증가함이 관찰되었다(도 9 참조). 이를 통해, 티론이 공지된 다른 항암제와 함께 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 티론을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
본 발명의 항암제는 급성 전골수성 백혈병을 대상으로 한다. 본 발명의 항암제는 티론 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 염으로는 약제학적으로 허용가능한 무독성 염이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탈술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등의 염 형태로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항암제는 시스플라틴과 병용 투여할 수 있다(도 9 참조).
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량부로 포함한다.
본 발명의 항암제는 암을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 항암제는 상기 티론에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 항암제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.01 내지 12.5 ㎎/kg이고, 바람직하게는 1.25 내지 2.5 ㎎/kg이며, 하루 일 회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 티론(4,5-
디하이드록시
-1,3-벤젠
디술포닉산
: 이하 "티론"이라 칭함)에 의한 인간
전골수성
백혈병 세포주
HL
-60 세포 성장률 조사
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 100 units/㎖ 페니실린(penicillin; SIGMA, USA), 10% 65℃에서 불활성화시킨 우태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum; Hyclone, USA)을 포함한 pH 7.4의 RPMI 1640(GIBCO-BRL, UK)배지에 전체부피 5 ㎖에 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플레이트에 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)은 Sigma사(USA)에서 구입하여 PBS로 희석하여 배양중인 세포에 각각 1 mM, 3 mM로 처리하였고, 티론 3 mM + 20 μM FeCl3을 함께 처리하여 24, 48, 72시간 동안 CO2 배양기에 배양하여 트립판 블루 염색법을 이용하여 세포 성장을 조사하였다.
본 실험 결과, 티론 1 mM(T1)과 3 mM(T3)를 처리한 후 24시간 후 인간 전골수성 백혈병 세포주 증식이 대조군(C)과 비교하였을 때 통계적으로 유의성 있게 감소하는 것은 확인할 수 있었으며(P<0.001), 티론 3 mM + 20 μM FeCl3을 함께 처리했을 때 인간 전골수성 백혈병 세포주의 성장이 회복되는 것을 알 수 있다(도 1 참 조). 이를 통해 티론이 인간 전골수성 백혈병 세포주의 성장을 저해함을 알 수 있다.
<
실시예
2>
티론에
의한 인간
전골수성
백혈병 세포주의 세포 독성, 세포 분열 및 성장에 미치는 영향 조사
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 3 mM 티론, 3 mM 티론 + 20 μM FeCl3을 0, 3, 6, 24시간 처리한 다음 우태아 혈청이 들어있지 않은 배지로 2회 세척 후 37℃에서 전체 배양시간이 24시간이 될 때 Cytochalasin-B(Sigma, USA) 3 ㎍/㎖를 처리한 다음 전체 배양시간이 48시간이 될 때까지 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 0.075 M KCl 저장액에 3분간 노출한 후 메탄올(Merck, USA):아세트산(JUNSEI, Japen)을 3:1(v/v)로 혼합한 고정액에 2회 고정시키고 깨끗한 슬라이드 글라스에 떨어뜨린 다음 공기 중에 말린 후 5% 김자 용액(Geimsa, Sigma, USA)에 염색하여 현미경(1000X)을 이용하여 관찰하였다. 각각의 CBPI(cytokinesis-block proliferation index)를 측정하였다(Surralles J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H., Marcos, R., Mutat . Res . 341:169184, 1995).
본 실험 결과, 티론을 24시간 처리할 경우 CBPI값이 통계적으로 유의성 있게 감소함이 확인되었다(P<0.05)(도 2 참조). 이를 통해 티론의 처리 시간에 따라 암세포의 성장이 영향받는다는 것을 알 수 있다.
<
실시예
3>
티론에
의한 인간
전골수성
백혈병 세포주에서
HIF
-1α 발현 조사
<
실시예3
-1> RT-
PCR
분석
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 0.5 mM 티론, 0.5 mM 티론 + 20 uM FeCl3를 처리한 다음 37℃에서 96시간 동안 배양하고, 세포를 수확하여 PBS로 세척한 후 1×106 세포를 준비하였다. 준비된 세포를 1.5 ㎖ 튜브에 옮긴 후, 1 ㎖ TRIzol 시약(GIBCO-BRL, UK)을 첨가하고 파이펫을 이용하여 파쇄하였다. 다음 200 ㎕ 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 2-3회 교반하여 시료를 혼합시켜 4℃, 13,000 rpm으로 10분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 400 ㎕의 투명한 상등액을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 이소프로판올(isopropanol) 400 ㎕를 첨가한 다음 2-3회 교반하여 상온에 방치하였다. 10분 후 각각의 튜브를 4℃, 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 후 1 ㎖ 에탄올(ethanol)을 첨가해 2-3회 교반하고, 4℃, 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하였다. 상기 과정을 거친 RNA 덩어리를 5분간 실온에서 건조한 다음 20 ㎕ DEPC 처리 증류수를 첨가해 RNA 덩어리를 용해하였다. 상기 정제된 RNA는 260 nm 흡광도로 정량하여 0.1 ㎍의 RNA, 서열번호 1로 기재되는 HIF-1α 정방향 프라이머(5'-GGATTCTGGGTAGGAGATGGAGATGC-3')와 서열번호 2로 기재되는 HIF-1α 역방향 프라이머(5'-GCACTCATCAAGAAGTTGC-3')를 10 pM로 제작하여 PCR을 수행하여 HIF-1α의 발 현을 조사하였다. 또한, 서열번호 3으로 기재되는 C/EBPα 정방향 프라이머(5'-ACGTGGAGACGCAGCAGAA-3') 및 서열번호 4로 기재되는 C/EBPα 역방향 프라이머(5'-AGGCGGTCATTGTCACTGG-3')로 PCR을 수행하여 C/EBPα 의 발현을 조사하였다. 대조군으로 서열번호 5로 기재되는 β-actin 정방향 프라이머(5'-CATCCTCACCCTGAAGTACCC-3') 및 서열번호 6으로 기재되는 β-actin 역방향 프라이머(5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. RT-PCR ONE-STEP kit(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea)와 증류수를 혼합하여 전체 부피 20 ㎕로 맞춘 후 PCR을 실시하였으며, PCR 조건은 하기와 같다. 45℃에서 30분 동안 RNA를 역전사시켜 cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분간 초기 변성 과정을 거친 후, 95℃에서 30초 동안 변성 반응, 58℃에서 45초 동안 프라이머 결합 반응, 72℃에서 45초 동안 길이 연장 반응을 수행하였고, 상기 과정을 32회 반복하였다. PCR 산물은 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하고 다음 에티디움브로마이드(EtBr)용액을 이용해 염색하여 발현 정도를 확인하였다.
본 실험 결과, 티론은 인간 전골수성 백혈병 세포주 내에서 HIF-1α의 발현을 증가시키며, 이에 따른 C/EBPα의 발현도 증가시킴을 알 수 있다(도 3a 참조). FeCl3와 티론을 함께 처리한 경우 티론의 효과가 사라졌다.
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실시예
3-2>
웨스턴
블롯
분석
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM 티론을 처리한 다음 37℃에서 36시간 동안 배양하였고, 세포를 수확하여 PBS로 세척한 후 단백질 가수분해 효소억제 복합제(Sigma, USA)를 처리하여 초음파를 이용해 단백질을 추출한 다음 로우리(Lowry)법을 이용하여 단백질을 정량하여 12% 폴리아크릴아마이드 젤에서 단백질을 분자량에 따라 전개시켰다. 이후 니트로셀룰로오스막에 단백질을 옮겨 1차 항체(anti-HIF1α antibody; BD, Pharmingen, USA)에 2시간 동안 노출시키고, 항-레빗 2차 항원(rabbit Ig conjugated horseradish peroxidase)에 1시간 동안 노출시킨 다음 ECL 키트(Amersham Pharmacia Biotich, UK)를 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
본 실험 결과, 티론이 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 C/EBPα와 HIF-1α의 발현을 단백질 단계에서 유도함을 알 수 있다(도 3b 참조).
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실시예
3-3>
HIF
-1α 발현 측정
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 5 ㎖로 2×105 세포/㎖가 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 0.5 mM 티론, 0.5 mM 티론 + 20 uM FeCl3를 처리한 다음 37℃에서 96시간 동안 배양하고, 세포를 수확하여 PBS로 세척한 후 5×105 세포를 준비하였다. 티론에 의해 인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세 포가 HIF-1α의 발현을 유도하는지 알아보기 위해 HIF-1α 항체(BD Bioscence, USA)를 이용하여 측정하였다. 수확한 세포를 BD cytofix/cytoperm 용액(BD Bioscence, USA)로 4℃에서 20분간 처리한 다음 BD perm/wash 용액(BD Bioscence, USA)을 이용하여 세척한 후 0.5 ㎍/㎕ 항체를 각각 처리하여 4℃에서 30분간 노출시키고 BD perm/wash 용액(BD Bioscence, USA)을 이용하여 세척하여 세포유동분석기(FACS; Coulter Co. Epix)를 이용하여 측정하였다.
본 실험 결과, 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포에 티론을 처리했을 때 HIF-1α의 발현이 증가하며, 티론과 FeCl3를 함께 처리했을 때 HIF-1α에 대한 티론의 효과가 사라졌다(도 3c 참조).
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실시예
4> 세포 분화 조사
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 0.5 mM 티론, 0.5 mM 티론 + 20 uM FeCl3을 처리한 다음 37℃에서 96시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS로 세척하고 5×105 세포를 준비하였다. 티론에 의해 인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포가 분화를 유발하는지 알아보기 위해 세포 분화 표지자인 CD11b 항체(BD Bioscence, USA)와 CD 14항체(BD Bioscence, USA)를 이용하여 측정하였다. 수확한 세포를 BD cytofix/cytoperm 용액(BD Bioscence, USA)을 4℃에서 20분간 처리한 다음 BD perm/wash 용액(BD Bioscence, USA)을 이용하여 세척한 후 0.5 ㎍/㎕ 항체를 각각 처리하여 4℃에서 30분간 노출시키고, BD perm/wash 용액(BD Bioscence, USA)을 이용하여 세척한 다음 세포유동분석기(FACS; Coulter Co. Epix)를 이용하여 측정하였다. 또한, 세포분화의 형태학적 분석은 세포를 슬라이드 글라스에 고정한 다음 김자(Geimsa, Sigma, USA)용액을 처리한 다음 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
본 실험 결과, 티론을 처리했을 때 세포 분화 표지자(CD11b, CD14)의 발현 정도가 높게 관찰되었으며, 티론과 FeCl3을 함께 처리하였을 때, 유전자의 발현이 감소되었다(도 4a 참조). 이를 통해 티론에 의한 암세포 내 철 이온의 감소는 세포의 분화와 관련된 유전자의 발현을 유도함을 알 수 있다.
또한, 세포 분화를 광학 현미경으로 관찰한 결과, 티론 처리한 세포의 핵이 작아지면서 다면체를 형성하고 세포질의 비율이 증대되는 분화 현상이 일어남이 관찰되었다(도 4b 참조).
본 실시예 결과, 티론에 의한 암세포 내 철 이온의 감소는 세포 분화를 유도시킴을 알 수 있다.
<
실시예
5>
티론에
의한 인간
전골수성
백혈병 세포주
HL
-60 세포의 DNA 손상 정도 조사
<
실시예
5-1>
소핵
분핵법
조사
티론의 처리시간에 따라 발생하게 되는 DNA 손상 정도의 차이를 알아보기 위해 소핵 분석을 실시하였다. 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 3 mM의 티론을 0, 3, 6, 24시간 처리한 다음 우태아 혈청이 들어있지 않은 배지로 2회 세척 후 37℃에서 전체 배양시간이 24시간이 될 때 Cytochalasin-B(Sigma, USA) 3 ㎍/㎖를 처리한 다음 전체 배양시간이 48시간이 될 때까지 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 0.075 M KCl 저장액에 3분간 노출한 후 메탄올(Merck, USA):아세트산(JUNSEI, Japen)을 3:1(v/v)로 혼합한 고정액에 2회 고정시키고 깨끗한 슬라이드 글라스에 떨어뜨린 다음 공기 중에 말린 후 5% 김자 용액에 염색하여 현미경(1000X)을 이용하여 1000개의 이핵세포(binuclei)를 갖는 세포를 관찰하여 이들이 갖는 소핵의 수를 계측하였다.
본 실시예 결과, 티론을 처리했을 때 소핵의 빈도가 증가했음을 알 수 있다(도 5a 참조).
<
실시예
5-2> 단세포 전기영동법 조사
티론의 농도에 따라 발생하게 되는 DNA 손상 정도의 차이를 알아보기 위해 단세포 전기영동법을 수행하였다. 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM 티론, 3 mM 티론 + 20 μM FeCl3을 처리한 다음 0, 24, 48시간에 세포를 수거하여 분석하였다. 0.6%의 normal melting 아가로오스겔을 슬라이드 글라스에 로딩하여 제 1층을 형성한 다음 1×105 세포/10 ㎕를 85 ㎕ 0.5% low melting 아가로오스겔에 혼합하여 신속히 제 1층 위에 로딩하고 마지막으로 85 ㎕ 0.5% low melting 아가로오스겔을 슬라이드 글라스 위에 로딩하여 슬라이드를 준비하였다. 준비된 슬라이드는 알카라인 라이시스 완충용액(alkaline lysis buffer; 2.5 M NaCl, 100 mM Na2-EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10)에 담궈 4℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 이후 슬라이드를 10분 동안 증류수에 담가 세척한 다음 알카라인 완충용액(alkaline buffer: 1 mM Na2-EDTA, 300 mM NaOH, pH 13)에서 0.78 V/cm로 25분간 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 중성화 완충용액(neutralization buffer; 0.4 M Tris-HCl, pH 7.5)을 이용해 세척한 후 100% 에탄올에 1분간 담가놓은 다음 슬라이드를 꺼내 100 ㎕ 에티디움 브로마이드 용액(10 ㎍/㎕)을 슬라이드 위에 로딩하여 염색 한 다음 형광현미경(Leica, Germany)과 이미지 프로그램(Kinetic imaging, UK)을 이용하여 계측하였다.
본 실험 결과, 티론 처리시 DNA의 분절이 증가되었으며, 티론의 농도가 증가할수록 DNA 분절도로 높아짐을 알 수 있었다(도 5b 참조). 형광 현미경으로 관찰시 티론을 처리한 세포는 대조군과 FeCl3를 함께 처리한 세포에 비하여 손상이 심해짐을 관찰할 수 있었다(도 5c 참조).
본 실시예를 통해, 티론의 처리기간뿐 아니라 티론의 농도에 의존적으로 인간 전골수성 백혈병 세포주에서 DNA 손상이 증가됨이 확인되었다.
<
실시예
6>
티론에
의한 인간
전골수성
백혈병 세포주
HL
-60 세포 생존율 조사
인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포를 100 units/㎖ 페니실린(penicillin; SIGMA, USA), 10% 65℃에서 불활성화시킨 우태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum; Hyclone, USA)을 포함한 pH 7.4의 RPMI 1640(GIBCO-BRL, UK)배지를 이용하여 전체부피 5 ㎖에 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플레이트에 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 티론 1 mM, 3 mM로 처리하였고, 티론 3 mM + 20 μM FeCl3을 함께 처리하여 24, 48, 72시간 동안 CO2 배양기에 배양하여 트립판 블루 염색법을 이용하여 세포 성장을 조사하였다.
본 실험 결과, 티론의 농도 1 mM 및 3 mM을 처리했을 때 인간 전골수성 백혈병 세포주의 생존률이 감소하며, FeCl3을 함께 처리한 세포의 경우 생존률이 대조군과 비슷한 경향을 보였다(도 6 참조). 이를 통해 금속 킬레이트인 티론이 암세포의 성장뿐 아니라 생존에도 영향을 준다는 것을 알 수 있다.
<
실시예
7>
티론에
대한 인간
전골수성
백혈병 세포주의 세포 사멸도 조사
<
실시예
7-1> DNA 단편 형성 조사
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체부피 5 ㎖에 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM의 티론, 3 mM 티론 + 20 uM FeCl3을 처리한 다음 36시간에 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다. 이 후 Promega사(USA)의 Wizard DNA purification kit을 이용하여 DNA를 분리하고, 1.5% 아가로스젤에 전기 영동하여 에티디움 브로마이드(EtBr)용액을 이용해 염색하여 DNA의 전개 경향을 분석하여 세포 사멸 정도를 비교 분석하였다.
본 실험 결과, 세포사멸(apoptosis)로 인한 특이적인 DNA 절단 현상인 래더 패턴(ladder pattern)이 관찰되었다(도 7a 참조).
<
실시예7
-2>
FITC
Anexon
V/
Propidium
idodide
(PI)를 이용한 세포 사멸 분석
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피가 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM의 티론, 3 mM 티론 + 20 uM FeCl3을 처리한 다음 36시간 경과 후 세포를 수거하여 10분간 1,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 제거한 후 차가운 PBS 용액을 이용하여 세척하였다. 이후 세포를 FITC Anexin V/PI 용액(Invitrogen, USA)에 15분간 상온에 노출시킨 다음 세포유동분석기(FACS,Coulter Co. Epix)와 형광현미경(Leica, Germany)을 이용하여 분석하였다. 상기와 같은 조건에서 세포를 배양한 후 대조군, 3 mM의 티론, 3 mM 티론 + 5 μM H2O2, 3 mM 티론 + 10 μM H2O2, 3 mM 티론 + 15 μM H2O2, 3 mM 티론 + 30 μM H2O2으로 처리하고, 상기 방법과 같이 세포유동분석기(FACS; Coulter Co. Epix)를 이용하여 세포 사멸을 분석하였다.
본 실험 결과, 1 mM와 3 mM 티론을 처리한 결과, 대조군에 비교하여 각각 3배 내지 5배 세포사멸이 증가하였다. 또한, 티론에 의한 암세포주의 세포 사멸은 외부에서 FeCl3을 처리해 주입하므로 막을 수 있었다(도 7b 참조).
세포내 활성산소종의 농도에 의해 세포 사멸 현상이 유도되는지 알아보기 위해 H2O2를 소량(5, 10, 15, 30 μM)을 투여하여 세포 사멸을 조사한 결과, H2O2를 15 μM을 투여했을 때 세포 사멸 현상이 10% 정도 감소하는 것을 관찰하였다(도 7c 참조).
<
실시예
8> 세포 사멸(
apoptosis
) 관련 유전자 발현 조사
<
실시예
8-1>
웨스턴
블롯
분석
실시예 3-2와 같이 세포를 준비하고, 대조군, 1 mM, 3 mM의 티론을 처리한 다음 37℃에서 36시간 동안 배양한 다음 실시예 3-2와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체(Trx, p21, Bax, Bcl2, PARP, β-actin; BD, Pharmingen, USA)에 2시간 동안 노출시키고, 항-레빗 2차 항원(rabbit Ig conjugated horseradish peroxidase)에 1시간 동안 노출시킨 다음 ECL 키트(Amersham Pharmacia Biotech, UK)를 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
본 실험 결과, 세포 사멸(apoptosis) 관련 유전자가 티론에 의해 발현이 유도됨이 확인되었다(도 8a 참조).
<
실시예
8-2>
Caspase
-3 활성도 조사
Caspase-3의 활성은 Alexis Biochemical사(USA)의 Caspase-3 colorimetric assay kit를 이용하여 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다. 인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포를 전체 부피 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM 티론, 3 mM 티론 + 20 uM FeCl3을 처리한 다음 36시간에 세포를 수확하여 PBS로 세척한 후 단백질 가수분해 효소억제 복합제(Sigma, USA)를 처리하여 초음파를 이용해 단백질을 추출한 다음 로우리(lowry)법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 100 ㎍ 단백질을 50 ㎕ 2X 반응 완충 용액과 5 ㎕ 4 mM DEVD-pNA 기질과 혼합한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험 결과, Caspase-3의 활성이 티론을 처리하였을 때 증가하였으며, 티론의 농도가 증가할수록 활성 또한 함께 증가하였다(도 8b 참조).
본 실시예를 통해 티론에 의한 세포 사멸 현상이 세포사멸(apoptosis)과 관련된 유전자 발현을 통한 프로그램된 세포 사멸(programed cell death)인 것을 알 수 있다.
<
실시예
9>
티론과
항암제에 대한 인간
전골수성
세포주의 세포 사멸 분석
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포를 전체 부피가 5 ㎖로 2×105 세포/㎖이 되도록 T25 플라스크에 분주하여 대조군, 1 mM, 3 mM 티론, 15 uM 시스플라틴, 1 mM 티론 + 15 uM 시스플라틴, 3 mM 티론 + 15 uM 시스플라틴을 처리한 다음 6시간과 12시간 경과 후에 세포를 수거하여 10분간 1,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 세포를 부유시켜 70% 에탄올 1 ㎖을 첨가해 30분간 -20℃에 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후 1,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 에탄올을 완전히 제거하고 PBS로 세척하여 PI 염색시약(PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM EDTA, pH 7.4, 0.05 ㎎/㎕ RNase A(50 units/㎎), 5 ㎍/㎖ PI) 500 ㎕를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 염색 후 염색된 세포를 세포유동분석기(FACS; Coulter Co. Epix)로 분석하였다.
1 mM 및 3 mM 티론을 처리한 세포에 암세포의 DNA 변형을 유도하는 항암제인 시스플라틴 15 uM을 동시에 처리했을 때, 시스플라틴과 티론 만을 각각 독립적으로 처리한 경우보다 약 2배 정도 암세포 사멸 현상이 증가하였다(도 9 참조).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)은 인간 전골수성 백혈병 세포의 생존과 성장을 효과적으로 억제하며, 세 포 내 철 이온의 농도를 감소시켜 HIF1-α와 C/EBPα의 발현을 증가시키고, 암세포의 DNA 손상을 일으킨다. 또한, 세포 사멸(apoptosis) 관련 유전자의 발현을 유도하여 암세포의 세포 사멸을 유도하고, 세포 분화를 효과적으로 촉진함으로 항암제로 유용하게 사용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (7)
- 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을 유효성분으로 함유하는 백혈병 치료제.
- 제1항에 있어서, HIF-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha)의 활성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
- 제1항에 있어서, 전골수성 백혈병 세포의 세포사멸을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
- 제3항에 있어서, p21, Bax, Bcl-2 및 PARP(poly (ADP-ribose) polymerase) 세포사멸 유전자 발현을 유도하여 전골수성 백혈병 세포의 세포사멸을 촉진하는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
- 제1항에 있어서, 백혈병 세포의 세포 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
- 제1항에 있어서, 시스플라틴과 병용투여하는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
- 제6항에 있어서, 급성 전골수성 백혈병을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료제.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060001967A KR100713714B1 (ko) | 2006-01-06 | 2006-01-06 | 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을유효성분으로 포함하는 항암제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060001967A KR100713714B1 (ko) | 2006-01-06 | 2006-01-06 | 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을유효성분으로 포함하는 항암제 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100713714B1 true KR100713714B1 (ko) | 2007-05-04 |
Family
ID=38269460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060001967A KR100713714B1 (ko) | 2006-01-06 | 2006-01-06 | 티론(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디술포닉산)을유효성분으로 포함하는 항암제 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100713714B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024143579A1 (ko) * | 2022-12-27 | 2024-07-04 | 경상국립대학교병원 | 티론을 포함하는 조골 세포 분화 억제용 조성물 및 골암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4701320A (en) * | 1984-11-29 | 1987-10-20 | Lederle (Japan), Ltd. | Composition stably containing minocycline for treating periodontal diseases |
-
2006
- 2006-01-06 KR KR1020060001967A patent/KR100713714B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4701320A (en) * | 1984-11-29 | 1987-10-20 | Lederle (Japan), Ltd. | Composition stably containing minocycline for treating periodontal diseases |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.Biol.Chem. 279(33), p.34643-34654 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024143579A1 (ko) * | 2022-12-27 | 2024-07-04 | 경상국립대학교병원 | 티론을 포함하는 조골 세포 분화 억제용 조성물 및 골암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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