KR100689429B1 - 암 세포 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자와 듀플렉스 분자를 형성함으로써 번역 수준에서 Ii 단백질 합성을 억제하는 기능을 하는 것들을 포함하여, Ii의 특이적 조절인자의 몇가지 형태에 대해 기술한다. 상기 클래스는 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자에 특이적으로 하이브리드화되는 누클레오티드 염기로 구성된 공중합체 및 발현될 수 있는 역방향 유전자 구성물을 포함한다. 다른 일면에서, 본 발명은 Ii 발현의 특이적 조절인자를 가진 MHC 클래스 II-포지티브 항원 제시 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 세포들은 MHC 클래스 II 단백질과 관련된 자가결정인자 펩티드를 디스플레이시키기는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 바람직하지 않은 세포에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써 환자에게서 예컨대, 악성종양 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 적용법을 제공한다. 추가적인 적용은 세포로부터 자가결정인자 펩티드를 단리하는 것이다.

Description

암 세포 백신{CANCER CELL VACCINE}
특이적 항원에 대한 면역 반응은 T 림프구에 의해 이들 항원의 펩티드 단편을 인식함으로써 조절된다. 항원 제시 세포 내에서는, 이와 같이 프로세싱된 항원의 펩티드 단편이 주조직적합성 복합체(MHC) 분자의 항원 펩티드 결합 부위 내로 결합된다. 이어서, 이들 펩티드-MHC 복합체는 헬퍼(helper) 또는 세포독성 T 림프구 상의 T 세포 수용체에 의해 (외래 펩티드와 제시 MHC 분자의 인접 표면 모두의) 인식을 위해 세포 표면에 수송된다. 펩티드를 운반하는 두 가지 클래스의 MHC 분자, 즉 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 있다.
MHC 클래스 I 분자는 항원을 CD8-양성 세포독성 T-림프구에 제시하는데, 이때 활성화되어 항원 제시 세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 이의 합성 동안 소포체 내에서 감염성 바이러스와 같은 내재적으로 합성된 단백질로부터의 펩티드만을 수용하게 된다.
MHC 클래스 II 분자는 항원을 CD4-양성 헬퍼 T-림프구(T 헬퍼 세포)에 제시한다. 일단 활성화되면, T 헬퍼 세포는 물리적 접촉과 사이토킨 방출을 통하여 세포독성 T 림프구(T 킬러 세포) 및 B 림프구를 활성화시키는데 기여한다. MHC 클래스 I분자와는 달리, MHC 클래스 II 분자는 비-특이적 또는 특이적 엔도사이토시스(endocytosis)를 통하여 내면화시킨 외인성 항원과 결합된다. 합성 동안, MHC 클래스 II 분자는 비변이(invariant) 쇄 단백질(Ii)과 대신 결합함으로써 내재성 항원과 결합되는 것이 차단된다. 이들 MHC 클래스 II-Ii 단백질 복합체는 소포체로부터 골기-후방 구획 내로 수송되는데, 여기서 Ii가 단백질 분해 작용에 의해 방출되고 외인성 항원 펩티드가 결합된다[참조: Daibata et al., Molecular Immunology 31: 255-260(1994); Xu et al., Molecular Immunology 31: 723-731(1994)].
MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자는 세포들 간에 별개의 분포를 나타낸다. 거의 모든 핵화 세포가 MHC 클래스 I 분자를 발현시키지만, 발현 정도는 세포 타입에 따라 다양하다. 면역계 세포는 이들의 표면 상에 다량의 MHC 클래스 I를 발현시키는 반면, 간 세포는 비교적 낮은 수준으로 발현시킨다. 비-핵화 세포는 MHC 클래스 I을 거의 또는 전혀 발현시키지 않는다. MHC 클래스 II 분자는 B 림프구 및 마크로파아지 상에서는 고도로 발현되지만, 기타 조직 세포 상에서는 발현되지 않는다. 그러나, 기타 많은 세포 타입을 사이토킨에 노출됨으로써 MHC 클래스 II 분자를 발현하도록 유도시킬 수 있다.
정상적인 조건하에서는, 내재성 펩티드(자가면역 질환을 잠재적으로 유발시키는 자가 결정인자를 지니고 있음)가 MHC 클래스 II 분자에 결합되지 않는데, 이는 Ii 단백질이 신생기의 MHC 클래스 II 분자와 항상 함께 합성되기 때문이다. 자가 결정인자 펩티드와 MHC 클래스 II 분자를 함유하는 복합체는 신체의 면역 감시계에 의해 결코 발견된 바 없기 때문에, 이들 결정인자에 대한 면역관용이 진행되지 않는다. MHC 클래스 II 분자가 특정의 진행된 개체에게서 Ii에 의해 억제되지 않는 경우에는, 내재성 자가 결정인자가 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되어, 이들 내재성 항원에 대한 자가면역 반응을 개시한다. 이는 특정한 자가면역 질환의 경우에 해당된다. 이러한 효과를 악성 세포에서 유전공학적으로 처리함으로써, 종양의 내재성 항원에 대한 "자가면역 반응"을 치료학적으로 이용하여 종양 세포의 성장을 제한하거나 종양 세포를 제거할 수 있다.
Ii 단백질의 부수적인 증가 없이 MHC 클래스 II 분자 발현 증가에 의한 치료학적 효과가 MHC 클래스 II-음성, Ii-음성 종양에서 입증된 바 있다[참조: Ostrand-Rosenberg et al., Journal of Immunol. 144: 4068-4071(1990); Clements et al., Journal of Immunol. 149: 2391-2396(1992); Baskar et al., Cell. Immunol. 155: 123-133(1994); Baskar et al., J. Exp. Med. 181: 619-629(1995); and Armstrong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6886-6891(1997)]. 이들 연구에서, MHC 클래스 II 분자에 대한 유전자를 MHC 클래스 II-음성 뮤린(murine) 육종 내로 트랜스펙션시키면, MHC 클래스 II-양성이지만 Ii-음성인 종양 세포주가 생성되었다. 이들 세포를 MHC 적합성 숙주에 주사하는 것이 모(parental) 종양의 성장 지연을 야기시켰다. Ii 단백질에 대한 유전자를 MHC 클래스 II 유전자와 함께 육종 세포주 내로 공동-트랜스펙션시키면, MHC 클래스 II 유전자의 종양-치료 효과가 억제되었는데, 이는 Ii 쇄가 내재성 종양 항원의 제시화를 차단시켰기 때문이다. 특정 뮤린 흑색종을 이용하여 이에 필적하는 결과를 획득하였다[참조: Chen and Ananthaswamy, Journal of Immunology 151: 244-255(1993)].
이러한 치료학적 접근법의 성공은 수지상 세포의 천연 활성과 연관이 있는 것으로 여겨진다. 수지상 세포는 전문적인 스캐빈저인데, 이는 외래 항원을 펩티드 내로 프로세싱한 다음, 이들을 이들의 세포 표면 상에서 MHC 항원으로부터 T 림프구에 제시한다. 수지상 세포는 MHC 클래스 I 분자와 MHC 클래스 II 분자 모두를 통하여 항원을 제시하는 능력을 지니고 있는데, 이러한 능력으로 인해 상기 세포는 T 헬퍼 세포와 T 킬러 세포 모두를 활성화시킬 수 있다. 유효한 T 헬퍼 세포 반응이 강력한 T 킬러 세포 반응을 유도하는데 요구되는 것으로 여겨지고, 또한 수지상 세포에 의해 생성된 합한 활성화가 항-종양 반응 증대를 야기하는 것으로 여겨진다[참조: Ridge et al., Nature 193: 474-477(1998); Schoenberger et al., Nature 193: 480-483(1998)]. 마크로파아지 리니지(lineage)의 수지상 세포는 종양 세포 발견시, 종양-특이적 항원과 종양-관련 항원 모두를 섭취하여 이들을 프로세싱한다. 이때, 수지상 세포는 종양 부위를 배액시키는 림프절로 이동하고, 새로운 T 세포가 발아되는 림프절 피질 근처 림프절에 거주한다. 이러한 절 피질에서는, 수지상 세포 상의 종양 결정인자를 인식하는 휴지기 T 킬러 세포가 활성화되고 증식된 다음, 적격한 항-종양 킬러 T 세포로서 순환계 내로 방출된다.
T 헬퍼 세포와의 상호작용이 수지상 세포를 활성화시키거나 "라이센스(license)"하여 항원을 MHC 클래스 I 분자를 통해 제시함으로써 T 킬러 세포를 활성화시키긴 하지만, T 헬퍼 세포 및 T 킬러 세포와의 동시 상호작용이 필요하지는 않은데; 활성화된 수지상 세포는 T 헬퍼 세포 매개된 활성화 후 얼마 동안 T 킬러 세포를 자극하는 이들의 능력을 유지하고 있다. MHC 클래스 II 또는 MHC 클래스 I 결정인자에 의해 제시되는 각각의 항원성 펩티드가 하나의 항원성 단백질로부터 유래될 필요는 없으며, 악성 세포로부터의 둘 이상의 항원이 수지상 세포에 의해서 프로세싱되어 제시될 수 있다. 따라서, 아마도 종양 특이적이 아닌 하나의 결정인자에 대한 라이센싱는 T 킬러 세포의 활성화를 라이센스하는 힘을, 아마도 종양 특이적인 다른 결정인자에 운반시킨다. 이러한 '마이너' 또는 '크립틱(cryptic)' 결정인자가 각종 치료 목적을 위해 사용되었다[참조: Mougdil et al., J. Immunol. 159: 2574-2579(1997)].
MHC 클래스 II 항원 제시화를 실험적으로 변화시키는 것은 이들 마이너 결정인자에 대한 면역 반응을 확장시키는 것으로 여겨진다. MHC 클래스 II 분자에 기인하여 통상적으로 이용 가능하지 않은 일련의 펩티드는 MHC 클래스 II 제시화용으로 다양한 펩티드의 풍부한 공급원을 제공한다. 이러한 일련의 결정인자를 이용하는 것이 반응성 T 헬퍼 세포 집단을 팽창시켜 준다. 이와 같이 팽창된 집단은 수지상 세포 라이센싱을 유도할 수 있으며, 이들 중의 몇몇은 종양 특이적이고 종양 관련된 결정인자에 대해 지시된다. 정상 세포가 종양 세포 결정인자를 잠재적으로 공유하고 있긴 하지만, 정상 세포에 대해서는 미세한 세포상 손상 만이 일어난다. 이는 항-종양 반응의 다중 효과인자 반응(다량의 킬러 T 세포, 주변 활성화 사이토킨, 식작용 마크로파아지 및 이의 생성물 등)이 정상 세포에 대해서는 지시되지 않기 때문이다.
정상적인 MHC 클래스 II 항원 제시화는 MHC 클래스 II 분자와 Ii 단백질 간의 상호작용을 억제시킴으로써 변화시킬 수 있다. 이는 총 Ii 단백질을 감소시키거나(예를 들면, 발현을 감소시키거나) 또는 Ii 면역조절 기능을 방해함으로써 달성된다. Ii 발현의 억제는 각종 안티센스 기술을 이용하여 달성하였다. Ii 단백질에 대한 mRNA의 AUG 부위와 상호작용하는 안티센스 올리고누클레오티드가 외인성 항원의 MHC 클래스 II 제시화를 감소시키는 것으로 보고되었다[참조: Bertolino et al., Internet. Immunology 3: 435-443(1991)]. 그러나, MHC 클래스 II 분자에 의한 내재성 항원의 제시화에 대한 효과와 Ii 단백질의 발현에 대한 효과는 조사되지 않았다. 더욱 최근에, 훔프레이즈(Humphreys) 등의 미국 특허 제5,726,020호(1998)는 3가지 안티센스 올리고누클레오티드와, MHC 클래스 II 분자를 발현하는 항원 제시 세포 내로의 도입시 Ii 단백질 발현을 효과적으로 억제시키는 역(reverse) 유전자 구성물을 동정하였다. 이러한 기전에 의해 Ii 억제된 종양 세포가 접종된 마우스는 처리되지 않은 모 종양 세포가 접종된 마우스보다 상당히 더 오래 생존하는 것으로 나타났다. 이러한 관찰 내용은 Ii 단백질을 억제시키는 것이 항원 결정인자 제시화의 범위를 증가시켜, 종양 세포에 대한 보다 효과적인 면역 반응을 촉발시켰다는 것을 지시해준다.
발명의 요약
한 국면에 있어서, 본 발명은 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자에 관한 것이다. 구체적으로 언급하면, 본원에는, 번역 수준에서 Ii 단백질 합성을 억제시키는 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자와의 듀플렉스 분자 형성을 통하여 작용하는 것을 포함한, 몇몇 형태의 Ii의 특이적 조절인자가 개시되어 있다. 이러한 클래스에는 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자와 특이적으로 하이브리드화되는 누클레오티드 염기, 예를 들면, 안티센스 올리고누클레오티드와, 또한 Ii RNA와 특이적으로 하이브리드화되는 RNA 분자를 엔코딩하는 발현 가능한 역방향 유전자 구성물로 구성된 공중합체가 포함된다. 다른 국면에 있어서, 본 발명은 Ii 발현의 특이적 조절인자를 함유하는 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는, 예를 들면, MHC 클래스 II 단백질과 연합하여 자가 결정인자 펩티드를 디스플레이하는데 유용하다. 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 바람직하지 못한 세포에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써, 환자에게서 질환, 예를 들면, 악성 종양 및 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포를 제공하는 단계; 및 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 도입하여 내재성 항원 결정인자의 제시화를 향상시키는 단계를 포함한다. 이어서, 이들 세포 또는 이의 생성물을 사용하여 환자의 면역계를 자극한다.
앞서 발견한 사항들을 집합적으로 조합해보면, 이는 MHC 클래스 II 항원 제시 세포에서의 Ii 단백질 발현을 억제시키는 것이 Ii 단백질의 기능을 폐기시키고 MHC 클래스 II 분자에 의해 면역계에 제시되는 항원성 에피토프의 범위와 선택을 상당히 변화시킨다는 것을 나타내고 있다. 세포에서의 Ii 단백질 발현을, 특정 올리고누클레오티드 또는 역방향 유전자 구성물을 이용하는 안티센스 기술을 사용하여 특이적이고도 효율적으로 억제할 수 있는 것으로 선행 기술에서 밝혀졌다. 미국 특허 제5,726,020호(훔프레이즈 등)에는 이러한 선행 기술이 예시되어 있고, 이의 명세서는 본원에 참조문헌으로 통합된다. 본 발명은 부분적으로는, Ii 단백질의 발현을 억제시켜 주는 부가의 조성물 발견에 근거한 것이다. 이들 조성물 및 이들의 동정 방법이 본원에 기재되어 있다. 이들 발견으로부터 비롯하여, 개체 내의 특정 세포의 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능을 차단시킴으로써 야기되는 항원 결정인자의 제시화 향상으로 인해, 상기 개체로부터의 관련 세포 집단을 제거시키는 면역 반응이 유발되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견이 본 발명에 이용되어 몇몇 유용한 치료학적 목적을 달성해주는데, 이들 목적 중의 많은 목적이 개체로부터의 바람직하지 못한 세포 집단을 제거하는 것이다.
본 발명의 한 국면은 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자이다(올리고누클레오티드 CTCGGTACCTACTGG가 특정하게 제외된다). 이러한 Ii의 특이적 조절인자를 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포에 전달하면, 상기 세포의 MHC 클래스 II 분자가 결합되는 항원 결정인자의 범위와 선택이 변화됨으로써 상기 세포의 항원 제시화가 변화된다. 몇몇 조성물이 Ii의 특이적 조절인자로서 작용하며 이들 각각은 이들의 작용 기전에 의해 분류될 수 있다.
한 양태에 있어서, Ii의 특이적 조절인자는 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자와의 듀플렉스 분자 형성을 통하여 작용한다. 이러한 듀플렉스 분자의 형성은 번역 수준에서 Ii 단백질 합성을 억제시킨다. 상기 특이적 조절인자는 누클레오티드염기를 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성에 의해 Ii RNA의 다른 염기와 결합시키는 방식으로 공중합체 주쇄 상에서 적당하게 간격을 둔 누클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 듀플렉스 분자의 형성과 연관된 Ii RNA 서열은 단백질 코딩 세그먼트(엑손), 개재 세그먼트(인트론), 엑손과 인트론 간의 중첩부(스플라이스 부위), 단백질 번역을 위한 개시 부위(AUG 부위), AUG 부위에 대한 상단(예를 들면, CAP 부위, 또는 기타 서열-특이적 조절 부위), 또는 코딩 세그먼트로부터의 하단(3' 폴리아데닐화 서열-특이적 조절 부위내)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
2가지 일반적인 유형의 특이적 조절인자를 사용하여 Ii RNA와의 듀플렉스 분자를 형성시킬 수 있다. 첫 번째 유형은 10 내지 50개의 누클레오티드 염기를 함유하는 화학적으로 합성된 공중합체이다. 이러한 공중합체는 안티센스 서열로서 공지되어 있기도 하는, RNA 분자의 표적화 부분에 상보적인 누클레오티드 염기 서열을 함유한다. 이러한 공중합체의 한 예가 안티센스 올리고누클레오티드이다. 공중합체는 두 기전에 의해 RNA로부터의 단백질 번역을 억제시킨다. 한 방법은 리보솜, 스플라이스오솜(spliceosome), 또는 RNA 성숙 또는 번역에 필수적인 기타 인자와 상호작용해야만 하는 RNA의 특정 부분으로의 접근을 차단하는 것이다. 두 번째 방법은 DNA와 하이브리드화되는 RNA의 서열을 절단시키는 효소, 즉, 리보누클레아제 H를 향상시키는 것과 연관이 있다. 따라서, DNA 또는 RNA형 공중합체를 RNA 중의 상응하는 세그먼트와 결합시키면, 이러한 공중합체 결합 부위에서 RNA가 절단된다.
상기 공중합체는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 표적 RNA와 하이브리드화된다. 공중합체의 서열은 표적 RNA의 상보 서열에 의해 규정된다. 표적 RNA의 6개 이상의 상보적 누클레오티드에 걸쳐 있는 누클레오티드 서열 길이를 갖는 공중합체를 통상 화학적으로 합성할 수 있는데, 12 내지 25개가 가장 통상적이다. 통계적으로, 특정 세포의 모든 RNA의 집단 내에서는 약 15개 누클레오티드의 서열이 독특한데, 이로써 특정한 어떠한 RNA가 고수준의 특이성으로 표적화될 수 있다. RNA에 대한 결합이 또한 매우 안정한데, 20개 염기쌍을 포함하는 공중합체의 경우 Kd 값은 대략 10-17M이다.
몇몇 경우에 있어서, 배양물 중의 세포는 유용한 효과를 성취하기에 충분한 양으로 공중합체를 자발적으로 흡수한다. 이러한 흡수는 생화학적 에너지와 특정한 세포 표면 단백질의 참여를 필요로 하는 능동적인 과정인 것으로 보인다. 흡수는 또한 세포 흡수 작용에 의해 일어날 수 있다. 이러한 경로는 공중합체를 함유하는 고장성(hypertonic) 매질에서 세포를 인큐베이팅한 다음, 이 세포를 약간 저장성(hypotonic)인 매질에 재현탁시켜 세포내 세포흡수성 소포의 파열을 유도함으로써 향상시킬 수 있다. 기타 경우에 있어서는, 지질 또는 리포솜을 사용하거나, 일렉트로포레이션시키거나, 또는 스트렙토라이신 O 처리에 의해서 세포막을 침투 가능하게함으로써 흡수를 촉진시킬 수 있다. 생체내 세포는 종종, 배양 세포보다 더 용이하게 공중합체를 흡수한다. 일렉트로포레이션에 의한 공중합체의 세포 흡수에 최적인 조건이 하기 실시예 2에 나타나 있다.
표적 RNA의 잠재적 부위는 단백질의 작용성 복합체의 결합을 위해 개열(open)된 부위이며, 그 밖의 부가의 부위가 공중합체 결합을 위해 개열된다. 이러한 부위는 DNA와 하이브리드화되는 RNA를 절단시키는 효소인 리보누클레아제 H(RNase H)를 사용하여 동정할 수 있다. 단일 또는 혼합물 형태의 DNA 올리고누클레오티드를 리보누클레아제 H의 존재하에 5'-방사성인-표지된 RNA에 가함으로써, 이러한 RNA를 겔 전기영동시키고 자동방사선 사진술을 수행한 후에, 올리고누클레오티드와 기타 공중합체가 하이브리드화되는 RNA 상의 부위를 동정한다. Ii 안티센스 올리고누클레오티드를 이용한 상기 실험이 실시예 1에 제시되어 있다. 본 발명에서 RNase H 절단을 위해 대부분 개열된 것으로 밝혀진 Ii RNA 중의 부위는 AUG 개시 코돈의 영역 및 프레-mRNA 내의 첫 번째 스프라이스 부위의 영역이다.
본 발명에 관한 용어 "올리고누클레오티드"는 천연의 염기 및 포스포디에스테르 연결에 의해 결합된 펜토푸라노실 당으로 형성된 누클레오티드 단위를 포함하는 폴리누클레오티드를 지칭한다. 용어 "공중합체"에는 올리고누클레오티드, 및 또한 올리고누클레오티드의 천연이 아니거나 변형된 아단위로부터 형성된 구조적으로 관련된 분자가 포함된다. 이들 변형은 누클레오티드의 염기 부분, 누클레오티드의 당 부분 또는 누클레오티드간 연결 그룹 상에서 이루어진다. 천연 올리고누클레오티드의 당 및 포스페이트 주쇄가 종종, 부가의 연결 그룹으로 치환되어 다음에 보다 상세히 논의되는 공중합체가 생성되기도 한다.
이러한 올리고누클레오티드 변형 및 이로 인한 특징들은 당해 분야의 숙련인에게 용이하게 이용 가능하다. 변형의 예가 미국 특허 제4,469,863호(1984); 미국 특허 제5,216,141호(1993); 미국 특허 제5,264,564호(1993); 미국 특허 제5,514,786호(1996); 미국 특허 제5,587,300호(1996); 미국 특허 제5,587,469호(1996); 미국 특허 제5,602,240호(1997); 미국 특허 제5,610,289호(1997); 미국 특허 제5,614,617호(1997); 미국 특허 제5,623,065호(1997); 미국 특허 제5,623,070호(1997); 미국 특허 제5,700,922호(1997); 및 미국 특허 제5,726,297호(1998)[이들 명세서가 본원에 참조문헌으로 통합된다]에 제시되어 있다.
상보적 RNA와 하이브리드화되는 올리고누클레오티드의 능력은 화학적 변형에 매우 관용적이다. 따라서, 많은 상이한 작용성 공중합체가 가능하다. 특히, 당 포스페이트 주쇄는 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 능력을 상실하지 않고서도 광범위하게 변형시킬 수 있다. 정의하자면, 누클레오티드는 당, 질소 헤테로사이클 및 포스페이트 잔기를 포함한다. 당이나 포스페이트 그룹, 또는 이들 둘 다가 결여되어 있는 올리고누클레오티드의 몇몇 합성 유사체는 여전히 안티센스 올리고누클레오티드와 동일한 방식으로 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 하이브리드화될 수 있으며, 동일한 목적에 사용될 수 있다. 누클레오티드 염기를 함유하는 이들 공중합체는 RNA와 하이브리드화하는데 있어서 올리고누클레오티드의 작용성 등가물이다. 안티센서 적용을 위해 이들의 특성을 변화시키고 개선시킨, 올리고누클레오티드에 대한 몇몇 변형체가 다음에 요약되어 있다:
1. 포스페이트의 비-브릿징 산소 원자 중의 하나를 황[참조: Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083(1988)], 셀레늄[참조: Mori et al., Nucleic Acids Res. 17: 8207-8219(1989)] 또는 치환된 붕소[참조: Porter et al., Nucleic Acids Res. 25: 1611-1617(1997)]로 대체하여 음으로 하전된 유사체를 수득한다.
2. 비-브릿징 산소 원자 둘 다를 황으로 대체한다[참조: Vaughn et al., Nucleic Acids Res. 24: 4558-4564(1996)].
3. 비-브릿징 산소 원자 중의 하나를 에스테르화하거나, 또는 메틸 또는 치환된 질소 원자로 대체하여 하전되지 않은 포스포트리에스테르[참조: Hayakawa et al., J. Org. Chem. 60: 925-930(1995); Iyer et al., Tetrahedron 52: 14419-14436(1996); Zhang et al., Bioorg. Medicinal. Chem. Letter 6: 1911-1916(1996)], 포스포네이트[참조: Sarin et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 85: 7448-7451(1988)] 또는 포스포르아미데이트[참조: Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083(1988)]를 수득한다.
4. 2개의 브릿징 산소 원자를 상이한 변경 및 조합으로 황 또는 질소로 대체시킨다[참조: Gryaznov et al., Nucleic Acids Res. 24: 1508-1514(1996); Goodchild, Bioconjugate Chem. 1: 165-187(1990)].
5. 상기 치환들을 조합한다(예를 들어, 메틸포스포노티오에이트를 생성시키기 위함)[참조: Padmapriya & Agrawal, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 3: 761-764(1993)].
6. 누클레오시드간 포스페이트 그룹을, 인을 함유하지 않고 하전되지 않은 기타 배열의 원자로 대체한다[참조: Sanghvi & Cook, Carbohydrates: synthetic methods and applications in antisense therapeutics. An overview. Chap. 1. In: Carbohydrate Modifications in Antisense Research. (:Sanghvi, Cook)(ACS Symposium Series, 580). American Chemical Society, Washington, DC 1-22(1995); De Mesmaeker et al., Account. Chem. Res. 28: 366-374(1995); Kiely, Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344(1994)].
7. 당은 리보스 또는 2'-데옥시리보스이다. 리보스 중의 2'-하이드록실 그룹을 알킬화시키거나, 또는 할로겐, 아미노 또는 탄소 치환체[참조: Kiely, Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344(1994); De Mesmaeker et al., Account. Chem. Res. 28: 366-374(1995); Sanghvi & Cook, Carbohydrates: synthetic methods and applications in antisense therapeutics. An overview. Chap. 1. In: Carbohydrate Modifications in Antisense Research. (:Sanghvi, Cook)(ACS Symposium Series, 580). American Chemical Society, Washington, DC 1-22(1995); Freier & Altmann, Nucleic Acids Res. 25: 4429-4443(1997)], 또는 메르캅토[참조: Hamm & Piccirilli, J. Org. Chem. 62: 3415-3420(1997)]로 대체시킨다.
8. 당 환 주변의 입체 화학을 1' 위치에서 변화시켜 α-누클레오시드 시리즈를 수득하거나[참조: Lavignon et al., Antisense Research and Development 2: 315-324(1992)], 2'-위치에서 변화시켜 아라비노스 시리즈를 수득하거나, 또는 3'-위치에서 변화시켜 자일로스 시리즈를 수득한다[참조: Seela et al., Helv. Chim. Acta. 79: 1451-1461(1996)].
9. 당은 푸라노실 또는 피라노실[참조: Pitsch et al., Helv. Chim. Acta. 78: 1621-1635(1995)], 펜토스 또는 헥소스[참조: Herdewijn, Liebigs Annalen 1996: 1337-1348(1996)]이다.
10. C3'-C5' 위치를 가로질러 두 번째 환을 융합시키거나 당과 염기 사이를 융합시킴으로써, 리보푸라노실 환을 보다 강성을 만들어 하이브리드화를 개선시킨다[참조: Tarkoy et al., Helv. Chim. Acta. 77: 716-744(1994); Herdewijn, Liebigs Annalen 1996: 1337-1348(1996)].
11. 누클레오티드가 3'-5'(정상적임) 또는 2'-5'로 연결시킨다[참조: Maran et al., Science 265: 789-792(1994)].
12. 당을 모르폴린으로 대체시킨다[참조: Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug D. 7: 63-70(1997)].
13. 당 포스페이트 주쇄를 펩티드 주쇄로 대체하여 "펩티드 핵산"(pna)을 수득한다[참조: Egholm et al., Nature 365: 566-568(1993)].
현재에는, 다음 변형 서브세트가 가장 통상적으로 사용되고 있다:
당은 2'-데옥시리보스 또는 2'-O-메틸 리보스[또는 2'-O-알릴 리보스 또는 2'-O-(2-메톡시)에틸 리보스]이고 포스페이트 그룹은 다음 중의 하나이다:
1. 변형되지 않은 포스포디에스테르
2. 황(포스포로티오에이트), 메틸(메틸포스포네이트) 또는 치환된 질소(포스포르아미데이트)로 대체된 비-브릿징 산소를 갖는 것
3. NH로 대체된(포스포르아미데이트) C3'에 브릿징되는 산소 원자를 갖는 것.
올리고누클레오티드 등가물 중에서, 펩티드 핵산 및 모르폴리노 유도체가 효과적인 공중합체로서 가장 통상적으로 사용된다. 피롤-이미다졸 폴리아미드를 사용할 수도 있다[참조: Gottesfeld, J.M., Nature 387: 202-205(1997)].
각 변형은 상이한 특성을 지니고 있으며, 각종 변형을 단일 올리고누클레오티드 쇄에서 조합하여 목적하는 특성을 지닌 공중합체를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 리보누클레아제 H를 활성화시키는 포스포디에스테르 또는 포스포티오에이트 연결물의 중앙 블록을, 엑소누클레아제에 대해 보다 내성인 플랭킹 서열과 합할 수 있다(미국 특허 제5,491,133호(1996)).
공중합체의 염기를 변형시킬 수 있는데, 단 이것이 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 방해하지 말아야 한다. 이러한 변형을 통상적으로 이용하여 하이브리드 안정성을 증가시킨다. 예로는 C 또는 U 및 T를 각각 대체시키기 위한 5-치환된 시토신 또는 우라실, 특히 5-프로피닐 시토신 및 5-프로피닐 우라실, 또는 A를 대체시키기 위한 2,6-디아미노퓨린이 있다[참조: Freier & Altmann, Nucleic Acids Res. 25: 4429-4443(1997)].
mRNA의 2차 및 3차 구조로 인해, 상기 분자의 몇몇 부분은 공중합체 하이브리드화를 위한 접근이 가능하지 않거나 이에 이용될 수 없다. 단백질 결합에 이용 가능한 RNA 부위가 공중합체 결합을 위해 더 접근 가능할 것이다. 이에는 리보솜 어셈블리가 일어나는 5'-캡 및 AUG 개시 코돈, 프레-mRNA 내의 스플라이스 부위 및 폴리아데닐화 시그널이 포함된다[참조: Goodchild et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 85: 5507-5511(1988); Dominski & Kole, Mol. Cell. Biol. 14: 7445-7454(1994)]. 세포-무함유 번역 연구에서는, mRNA의 5'-캡 및 AUG 개시 코돈이 특히 유효한 부위이고, 이러한 캡과 하이브리드화되는 올리고누클레오티드가 리보솜의 결합과 폴리솜의 어셈블리를 방해한다는 것이 밝혀졌다[참조: Goodchild et al., Arch. Biochem. Biophys. 263: 401-409(1988)].
다음의 예시 부분의 실시예 1 및 3에 상세하게 설명된 초기 연구에서는, AUG 개시 인자 영역에 상보적인 서열번호 40(표 1), 및 Ii mRNA 내의 첫 번째 스플라이스 공여체 부위에 상보적인 서열번호 32에 열거된 공중합체가 하이브리드화 및 Ii 억제에서 가장 큰 활성을 나타낸 것으로 입증되었다.
공중합체 결합에 이용 가능한 영역의 동정시, 부가의 중첩 공중합체를 합성하여, 이들 영역을 표적으로 하는데 가장 활성인 서열을 발견한다(표 5). 이들 공중합체를 앞서와 같이 검정하고, Ii 억제에 있어서의 활성(표 6A) 뿐만 아니라 세포독성(표 6B)에 대해 조사하였다. 이들 기준에 의해 가장 활성인 화합물, 서열번호 54는 AUG 개시인자에 상보적이고 또한, MHC 클래스 II 발현, 세포의 회수 및 생존성에 대해 최소의 효과를 나타낸다. RNA 분자의 스플라이스 부위를 경계짓는 엑손의 일정 부분에 상보적인 서열, 보다 특정하게는 제1 스플라이스 공여체 영역 내의 서열에 상보적인 서열에 상응하는, 서열번호 62에 열거된 공중합체가 또한 강력한 활성을 나타낸다.
다음 예시 부분에 제시된 바와 같이, 특이적 공중합체는 RNase H 검정을 이용하여 나타낸 바와 같이 Ii RNA의 특이적 세그먼트와 하이브리드화되고, 면역형광성 FACS 검정을 이용하여 나타낸 바와 같이 Ii 단백질 발현을 억제시킨다. 번역 개시 부위에 상보적인 공중합체 중에서, 서열번호 54, 서열번호 53, 서열번호 52, 서열번호 40, 서열번호 55가 RNase H 검정에 유효하고, Ii 발현 억제에 특히 활성을 나타낸다. 스플라이스 부위를 경계짓는 엑손의 일정 부분에 상보적인 공중합체, 즉 서열번호 32 및 서열번호 62가 RNase H 검정에 유효하고, 또한 Ii 발현 억제에 또한 활성을 나타낸다. 스플라이스 부위의 엑손 및 인트론 경계 내의 영역과 결합되는 부가의 공중합체는 인트론 스플라이싱을 억제하고, 그로 인해서, Ii 단백질 발현을 억제한다. 구체적으로 언급하면, 제1 엑손의 3' 말단의 일정 부분 및 제1 인트론의 5' 말단의 일정 부분에 상보적인 올리고누클레오티드는 인트론 스플라이싱을 억제하고, 그로 인해서, Ii 단백질 발현을 억제한다. 종결 코돈의 영역 3'에 상보적인 올리고누클레오티드 중에서, 예를 들면, 서열번호 64가 Ii 단백질 발현을 억제한다. 개시 코돈의 5' 영역에 상보적인 올리고누클레오티드 중에서, 예를 들면, 서열번호 48이 Ii 단백질 발현을 억제한다. CLIP 펩티드를 엔코딩하는 영역에 상보적인 올리고누클레오티드 중에서, 예를 들면, 서열번호 11이 Ii 단백질 발현을 억제한다.
상기 언급된 주쇄 변형 이외에도, 기타 그룹을 공중합체 상의 부위에 접합시켜 이의 활성을 다양한 방식으로 향상시킬 수 있다. 이들 그룹은 작용상 카테고리로 나눈다. 알킬화제 및 기타 활성 종과 같은 화학적 그룹을 공중합체의 말단 또는 내부 부위에서 접합시켜, 이러한 공중합체를 하이브리드화된 RNA 분자에 가교결합시킨다. 기타 화학적 그룹을 이와 같이 접합시켜 하이브리드화된 RNA 분자의 절단을 촉매시킨다(예: 킬레이트제). 공중합체 내로 유전공학적으로 처리된 리보자임은 또한, Ii RNA의 절단을 촉진시킨다. 공중합체와 접합되는 또 다른 카테고리의 화학적 그룹을 RNA 분자의 누클레오티드 염기 내로 삽입하여, 상기 공중합체와 Ii RNA의 하이브리드화를 안정화시킨다. 또한, 기타 접합된 화학적 잔기는 공중합체의 세포성 흡수를 향상시킨다(예: 폴리라이신). 또한, 기타 잔기는 특정 조직 또는 세포 타입에 대한 공중합체의 직접적인 전달 또는 흡수를 향상시킨다. 이들 상이한 그룹은 공중합체의 말단 하이드록실 그룹에 접합되거나, 또는 내부 포스페이트에 접합된다. 부가적으로, 이들은 말단 또는 내부 당 또는 염기 잔기에 부착된 링커에 접합되거나, 또는 쇄 내의 누클레오티드 사이에 삽입된 링커에 접합될 수 있다[참조: Goodchild, Bioconjugate Chem. 1: 165-187(1990)].
가교 결합 및 알킬화 그룹에는 다음이 포함된다:
1. 질소 머스타드 유도체[참조: Knorre & Vlassov, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 32: 291-320(1995)].
2. 디아조메탄 유도체[참조: Nakatani et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 7626-7635(1997)].
3. 스페이서 쇄를 통하여 누클레오시드 염기 상의 각종 부위에 접합된 요오도아세트아미도 또는 브로모아세트아미도 작용기[참조: Meyer et al., J. Amer. Chem. Soc. 111: 8517-8519(1989); Kido et al., Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344(1992); Coleman & Pires, Nucleic Acids Res. 25: 4771-4777(1997)].
4. 페나진 디-N-옥사이드[참조: Nagai & Hecht, J. Biol. Chem. 266: 23994-24002(1991)].
5. 광활성화되거나[참조: Chatterjee & Rokita, J. Amer. Chem. Soc. 112: 6397-6399(1990)], 또는 사이토크롬 c 리덕타제에 의해 퀴논 메티드로 활성화되는 나프토퀴논[참조: Chatterjee & Rokita, J. Amer. Chem. Soc. 113: 5116-5117(1991)].
6. 광활성화를 수행한 후의 팔라듐(II)-코프로포르피린[참조: Fedorova et al., FEBS Letters 259: 335-337(1990)] 및 포르피린[참조: Le Doan et al., Bioconjugate Chem. 1: 108-113(1990)].
7. 시토신 대신 사용될 수 있는 5-메틸-N4,N4-에타노시토신[참조: Webb & Matteucci, Nucleic Acids Res. 14: 7661-7674(1986)].
8. 광활성화되는 프소랄렌[참조: Bhan & Miller, Bioconjugate Chem. 1: 82-88(1990)].
하이브리드 결합된 RNA 쇄의 가수분해를 촉매시키는 공중합체에 접합된 그룹에는 다음이 포함된다:
1. 스타필로코커스성 누클레아제[참조: Zuckermann et al., J. Amer. Chem. Soc. 110: 1614-1615(1988)].
2. 이미다졸 및 1급 아민[참조: Ushijima et al., Bba. Gen. Subjects 1379: 217-223(1998)] 또는 디아민[참조: Reynolds et al., Nucleic Acids Res. 24: 760-765(1996)].
3. 히스타민[참조: Hovinen et al., J. Org. Chem. 60: 2205-2209(1995)].
공중합체에 접합된 킬레이트 그룹은 RNA 가수분해의 금속-증진된 촉매 작용을 증진시킨다. 몇몇 예에는 다음이 포함된다:
1. 이미노디아세테이트[참조: Matsumura et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994: 2019-2020(1994)].
2. 페난트롤린[참조: Perrin et al., Biochemistry 33: 3848-3854(1994)].
3. 2,2'-비피리딘 및 2,2':6',2"-테르피리딘[참조: Bashkin et al., J. Org. Chem. 61: 2314-2321(1996)].
4. 텍사피린[참조: Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 2293-2294(1997)].
5. EDTA[참조: Joseph et al., Science 278: 1093-1098(1997)].
6. 포르피린[참조: Sigma, Biochemmistry 29: 9097-9105(1990)].
7. 블레오마이신[참조: Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068(1994)].
8. 2,6-피리딘디카복실레이트[참조: Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068(1994)].
9. 2,2'-디포실릴아민[참조: Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068(1994)].
해머헤드(hammerhead) 및 헤어핀 리보자임으로부터의 촉매적으로 활성인 부위를 공중합체 내로 유전공학적으로 처리하여, 상보적 Ii RNA의 절단을 촉매시키는 인공적 리보자임을 생성시킨다[참조: Santoro and Joyce, A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme 94: 4262-4266(1997)]. 사실상, 수 많은 리보자임은 RNA 프로세싱 동안 RNA의 부위-특이적 절단에 역할을 한다. 이들은 보다 덜 특징 확인된 형태 이외에도, 그룹 I, 그룹 II, 해머헤드, 헤어핀 및 HDV 리보자임을 포함한, 몇몇 유형으로 나눌 수 있다[참조: Cech & Bass, Annu. Rev. Biochem. 55: 599-629(1986)]. 촉매적으로 활성인 안티센스 올리고누클레오티드의 개발이 문헌[참조: Christoffersen & Marr, J. Med. Chem. 38: 2023-2037(1995)]에서 고찰되었다. 또 다른 한편, 동일한 원리를 사용하여 리보자임을 역방향 유전자 구성물 내로 유전공학적으로 처리할 수 있는데, 이는 다음에 상세히 논의된다.
공중합체에 접합된 삽입성 그룹의 예에는 다음이 포함된다:
1. 형광성 삽입인자[참조: Endo & Komiyama, J. Org. Chem. 61: 1994-2000(1996)].
2. 아크리딘[참조: Lancelot et al., Biochemistry 24: 2521-2529(1985); Asseline et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 81: 3297-3301(1984); Asseline et al., EMBO J. 3: 795-800(1984); Asseline et al., J. Biol. Chem. 260: 8936-8941(1985)].
3. 안트라퀴논[참조: Deshmukh et al., Bioconjugate Chem. 6: 578-586(1995)].
4. 다우노루비신[참조: Timofeev et al., Tetrahedron. Lett. 37: 8467-8470(1996)].
5. 메티듐[참조: Timofeev et al., Tetrahedron. Lett. 37: 8467-8470(1996)].
6. 옥사졸 옐로우[참조: Ishiguro et al., Nucleic Acids Res. 24: 4992-4997(1996)].
7. 페난트린[참조: Puri et al., Tetrahedron 53: 10409-10432(1997)].
8. 피렌[참조: Mann et al., Bioconjugate Chem. 3: 554-558(1992)].
공중합체의 세포성 흡수를 증진시키기 위해 접합된 그룹에는 다음이 포함된 다:
1. 생물학적 막을 통하여 전좌되는 융합유도(fusogenic) 및 기타 펩티드[참조: Bongartz et al., Nucleic Acids Res. 22: 4681-4688(1994); Allinquant et al., J. Cell. Biol. 128: 919-927(1995); Chaloin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243: 601-608(1998)].
2. 폴리라이신[참조: Degols et al., Antisense Research and Development 2: 293-301(1992)].
3. 콜레스테롤 및 콜산[참조: Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86(1994)].
Ii의 특이적 조절인자의 공중합체 또는 기타 형태의 세포성 흡수를 증가시키기 위해 사용된 복합체, 보조제 및 제제에는 다음이 포함된다:
1. 리포솜[참조: Zelphati & Szoka, Pharmaceut. Res. 13: 1367-1372(1996); Juliano & Akhtar, Antisense Research and Development 2: 165-176(1992)].
2. 불활성화 센다이(sendai) 바이러스 또는 기타 융합 단백질을 함유하는 리포솜[참조: Kitajima et al., J. Biol. Chem. 272: 27099-27106(1997); Morishita et al., Gene 149: 13-19(1994); Kitajima et al., Arthritis. Rhem. 40: 2118-2127(1997)].
3. 사이클로덱스트린[참조: Zhao et al., Antisense. Res. Dev. 5: 185-192(1995)].
4. 융합유도 펩티드[참조: Hughes et al., Pharmaceut. Res. 13: 404- 410(1996); Morris et al., Nucleic Acids Res. 25: 2730-2736(1997)].
5. 양이온성 지질[참조: Zelphati & Szoka, Pharmaceut. Res. 13: 1367-1372(1996); Capaccioli et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 818-825(1993)].
6. 핵산과 결합되는 특정 부분 및 세포 표면 상에 광범위하게 발현된 인테그린 수용체와 결합되는 또 다른 부분을 포함하는 펩티드[참조: Bachmann et al., J. Molecular Med. Imm. 76: 126-132(1998)].
7. 스트렙토라이신-O[참조: Giles et al., Nucleic Acids Res. 26: 1567-1575(1998)].
8. 폴리에틸렌이민[참조: Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301(1995)]
9. 양이온성 인지질[참조: Le Bolc'h et al., Tetrahedron Lett. 36: 6681-6684(1995)].
10. 덴드리머[참조: Hughes et al., Pharmaceut. Res. 13: 404-410(1996)].
11. 양이온성 안면 양친매성 물질[참조: Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1585-1590(1996)].
특이적 세포 타입 또는 조직 내로의 선택적인 흡수를 증진시키는, 공중합체에 접합된 그룹에는 다음이 포함된다:
1. 당단백질을 내재화시키는 막 렉틴을 갖는 마크로파아지 및 단구로의 흡수를 지시해주는 네오글리코프로테인[참조: Bonfils et al., Nucleic Acids Res. 20: 4621-4629(1992)].
2. 핵 수송 시그날로서 작용하는 펩티드[참조: Delatorre et al., Tetrahedron Lett. 35: 2733-2736(1994)].
3. 호중구를 표적으로 하는 콜레스테롤, 콜산 및 테트라펩티드, fMFLY[참조: Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86(1994)].
4. 만노스 특이적 표면 렉틴을 갖는 마크로파아지를 표적으로 하는 만노스[참조: Akhtar et al., Tetrahedron Lett. 36: 7333-7336(1995)]
5. 간을 표적으로 하는 아시알로글리코프로테인[참조: Rajur et al., Bioconjugate Chemistry 8: 935-940(1997)].
6. 인슐린 성장 인자 1 수용체를 발현하는 세포에 의한 흡수를 증가시키기 위한 인슐린-유사 성장 인자 1의 펩티드 유사체[참조: Basu & Wickstrom, Bioconjugate Chemistry 8: 481-488(1997)].
7. 인터루킨-1β에 대한 수용체를 발현하는 세포에 의한 흡수를 증가시키기 위한 인터루킨-1β.
특이적 세포 또는 조직 유형에 대한 공중합체의 흡수를 지시하기 위해 사용된 복합체, 보조제 및 제형에는 다음이 포함된다:
1. 간 특이적 아시알로글리코프로테인 수용체를 표적으로 하는 아시알로글리코프로테인 또는 아시알로-오로소뮤코이드에 접합된 폴리라이신과 복합체를 형성한 올리고누클레오티드[참조: Bunnell et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 18: 559-569(1992); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 267: 12436-12439(1992); Lu et al., J. Nucl. Med. 35: 269-275(1994)].
2. 트랜스페린 수용체를 고수준으로 발현하는 세포를 표적으로 하는 트랜스페린에 접합된 폴리라이신과 복합체를 형성한 올리고누클레오티드[참조: Citro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7031-7035(1992)].
3. 바이타민 올리고누클레오티드에 대한 수용체를 과발현하는, 신속하게 분열되는 세포를 표적으로 하는 폴산에 접합된 폴리라이신과 복합체를 형성한 올리고누클레오티드[참조: Citro et al., British J. of Cancer 69: 463-467(1994); Leopold et al., Blood 85: 2162-2170(1995)].
4. 만노스 특이적 표면 렉틴을 갖는 마크로파아지 내로의 흡수를 지시하는 바이오티닐화된 올리고누클레오티드와 결합되는 스트렙트아비딘과 접합된 만노스[참조: Bonfils et al., Bioconjugate Chem. 3: 277-284(1992)].
5. 간세포를 표적으로 하는 갈락토실화된 폴리에틸렌이민[참조: Zanta et al., Bioconjugate Chem. 8: 839-844(1997)].
바람직한 양태에서는, 상기 공중합체가, 이러한 공중합체의 약리학적 특성 또는 독성 프로필을 개선시키기 위해, 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 화학적 잔기와 접합된다. 효과를 발휘할 수 있는 약리학적 특성으로는 생물학적 이용 효능, 안정성, 혈청 및/또는 생리학적으로 관련된 구획에서의 반감기, 독성 및 유해하거나 유해하지 않을 수 있는 경쟁적 생물학적 효과가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 공중합체의 물리적 특성은 친지성 또는 하전된 잔기, 예를 들면, 콜레스테롤을 접합시킴으로써 변화된다[참조: Ojwang et al., J. Acq. Immun. Defic. Syndrome 7: 560-570(1994)]. 이러한 변화는 공중합체의 생물학적 특성에 영향을 미친다[참조: Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86(1994); Demirhan et al., Virus Genes 9: 113-119(1995)]. 또 다른 예는 바이오틴과 접합된 다음 스트렙트아비딘과 결합되는 공중합체이다. 이 생성물은 접합되지 않은 올리고누클레오티드보다 10배 이상 느리게 신장에 의해 제거되어 전신 제거율을 50% 감소시키고 보다 많은 공중합체를 간에 재유도시킨다[참조: Kang et al., Drug Metab. Dispos. 23: 55-59(1995)].
번역을 억제하기 위해 Ii RNA와 듀플렉스 분자를 형성하는 다른 유형의 특이적 조절인자는 발현 가능한 역방향 유전자 구성물이다. 본 발명에서는, 역방향 유전자 구성물이 발현 가능한 DNA 구성물이고, 이의 발현은 야생형 Ii를 엔코딩하는 RNA 분자의 일정 세그먼트에 상보적인 RNA 분자의 합성 또는 번역을 유도한다. Ii 생산 세포에서 공동 발현된 경우, 이러한 역방향 유전자 구성물의 RNA 생성물을, Ii을 엔코딩하는 RNA와 하이브리드화시킴으로써 듀플렉스 구조를 형성할 수 있다. 이러한 듀플렉스 구조의 형성은 Ii를 엔코딩하는 mRNA의 번역을 억제함으로써, 세포 중에서의 Ii 단백질 수준을 감소시킨다.
바람직하게는, 상기 역방향 유전자 구성물은 이러한 역방향 유전자 구성물이 발현하게 될 세포 타입에 상응하는 유기체로부터 Ii을 엔코딩하는 cDNA 또는 이의 단편을 사용하여 합성한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 일반적으로 포유류 시스템에 적용 가능하다. Ii 단백질을 엔코딩하는 cDNA가 각종 포유류 시스템으로부터 분리된 mRNA로부터 생성되었으며, 이러한 핵산 서열이 결정되었다[참조: Singer et al., EMBO J. 3: 873-877(1984); Strubin et al., EMBO J. 3: 869-872(1984); Henkes et al., Nucl. Acids Res. 16: 11822(1988)]. Ii을 엔코딩하는 포유류 유전자가 고도로 보존된 것으로 결정되었다. 예를 들면, 뮤린 및 사람 Ii를 엔코딩하는 cDNA 서열이 대략 85%의 상동율을 나타내는 것으로 결정되었다. 뮤린 서열과 랫트 서열 간의 보존율은 90% 초과이다[참조: Henkes et al., Nucl. Acids Res. 16: 11822(1988)]. 포유류 Ii 유전자들 간의 높은 보존율 측면에서 보면, 실제적으로 관심있는 어떠한 포유류 시스템으로부터의 cDNA 라이브러리도 Ii 프로브(예를 들면, 사람 또는 뮤린 기원)로 스크리닝하여 상응하는 Ii 유전자를 분리시킬 수 있었다.
역방향 유전자 구성물의 작제에 사용하기 위한 발현 벡터 배경의 선택은 발현이 요망되는 세포 타입에 의해 영향을 받는다. 각종의 적당한 벡터가 이용 가능하고, 당해 분야의 숙련인은 과도한 실험을 할 필요없이 입수 가능한 많은 것들로부터 적당한 벡터를 선택할 수 있을 것이다. 유사하게, 효율적인 발현에 필요한 조절성 시그날은 발현이 요망되는 세포 타입을 기준으로 하여 선택한다. 이러한 조절성 시그날에 대한 요구 사항은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이러한 시그날의 무제한적 공급원이 일반적으로 공지되어 있다.
바람직한 양태에서는, 상기 역방향 유전자 구성물이 바이러스성 발현 벡터로부터 발현된다. 이러한 바이러스성 발현 벡터는 포유류 세포 내로의 트랜스펙션을 향상시키는 능력을 특징으로 한다. 상기 벡터에는 MFG 레트로바이러스성 벡터, 기타 레트로바이러스성 벡터, 예를 들면, pLJ, pEm 및 알파SGC 벡터, 및 아데노바이러스성 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 벡터는 소정의 세포 타입에서 고효율의 발현 및 작용을 나타내는 특정한 구성물을 동정하기 위하여 수 많은 역방향 유전자 구성물을 검정 시스템에서 스크리닝해주는 특별한 용도를 지닐 수 있다. 또한, 이러한 벡터는 특정한 세포 타입에 대한 결합 및/또는 이에 의한 흡수를 향상시키는 특징을 지니고 있는 단백질을 발현할 수 있다. 상기 벡터가 또한, 선호될 수 있는데, 이는 이러한 벡터가 일반적인 특성으로서 포유류 세포 내에서, 및/또는 특정한 세포 타입 내에서, 예를 들면, 특정한 기관 또는 조직 클래스의 암으로부터 분리되는 세포 타입에서 역방향 유전자 구성물의 발현을 향상시키는 전사 프로모터를 함유하기 때문이다.
역방향 유전자 구성물은 Ii cDNA 또는 이의 단편을, 야생형 배양과 비교해 볼때 프로모터에 대해 역 배향으로 적합한 발현 벡터 내로 도입함으로써 생성시킬 수 있다. mRNA가, 상보적 분자와 하이브리드화되는 이의 능력을 방해할 수 있는 복합체 2차 구조를 나타내는 것으로 공지되어 있다는 사실에 비추어 볼때, 전장 역방향 유전자 구성물(즉, 이의 전체 길이를 따라 Ii를 엔코딩하는 mRNA에 상보적인 mRNA 분자를 엔코딩하는 역방향 유전자 구성물)이 항상 가장 효율적인 고안은 아니다. Ii 억제를 위해 보다 효율적인 구성물을 개발하기 위해서는, 역방향 유전자 구성물에 사용될 경우에 Ii 합성을 억제하는데 유효한 전장보다 짧은 cDNA 단편을 동정하기 위해 통상적인 실험을 수행하는 것이 종종 필요하다. 이러한 실험의 한 예가 본 출원의 예시 부분에 상세히 설명되어 있다.
전장보다 짧은 구성물을 고안하는데 있어서는, Ii를 엔코딩하는 mRNA의 작용상 중요한 영역을 동정하고, 역방향 유전자 구성물에 의해 엔코딩된 mRNA가 상기 작용상 중요한 영역과 상보적이 되도록 역방향 유전자 구성물을 고안하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들면, 작용상 중요한 영역에는 mRNA의 리보솜 인식과 관계된 영역, 번역 개시 부위, mRNA 스프라이스 연결부 및 폴리아데닐화에 필요한 번역 종결 코돈의 3' 영역이 포함된다.
진핵 세포에서, mRNA로의 초기 리보솜 진입 기전은 원핵 세포에서의 기전과 상이하다. 진핵 세포에서는, 이것이 일반적으로, 번역 개시점으로서 사용되는 5'-대부분 Met-특이화 코돈이다. 진핵성 mRNA의 5' 말단은 5'-5' 피로포스페이트 연결부에서 제1의 변형되지 않은 누클레오티드에 결합된 메틸화된 구아닐레이트 잔기를 포함하는 변형된 말단을 갖는다(종종, 5' 캡으로서 지칭됨). 실험 결과, 예를 들면, 5' 캡이 결여된 mRNA는 효율적으로 번역되지 않은 것으로 입증되었다. 따라서, 진핵 세포에서의 번역 개시는 5' 캡을 인식한 다음 AUG 코돈 주변에 컨센서스 서열을 정위시키는 것을 포함한다. 가까운 단백질 코딩 서열의 리보솜 인식에 대한 컨센서스 서열은 "5'-ACCAUGG-"이다.
1차 전사체 내의 스플라이스 부위의 위치는 게놈성 DNA 서열(상기 1차 전사체를 엔코딩함)을 상응하는 cDNA 서열(프로세싱된 전사체로부터 생성됨)과 비교함으로써 측정할 수 있다. 이러한 비교시 확인된 불연속점은 인트론/엑손 경계를 제시한다. 이러한 경계에 대한 연구는 인트론/엑손 경계에서 적절히 보존된 짧은 컨센서스 서열을 나타내고 또한 피리미딘-풍부한 영역이 3' 스플라이스 부위의 바로 상단에 존재하는 경향을 나타내었다. 또한, 보편적으로 보존된 누클레오티드 염기가 첫 번째 2개(GU) 및 마지막 2개(AG) 인트론 위치에서 발견되었다.
폴리아데닐화는 폴리(A) 시그날인 AAUAAA, 및 폴리 A 부가 부위로부터 하단의 약 30개 누클레오티드를 필요로 한다. 폴리아데닐화는 mRNA를 안정화시킴으로써, 세포 내에서의 이의 반감기를 연장시킨다.
하기 예시 부분에 기재된 실험에서는, 뮤린 세포에서 Ii 발현을 억제하기 위한 역방향 유전자 구성물을 고안하고 시험하였다. 뮤린 Ii 단백질은 215개 아미노산 잔기로 구성된다[참조: Singer et al., EMBO J. 3: 873-877(1984)]. 따라서, 이러한 분자를 엔코딩하는 전장 cDNA는 코딩 서열의 645개 염기쌍으로 구성될 것이다.
하기 실시예에서는, 몇몇 역방향 유전자 구성물을 고안하고 시험하였다. 이들 중의 몇몇은 SaI/CIITA 세포에서 Ii 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. Ii 단백질 발현 억제(세포의 60% 이하)가, 전부는 아니지만 몇몇 mIi 역방향 유전자 구성물에 의해 트랜스펙션체에서 관찰되었다. 서열번호 68, 71, 72, 75, 77, 78 및 79에 열거된 역방향 유전자 구성물이 Ii 단백질 발현을 상당히 억제하였다.
앞서 논의된 바와 같이, 역방향 유전자 구성물을 이용한 단백질 발현의 억제 효율은 상당 부분 표적 mRNA의 2차 구조에 의존적이다. 본원에 기재된 실험은 Ii 단백질이 역방향 유전자 구성물에 의한 발현 억제에 특히 민감하다는 것을 지시해준다. 이러한 결론은 몇몇 역방향 유전자 구성물이 Ii 발현을 상당히 억제시키는 능력을 나타낸다는 사실에 기초한 것이다. 더욱이, 전장 역방향 유전자 구성물의 트렁케이팅된 구성물이 보다 높은 억제를 나타내었다. 이러한 실험 연구가, 포유류 Ii 유전자들 간의 공지된 높은 보존율과 함께, 사람 시스템을 포함한 기타 포유류 시스템에서의 역방향 유전자 구성물 활성을 효과적으로 예시해주는 것으로 간주된다.
또 다른 양태에서는, Ii의 특이적 조절인자가 Ii 유전자와 특이적으로 하이브리드화되는 누클레오티드 염기로 구성된 공중합체이다. 이러한 하이브리드화는 표적 세포의 Ii 유전자의 전사 및/또는 발현 조절을 차단시킨다. DNA의 두 역평행 스트랜드의 누클레오티드 염기의 상보적 왓슨-크릭 염기쌍 형성이 유지되는 경우에는, 하이브리드화가 후그스텐형 염기쌍(Hoogsten pair)의 형성을 통해서 이루어질 수 있다. 또 다른 한편, 치료학적 제제의 누클레오티드 염기쌍 형성은 'D 루프'의 형성을 통하여 세포성 DNA의 한 스트랜드의 누클레오티드 염기 서열과 역평행 방식일 수 있다. 세포에 전달하는데 적절한 공중합체 조성물 및 방법이 상기 언급되어 있다.
또 다른 양태에서는, Ii의 특이적 조절인자는 20 내지 1000달톤의 유기 분자이다. 이러한 유기 분자는, 예를 들면, 표적 세포의 소포체에서, MHC 클래스 II 분자에 대한 내재성 항원 결정인자의 결합을 향상시키는 방식으로 MHC 클래스 II 분자와 Ii 단백질 간의 상호작용을 변화시킴으로써 Ii 단백질 기능을 억제시킨다. 본 발명의 유기 분자의 예에는 펩티드, 펩티드-모사체, 작은 유기 분자가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. Ii의 특이적 조절인자로서 작용하는 유기 분자는, MHC 클래스 II 분자 및 Ii 단백질의 구조에 대한 결정학적 또는 NMR 증거를 근거로 하여 이성적으로 고안하기 위한 프로그램을 통하여 동정된다. 보다 구체적으로 언급하면, Ii 단백질과 MHC 클래스 II 분자 간의 상호작용 부위를 동정하고, 이러한 상호작용 부위에서, 어느 한 단백질의 펩티딜 세그먼트를 모사하는 화합물을 제조한 다음, 이들 대상으로 하여 MHC 클래스 II/Ii 단백질 복합체 형성의 파열에 대해 시험한다. 또 다른 한편, 이러한 작은 유기 분자는 화합물의 조합 라이브러리를 제조하거나, 또는 분류상 다중의 다양한 화학적 그룹을 사용하여 동정한다. 이어서, 상기 화합물을 몇몇 유형의 검정법으로 시험한다. 시험관내 화학적 수준에서는, 특이적 카텝신 및 기타 세포내 프로테아제의 존재 또는 부재하에 Ii 단백질을 MHC 클래스 II α,β단백질로부터 해리시키는 것을 검정한다. 이러한 검정으로부터의 후보 분자를 대상으로 하여, 예를 들면, 트랜스펙션된 유전자 포맷에서 코딩된 달걀 라이소자임으로부터 내재적으로 합성된 항원 결정인자의 제시화 향상에 대해 추가로 시험한다. 이어서, 리드(lead) 화합물을 대상으로 하여, 예를 들면, 다음에 논의된 암 세포 백신 모델에서 종양 면역원성의 유도 향상에 대해 작용성 검정법으로 검정한다.
바람직한 양태에서는, Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자가 약제학적으로 허용되는 담체 내에 제형화된다. 이러한 담체는, 예를 들면, 변성으로부터의 보호, 안정성, 일반적인 물리화학적 수단에 의하고/의하거나 세포 표면 수용체에 대한 특이적 유착에 의한 표적 세포 집단의 표면에 대한 흡착 등에 대해서 바람직한 특성을 지니고 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한, Ii의 특이적 조절인자를 세포 집단에 전달하는 것을 향상시킬 수 있다.
한 양태에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 한 가지 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 보호, 구획화, 또는 표적화 세포 집단으로의 전달 특성을 지니고 있는, 하나 이상의 지질 및/또는 리포폴리사카라이드의 리포솜 또는 소포 제제이다.
또 다른 양태에서는, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 Ii의 특이적 조절인자를 특이적 세포 집단으로 전달하는 것을 향상시켜 준다. 이의 한 예에는 분자의 상호작용이 있는 특정 제형이 있는데, 그 제형에 결합되어 있거나 그 위에 흡착되거나 또는 유착되어 있는 분자, 예를 들면, 리포솜 또는 소포 제제로서, 예를 들면, 표적 세포 상의 상보적 수용체 분자와의 상호작용을 통하여, 표적 세포 집단의 표면에 대한 결합 특성을 지니고 있는 분자의 상호작용을 나타내는 제형이 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자를 도입시킨 세포에 관한 것이다. 상기 언급된 Ii의 특이적 조절인자를 적당한 수용자 세포에 도입하는 것은 각종 방법으로 달성할 수 있다. 사용된 방법은 전달될 특이적 조절인자, 이러한 특이적 조절인자의 제형, 및 수용자 세포에 좌우된다. 이들 세포는 질병 치료에 있어서, 및 상기 세포에 의해 제시된 에피토프로부터 신규한 진단 및 치료용 시약(항원성 펩티드 및 이의 유도체)을 개발하는데 있어서 몇 가지 용도를 지니고 있다.
적당한 수용자 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하거나 MHC 클래스 II 분자를 통하여 항원을 제시하도록 작용하는 세포이다. 이 세포는 천연 상태이거나, 또는 다음에 논의된 하나 이상의 세포를 조작함으로써 생성된 것일 수 있다. MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포는 본원에서 MHC 클래스 II-양성으로서 지칭된다. 상기 요건을 충족시키는 세포가 본원에서 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포로서 지칭된다.
천연의 작용성 항원 제시 세포는 MHC 클래스 II 분자와, MHC 클래스 II 펩티드 결합 부위 내로의 혼입 방식으로 항원성 펩티드의 프로세싱, 트래픽킹, 결합 및 편집에 요구되는 기타 보조 작용기를 발현한다. 또한, 이러한 세포는 세포 표면 상호작용 분자, 예를 들면, B7, CD24, CD40, 인터루킨 수용체, 및 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 항원성 펩티드의 인식시 최적의 생물학적 반응에 요구될 수 있는 인터루킨 및 기타 상기 단백질을 발현한다. 천연 상태가 아닌 경우, 요구된 보조 작용기의 발현은, 인터페론 감마 또는 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자와 같은 사이토킨의 사용을 통하거나 또는 면역 반응의 상기 촉진인자 중의 어느 하나를 사용하는 유전자 트랜스펙션을 통하여, 세포 내에서 유도될 수 있다. 이러한 세포 및 세포성 유도체, 및 이들의 자손이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 한 가지 궁극적인 목적은 MHC 클래스 II 단백질과 연합하여 특이적 항원성 펩티드를 디스플레이하는 세포를 생성시키는 것이다. 따라서, 수용자 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포는 이러한 펩티드를 발현하거나 함유해야만 한다. 바람직한 양태에서는, 이러한 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포가, 항원 제시 기관 및 관련 MHC 클래스 II 분자를 함유하는 세포와, 면역 반응이 요망되는 항원성 펩티드 또는 결정인자를 함유하는 세포 또는 이러한 세포의 유도체와의 융합물로부터 발생된다. 대부분의 경우, 상기 생성물은 전문적인 항원 제시 세포, 예를 들면, 수지상 세포, 마크로파아지, B 림프구 또는 특정의 다능성 세포 클래스와 관심있는 항원성 에피토프를 발현하는 세포와의 융합물이다. 이러한 항원성 에피토프를 발현하는 세포에는, 예를 들면, 악성 세포, 바이러스 감염되거나 형질전환된 세포, 자가면역 반응 유도와 관련된 세포, 및 예를 들면, 항-유전형 네트워크 기전(예를 들면, 류마티스성 관절염에서 병원성 관련된 T 세포 수용체(TCR)를 발현시킴)을 통하여 자가면역 반응을 조절하는 세포가 포함된다. 이러한 융합 생성물은 총제적으로, 생체외에서 신선하게 수득되거나 시험관내에서의 복제된, 이종 세포 제제일 수 있다. 이들은 시험관내에서 상기 융합물로부터 유도된 세포주이거나 이러한 세포주로부터 유도된 클론성 제제일 수 있다.
또 다른 한편, 수용자 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포는, 목적하는 항원성 에피토프를 수반하는 세포로부터의 유전 물질 또는 단백질 유도체를 항원 제시 기관 및 관련 MHC 클래스 II 분자 모두를 천연 상태에서 발현시키는 세포에 도입함으로써 생성된다. 예를 들면, 특정 세포로부터의 폴리아데닐화된 mRNA 제제로부터 cDNA를 합성한다. 이러한 cDNA 제제는 기정 과정에 의해, 항원성 에피토프의 합성이 요망되는 또 다른 세포에 전달된다. 유전자 총 또는 기타 기술을 이용하여 DNA를 전달하는 방법이 이용 가능하고 당해 분야의 숙련인에 의해 성공적으로 적용될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,593,972호(1997); 미국 특허 제5,643,578호(1997); 미국 특허 제5,716,613호(1998); 미국 특허 제5,741,486호(1998)]. 부가적으로, 종양-관련되거나 종양-특이적인 단백질에 대한 유전자, 또는 이러한 단백질에 대한 유전자의 세그먼트를, 미국 특허 제5,627,025호(1997)(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 기재된 바와 같이, 환자의 수지상 세포 또는 또 다른 전문적인 항원 제시 세포 집단에 전달할 수 있다. 이들 방법으로부터 발생된 세포 집단을 미정제 상태의 이종, 세포주 또는 클론성 수준에서 백신으로서 사용할 수 있다.
한 양태에서는, 수용자 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포가 악성 세포이거나, 또는 악성 세포로부터 유도된 성분을 함유하고 있다. 이러한 세포에는 암종 및 기타 위암, 결장 또는 직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 방광암, 췌장암 및 뇌암, 및 또한 흑색종, 백혈병 및 림프종 세포가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 양태에서는, 상기 세포가, 예를 들면, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자 맥락에서, 세포 표면 수용체 내에서 유전형 결정인자를 발현한다. 이러한 유전형 결정인자는, 예를 들면, 면역글로불린 또는 T 세포 수용체로부터 유도할 수 있고, MHC 분자에 의해 제시된다. 즉, 항원 결정인자는 정말로 종양-특이적인데, 이는 이러한 유전형 펩티드가 세포 클론-특이적 수용체로부터 유도되기 때문이다. B-림프구성 악성 종양의 면역글로불린 수용체는 항원에 대한 이들의 결합 부위에서 유전형 펩티드 서열을 함유한다. 이러한 수용체 및 이들의 유전형 펩티드는 상기 세포 집단에 대해 독특하다. 또 다른 양태에서는, 수용자 MHC 클래스 II 분자-항원 제시 세포가 비-악성 세포이다. 이들 세포에는 바이러스, 세균, 기생충 또는 기타 병원체를 함유하는 세포가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 면역계에서 기능하는 세포, 예를 들면, T 세포, B 세포, 마크로파아지, 수지상 세포 및 천연의 킬러 세포가 포함된다.
상기 언급된 세포는 질병 치료에 있어서, 및 이러한 세포에 의해 제시된 에피토프로부터 신규한 진단 및 치료용 시약을 개발하는데 있어서 몇몇 용도를 지니고 있다. 이들 세포주를 이용하여, 본 발명은 또한, 치료학적 시약을 생성시키는 방법 및 질환을 치료하는 치료학적 방법을 제공한다. 본 발명의 한 국면은 자가 결정인자 펩티드를 MHC 클래스 II 단백질과 연합하여, MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포의 표면 상에 디스플레이하는 방법이다. 자가 결정인자 펩티드는 T 림프구에 대한 제시를 위해, MHC 클래스 II 분자의 항원성 펩티드 결합 부위 내로 결합될 수 있는 펩티드로서 본원에 정의된다. 이러한 펩티드는 항원 제시 세포 자체 내에서 합성된 단백질로부터 유도되거나, 또는 예를 들어, 항원 또는 보체에 대한 세포 표면 수용체에 의해 항원 제시 세포 내로 전달된 단백질로부터 유도될 수 있다. 상기 방법은 목적하는 자가 결정인자 펩티드를 함유하는, 상기 언급된 바와 같은 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포를 제공하는 것을 포함한다. 일단 제공되면, Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자를 상기 세포 내로 도입하여, 자가 결정인자 펩티드를 MHC 클래스 II 단백질과 연합하여 디스플레이한다. 이러한 Ii의 특이적 조절인자는 앞서 기재된 어떠한 형태일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 Ii의 특이적 조절인자가 누클레오티드 염기를 포함하는 공중합체이거나, 또는 발현 가능한 역방향 유전자 구성물이다. 이러한 조성물이 도입되는 세포는 악성 또는 비-악성일 수 있고, 상기와 같이 처리된 세포의 내재성 결정인자로의 면역으로부터 치료학적 효과가 요망되는 개체 또는 또 다른 개체로부터의 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물이 도입되는 세포는 특정 개체로부터 신선하게 수득되거나 또는 세포주 또는 클론의 확립을 포함한 배양 후에 수득된 샘플일 수 있다. Ii의 특이적 조절인자는 일렉트로포레이션에 의해 수용자 세포 내로 도입하는 것이 바람직하다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 악성 종양에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써, 환자에게서 악성 종양을 치료하는 방법을 제공해 준다. 이는 종양 세포 백신을 생성시켜 이를 사용함으로써 달성된다. 종양 세포 백신은 환자의 면역계가 악성 종양에 대해 촉발하도록 하기 위한 노력으로, 악성 종양의 항원성 에피토프를 함유하는 세포를 조작하여 이러한 에피토프가 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시되도록 함으로써 생성시킨다. 이러한 유형의 치료는 두 가지 방법, 즉 1) 세포를 시험관내에서 조작하여 종양 백신 세포를 생성시킨 다음, 이를 환자에게 도입하는 생체외 방법, 및 2) 종양 백신 세포를 생체내에서 직접적으로 생성시키는 접근법 중의 한 가지 접근법으로 수행한다. 첫 번째 방법에서는, 악성 세포 집단을 각종 공급원으로부터 수득할 수 있다. 이러한 제제는 수반하는 정상 세포로부터 분리시키거나 분리시키지 않으면서 특정 환자로부터 수득된 선택되지 않은 악성 세포 집단 또는 세포주로서 수득된 세포로부터 유래되거나, 또는 이러한 세포주로부터의 클론으로서 존재할 수 있다. 이러한 세포는 신선한 악성 조직(예: 결장 또는 난소 선암)의 확립된 악성 세포주 또는 외식편(explant)으로부터 수득된다. 필요한 경우, 이와 같이 수득된 세포 집단을 시험관내에서 팽창시킬 수 있다. 또 다른 한편으로, 비-악성 세포를 사용할 수 있다.
공급원이 무엇이든지 간에, 상기 세포는 치료하고자 하는 악성 종양의 항원 결정인자를 발현하거나 이를 함유해야만 한다. 부가적으로, 상기 세포가 충분한 양의 MHC 클래스 II 분자를 자연적으로 발현하지 못할 경우에는, 그렇게 하도록 상기 세포를 유도시켜야만 한다. 이는 상기 언급된 방법에 의해 달성될 수 있다.
일단 적절한 세포 집단이 수득되거나 생성되면, Ii 발현의 특이적 조절인자를 앞서 기재된 방법, 바람직하게는 일렉트로포레이션에 의해 세포 내로 도입한다. 이러한 특이적 조절인자를 도입한 후, 상기 세포를 일반적으로, 내재성 항원 결정인자를 MHC 클래스 II에 하중시킨 후 이러한 복합체가 표면-발현되도록 하기 위해, Ii 발현을 억제시키는 효과를 발휘하도록 Ii 발현의 억제인자에 필요한 시간 동안 추가로 배양한다.
이어서, 이와 같이 처리된 세포를 환자에게 도입한다. 또 다른 한편, 상기 처리된 세포의 유도체를 환자에게 도입한다. 세포의 도입은, 예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 도입용 세포를 환자에게 도입하기에 앞서, 이를 복제 부적격하게 만든다(예를 들면, 방사선 처리 또는 고정에 의해서).
암 백신 면역요법용으로 정립된 프로토콜이 다음 문헌에 논의되어 있다[참조: Clements et al., Immunol. 149: 2391-2396(1992); Baskar et al., Cell. Immunol. 155: 123-133(1994); Baskar et al., J. Exp. Med. 181: 619-629(1995); Hersey, Drugs 47: 373(1994); and Pardoll, Immunol. Today 14: 310(1993)].
본 발명에 의해 제공된, 환자에게서 악성 종양을 치료하기 위한 두 번째 방법은, Ii의 특이적 조절인자를 항암 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 환자에게 투여함으로써, 이러한 환자로부터 제거되지 않는 접근 가능한 종양 세포 내로 상기 Ii의 특이적 조절인자를 도입하는 것을 포함한다. 이러한 반응은 암 세포를 사멸시키고/시키거나 암 세포를 사멸시키도록 다른 세포를 조절하는 T 림프구의 활성을 유도하고/거나 이의 수를 증가시키는 것을 특징으로 한다. 항암 면역 반응을 유도시키는데 요구되는 양은 개개의 환자와 특정한 악성 종양에 따라 다양할 것이다. 한 양태에서는, 이러한 양이 1일 10㎍ 내지 100mg이다.
적합한 투여 방법에는 정맥내 주입(예를 들어, 주사를 통함), 피부 또는 점막 표면을 통한 주입(예를 들어, 국소 투여), 적합한 담체 입자(예: 콜로이드성 골드(gold)) 상으로 피복한 후 유전자 총으로 삽입하는 것이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히, 표적 조직을 가시화해주는 투시 촬영법을 사용하여 방사선 전문의에 의해 내장 전이물 내로 미세주사하는 것이 널리 공지된 표준 기술이다. 이러한 투여는 또한, 체강 내로의 주입을 통해서일 수 있거나, 또는 예를 들면, 난소암종의 경우에는 이러한 체강 내에 함유된 복수 내로의 주입을 통해서일 수 있다. 이러한 방법을 통하여, Ii의 특이적 조절인자가 1차 또는 전이성 종양 세포와 접촉하고 이들 세포 내로 도입되어, 종양 세포에 의한 면역계로의 내재성 종양 결정인자의 MHC 클래스 II 분자 제시화를 향상시킨다.
한 양태에서는, Ii의 특이적 조절인자를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여한다. 간략하게 언급하면, 전신 또는 국부 주입한 후에 치료학적 올리고누클레오티드를 보호하고, 선택된 세포 집단으로 운반 및 유입되도록 표적시키는 것으로 널리 정립된 방법이 있다. 전신 또는 국부 치료 방법은 종양 및 이의 제시화에 따라 적응될 것이다. 예를 들면, 복부 전이와 복수증을 나타내는 난소암은 악성 세포에 의한 흡수를 향상시키기에 적당한 제형 중에 투여된 올리고누클레오티드를 복강내 주입하여 치료할 것이다. 이러한 방법은 본원에 인용된 문헌 및 특허 또는 미국 특허 제5,098,890호(1992); 미국 특허 제5,273,745호(1993); 미국 특허 제5,290,551호(1994); 미국 특허 제5,637,483호(1997); 미국 특허 제5,648,223호(1997); 미국 특허 제5,679,647호(1997); 미국 특허 제5,693,522호(1997); 및 미국 특허 제5,788,963호(1998)(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 제시되어 있다.
상기 언급된 바와 유사한 방법을 적용하여 바람직하지 못한 비-악성 세포에 대해 개체의 면역계를 촉발시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 개체의 바람직하지 못한 세포 집단에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써 이러한 개체에게서 비-악성 질환을 치료하는 치료학적 방법에 관한 것이다. 바람직하지 못한 세포 집단으로부터의 세포는 통상적으로, 환자로부터 직접적으로 수득하고, 이를 앞서 기재된 바와 같이 시험관내에서 조작하여, 바람직하지 못한 세포 집단에 공통으로 존재하는 항원 결정인자를 함유하는 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포를 발생시킨다. 일단, 적당한 수용자 세포 집단이 발생되면, Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 상기 수용자 세포 내로 도입하여, 상기 언급된 바와 같이 항원 결정인자의 MHC 클래스 II 제시화를 향상시킨다. 바람직한 도입 방법은 일렉트로포레이션법이다. 이어서, 상기 세포를 개체에게 재도입한다. 이는 상기 언급된 방법에 의해 달성된다. 바람직한 양태에서는, 상기 세포를 개체에게 재도입하기에 앞서, 앞서 논의된 바와 같이, 이를 복제 부적격하게 만든다.
통상적으로, 바람직하지 못한 세포 집단은 질병의 원인이거나 산물이다. 바이러스 또는 기타 세포내 병원체를 수반하고 있는 세포 집단이 한 예이다. 이러한 세포는 상기 병원체에 의해 엔코딩되거나 또는 이러한 병원체에 대해 반응하는 단백질을 발현한다. 병원성 면역학적 반응과 연관된 세포 집단이 또 다른 예이다.
바이러스 또는 기타 세포내 병원체를 수반하는 세포는 이러한 병원체의 감염에 특이적인 분자를 발현한다. 숙주 세포 구조 유전자에 대한 몇몇 상단 조절 영역은, 상기 병원체에 의해 엔코딩되거나 또는 이러한 병원체에 의해 코딩된 트랜스액팅(transacting) 인자에 의해 유발되는 트랜스액팅 인자로 활성화시킬 수 있다. 숙주 세포 단백질은 또한, 예를 들어, 사이토킨에 의해 상기 병원체에 대한 면역 반응의 한 성분으로서 유발될 수 있다. 감염된 세포에 대해 절대적 또는 상대적 특이성을 지니고 있는 상기 단백질을 프로세싱한 다음, 상기 감염된 세포에 의해서 제시하거나 숙주 항원 제시 세포, 예를 들면, 마크로파아지 또는 수지상 세포에 의해서 제시할 수 있다. 병원체의 단백질을 제시하거나 이 병원체에 대해 반응하여 유발되는 세포가, Ii 단백질을 표적으로 하는 안티센스 시약에 의해 적절하게 접촉되는 경우, T 헬퍼 세포 클론의 팽창을 유도한 다음 병원체에 대한 그 밖의 MHC 클래스 I-제한된 면역 반응을 증대시키는 MHC 클래스 II 분자를 통하여 부가의 항원 결정인자가 제시된다. 이 방법은 부가의 바이러스성 결정인자, 또는 바이러스 감염된 세포에 절대적으로 또는 상대적으로 특이적인 결정인자의 MHC 클래스 II 제시화를 향상시켜 준다. MHC 클래스 II 제한된 헬퍼 세포의 도입으로 인해, 킬러 T 림프구에 의한 바이러스 감염된 세포의 파괴가 향상되고 치료학적 면역글로불린의 유도가 향상된다. 이와 관련하여, 바이러스 감염된 세포의 일정 부분만이 Ii 안티센스 치료제로 처리하여 환자에게 재도입할 필요가 있다. 특히, Ii이 부분적으로 상당히 과발현되어 항-EBV 면역 반응을 억제시키는 것으로 입증된, 정상적인 B 세포의 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 감염의 경우에는, 이러한 치료가 항-EBV 면역 반응을 향상시키는데 유효할 것이다. 유사하게, 활성화시 MHC 클래스 II 항원을 발현할 수 있는 HIV-감염된 CD4+ T 림프구의 경우에는, 이들 세포를 항-Ii 구성물로 처리함으로써 항-HIV 면역 반응이 향상될 것이다. 치료 효능을 기록하는 과정은 현재 이용되는 방법으로부터 가능할 수 있다. 바이러스성 DNA를 세포 및 조직 내로 도입하는 방법이 미국 특허 제4,689,320호(1987) 및 미국 특허 제5,620,896호(1997)(이의 관련 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 제공되어 있다.
또 다른 양태에서는, 바람직하지 못한 세포 집단이 자가반응성 T 림프구를 포함하고 있다. 병원성 면역학적 반응과 연관된 세포는 또한, 상기 집단에 특이적인 항원 결정인자를 발현한다. 또한, 자가반응성 T 림프구에 의해 매개된 자가면역 질환은 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료할 수 있다. MHC 클래스 II 분자를 발현하는 병원성 T 세포는 이들 분자를 통하여, 이들 TCR의 유전형 펩티드를 제시한다. 상기 언급된 방법을 사용함으로써, 상기 세포 집단을 사용하여 병원성 T 세포에 대한 환자의 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 이 방법은 암 세포 백신 제조를 위해 상기 언급된 방법으로부터 가능할 수 있다. 구체적으로, 이들 방법에는 T 세포 백신을 제조하기 위해 병원성 T 세포를 배양물에서 팽창시키는 방법, 및 또 다른 세포 집단, 예를 들면, 수지상 세포를, TCR의 일정 쇄 또는 세그먼트를 코딩하는 핵산 공중합체로 트랜스펙션시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. MHC 클래스 II 제한된 헬퍼 세포의 도입으로 인해, 기타 킬러 T 림프구에 의한 병원성 T 세포의 파괴가 향상된다. 이와 관련하여, 병원성 T 세포, 또는 이의 배양물 또는 클론의 일정 부분 만을 Ii 안티센스 치료제로 처리하여 환자에게 재도입할 필요가 있다.
예를 들면, 류마티스성 관절염은 염증 발생된 관절에 국재된 항원에 지시된 세포독성 T 세포로부터의 파괴 효과에 의해 매개되는 것으로 제안된 바 있다. 이러한 세포독성 T 세포는, 프로세싱되어 면역계에 대해 제시될 수 있는 독특한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는다. 이러한 TCR-유도된 유전형 펩티드에 대한 기타 T 세포의 면역 반응을 향상시키는 것이 류마티스성 관절염이 있는 환자의 임상 상태를 개선시킬 것이다. 이러한 병리학적 T 림프구가 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 정도로, Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자의 도입이 관련 TCR에서 에피토프에 대한 헬퍼 T 세포 반응을 촉발시킬 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 수용자 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포의 발생과 관련하여, 상기 치료법은 또한, 수지상 세포 라이센싱을 향상시킴으로써 발휘될 수 있다. 이러한 치료 방식에는 T 세포 집단의 분리 방법, 및 상기 논의된 바와 같이, TCR 유전자를 수지상 세포 내로 트랜스펙션시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
치료 효능을 기록하는 과정은 자가면역 질환 치료를 기록하기 위한 기존의 과정으로부터 유도될 수 있다. 이러한 관련 방법이 본원에 인용된 것을 포함한 당해 문헌, 또는 미국 특허 제5,614,192호(1997)(이의 관련 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 제시 또는 고찰되어 있다.
또 다른 양태에서는, 자가면역 질환 환자의 치료가, 이러한 질환이 진행되는 동안 적절한 시점에 Ii 발현의 특이적 조절인자를 투여함으로써 성취된다. 즉, 자가면역 반응의 억제인자 T 세포-매개된 분할 동안 보다는 오히려, 자가면역 반응의 팽창 독성 상과 관련된 결정인자에 대한 반응을 하향 조절하도록 치료 시기를 정한다. 이러한 치료 스케쥴 설정은 예를 들어, 랫트 보조관절염, 및 실험상 알레르기성 뇌척수염의 경우에 대해 당해 문헌에 기재되어 있다. 이러한 방법에서는, Ii 기능의 특이적 조절인자를 항-질환 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 환자에게 투여한다. 항-질환 면역 반응은 병리학적 면역 반응을 나타내는 T 림프구의 활성 및/또는 수의 감소, 및/또는 병리학적 면역 반응을 나타내는 세포의 활성 및/또는 수를 조절하는 T 림프구의 활성의 유도 및/또는 수의 증가를 특징으로 한다. 항-질환 면역 반응을 유도하는데 요구되는 양은 개개의 환자와 특정한 질환에 따라 다양할 것이다. 한 양태에서는, 이러한 양이 1일 10㎍ 내지 100mg이다.
적합한 투여 방법에는, 예를 들면, 관절 공간 내로의 주사, 정맥내 또는 체강 내로의 투여, 및 국소 투여가 포함된다. 환자를 대상으로 하여, 부분적으로는 질환의 억제를 유도하는 방식으로 투여 시기를 정하기 위하여, 질환의 진행 단계 또는 질환의 갑작스런 악화 상태를 기록한다.
한 양태에서는, Ii 기능의 특이적 조절인자를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 환자에게 투여하여 상기 화합물을 보호하고/거나 특정한 조직으로의 표적화 및 이 조직에서의 흡수를 향상시킨다. 국부 또는 전신 주입시 치료학적 올리고누클레오티드를 보호하고, 선택된 세포 집단으로 운반 및 유입되도록 표적시키는 것으로 널리 정립된 방법이 있다. 국부 또는 전신 투여 방법은 자가면역 질환 및 이의 제시화에 따라 적응될 것이다. 예를 들면, 류마티스성 관절염에 의해 하나의 무릎 관절에 급성 염증이 발생된 경우는 Ii 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자를 상기 관절 공간에 주입함으로써 치료할 수 있다. 공중합체를 투여하는 것과 관련된 방법, 및 기타 Ii 기능의 특이적 조절인자가 상기 및 본원에 인용된 문헌 및 특허에 제시되어 있다. 이러한 방법은 다음에 인용된 문헌 또는 미국 특허 제5,356,779호(1994); 미국 특허 제5,672,473호(1997); 미국 특허 제5,731,160호(1998); 미국 특허 제5,736,507호(1998)(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 제시되어 있다.
본 발명은 또한, 자가결정인자 펩티드를 특정 세포로부터 분리하는 방법을 제공해준다. 이러한 자가결정인자 펩티드는 상기 언급된 방법을 사용하여 자가결정인자 펩티드의 MHC 클래스 II 항원 제시화를 유도한 다음, MHC 클래스 II 분자를 가용화 및 정제(이는 이들과 연합되어 있는 자가결정인자 펩티드와 함께 정제될 것이다)함으로써 수득한다.
목적하는 자가결정인자 펩티드를 함유하는 세포는 환자로부터 신선하게 수득하거나, 또는 상기 세포의 배양물로부터 수득한다. 이러한 세포가 천연 상태의 항원 제시 세포가 아닌 경우, 예를 들면, MHC 클래스 II 분자를 발현하지 못하는 경우, 상기 논의된 과정에 의해, 이를 시험관내에서 조작하여 필요한 활성을 나타내도록 한다. 일단 수용자 항원 제시 세포가 발생되면, 상기 언급된 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 세포에 도입하고, 이 세포를 상기 특이적 조절인자를 발현시키고 이로 인해 자가결정인자 펩티드의 MHC 클래스 II 항원 제시화가 향상되도록 하기에 충분한 시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 상기 세포를 표준 과정으로 가용화시키고, MHC 클래스 II 분자 및 이와 연합된 자가결정인자 펩티드를, 상기와 같이 가용화된 세포로부터 정제한다. 정제 과정에는 세제-가용화된 렉틴-친화성 강화된 막 단백질의 면역정제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이어서, 자가결정인자 펩티드를, 예를 들면, 산 처리에 의해서, 면역정제된 MHC 클래스 II 분자로부터 방출시킨다. 이어서, 방출된 자가결정인자 펩티드를 분리하고 동정한다. 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광측정법의 사용을 통한 동정에 의해 정제를 달성할 수 있다. 추정상의 자가결정인자 펩티드 서열은 이러한 펩티드를 화학적으로 합성한 다음, 물리화학적 및 생물학적으로 분석함으로써 확인한다. 이 방법이 문헌[참조: Urban et al., Crit. Rev. Immunol. 17: 387-397(1997)]에 고찰되어 있다.
본 발명은 또한, 환자에게서 병원성 자가면역 반응을 치료하는데 적용된다. 보다 구체적으로 언급하면, 병원성 자가면역 반응을 하향 조절하기 위해서는, 자가면역 질환 주기의 특정 상 동안 내재성 항원 제시화의 향상을 자극시킨다. 예를 들면, 관절염의 특정한 동물 모델(예를 들면, 랫트 보조관절염)에서, 질환의 공격적인 진행의 초기 상 후에, 병원성 과정을 개시한 동일한 항원 결정인자에 대해 지시된 억제인자 T 림프구가 상기 면역 반응을 억제할 것이라는 사실이 입증되었다. 질환 진행 과정을 하향 조절해주는 두 번째 상(임상적으로 차도를 나타내는 징후로서 보여짐) 동안에는, Ii의 억제에 의한 세포 내에서의 내재성 자가항원 제시화의 치료학적 향상이 상기 질환을 하향 조절할 것이다. 추가로, 보조-자극 시그날이 결여되어 있는 세포(예를 들면, B7을 함유하지 않거나, 또는 B7 발현이 B7 안티센스 구성물로의 처리에 의해 억제된 세포)에서의 Ii 억제가 무감작성 반응을 야기시킬 것이다.
세포 집단(예를 들면, 병리학적 과정에서 활성을 나타내는 T 세포 수용체를 발현하는 T 림프구, 또는 자가면역 질환 과정의 표적 세포, 또는 바이러스 감염된 세포)을 먼저, 표준 기술을 사용하여 개체로부터 분리시킨다. 필요한 경우, 상기 언급된 기술에 의해 MHC 클래스 II 분자를 상기 세포에서 유도시킨다. 이어서, 이러한 세포 집단을 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자로 처리한다. 이어서, 이 세포를 가용화시키고, MHC 클래스 II 분자 및 이와 연합된 펩티드를, 예를 들면, MHC 클래스 II 분자에 대한 모노클로날 항체로 면역침전시킴으로써 정제한다. 이 펩티드를, 예를 들면, 산 처리하여, MHC 클래스 II 분자로부터 분리시키고, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피하여 분리한 후, 개개의 펩티드를 질량 분광측정법으로 검정함으로써 특징 확인한다. 펩티드의 서열은 질량 분광기에서 이의 이온 단편화 패턴으로부터 추론하고, 이와 같이 추론된 서열을 갖는 합성 펩티드의 분광측정 분석을 통하여 확인한다. 생물학적 검정 결과, 상기 합성 펩티드와 질환 과정과의 관련성 여부, 및 이의 분할을 추가로 확인할 수 있다. 이어서, 이로써 동정된 펩티드의 한 가지 이상의 합성 형태 또는 동족체를 상기 환자 또는 동일한 병리학적 과정을 나타내는 기타 환자에게 도입하여, 임상적 변화를 유도한다. 이와 같이 치료된 환자는 차도 징후를 나타내는 것으로 기록된다.
이러한 과정과 관련된 방법이 본원에 인용된 문헌 또는 미국 특허 제5,356,779호(1994); 미국 특허 제5,672,473호(1997); 미국 특허 제5,736,507호(1998); 및 미국 특허 제5,773,570호(1998)(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다)에 제시되어 있다.
상기 기재된 방법의 중요한 이점은 당해 기재된 조성물을 일시적 또는 간헐적으로 사용하면, 질환-특이적 또는 질환-관련된 결정인자에 대한 면역 반응이 촉발된다는 점이다. 이러한 촉발 후, 부가의 안티센스 처리없이, 면역계는 종양 또는 병원성의 자가반응성 T 세포를 거부할 수 있다. 이와는 대조적으로, 질환(예: HIV와 같은 바이러스성 질환)을 제어하기 위해 안티센스 치료제를 적용하는 대부분의 현 분야에서는, 안티센스 약물을 중단하면, 질환(또는 바이러스)이 재발된다. 이 방법의 또 다른 바람직한 가치는, 면역 반응의 항-질환 촉발 유도가 본원에 기재된 안티센스 조성물의 생체내 또는 생체외 사용으로 수행될 수 있다는 점이다.
본 발명의 또 다른 국면은 자가면역 파괴가 자극된 조직에서 Ii 단백질을 증가시킴으로써 조직-특이적 자가면역 질환을 치료하기 위한 개체의 유전적 치료법에 관한 것이다. 이러한 치료학적 접근법은 자가결정인자의 MHC 클래스 II 분자 제시화를 향상시키도록 Ii 단백질 발현을 감소시키는, 상기 제시된 출원들의 개념상의 거울 상이다. 바꿔 말하면, 상기 방법은 세포성 활성화 사건 동안 Ii 단백질의 존재를 증가시켜 준다. 이러한 사건에서는, Ii 단백질의 부수적인 발현 증가없이 MHC 클래스 II 알파 및 베타 쇄의 발현 증가로 인해, 자가항원의 제시화가 향상된다. 이와 같이 향상된 자가항원의 제시화로 인해, 조직을 손상시키는 자가면역 반응이 유발된다. 조직 내에 Ii을 치료학적으로 증가시키는 것은 내재성 항원의 MHC 클래스 II 분자 제시화를 감소시켜 자가면역 반응을 최소화시키며, 결국에는 조직 파괴를 가져다 준다. Ii 단백질은 Ii의 구성적 발현을 증가시킴으로써 표적 조직에서 증가된다. 이는 표적 조직 세포에서 활성인 특정 프로모터의 조절 하에 있는 Ii 유전자를 도입함으로써 달성된다. 바람직하게는, 이러한 프로모터가 조직 특이적인데, 즉 비-표적 조직에서는 최소의 활성을 나타낸다. Ii 유전자 및 프로모터는 발현 구성물의 형태로 제공된다. 적합한 발현 구성물(예: 바이러스성 벡터) 및 이러한 발현 구성물을 환자의 세포 내로 도입하는데 적당한 방법이 상기에 제시되어 있다. 유전자 치료법의 각종 방법에 통상적인 과정 및 조성물은 유용한 임상학적 결과를 수득하도록 선택되어야 한다.
당해 방법을 사용하여 당뇨병 질환을 치료할 수 있는데, 이로써 췌장 베타 세포가 파괴된다. 인슐린 프로모터의 조절하에 있는 Ii 유전자를 감응성 개체에게 삽입하면, 췌장 베타 세포에서의 Ii 단백질의 발현이 향상된다. 이러한 치료는 상기 췌장 베타 세포를 자가면역 유도된 파괴로부터 보호해준다. 부가적으로, 상기 방법을 사용하여 갑상선 포상 세포의 파괴를 가져다 주는 갑상선염 형태를 치료할 수 있다. 티로글로불린 프로모터의 조절하에 있는 Ii 유전자를 삽입하면, 갑상선 포상 세포에서의 Ii의 발현이 향상되어, 이들을 자가면역 파괴로부터 보호해줄 것이다.
실시예 1. 안티센스 올리고누클레오티드와 하이브리드화하는 Ii RNA 부위의 동정
DNA와 하이브리드화되는 부위에서 RNA를 절단하는 리보누클레아제 H의 작용을 이용하여, 안티센스 올리고누클레오티드와 하이브리드화된 Ii RNA의 부위를 동정한다. 엇물린 중첩 패턴의 Ii RNA의 세그먼트에 헤드-투-테일(head-to-tail) 방식으로 상보적인 서열에 각각 18개 염기를 함유하는 일련의 데옥시올리고누클레오티드(표 1)를 하이브리드화 검정에 사용하였다. RNA를 전사시키고, 32P로 5'-말단에서 표지시켰다. 이러한 32P-표지된 Ii mRNA의 샘플을 리보누클레아제 H의 존재하에, 각 올리고누클레오티드와 별도로 인큐베이팅하였다. 이러한 RNA와 하이브리드화되는 올리고누클레오티드는 RNase H가 하이브리드화 영역 내에서 RNA를 절단하도록 지시하였다. 절단 부위는 RNA의 5'-말단으로부터 측정하면서, 상기 표지된 생성물의 길이로써 지시되었다. 반응 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 자동방사선 사진술로 분석하였다(표 2). 전부는 아니지만, 몇몇 올리고누클레오티드는 절단 생성물의 가변적 생성으로 지시된 바와 같이, RNA와 효과적으로 하이브리드화되었다. 어떠한 올리고누클레오티드의 부재하, 올리고누클레오티드의 존재하(단, RNase H가 결여되어 있음), 또는 센스 올리고누클레오티드 대조군(서열번호 46) 또는 1개의 내부 결실이 있는 안티센스 올리고누클레오티드(서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45)의 존재하에서는 Ii RNA의 절단이 전혀 관찰되지 않았다. 가장 강력한 절단을 가져다주는 올리고누클레오티드 서열을, 실시예 3, 4 및 5에 제시된, 부가의 안티센스 효능 연구를 위해 포스포로티오에이트 연결부를 이용하여 재합성하였다.
마우스 Ii P31 mRNA를 사용하여 본 연구를 수행하지만, 하이브리드화 부위 분석을 위해 유사한 과정이 어떠한 종의 RNA에도 적용 가능하다.
표 1. RNase H 지도화 실험에 사용된 안티센스 포스포디에스테르 올리고누클레오티드의 서열
Figure 112001013334694-pct00001
Figure 112001013334694-pct00002
Ii mRNA 서열[참조: Koch, N. et al. EMBO J. 6: 1677-1683, (1987)]은 첫 번째 AUG 코돈의 A가 올리고누클레오티드 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 46에서의 누클레오티드 1이 되도록 번호를 매긴다. 음성 대조군으로서 다음이 포함된다: 각각 하나의 내부 결실이 있는 올리고누클레오티드 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45, 및 센스 서열 배향을 지닌 올리고누클레오티드 서열번호 46. *서열번호 43 및 44에 대한 본래의 서열(결실없음)이 괄호 안에 제시되어 있고, 이는 표 4에 제시된 후속 실험에 사용되었다.
표 2. 마우스 Ii 안티센스 올리고누클레오티드에 대한 접근 가능한 부위의 RNase H 지도화
Figure 112001013334694-pct00003
Figure 112001013334694-pct00004
안티센서 올리고누클레오티드 서열 번호, Ii mRNA 내에서의 이들의 누클레오티드 출발 위치, 및 -, + 내지 +++ 등급으로 판정되는 생성물의 세기가 각 올리고누클레오티드에 대해 제시된다.
실험
화합물. 포스포디에스테르 데옥시올리고누클레오티드가 다음 공급처(Integrated DNA Technologies, Inc.; Coralville, IA)에 의해서 합성되었다. 각 올리고누클레오티드의 서열 번호, 누클레오티드 서열 및 Ii mRNA 내에서의 누클레오티드 번호가 표 1에 열거되어 있다.
Ii mRNA의 제조. 뮤린 Ii P31 cDNA를 함유하는 pBluescript KS 플라스미드를, 제조업자의 프로토콜에 따라서 T7-리보맥스(Ribomax) 대규모 RNA 생산 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여 Xho I로 선형화시킨 다음 시험관내에서 전사시켰다. DNA 주형을 RQ1 RNase-무함유 DNase(Promega, Madison, WI)로 처리하여 제거하고, RNA 생성물을 송아지 장 알칼리 포스파타제(Promega, Madison, WI)로 탈포스포릴화하였다. 이러한 RNA를 T4 폴리누클레오티드 키나제(Promega, Madison, WI)를 사용하여 [γ-32P] ATP로 5' 말단 표지시켰다. 모든 과정을 표준 분자 생물학 기술에 따라서 수행하였다[참조: Sambrook, J., E.F. Fritsh, and T. Maniatis. 1990. Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].
하이브리드화 부위의 RNase H 지도화. 32P-표지된 마우스 Ii P31 mRNA(5 x 105cpm)을 1 x RNase H 완충액 중의 2mg 효모 tRNA와 혼합하고, 70℃에서 3분 동안 가열한 다음, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 안티센스 올리고데옥시누클레오티드(0.2 내지 1pmol)를 가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 이. 콜라이(E. coli) RNase H(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 0.5단위를 가하여 10ml의 최종 반응 용적을 수득하였다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이팅한 후, 전기영동 부하 완충액 8ml를 가하고, 90℃에서 5분 동안 가열한 다음, 얼음 상에서 냉각시킴으로써 반응을 중지시켰다. 각 제제 5ml를 6% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 2시간 동안 50와트하에 전기영동시킨 다음, X선 필름에 노출시켰다. 자동방사선 사진술로 검사하여 주요한 RNA 절단 생성물을 동정하고, 이들의 세기가 표 2에 요약되어 있다.
실시예 2. 올리고누클레오티드를 일렉트로포레이션에 의해 세포 내로 전달하기 위한 최적 조건
모든 포유류 세포주에 적용 가능한 마우스 SaI/CIITA 세포를 사용하여 본 연구를 수행하였다.
올리고누클레오티드를 포유류 세포 내로 일렉트로포레이션시키기 위한 상이한 조건을 시험하여, 세포 손상을 최소화하면서 최대 흡수를 가져다 주는 조건을 결정하였다. 전압과 정전용량(capacitance)의 각종 조합을 사용하여, SaI/CIITA 마우스 육종 세포를 일렉트로포레이션시켰다. 플루오레세인-표지된 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드(서열번호 64)를 사용하여 올리고누클레오티드 흡수를 탐지하고 정량화하였다. 대조군 세포를 플루오레세인-표지된 올리고누클레오티드의 부재하에 일렉트로포레이션시켰다. 이와 같이 일렉트로포레이션시킨 세포를 1시간 동안 배양한 다음, 트립판 블루 염료 제한법으로 생존성에 대해 측정하였다. 플루오레세인-표지된 올리고누클레오티드의 흡수를 형광성-활성화된 세포 분류기(FACS)로 측정하였다. FACS는 플루오레세인 표지된 잔기를 활성화시키는 레이저 빔을 통하여 개개의 세포를 구동시킨다. 이러한 빔을 가로지르는 각 세포의 형광 세기를 광전자 증배관으로 측정한다. 각 세포로부터의 빛의 전방 및 측면 산란도를 동시에 측정하여 사멸되거나 응집된 세포를 제거시킨다. 예를 들면, 일만개 세포를 분석한 후, 세로 좌표가 탐지된 세포의 수를 나타내는 선형 눈금이고 가로 좌표가 각 세포의 정량적 형광성을 나타내는 로그 눈금인, 컴퓨터-이용한 데이타 제시를 2차원 막대 그래프로서 나타낸다. 일렉트로포레이션 최적화 검정으로부터의 데이타가, 대조군 세포 보다 큰 형광 세기를 갖는 모든 세포의 비율(%)을 나타내는 양성 세포의 비율(%)로서 표 3에 제시되어 있다.
최대 올리고누클레오티드 흡수 및 세포 생존성은 200V 및 1200mF를 사용하여 발생되었다(표 3A). 세포의 90% 이상이 2mM 올리고누클레오티드를 사용하는 이들 조건 하에서 최대 형광성을 나타내었다(표 3B).
표 3A. 일렉트로포레이션에 의한 올리고누클레오티드 흡수에 대한 최적 조건
Figure 112001013334694-pct00005
표 3B. 일렉트로포레이션에 의한 올리고누클레오티드 흡수에 대한 최적 조건
Figure 112001013334694-pct00006
두 실험을 수행하였다: A) 0.017 마이크로몰 플루오레세인-표지된 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 서열번호 64 및 2.15 마이크로몰 포스포디에스테르 올리고누클레오티드를 사용함; B) 2마이크로몰 플루오레세인-표지된 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 서열번호 64를 사용함.
실험
화합물. 이들 연구에 사용된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드 서열번호 64(표 5 참조)을 플루오레세인으로 5' 표지시킨다. 이는 공급처(Integrated DNA Technologies, Inc.; Coralville, IA)에 의해서 합성되었고 HPLC 정제되었다.
세포 배양물. SaI/CIITA 마우스 육종 세포주를, 5% FCS(FetalClone I, HyClone Laboratories, Logan, UT), 2mM L-글루타민, 200U/ml 페니실린 및 200mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 이스코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM, JRH Biosciences, Lenexa, KS) 중에서 흡화된 대기하 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다.
일렉트로포레이션. 세포를 2회 세척하고 보충물을 함유하지 않은 RPMI-1640 배지에 재현탁시켰다. 각종 양의 5'-플루오레세인-표지된 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 서열번호 64를 함유하는 500㎕ 배지 중의 2 내지 5 x 106세포를 4mm-갭 큐베트에 가하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이팅한 다음, 일렉트로셀 조작기 ECM 600 시스템(BTX Inc., San Diego, CA)에서 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 후, 세포를 실온에서 10분 동안 유지시키고, 2x 보충물을 갖는 등용적의 IMDM과 혼합한 다음, 분석 전에 1시간 동안 5% CO2 중에서 37℃ 하에 인큐베이팅하였다. 트립판 블루 염료 제한법으로 세포 생존성을 측정하였다. 0.2M 글리신(pH 4.4)으로 1회 세척하고, 한크스 완충 염 용액으로 2회 세척한 다음, 얼음 상에서 15분 동안 2% 포르말린으로 고정시킨 세포를 FACS 분석함으로써 올리고누클레오티드 흡수를 평가하였다. 세포 생존성 및 올리고누클레오티드 흡수를 나타내는 세포의 비율(%)이 표 3에 제시되어 있다.
실시예 3. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드에 의한 세포 내에서의 Ii 발현의 특이적 억제
상기 결정된, 안티센스 올리고누클레오티드 혼입에 최적인 방법을, 종양 세포주에서 Ii 단백질 발현에 대한 Ii 안티센스 올리고누클레오티드의 효과를 결정하기 위한 검정에 사용하였다. SaI/CIITA 뮤린 육종 세포주를 이들 검정법에 사용하였다. 이들 세포를, MHC 클래스 II 전사 활성화 인자 CIITA에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션시키면, 이 세포는 고수준의 MHC 클래스 II 및 Ii 단백질을 발현하였다.
뮤린 Ii RNA와 강력하게 하이브리드화하는 것으로 실시예 1에서 결정된 13개 서열을 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드로서 합성하였다. 이들 올리고누클레오티드를 일렉트로포레이션을 통해 SaI/CIITA 세포 내로 도입하였다. 24시간 동안 인큐베이팅한 후, 형광성 항체를 사용하여 Ii 및 MHC 클래스 II 단백질의 수준을 알아보기 위해 세포를 검정하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 FACS를 사용하여, 결합된 항-MHC 클래스 II 항체 또는 항-Ii 항체의 존재를 정량화하였다. Ii 단백질 또는 MHC 클래스 II 분자의 발현 억제를, 대조군 Ii-음성 및 MHC 클래스 II-음성 세포(CIITA 트랜스펙션을 수행하지 않은 모 SaI 육종 세포)와 동일한 형광 세기를 보여주는 안티센스 올리고누클레오티드-처리된 세포의 비율로서 측정하였다. 이러한 측정치는 지시된 단백질 발현을 완전히 억제시키는 세포 분획을 반영한다는 점에서 보아 세포 수로 나타내었으므로, 억제 수준을 과소평가할 수도 있는데, 이는 Ii 단백질을 부분적으로 억제시키는 세포가 계수되지 않을 수 있기 때문이다.
표 4에 제시된 이들 검정 결과는 상이한 올리고누클레오티드가 각각 다양한 수준의 Ii 억제를 가져다 준다를 것을 지시해준다. 가장 큰 활성은 AUG 개시인자 영역에 상보적인 올리고누클레오티드 서열번호 40(표 1) 및 Ii mRNA에서 첫 번째 스플라이스 공여체 부위에 상보적인 올리고누클레오티드 서열번호 32에 의해 나타났다. 센스 올리고누클레오티드(서열번호 46)을 사용하여 수행하였거나 올리고누클레오티드를 사용하지 않고 수행된 대조 반응은 억제를 전혀 나타내지 못하였다. MHC 클래스 II 단백질 발현은 이들 세포 중의 어떠한 것에서도 영향을 받지 않았는데, 이는 안티센스 올리고누클레오티드에 의해 야기된 억제가 Ii 발현에 특이적이라는 것을 입증해준다.
이어서, 부가의 중첩 올리고누클레오티드를 합성하여 이들 영역을 표적시키는데 가장 활성인 서열을 밝혀내었다(표 5). 이들 올리고누클레오티드를 앞서와 같이 검정하고, Ii 억제 활성(표 6A) 및 세포독성(표 6B)에 대해 조사하였다. 가장 활성인 화합물 서열번호 54는 AUG 개시인자에 대해 상보적이고, 또한 상기 세포의 MHC 클래스 II 발현, 회수 및 생존성에 대해 최소의 효과를 나타내었다. 첫 번째 스플라이스 공여체 영역 내에서 가장 우수한 화합물은 서열번호 62이다. 3' 비-번역 영역에서 폴리아데닐화 부위에 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드(서열번호 64)가 또한, 약간의 활성을 나타내었다.
표 4. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드에 의한, I-E 발현이 아닌 Ii의 억제
Figure 112006078400122-pct00019
2가지 독립적인 실험으로부터, Ii 및 I-E 음성 세포의 비율의 평균값 및 표준 편차(SD) 뿐만 아니라 안티센스 올리고누클레오티드의 부재하에 처리된 대조군 세포와 비교한 바와 같은 음성 세포의 배(fold)가 보고되어 있다.
표 5. 민감성 부위에서 가장 활성인 화합물을 결정하기 위해 사용된 안티센스 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드
Figure 112001013334694-pct00008
표 6A. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드 II에 의한, I-E 발현이 아닌 Ii의 억제
Figure 112006078400122-pct00020
표 6B. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드 II에 의한, I-E 발현이 아닌 Ii의 억제
Figure 112001013334694-pct00010
실험
화합물. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고누클레오티드는 다음 공급처(Integrated DNA Technologies, Inc.; Coralville, IA)에 의해서 합성되었고 HPLC 정제되었다.
일렉트로포레이션. 개개의 올리고누클레오티드(50μM)를 사용하여, 200V 및 1200μF에서 SaI/CIITA 세포의 일렉트로포레이션을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. MHC 클래스 II 및 Ii 단백질을 정량화하기 전에, 세포를 24시간 동안 인큐베이팅하였다.
막 결합된 MHC 클래스 II 단백질에 대한 검정. 세포를 얼음 상에서 60분 동안 20㎍/ml 랫트 항-마우스 I-Ek 모노클로날 항체 M5/114.15.2(American Type Culture Collection, Rockville, MD)와 함께 인큐베이팅하고, 한크의 균형 염 용액으로 2회 세척한 다음, 실온에서 30분 동안 염소 항-랫트 IgG(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)의 FITC-표지된 F(ab')2를 1:100 희석시켰다. 세포를 한크의 용액으로 3회 세척하고, 얼음 상에서 15분 동안 2% 포르말린으로 고정시켰다. FACS 분석을 사용하여 MHC 클래스 II 단백질의 존재를 지시해주는 형광 세포의 비율(%)을 결정하였다.
세포내 Ii 단백질에 대한 검정. 세포를 2% 포르말린으로 고정시키고, 1M 글리신으로 1회 세척한 다음, 20mM HEPES 및 0.2% 사포닌을 함유하는 한크의 완충액 염 용액으로 2회 세척하였다. 세포를 먼저, 하이브리도마 배양 상등액으로서 랫트 항-마우스 Ii 모노클로날 항체 In.1[참조: Koch, N. et al., Nature 299: 644-645, 1982]로 염색시키고, 세척한 다음, 염소 항-랫트 IgG의 FITC-표지된 F(ab')2와 함께 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 상기와 같이 재고정시켰다. 개개 세포의 면역형광성을 FACS로 결정하였다.
실시예 4. Ii 단백질 발현의 억제에 있어서 각종 주쇄 변형물의 상대적 효능
본 연구에서는, 실시예 3에서 동정된 가장 활성인 안티센스 서열인 서열번호 54를 사용하여 Ii 단백질 발현의 억제에 있어서 각종 주쇄 변형물의 상대적 효능을 비교하였다. 동일한 서열의 4가지 주쇄 변형물을 제조하였다(표 7): (1) 포스포로티오에이트(서열번호 54), (2) 5' 및 3' 말단에 2' 메틸옥실 변형된 포스포로티오에이트를 갖는, 중간 부분에서 포스포디에스테르의 혼합된 주쇄(서열번호 65), (3) 5' 및 3' 말단에 2' 메틸옥실 변형된 포스포로티오에이트를 갖는, 중간 부분에서 포스포로티오에이트의 혼합된 주쇄(서열번호 66), 및 (4) 2'-메틸옥시 변형된 포스포디에스테르(서열번호 67). 각각의 올리고누클레오티드 10 및 50mM을 SaI/CIITA 육종 세포 내로 일렉트로포레이션시킨 다음, 24 또는 48시간 동안 배양한다. Ii 단백질 발현의 억제 수준 뿐만 아니라 MHC 클래스 II 단백질 발현에 대한 올리고누클레오티드의 효과를 FACS 분석함으로써 정량화하였다. 표 8에 제시된 바와 같이, 각각 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는, 올리고누클레오티드 서열번호 54 및 서열번호 66은 MHC 클래스 II 발현에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 필적할 만한 Ii 단백질의 억제를 가져다준다. 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 다른 2개의 올리고누클레오티드는 Ii 발현을 덜 억제시키는 것으로 나타났다. 세포 생존성을 올리고누클레오티드의 존재하 또는 부재하에서 시험하는데, 이는 모든 올리고누클레오티드가 최소한의 세포독성 효과를 지니고 있다는 것을 보여준다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 합성이 보다 높은 수율, 보다 신속한 턴오버(turnover), 저렴한 비용을 가져다 주기 때문에, 이러한 유형의 주쇄를 갖는 공중합체가 모든 후속 실험에 사용되었다.
표 7. 상이한 주쇄 구조를 갖는 올리고누클레오티드의 서열
Figure 112001013334694-pct00011
표 8. 상이한 주쇄 구조를 갖는 안티센스 올리고누클레오티드에 의한 Ii 발현의 억제
Figure 112006078400122-pct00021
실험
화합물. 표 7에 열거된 바와 같은 안티센스 올리고누클레오티드가 다음 공급처(Integrated DNA Technologies, Inc.; Coralville, IA)의해서 합성되었고 HPLC 정제되었다. 일렉트로포레이션, 세포 배양, 및 세포내 Ii 및 표면 I-E 발현에 대한 FACS 검정은 실시예 3에서와 동일하다.
실시예 5. Ii 역방향 유전자 구성물에 의한 Ii 단백질 발현의 억제
이들 실험을 위해, SaI 육종 세포를 먼저, MHC 클래스 II 분자[참조: Armstrong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6886(1997)]의 발현을 상향 조절하는 CIITA 트랜스액팅 인자에 대한 유전자로 트랜스펙션시켜 SaI/CIITA 세포를 생성시켰다. Ii mRNA 서열에 상응하는(상응하는 서열 수가 지시되어 있다), 표 9에 열거된 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입함으로써, 몇몇 Ii 역방향 유전자 구성물을 제조하였다. 이어서, 이러한 역방향 유전자 구성물을 SaI/CIITA 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 발현 벡터가 삽입된 세포는 하이그로마이신 함유 배지에서 성장시킴으로써 선별하였다. 모노클로날 항체 In.1을 사용하여 Ii의 발현을 위해 이들 세포를 세포내 염색시켰다. 이어서, 이들 세포의 Ii 발현을 FACS 분석함으로써 정량화하였다.
Ii 단백질 발현의 억제(세포의 60% 이하)가 몇몇 mIi 역방향 유전자 구성물에 의해 트랜스펙션체에서 관찰되었다. 표 10에 요약된 데이타는 서열번호 68, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79에 열거된 서열로부터 제조된 역방향 유전자 구성물이 상기와 같이 처리된 세포의 상당 분획에서 Ii 단백질 발현을 상당히 억제시켰다는 것을 지시해준다.
표 9. 역방향 유전자 구성물의 서열
Figure 112001013334694-pct00013
Figure 112001013334694-pct00014
Figure 112001013334694-pct00015
표 10. 역방향 유전자 구성물의 활성
Figure 112001013334694-pct00016
* 이들 구성물을 이용하여 SaI/CIITA 안정한 트랜스펙션체를 스크리닝하는데 있어서 Ii 억제(약 60% 이하)가 관찰되었다(+).
실험
역방향 유전자 구성물의 생성. 각종 Ii 역방향 유전자 구성물을 2개 플라스미드 중의 1개로부터 제조하였다. pcDNA3.1(+)(Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 제조된 구성물은 유전자 발현을 구동시키기 위해 사이토메갈로바이러스 프로모터를 이용하였다. RSV.5로부터 제조된 구성물은 라우스 육종 바이러스 프로모터[참조: Long et al., Human Immunology 31: 229-235(1991)]를 이용하였다. 양 플라스미드는 트랜스펙션된 세포의 선별을 위해 사용되는 하이그로마이신 내성 유전자를 함유하였다. mIi 역방향 유전자 단편을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 생성시켰다. 이러한 PCR 단편을 Nhe1 및 Apa1로 분해시킨 다음, 동일한 엔도누클레아제로 분해시킨 pcDNA3.1(+) 내로 클로닝시킨다. mIi 역방향 유전자 단편의 삽입을 Nhe1 및 Apa1 분해로써 확인하였다. 상기 PCR 단편을 Sal 1 및 BamH1로 분해시킨 다음, 동일한 엔도누클레아제로 분해시킨 RSV.5 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 모든 mIi 단편을 서열 결정함으로써 확인하였다.
세포. 매릴랜드 대학(Baltimore, MD)의 오스트란드-로젠버그 박사(Dr. Ostrand-Rosenberg)의 기증물인 SaI/CIITA 세포를 5% FCS(FetalClone I, HyClone Laboratories, Logan, UT)를 함유하는 IMDM(JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서 배양하였다.
트랜스펙션. SaI/CIITA 세포를 제조업자의 지시에 따라서 리포펙틴(GIBCO BRL)을 사용하여 mIi 역방향 유전자 구성물로 트랜스펙션시켰다. 간략하게 언급하면, 10㎕의 리포펙틴과 3 내지 5mg의 플라스미드 DNA를 별개로, 100㎕의 Opt. MEM I(GIBCO BRL)와 온화하게 혼합하였다. 이 반응물을 실온에서 40분 동안 인큐베이팅하였다. 두 가지 반응물을 함께 온화하게 혼합한 다음, 실온에서 15분 더 인큐베이팅하였다. 한편, 105 SaI/CIITA 세포를 Opt. MEM I으로 세척하고, 800㎕의 Opt. MEM I 내로 재현탁시켰다. 리포솜/DNA 반응물을 상기 SaI/CIITA 세포에 온화하게 적가한 다음, 세포를 37℃에서 12 내지 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 트랜스펙션 배지를 2ml의 배양 배지로 대체하고, 이 세포를 24 내지 48시간 동안 인큐베이팅한 다음, 하이그로마이신 B(ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA) 800단위를 가하여 96-웰 플레이트에서 트랜스펙션된 세포를 선별하였다.
FACS 분석. 하이그로마이신 내성 세포를, 모노클로날 항체 In.1을 사용하여 Ii을 발현시키기 위해 세포내 염색시켰다(상세한 과정에 대해서는 실시예 3 및 4 참조). 이와 같이 염색된 세포를 FACS로써 분석하였다.
실시예 6. Ii 단백질-억제되고 고정된 백신 세포를 이용한 종양 챌린지에 대한 보호
모 종양으로의 챌린지로부터 숙주를 보호하기 위하여 Ii 단백질-억제된 종양 세포를 종양 세포 백신으로서 사용하는 것을 개발하기 위한 실험을 수행하였다. 이들 실험을 위해, SaI 육종 세포를 먼저, MHC 클래스 II 분자[참조: Armstrong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6886(1997)]의 발현을 상향 조절하는 CIITA 트랜스액팅 인자에 대한 유전자로 트랜스펙션시켜 SaI/CIITA 세포를 생성시켰다. 이와 같이 트랜스펙션된 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자 모두를 발현한다. 이러한 CIITA 유전자로 트랜스펙션시키지 않으면, SaI 세포는 MHC 클래스 I 분자만을 발현하였다. SaI/CIITA 세포는 또한, 상당 량의 Ii 단백질을 MHC 클래스 II 분자와 함께 발현하였다. CIITA 트랜스액팅 인자가 또한, Ii 단백질에 대한 구조 유전자로부터의 상단( 및 이의 첫 번째 인트론 내의)에 있는 유전적 조절 단위에 대해 작용하기 때문에, Ii 단백질과 MHC 클래스 II 분자의 공동 발현이 일어났다[참조: Zhu and Jones, Molecular and Cellular Biology 10: 3906(1990); Moore et al., J. Immunol. 161: 1844(1998)].
SaI/CIITA 세포(MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 분자 및 Ii 단백질을 발현함)을 Ii mRNA에 대해 지시된 안티센스 올리고누클레오티드(서열번호 54)로 처리하여 Ii 단백질의 발현을 억제시켰다. 상기 실시예 3에 제시된 방법에 의해, SaI/CIITA 세포 내에서의 Ii 단백질의 억제 정도, 및 MHC 클래스 II 분자의 억제 결여 여부를 측정하였다. 안티센스 올리고누클레오티드 화합물 서열번호 54는 MHC 클래스 II 분자의 발현 정도에 대해서는 중요한 영향을 미치지 않으면서, SaI/CIITA 세포의 약 35%에서 Ii 단백질을 상당히 억제시켰다. 상기와 같이 접종된 숙주에서의 복제를 방지하기 위하여, 상기 백신 세포를 포름알데히드로 고정시켰다.
Ii 억제된 백신 세포가 투여된 마우스를 3가지 서브그룹으로 나누는데, 각 서브그룹은 2.5 x 105 세포/마우스, 7.5 x 105 세포/마우스, 및 20 x 105 세포/마우스 중의 어느 하나에서 SaI 종양으로 챌린지되었다. Ii를 억제시키는 공중합체로 처리하지 않은 고정된 SaI/CIITA 세포로 처리시킨 대조군 마우스를 또한, 상기 농도의 종양 세포로 챌린지시켰다. 마우스 6가지 서브그룹 각각에서의 종양 발병률이 표 11에 제시되어 있다. 13일째, 복수증 종양이 있는 모든 대조군 마우스(C)는 1.5 내지 2.5ml 복수증을 나타내고 종결되었다. CIITA 유전자-트랜스펙션된 백신 세포가 투여된 마우스(AS 마우스) 중에서, 2.5 x 105 세포/마우스 그룹 중의 1마리 마우스, 및 7.5 x 105 세포/마우스 그룹 중의 1마리 마우스는 1.5 내지 2.5ml 복수증으로 종결되었다. 20 x 105 세포/마우스 그룹 중의 어떠한 마우스도 61일째 종양을 나타내지 않았다.
이들 관찰은 MHC 클래스 II 분자는 발현하지만 Ii 단백질은 거의 또는 전혀 발현하지 않는 종양 세포로 마우스를 백신 접종하는 것이 보호 종양 면역을 유발시킨다는 것을 입증해준다. 이러한 보호가 MHC 클래스 II 분자가 아닌 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 모 SaI 세포에 대한 것이기 때문에, 면역이 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 헬퍼 T 세포에 의해 매개되고, 최종 이펙터인 킬러 T 세포 반응에 필요하다. 즉, 이들 백신 세포가 MHC 클래스 I-양성이지만 MHC 클래스 II- 및 Ii 단백질-음성인 모 SaI 세포에 대한 보호를 유도하기 때문에, 두 클래스의 T 세포에 의해 보호가 매개된다. 첫째, 헬퍼 T 세포는 면역조절성 Ii 단백질을 사용하지 않고 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시된 항원 결정인자에 의해 자극된다. 둘째, MHC 클래스 I 분자로써 제한되는 킬러 T 세포는 헬퍼 T 세포의 작용에 의해 팽창 및 활성화되도록 자극된다.
표 11. 화합물 서열번호 54로 처리시키지 않거나 처리시킨, 고정된 SaI/CIITA 세포로 백신 접종한 마우스에서, SaI 종양으로 챌린지한 후의 종양 발병률
Figure 112001013334694-pct00017
서열번호 54로 처리시키거나(안티센스 서브그룹에 대해 "AS") 처리시키지 않은(대조군 서브그룹에 대해 "C") CIITA 유전자-트랜스펙션된 종양 세포로 백신 접종한 마우스에서, 동일 용적이거나 1.5ml 더 큰 용적의 종양 복수증 발병률이 기록되었다.
실험
트랜스펙션. CIITA 유전자-트랜스펙션된 SaI 세포를 2 x 106 세포/ml로 50μM 화합물 서열번호 54와 함께 인큐베이팅하고, BTX ECM 600 일렉트로포레이션 시스템 속에서 200V, 1200μfd로 일렉트로포레이션시켰다. 이 세포를 연속적으로, 5% 송아지 태아 혈청을 함유하는 IMDM 배지에서 20시간 동안 배양한 후, 단백질 발현 및 고정를 위해 면역형광 분석하였다.
고정. 세포를 실온에서 15분 동안 인산염 완충 식염수(pH 7.2) 중의 0.15% 포름알데히드로 고정시킨 다음 세척하였다.
접종. 백신 세포를 2.5 x 105세포/마우스로 15마리 마우스에게 복강내 주사하였다. 서열번호 54 공중합체로 처리시키지 않은 SaI/CIITA 세포를 15마리 마우스의 평형 그룹에 주사하였다.
종양 챌린지. 27일 후, 3가지 서브그룹의 마우스(서브그룹당 5마리 마우스)(이는 서열번호 54로 처리된 SaI/CIITA 세포를 백신 접종한 마우스)를 각각 다음 3가지 용량으로 SaI 모 세포로 챌린지시켰다: 2.5 x 105 세포, 7.5 x 105 세포 및 20 x 105 세포. 이와 병행해서, 서열번호 54로 처리시키지 않은 고정된 SaI/CIITA 세포를 백신 접종한 마우스의 3가지 서브그룹을 상기와 동일한 용량으로 각각 SaI 모 세포로 챌린지시켰다. 이들 챌린지 용량은 세포 용량/종양 발병률 곡선을 적정하기 위해 앞서 실험에서 결정하였다.
실시예 7. Ii 단백질-억제되고 조사된 백신 세포에 의한 종양 챌린지에 대한 보호
본 실시예의 실험은 주요 두 요소를 제외하고는 실시예 6의 실험 방법과 유사하다. 첫째, CIITA에 대한 유전자를 트랜스펙션시킨 후가 아니라, 인터페론 감마에 대한 유전자를 트랜스펙션시킨 후에, MHC 클래스 II 분자 및 Ii 단백질을 SaI 세포에서 유도시켰다. 둘째, 백신 세포의 생존성은 조사(irradiation)함으로써 유지시키는 반면, 악성 잠재능(복제하는 능력)은 파괴되었다.
CIITA 보다는 오히려, 인터페론 감마의 작용을 통하여 MHC 클래스 II 분자를 유도시키는 것을 더 선호하는 몇몇 실제적인 과학적 및 경제적 이유가 있다. 예를 들면, 인터페론 감마의 작용은 종양-관련된 항원 결정인자의 최적 프로세싱 및 제시화에 필요한 부가의 기능을 유도시킬 수도 있다. 또한, 숙주 내로의 도입 후 얼마간 종양 세포가 지속적으로 생존(복제없이)하도록 허용하는 것이, 예를 들면, 항원 결정인자에 대한 지속적인 노출, 누적성 항원 용량, 면역계의 다중 보조 및 이펙터 세포간의 상호작용의 지속성 관점에서 바람직한 특성을 부여해준다.
이들 실험을 위해, SaI 육종을, pGKNeo 플라스미드에 삽입된 인터페론 감마 유전자[참조: Chen and Ananthaswamy, J. Immunol. 151: 244-255(1993)]로 일렉트로포레이션시킴으로써 트랜스펙션시켰다. 800㎍/ml G418에서 초기 선별하고, 400㎍/ml G418에서 유지시켰다. 인터페론 감마 생산 세포를 제한 희석율로 배양하고, 가시적 면역형광에 의해 ATCC 하이브리도마 T1B120으로부터의 5/114.15.2 모노클로날 항체로 MHC 클래스 II 분자를 표면 발현시킴으로써 동정한 클로날 집단을 팽창시킴으로써 선별한다.
세포 집단을 보호하는 다음 두 클래스의 백신을 제조하였다: 1) Ii 단백질 발현을 억제하기 위해 공중합체 서열번호 54로 트랜스펙션된 세포 및 2) 트랜스펙션되지 않은 세포. CIITA 유전자-트랜스펙션된 SaI 세포를 2 x 106 세포/ml로 50μM 공중합체 서열번호 54와 함께 인큐베이팅하고, BTX ECM 600 일렉트로포레이션 시스템 속에서 200V, 1200μfd로 일렉트로포레이션시켰다. 이 세포를 연속적으로, 5% 송아지 태아 혈청을 함유하는 IMDM 배지에서 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후, 단백질 발현 또는 상기 백신의 제조를 면역형광 분석하였다. 백신 접종에 앞서, 상기 세포를 세슘-조사기로 3,500rads 조사하였다.
1, 2 및 3일째에, 마우스에게 다음 3가지 유형의 조사된 인터페론[IFN] 감마 유전자-트랜스펙션된 세포 2 x 106세포/용량을 주사하였다: 1) IFN-감마 유전자-트랜스펙션된 세포(표 12에서 "C"), 2) MHC 클래스 II 분자에 대해서는 어떠한 영향도 미치지 않으면서, Ii 단백질이 세포의 약 34%에서 억제되도록 하기 위해, 화합물 서열번호 54로 처리한 후 24시간 동안 배양된 IFN-감마 유전자-트랜스펙션된 세포(표 12에서 "AS-24"), 및 3) MHC 클래스 II 분자에 대해서는 어떠한 영향도 미치지 않으면서, Ii 단백질이 세포의 약 45%에서 억제되도록 하기 위해, 화합물 서열번호 54로 처리한 후 48시간 동안 배양된 IFN-감마 유전자-트랜스펙션된 세포(표 12에서 "AS-48").
24일 후, 각 백신 접종 그룹 중의 마우스 서브그룹을 SaI 육종 세포의 다음 3가지 수준 중의 한 가지로 챌린지시켰다: 2 x 106세포, 5 x 106세포 또는 12.5 x 106세포(표 12). 대조군 서브그룹의 0/4, 2/4 및 4/4가 11일째에 2 내지 3ml 복수증이 발병하였고 13일째에 종결되었다. AS-24 및 AS-48 마우스의 경우, 보고된 표 12에서의 종점은 2ml 이상의 복수증을 나타내는 마우스의 종결일을 나타냈다. 13일째에 생존한 마우스는 어떠한 악성 종양도 나타내지 않았다.
이들 결과는, Ii 단백질을 억제시키고 MHC 클래스 II 분자를 발현시키는 '유전공학적으로 처리된' 유도체-종양 세포로 백신 접종함으로써, MHC 클래스 I-양성, MHC 클래스 II-음성 '모' 세포에 대한 효과적인 종양 보호를 입증하고 있다. 이는 Ii 단백질의 부재하에서 MHC 클래스 II 분자에 의한 '헬퍼' 항원기의 팽창된 레파토리를 제시화하면, 항-종양 반응이 향상된다는 것을 나타낸다.
표 12. 화합물 서열번호 54로 처리하지 않거나 처리하면서, 고정된 인터페론 감마 유전자-트랜스펙션된 SaI-세포로 백신 접종한 마우스에서, SaI 종양으로 챌린지한 후의 종양 발병률
Figure 112001013334694-pct00018
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Claims (96)

  1. 포유류 비변이 쇄 단백질(invariant chain protein: Ii 단백질)을 엔코딩하는 RNA 분자와 듀플렉스 분자를 형성함으로써 번역 수준에서 Ii 단백질 합성을 억제하는 기능을 하는 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자로서,
    조절인자가
    SEQ ID NO: 40, 52, 53, 54 및 55로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어진, 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자의 번역 개시 부위와 상보적인 누클레오티드 염기 서열;
    SEQ ID NO: 32 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어진, RNA 분자의 스플라이스 부위를 경계짓는 엑손의 일부와 상보적인 누클레오티드 염기 서열;
    SEQ ID NO: 64로 이루어진, RNA 분자의 종결 코돈의 3' 영역과 상보적인 누클레오티드 염기 서열;
    SEQ ID NO: 48로 이루어진, RNA 분자의 개시 코돈의 5' 영역과 상보적인 누클레오티드 염기 서열; 및
    SEQ ID NO: 11로 이루어진, 클래스 II 분자에 결합된 비변이 쇄 펩티드 (the class II-associated invariant chain peptides: CLIP 펩티드)를 엔코딩하는 영역과 상보적인 누클레오티드 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 구성되며,
    조절 인자가 10 내지 50개 누클레오티드 염기로 이루어진 공중합체이고,
    이러한 공중합체가 포유류 Ii 단백질을 엔코딩하는 RNA 분자에 특이적으로 하이브리드화되는 능력에 의해 특징화되며,
    올리고누클레오티드 CTCGGTACCTACTGG가 특이적으로 배제되는 특이적 조절인자.
  2. 제 1항에 있어서, 누클레오티드 염기가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포라미데이트, 포스포트리에스테르, 2'-데옥시리보오스, 2'-O-알킬 리보오스, 2'-O-알케닐 리보오스, 2'-O-치환된 알킬 리보오스, 모르폴린, 아미드 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 잔기를 포함하는 골격에 결합되어 있음을 특징으로 하는 특이적 조절인자.
  3. 제 2항에 있어서, 누클레오티드 염기가 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 2,6-디아미노푸린, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 특이적 조절인자.
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  56. a) MHC 클래스 II 분자-양성이거나 MHC 클래스 II 분자 발현을 유도하는 악성 세포 군집을 제공하는 단계; 및
    b) 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 단계 a)의 MHC 클래스 II-발현 악성 세포내로 도입시켜 내인성 항원 결정인자의 제시를 향상시키는 단계를 포함하여, 악성종양에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써 악성종양을 치료하는데 사용하기 위한 세포를 제조하는 방법.
  57. 삭제
  58. 제 56항에 있어서, 단계 b)에 의해 생성된 세포가 복제 불능으로 됨을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 56항에 있어서, Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자가 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 MHC 클래스 II-발현 악성 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 56항에 있어서, 단계 a)의 악성 세포 군집이 환자로부터 수득됨을 특징으로 하는 방법.
  61. a) MHC 클래스 II 분자-양성이거나 MHC 클래스 II 분자 발현을 유도하는 악성종양의 항원 결정인자를 발현하거나 포함하고 있는 세포 군집을 제공하는 단계; 및
    b) 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 단계 a)의 MHC 클래스 II-발현 악성 세포내로 도입시켜 내인성 항원 결정인자의 제시를 향상시키는 단계를 포함하여, 악성종양에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써 악성종양을 치료하는데 사용하기 위한 세포를 제조하는 방법.
  62. 삭제
  63. 제 61항에 있어서, 단계 b)에 의해 생성된 세포가 복제 불능으로 됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 61항에 있어서, Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자가 일렉트로포레이션에 의해 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 61항에 있어서, 단계 a)의 세포 군집이 환자로부터 수득됨을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자를 항암 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 포함하는, 악성종양을 치료하기 위한 약제 조성물.
  67. 삭제
  68. 제 66항에 있어서, 일일 투여될 특이적 조절인자의 양이 10 ㎍ 내지 100 ㎎임을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제 66항에 있어서, 조성물이 정맥내 주입, 체강내 주입, 피부를 통한 흡수, 점막 표면을 통한 흡수 및 위장관을 통한 흡수로 구성된 군으로부터 선택된 방식으로 투여됨을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제 66항에 있어서, 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  71. a) MHC 클래스 II 분자-양성이거나 MHC 클래스 II 분자 발현을 유도하는 바람직하지 않은 세포 군집으로부터 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 단계 a)의 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입시켜 항원 결정인자의 MHC 클래스 II 제시를 향상시키는 단계를 포함하여, 바람직하지 않은 세포 군집에 대한 면역학적 공격을 향상시킴으로써 비악성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 세포를 제조하는 방법.
  72. 삭제
  73. 제 71항에 있어서, 단계 b)에 의해 생성된 세포가 복제 불능으로 됨을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 71항에 있어서, Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자가 일렉트로포레이션에 의해 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 71항에 있어서, 바람직하지 않은 세포 군집이 자가면역 질환과 관련된 자가반응성 T 림프구를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 71항에 있어서, 바람직하지 않은 세포 군집이 바이러스-감염된 세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현 또는 면역조절 기능의 특이적 조절인자를 항질환 면역 반응을 유도시키기에 충분한 양으로 포함하는, 자가면역 질환을 치료하기 위한 약제 조성물.
  78. 삭제
  79. 제 77에 있어서, 일일 투여될 특이적 조절인자의 양이 10 ㎍ 내지 100 ㎎임을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제 77항에 있어서, 조성물이 정맥내 주입, 체강내 주입, 피부를 통한 흡수, 점막 표면을 통한 흡수 및 위장관을 통한 흡수로 구성된 군으로부터 선택된 방식으로 투여됨을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제 77항에 있어서, 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  82. a) MHC 클래스 II 분자-양성이거나 MHC 클래스 II 분자 발현을 유도하는 세포를 제공하는 단계;
    b) 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입시키는 단계;
    c) 단계 b)에 의해 생성된 MHC 클래스 II-발현 세포를 용해시키는 단계;
    d) 단계 c)의 용해된 세포로부터 MHC 클래스 II 분자 및 결합된 자가결정인자 펩티드를 정제하는 단계; 및
    e) 단계 d)의 MHC 클래스 II 분자로부터 자가결정인자 펩티드를 단리하는 단계를 포함하여, 세포로부터 자가결정인자 펩티드를 단리시키는 방법.
  83. 삭제
  84. 제 82항에 있어서, Ii 단백질의 특이적 조절인자가 일렉트로포레이션에 의해 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  85. a) MHC 클래스 II 분자-양성이거나 MHC 클래스 II 분자 발현을 유도하는 세포 군집을 제공하는 단계;
    b) 제 1항에서 기술한 Ii 단백질 발현의 특이적 조절인자를 단계 a)의 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입시키는 단계;
    c) 단계 b)에 의해 생성된 MHC 클래스 II-발현 세포를 용해시키는 단계;
    d) 단계 c)의 용해된 세포로부터 MHC 클래스 II 분자 및 결합된 자가결정인자 펩티드를 정제하는 단계; 및
    e) 단계 d)의 MHC 클래스 II 분자로부터 자가결정인자 펩티드를 단리시키는 단계를 포함하여, 병원성 자가면역 반응을 치료하는데 사용하기 위한 자가결정인자 펩티드를 제조하는 방법.
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  87. 제 85항에 있어서, Ii 단백질의 특이적 조절인자가 일렉트로포레이션에 의해 MHC 클래스 II-발현 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 85항에 있어서, 세포가 병리학적 작용에서 활성인 T 세포 수용체를 발현시키는 T 림프구임을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 85항에 있어서, 세포가 병원성 자가면역 반응의 표적 세포임을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 85항에 있어서, 세포가 바이러스에 의해 감염됨을 특징으로 하는 방법.
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