KR100676508B1 - 닭 β-글로빈 5′ＨＳ4 인슐레이터250-ｂｐ“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를이용하는 형질전환 동물 - Google Patents
닭 β-글로빈 5′ＨＳ4 인슐레이터250-ｂｐ“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를이용하는 형질전환 동물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마우스 WAP(Whey Acidic Protein) 프로모터와 비상동(heterologous) 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 DNA 콘스트럭트에 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp “코어”성분을 포함시킨 벡터를 제작하고 이를 인간을 제외한 포유동물에 도입시켜 크로모좀 위치 효과(chromosomal position effect)를 억제함으로써 인간을 제외한 형질전환 포유동물의 젖샘과 젖에서 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 수준의 현저한 증가가 있도록 개선된, 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물에 관한 것이다.
혈액응고 제 8 인자, 마우스 WAP 프로모터, 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 코어, 형질전환 동물
Description
도 1a는 형질전환 유전자(transgene) 콘스트럭트 WAP-FⅧ의 구조도(N: Not1, E: EcoRⅠ, RV: EcoRⅤ, S: SalⅠ).
도 1b는 형질전환 유전자 콘스트럭트 DC-WAP-FⅧ의 구조도(N: Not1, E: EcoRⅠ, RV: EcoRⅤ, S: SalⅠ).
도 2는 WAP-FⅧ 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 유전자의 지놈 DNAs의 써던 블롯 결과.
도 3은 출산 후 11 일째 암컷 형질전환 마우스의 젖에서의 FⅧ 항원의 정량적 분석 그래프.
도 4a는 WAP-FⅧ 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 F1 마우스의 젖샘에서 얻은 총 RNAs 중의 FⅧ mRNA을 위한 반-정량적인 RT-PCR 분석 사진.
도 4b는 도 4a의 FⅧ mRNA의 정량 분석 그래프.
도 5a는 WAP-FⅧ 형질전환 F1 마우스의 각 장기조직들에서 얻은 총 RNAs 중 의 FⅧ mRNA을 위한 반-정량적인 RT-PCR 분석 사진.
도 5b는 DC-WAP-FⅧ 형질전환 F1 마우스의 각 장기조직들에서 얻은 총 RNAs 중의 FⅧ mRNA을 위한 반-정량적인 RT-PCR 분석 사진.
본 발명은 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마우스 WAP(Whey Acidic Protein) 프로모터와 비상동(heterologous) 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 DNA 콘스트럭트에 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함시킨 벡터를 제작하고 이를 인간을 제외한 포유동물에 도입시켜 크로모좀 위치 효과(chromosomal position effect)를 억제함으로써 인간을 제외한 형질전환 포유동물의 젖샘과 젖에서 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 수준의 현저한 증가가 있도록 개선된, 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물에 관한 것이다.
혈액응고 제 8 인자(FⅧ)는 혈액응고를 위한 필수적인 보조인자로 기능하는 거대 혈장 당 단백질이다. FⅧ가 양적 또는 질적으로 결핍되면 혈우병 A를 야기한다. 혈우병 A는 혈장에서 유래되거나 또는 재조합된 FⅧ 생산물을 이용한 단백질 대체 요법으로 치료해 왔다. 그러나 혈장에서 유래된 FⅧ을 이용한 치 료방법은 바이러스 감염에 대한 위험이 존재하고 지속적으로 공급해야 하는 필요성 때문에 재조합 기술은 이용하는 방법에 대한 연구가 널리 이루어져 왔다. 또한, FⅧ 생산물의 한정된 이용성 및 높은 비용 때문에 단백질 대체 요법에 의한 치료방법은 수요에 따라 제한적으로 사용되어 왔다.
인간 FⅧ(hFⅧ)는 2,351-아미노산의 280 kDa 단일-사슬 당단백질로 합성된다. 혈액 속에서 hFⅧ 단백질 수준은 혈액응고 제 9 인자(4 ∼ 8 mg ml-1)와 간 폴리(A)+ RNA의 0.001 % 만을 차지하는 hFⅧ mRNA(100 ∼ 200 ng ml-1)에 비해서 낮다. 포유류 세포 배양 시스템에서 FⅧ의 발현량은 유사한 발현 전략을 사용하는 다른 유전자들의 경우보다 20 ∼ 30 배 떨어지는 것으로 알려져 있다. 이것은 FⅧ의 불충분한 세포간 전달, 낮은 수준의 FⅧ 분비 및 상기 응집인자의 단백질 분해(proteolytic degradation)에 대한 심한 감수성과 같은 번역 후 FⅧ 생산의 낮은 효율 때문일 것으로 여겨진다[Kaufman et al., 1989. Effect of von Willebrand factor coexpression on the synthesis and secretion of factor VIII in Chinese hamster ovary cells. Mol. Cell. Biol. 9, 12331242]. 더구나, 시험관 내의 다양한 세포 형태에서 FⅧ mRNA의 감소가 관찰되었다. 공개된 데이터는 hFⅧ cDNA가 번역 수준에서 자신의 발현을 억제하고 궁극적으로 제 9 인자(FⅨ)와 같은 다른 cDNA 서열을 가지는 벡터들에 비해서 30 내지 100 배 감소된 hFⅧ cDNA 발현 효율을 나타내는 사일렌서(silencer)와 같은 서열을 포함한다는 충분한 증거를 제공한다. 이러한 감소는 방법에 따라 어떤 방향 및 위치에서 발생한다.
재조합 FⅧ를 이용하는 단백질 치료법은 재조합 FⅧ의 낮은 생산 효율 때문에 가장 값비싼 단백질 치료법 중의 하나이다. 형질전환 동물에서 저렴한 비용으로 FⅧ를 생산하려는 대안적이고 수많은 시도가 있었다. 젖에서 FⅧ를 발현시킨 예가 형질전환 돼지, 양, 및 토끼에 대해서 보고 되었다[Hiripi et al., 2003. Expression of active human blood clotting factor VIII in mammary gland of transgenic rabbits. DNA Cell Biol.22, 41-45 등]. 그러나 돼지, 양, 및 토끼에 있어서, 젖에서 FⅧ의 발현 수준은 단백질 C 및 FⅨ와 같이 비슷한 크기의 다른 단백질의 경우에 비해서 낮았다. 이것은 상기의 세포에서 FⅧ의 낮은 발현 수준과 염색질에 집적된 FⅧ 형질전환 유전자 직렬 배열의 유전자 침묵 효과(gene silencing effect) 때문인 것으로 판명되었다.
형질전환 동물에서 FⅧ 형질전환 유전자의 침묵 효과(silencing effect)를 극복하기 위해서 새로운 콘스트럭트를 도입할 필요가 있었다. 클론된 hFⅧ 지놈 서열을 YACs와 같은 인공 염색체 벡터에 삽입시키는 방법을 이용하여 이를 극복하려는 시도가 있었다. 또한, 형질전환 유전자의 충분한 발현을 얻기 위하여 중요한 조절 요소(regulatory element)를 사용하는 것도 효과적인 방법이다. 상기 조절 요소에는 유전자 인슐레이터(gene insulators), 크로마틴 오프너(chromatin openers), 매트릭스 부착 영역(matrix attached regions), 인헨서(enhancers) 및 인트론(introns) 등이 포함된다.
닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터는 형질전환 동물 및 세포 주에서 형질전환 유전자(transgene)의 진정염색질 형성 및 발현에 도움이 되는 추가적 DNA-결합 단 백질의 보충을 통해 개방 크로마틴 영역의 형성 가능성을 증가시킬 수 있다고 제안되어 왔다. 닭 β-글로빈 자리의 5′말단에 인슐레이터 성분은 구성상 DNase 에 잘 잘리는 과민 자리(constitutive hypersensitive site) HS4를 포함하는 1.2-kb DNA 단편으로 알려져 있다. 최근 연구는 이 과민 자리를 포함하는 250-bp“코어”성분이 인헨서 블록킹(enhancer blocking) 및 세포 주에서 염색체 위치 효과(chromosomal position effect)의 억제에 있어서 작용할 수 있음을 보여준다.
하지만 이러한 역할은 세포주를 이용한 in vitro 상에서 알려져 있으나 이러한 역할이 범용적으로 적용되는지 밝혀지지 않았으며 이러한 인헨서 블록킹(enhancer blocking) 및 세포 주에서 염색체 위치 효과(chromosomal position effect)의 억제가 형질전환동물에서 형질전환 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있고 염색체 위치 효과를 억제할 수 있는지는 보이지는 못하였다. 또한 형질전환동물에서 250-bp“코어”성분에 대한 그 작용기전 및 역할에 대해서는 밝혀진 점이 없다.
이에 본 발명자들은 이러한 종래 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 마우스 WAP(Whey Acidic Protein) 프로모터와 비상동(heterologous) 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 DNA 콘스트럭트의 한 쪽 말단 또는 양 쪽 말단에 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분 두 카피(two copies)를 포함시킨 재조합 벡터를 제작하고 이를 마우스에 도입시키면 형질전환 마우스의 젖샘과 젖에 서 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 수준의 현저한 증가가 있다는 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 마우스 WAP 프로모터, 비상동(heterologous) 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 유전자를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 도입한 인간을 제외한 형질전환 동물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 마우스 WAP 프로모터, WAP에 비상동인 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 서열번호 2로 표시되는 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 유전자를 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 마우스 WAP(Whey Acidic Protein) 프로모터와 비상동 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 DNA 콘스트럭트에 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함시킨 벡터를 제작하고 이를 인간을 제외한 포유동물에 도입시켜 크로모좀 위치 효과(chromosomal position effect)를 억제함으로써 인간을 제외한 형질전환 포유동물의 젖샘과 젖에서 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 수준의 현저한 증가가 있도록 개선된, 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물에 관한 것이다.
형질전환 동물에서 인간 혈액응고 제 8 인자(FⅧ)를 생산하기 위해서 수많은 시도가 있으나 종래에는 FⅧ가 형질전환 동물의 젖에서 충분히 발현되지 않았으나, 본 발명에서는 단백질의 생산에 직접 관여하지 않는 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터의 코어 부분(250-bp)을 조절 요소로 사용하여 형질전환 유전자의 크로모좀(chromosome)의 위치에 따라 목적 단백질이 발현되기도 하고 그렇지 않기도 하였던 염색체 위치 효과(chromosomal position effect)를 억제한다. 이러한 염색체 위치 효과는 많은 형질전환체가 염색체 상에 위치할 때 비 특정적인 부분에 인테크레이션(integration)됨으로써 형질전환체의 발현정도는 그 주위의 환경, 즉 위치한 주위 부분의 전사 활성(transcriptional activity)의 정도에 따라 차이가 있다는 것이다. 또한 형질전환 유전자(transgene)는 대체족으로 여러 카피가 이어진 다-복합(multi-complex) 형태로 인테그레이션(integration)되어 그 발현량이 저하되는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 인간을 제외한 형질전환 동물에 적용되어 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 및 mRNA의 수준을 현저히 증가시킬 수 있는데, 상기 형질전환 동물에는 마우스, 소, 젖소, 토기, 돼지 등이 포함된다. 그리고 본 발명의 WAP에 비상동인 단백질에는 인간 혈액응고 제 8 인자, EPO, G-CSF, von Wilibrend Factor(vWF), Factor IX, Factor VII 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 혈우병 치료 용도로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 인간 전체-길이(full-length) FⅧ cDNA의 클로닝
울트라 HF RT-PCR 시스템 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 뉴클레오타이드 7237-7258(유전자은행 접속번호 NM000132)을 포함하는 유전자에 특이적인 프라이머(서열번호 3)를 이용하여 역전사를 수행하였다. 인간 간 mRNA 5.0 ㎍, 10X 역전사 버퍼 1 ㎕, F8B10 프라이머(서열번호 3) 0.1 μM, 4 mM dNTPs, RNase 저해제 1 유닛, 및 역전사 효소 10 유닛을 넣고 총 부피를 10 ㎕의 반응 혼합물(reaction mixture)을 만들었다. 그리고 cDNA를 발생시키기 위해서 반응 혼합물을 42 ℃에서 90 분 동안 배양하였다. 합성된 cDNA는 Pfu 폴리머레이즈와 유전자 특이적 프라이머 3 세트를 사용한 표준 PCR 프로토콜로 증폭하였다. 첫 번째 프라이머 세트(정방향: 서열번호 4 및 역방향: 서열번호 5)는 뉴클레오타이드 133-1997(유전자은행 접속번호 NM000132)를 담당한다. 두 번째 프라이머 세트(정방향: 서열번호 6 및 역방향: 서열번호 7)와 세 번째 프라이머 세트(정방향: 서열번호 8 및 역방향: 서열번호 3)는 각각 뉴클레오타이드 1810-4295와 4044-7320을 담당한다. PCR은 95 ℃에서 1 분 30 초 동안 변성(denaturation) 1 사이클, 증폭 45 사이클(95 ℃에서 30 초, 56 ℃에서 30 초, 및 68 ℃에서 6 분) 및 68 ℃에서 10 분 동안 신장(extension) 1 사이클의 조건 및 과정으로 수행되었다. 증폭된 단편은 pCR2.1 TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 서브클론되었고, 세 개의 서브클론된 단편은 KpnI and NsiI 절단 자리를 이용하여 pCR2.1 TOPO 벡터에 삽입되었다.
실시예 2 : 형질전환 유전자 발현 카세트의 제조
WAP-FⅧ와 인슐레이터-WAP-FⅧ-인슐레이터 형질전환 유전자의 개략도를 도 1a와 도 1b에 나타내었다. WAP-FⅧ의 경우에는 전체-길이 FⅧ cDNA가 2.4-kb 프로모터 서열의 WAP 유전자 다음에 삽입되었고(EcoRI-KpnI 단편), 그 뒤에 pBluescript SKII(pBS, Stratagene)에서 제작되었고 Not1과 Sal1 자리에 의해 접합된 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션(bGHpA) 시그널 서열을 위치시켰다. DC-WAP-FⅧ은 상기 WAP-FⅧ의 양 쪽에 250-bp 닭 β-글로빈 인슐레이터 코어 서열의 두 카피(two copies)를 접합시켰다. 250-bp 닭 β-글로빈 인슐레이터 코어 서열 두 카피를 포함하는 단편은 KpnI에 의해 pNI-CD에서 절단되었고, T4 DNA 중합효소(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)에 의해 블런트(blunt) 말단으로 되었으며, pBS의 블런트 말단 BamHI 자리에 클론되었다. 인슐레이터 코어 서열의 또 다른 두 카피는 pBS의 블런트 말단 ClaI 자리에 삽입되었다(DC-pBS).
완성된 재조합 벡터를 한국미생물 보존센터에 DC-WAP-FⅧ-pBS[KCCM 10620]로 기탁하였다. 방향성(orientation)은 시퀀싱에 의해 확인하였다. WAP-FⅧ 발현 카세트는 NotI-SalI 단편으로 WAP-FⅧ에서 절단되었고, T4 DNA 중합효소에 의해 블런트 말단으로 되었으며, DC-pBS의 EcoRV 자리에 삽입되었다(DC-WAP-FⅧ-pBS). 모든 구성성분의 방향성 및 보존성(integrity)은 제한효소 분해 특성 (restriction enzyme digestion diagnosis)과 시퀀싱에 의해 확인하였다.
상기 도 1a 및 도 1b에서 형질전환 유전자의 4.7-kb EcoRⅠ단편을 감지하는 프로우브로 800-bp FⅧ cDNA 단편을 사용하였다.
실시예 3 : 형질전환 마우스의 발생
형질전환 마우스는 DC-WAP-FⅧ-pBS 플라스미드 벡터로부터 얻은 아가로스 겔-정제된 NotI-SalI 단편을 수정된 마우스 배의 전핵에 주사함으로써 발생되었다. 형질전환 파운더(transgenic founder)는 써던 블롯 혼성법과 PCR에 의해 꼬리 DNA를 분석함으로써 확인되었다. 꼬리 생검법으로부터 EcoRI-절단된 지놈 DNAs(5 ㎍)은 0.8 % 아가로스 겔을 이용한 전기영동법으로 분리되었고 나일론 멤브레인에 전이되었다. 혼성화는 형질전환 콘스트럭트로부터 증폭되고 랜덤 프라이밍(random priming)에 의해 32P-dCTP로 방사능 표지된 0.8 kb 단편(인간 FⅧ cDNA 4346-5141 bp, GenBank accession no. NM000132)을 이용하여 수행되었다.
실시예 4 : 젖의 제조와 FⅧ 항원의 정량화
각각의 형질전환 주(line)로부터 얻은 A F1 암컷 마우스를 임의로 선택하였다. 젖은 출산 후 11 일째에 -80 ℃에서 보관된 50 IU 옥시토신(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)을 복막 내 투여한 후에 신경세포가 없는 비-형질전환 및 형질전환 F1 암컷 마우스에서 수집되었다. 젖은 인산 버퍼 살 린(PBS, pH 7.4) 5 부피로 희석되고 원심분리(13,000 X g, 20 분, 4 ℃)하고 지방층의 유청(whey)과 불용성 침전물을 제거하였다. 유청 시료는 -80 ℃에서 보관되었다. IMUBIND FⅧ ELISA 키트(American Diagnostica, Greenwich, CT, USA)를 이용하여 젖에 존재하는 FⅧ 항원의 수준을 결정하기 위하여 ELISA 분석법을 수행하였다. 분석은 1 mU ml-1을 감지하기 충분할 정도로 정밀하고 200 mU ml-1까지 선형적이었다. 젖 시료가 5 내지 100 배 희석되었기 때문에, FⅧ 항원의 검출 한계는 5 mU ml-1였다. 비-형질전환 마우스로부터 얻은 젖의 흡광도 값(background)은 시료의 값에서 공제하였다. 1000 밀리유닛(mU)은 FⅧ 항원 0.1 ㎍에 해당된다.
실시예 5 : 조직에서 FⅧ mRNA 발현의 반-정량 분석
동물들은 젖을 수집한 후에 희생되었다. 조직은 수집되어 -80 ℃에서 보관되었다. 간(Li), 비장 및 췌장(Pa/Sp), 뇌(Br), 신장(Ki), 폐(Lu), 심장(Ha) 및 난소(Ov)에서 얻은 총 RNA는 트리졸 시약(Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. 조직에서 FⅧ mRNA의 발현은 반-정량 RT-PCR에 의해 분석되었다. 역전사는 울트라 HF RT-PCR 시스템 키트(Stratagene)을 이용하여 수행하였다. DNase 처리 후 1 ㎍의 총 RNA는 올리고(dT) 프라이머와 dNTP 혼합물에 혼합되었다. 합성된 cDNA는 Taq 중합효소와 FⅧ cDNA(793 bp)에 특이적인 프라이머(정방향: 서열번호 9, 역방향: 서열번호 10)를 이용한 표준 PCR 프로토콜에 의해 증폭되었다. RT- PCR 반응에 사용된 상기 RNA 시료들의 보존성을 보이기 위해, 마우스 β-액틴에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머(정방향: 서열번호 11, 역방향: 서열번호 12, 403-bp product 생산)로 평형 증폭(parallel amplifications)을 수행하였다.
WAP-FⅧ 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스의 젖샘에서 FⅧ mRNA 발현과의 비교를 위해서, 다수의 PCR 사이클(FⅧ은 30 사이클, β-액틴은 24 사이클)과 가열 온도(FⅧ은 56.0 ℃, β-액틴은 58.3 ℃)이 사용되었다. 형질전환 마우스의 다양한 조직에서 FⅧ mRNA 발현에 대한 반-정량 분석을 위하여, DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스 젖샘의 총 RNAs의 RT 부산물 양을 조절하여 35 PCR 사이클을 수행하였다. 반응 부산물은 1.5 %의 아가로스 겔로 전기영동 되었다. 밴드 인텐시티(intensity)는 다-분석 소프트웨어 프로그램(Version 1.01; Bio-Rad)이 장착된 농도계(densitometer, Model GS-690; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 분석되었다. 정량화를 위하여, 시그널의 밀도는 β-액틴의 밀도에 대해 표준화되었다.
RT-PCR의 농도계 분석과 FⅧ 항원의 정량화로부터 얻은 데이터는 스튜던트 t-테스트에 의해서 분석되었다. 0.05 미만의 p-값이 통계적으로 중요하게 취급된다.
실시예 6 : 형질전환 유전자를 적재한 형질전환 마우스의 특징
추정되는 WAP-FⅧ 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스는 EcoRI으로 분해된 지놈 DNA의 써던 블롯에 의해 스크리닝 되었다(도 2). 보존된 형질전환 유전자를 EcoRI으로 절단하였더니 4.7-kb 인간 FⅧ cDNA를 포함하는 EcoRI 단편을 얻었다.
WAP-FⅧ 콘스트럭트가 미세 주사된 58 마리 마우스 중에서 써던 프로우브(probe)에 따라 총 6 마리의 마우스가 형질전환 유전자에 대해 양성이었다(도 2). DC-WAP-FⅧ-DC 콘스트럭트를 전핵에 주사한 후에 72 마리 중에서 7 마리 마우스가 써던 블롯 분석에 의해서 형질전환으로 확인되었다. FVB/N 마우스에 역교배(back-crossed)된 경우, 모든 형질전환 주(line)는 형질전환 유전자의 생식 계통 전달을 나타내었다.
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 WAP-FⅧ로 발생된 6 마리의 형질전환 마우스(라인 1 ∼ 6), 비-형질전환 마우스(라인 7), 및 DC-WAP-FⅧ로 발생된 7 마리의 형질전환 주(라인 8 ∼ 14)로부터 얻은 EcoRⅠ으로 절단된 마우스 꼬리 지놈 DNAs 5 ㎍을 DNA 프로우브로 혼성화시켰다. 그림 밑 부분의 숫자는 형질전환 주의 번호를 나타낸다.
실시예 7 : DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스의 젖과 젖샘에서 FⅧ 발현의 증가
WAP-FⅧ의 6 마리 파운드 라인, DC-WAP-FⅧ의 7 마리 파운더 라인, 및 비-형질전환 마우스에서 생산된 암컷 형질전환 F1 마우스가 젖에서 FⅧ의 발현을 위해서 분석되었다. FⅧ 항원의 정량적인 분석에 따라, 젖에서 FⅧ 항원의 수준이 출산 후 11-13 일째에 최고 수준에 이른다는 것과(데이터가 표시되지는 않음), WAP-FⅧ의 6 마리 파운드 라인 중에서 3 마리만 젖에서 감지할 수 있는 수준의 FⅧ 단백질을 생산하는데 반하여, DC-WAP-FⅧ의 7 마리 파운더 라인은 모두 젖산에서 FⅧ 단백질을 생산한다는 것을 보여주었다. 출산 후 11 일째의 젖에서 DC-WAP-FⅧ 형질전환 F1 마우스의 FⅧ 항원 수준은 WAP-FⅧ 형질전환 F1 마우스로부터 얻은 것보다 3 ∼ 4 배 높았다(도 3, p〈 0.01). 형질전환 유전자의 상대적인 카피(copy) 수는 써던 블롯 분석법에 의해 결정되었다. WAP-FⅧ 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스 모두에서, FⅧ 항원과 형질전환 유전자의 카피 수 사이에는 상호관련성이 없었다. 반-정량적인 RT-PCR은 출산 후 11 일째 젖에 포함된 FⅧ의 양이 확인된 WAP-FⅧ(라인 8, 19 및 46에서 얻은 F1 암컷 마우스) 및 DC-WAP-FⅧ(라인 2, 13 및 25에서 얻은 F1 암컷 마우스) 형질전환 마우스의 젖샘에서 얻은 총 RNAs 중에서 FⅧ mRNA의 수준을 비교하기 위하여 수행되었다. 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, DC-WAP-FⅧ 주에서 FⅧ mRNA의 양은 WAP-FⅧ 형질전환 마우스 주(p〈 0.01)의 경우보다 약 3 배 많았다.
도 5a 와 5b에서 볼 수 있는 바와 같이 유선이외의 타 장기조직에서 발현된 FVIII mRNA의 양은 WAP-FⅧ 형질전환 마우스 주(라인 8, 19 및 46에서 얻은 F1 암컷 마우스) 및 DC-WAP-FⅧ 형질전환 마우스 주 사이에 큰 차이점이 없어 코어 시퀀스가 타 조직에서의 형질전환체의 비 이상적 발현을 증가시키지 않는다는 점이 밝혀졌다. 도 5b에서 DC-WAP-FⅧ 마우스의 유선들(Ma로 표시)로부터 얻은 cDNA의 양은 비교를 위하여 1/10 희석하여 사용하였다.
상술한 바와 같이 본 발명의 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 형질전환 동물은 마우스 WAP(Whey Acidic Protein) 프로모터와 비상동(heterologous) 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 DNA 콘스트럭트에 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분을 포함시킨 벡터를 제작하고 이를 인간을 제외한 포유동물에 도입시켜 크로모좀 위치 효과(chromosomal position effect)를 억제함으로써 인간을 제외한 형질전환 포유동물의 젖샘과 젖에서 혈액응고 제 8 인자 등의 비상동 단백질 수준의 현저한 증가시키는 효과가 있다. 또한 형질전환 동물 내에서 그 형질전환체의 발현율도 혁신적으로 증가시키는 효과가 있었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 서열번호 1로 표시되는 마우스 WAP 프로모터, WAP에 비상동인 단백질인 혈액응고 제 8 인자(FⅧ)를 코딩하는 DNA 서열 및 서열번호 2로 표시되는 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분로 이루어진 유전자.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분이 2 카피인 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 닭 β-글로빈 5′HS4 인슐레이터 250-bp“코어”성분이 한 쪽 말단 또는 양 쪽 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 5 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 DC-WAP-FⅧ-pBS[KCCM 10620]인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 5 항의 재조합 벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질전환 동물.
- 제 6 항의 재조합 벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질전환 동물.
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- 2004-11-24 KR KR1020040096813A patent/KR100676508B1/ko not_active IP Right Cessation
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|---|
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