KR100643836B1

KR100643836B1 - 단포자의 액체종균배양을 이용한 자낭균문 또는 담자균문자실체의 대량생산방법

Info

Publication number: KR100643836B1
Application number: KR1020050020660A
Authority: KR
Inventors: 성재모; 박영진; 쉬레스타 부샨
Original assignee: 주식회사머쉬텍; 성재모
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2006-11-10
Also published as: KR20060099297A

Abstract

본 발명은 단포자의 액체종균배양을 이용한 자낭균문 자실체의 대량생산방법에 관한 것으로, 번데기동충하초의 균주를 액체배양하여 인공자실체의 형성을 유도하고 이로부터 단포자를 분리하여 교배형을 조사한 다음, 단포자의 교배를 통해 인공자실체 형성이 우수한 균주를 선발하고, 상기 균주의 단포자로부터 인공자실체의 최적생산조건을 확립하여 인공자실체를 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

자낭균문, 담자균문, 번데기동충하초, 자실체, 단포자, 액체배양, 대립교배형

Description

단포자의 액체종균배양을 이용한 자낭균문 또는 담자균문 자실체의 대량생산방법{A mass production method of fruiting bodies of Ascomycota or Basidiomycota using liquid spawn culture of single ascospore strains}

도 1은 번데기동충하초 원균의 보관 기간에 따른 인공자실체의 생물학적 효율을 나타낸 그래프이다.

도 2는 번데기동충하초로부터 분리한 단포자의 액체종균의 제조방법에 따른 인공자실체의 생물학적 효율을 나타낸 그래프이다.

도 3은 번데기동충하초로부터 분리한 단포자의 액체종균의 균총 접종비율에 따른 인공자실체의 생물학적 효율을 나타낸 그래프이다.

도 4는 번데기동충하초로부터 분리한 단포자의 액체종균의 균총 접종량에 따른 인공자실체의 생물학적 효율을 나타낸 그래프이다.

도 5는 번데기동충하초로부터 분리한 단포자의 액체종균의 보관 온도에 따른 인공자실체의 생물학적 효율을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명 동충하초의 단포자를 이용한 인공자실체의 생산방법을 도식화한 것이다.

본 발명은 단포자의 액체종균배양을 이용한 자낭균문 또는 담자균문 자실체의 대량생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 번데기동충하초의 균주를 액체배양하여 단포자를 분리하고 단포자 균주의 교배를 통해 인공자실체 형성이 우수한 균주를 선발하고, 상기 균주의 단포자로부터 형성되는 인공자실체의 최적생산조건을 확립하여 자낭균문 또는 담자균문의 인공자실체를 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

코디셉스속(Cordyceps) 균은 곤충의 몸을 기주로 하여 자실체를 형성하는 곤충기생균(Entomopathogenic fungi)으로써 자낭균류의 동충하초속에 속하는 균들로 약 300여종이 보고되었으며, 국내에서도 번데기동충하초 등 약 76종이 보고된 바 있다(성, 1996). 동충하초속균의 분류학적 위치는 자낭균문(Ascomycota), 자낭각균강(Pyrenomycetes), 맥각균문(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipiceae), 동충하초속(Cordyceps)에 속하는 균이다(Samson, 1974). Seaver(1911)은 북미의 코디셉스속(Cordyceps) 18종과 동충하초의 대표종(type species)으로 번데기동충하초(Cordyceps militais)를 소개하였다. 번데기동충하초(C. militaris)는 주로 나비목(Lepidoptera)의 유충 또는 번데기를 기주로하여 주황색의 곤봉형(cylindrical)의 자좌(stromata)를 형성하는 곤충기생성균(Entomopathogenic fungi)의 일종이며, 자낭각(perithecium)은 반나생형이며, 원통형의 자낭(ascus) 내에는 사상의 자낭포자(ascospore)들이 존재한다. 자낭포자는 2차 포자(secondary ascospore)로 분리·발아하여 균사(hypha)로 생장한다.

동충하초의 연구는 형태적인 분류와 생물적 방제제의 개발, 분자생물학적 연구, 성분 분석과 유용물질 검색, 동충하초의 인공재배에 관한 연구가 진행되고 있으며, 특히 성분 분석과 유용물질 검색 분야에서는 동충하초의 추출물을 이용하거나 추출분말을 이용한 종양성장 억제, 면역 활성, 항산화 작용에 관한 연구들이 발표되고 있다.

특히, 번데기동충하초(C. militaris)는 cordycepin을 다량 함유하고 있는 동충하초의 대표 종으로서 항균, 항암, 면역기능 증강 및 마약에 대한 해독기능 등을 지니는 것으로 보고하였다. Kinjo et al.(1996)은 번데기동충하초 배양균사로부터 추출한 물질에서 생리활성과 동충하초속(Cordyceps sp.), 균핵동충하초(C. ophioglossoides) 로부터 추출한 다당류에서 항종양에 대한 치료효과가 있다고 보고했다. Zhu et al.(1998)는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis) 균주의 각종 생리활성, 동물 및 임상시험에 대한 과학적인 자료로 정리한 총설이 있다. 김 등(2001)은 번데기동충하초에서 추출한 에르고스테롤 페록사이드(ergosterol peroxide) 성분이 항암 성분중의 하나라고 보고하였으며, Oh et al.(2003)는 동충하초 품종별 영양성분 비교에서 종양세포의 mRNA 합성저해에 기인한다고 알려진 코디셉틴(cordycepin)의 함량이 다른 동충하초에 비해 번데기동충하초에서 8~23 배 정도 높았는데, 이는 액체배양으로 획득한 코디셉틴 함량보다 더 높게 조사되었다고 보고하였다(Oh et al., 2003; Cunningham et al., 1951). 이러한 생리활성 물질을 추출하여 약리작용을 연구하기에는 자연산 동충하초 확보가 매우 어렵기 때문에 동충하초의 인공재배에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 인공재배에 있어 동충 하초의 인공자실체 형성은 매우 미흡한 실정이며, 인공자실체 형성보다는 균사 배양이 더 활성화되어 있다.

Shrestha(2003)에 의하면 번데기동충하초의 mating type을 이용하여 단포자가 MAT1-1, MAT1-2의 2극성(dipolar)으로 나타났으며, 번데기동충하초 균이 heterothallic이라는 것을 밝혀냈다.

이점에 착안하여 본 발명자들은 동충하초은행에 보관중인 균주의 교배에 의한 인공자실체 형성이 우수한 균주를 선발하고, 번데기동충하초의 인공자실체 형성에 불안정적인 요소를 조사하여 건실한 인공자실체 형성을 위한 조건을 확립하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자실체 형성이 우수한 동충하초 균주로부터 단포자를 분리하고 단포자의 액체종균배양을 통해 자낭균문 또는 담자균문의 인공자실체를 대량생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 동충하초은행에 보관 중인 균주를 액체배양하여 인공자실체를 형성시키고, 이로부터 단포자를 분리하고 액체배지에 서로 다른 단포자 균주의 균총을 접종하여 배양한 다음 자실체 형성을 유도한 후 교배형(mating type)을 조사하고, 각 단포자 균주를 교배를 통해 자실체 형성이 가장 우수한 균주를 선발하고, 번데기동충하초 균주의 인공자실체 최적생산조건을 규명하기 위해, 원균의 보관방법, 단포자 균주의 액체종균의 제조방법, 균총 접종비율 및 접종량, 액체종균의 보관 온도 및 기간에 따른 인공자실체 형성을 유도하여 생물학적 효율 을 조사함으로써 달성하였다.

본 발명은 동충하초은행에 보관 중인 균주의 인공자실체로부터 단포자 분리단계: 상기 단포자의 교배형 조사단계: 상기 단포자 균주의 교배를 통한 자실체 형성이 가장 우수한 균주 선발단계: 번데기동충하초 균주의 자실체의 최적생산조건 확립단계로 구성된다.

본 발명은 자낭균문 또는 담자균문 균주에서 분리한 2개의 서로 다른 대립교배형 단포자 균주를 액체배양하고, 상기로부터 얻은 2개의 대립교배형 단포자 균주들의 액체종균을 현미를 포함한 자실체형성배지에 1:4 ∼ 4:1의 비율로 접종하며, 상기 균총의 최적 접종량은 자실체형성배지 1L당 20∼25 mL로 하여 액체배양하여 자실체를 생산함을 특징으로 하는 자낭균문 또는 담자균문의 자실체 대량생산방법을 제공한다.

상기 자낭균문 또는 담자균문은 번데기동충하초, 느타리버섯, 표고버섯 또는 양송이버섯을 포함한다.

본 발명 자낭균문 또는 담자균문의 자실체 대량생산방법에 있어서, 2개의 대립교배형 단포자 균주들을 액체배양하여 얻은 액체종균의 자실체형성배지로의 균총 접종비율은 1:4 ∼ 4:1이며, 바람직하게는 1:1이며, 상기 균총의 최적 접종량은 자실체형성배지 1L당 20∼25 mL 을 접종한다. 이때, 상기 액체종균은 균주의 균사 선단 일부를 살균 SDAY 액체배지에 접종하여 3일간 배양한 후, 100mL의 상기 액체종균을 2L SDAY 액체배지에 접종하여 4일간 배양하여 얻은 균총을 접종한다.

상기 단포자 균주는 4℃에서 0∼18주 동안 보관된 것을 사용하고, 상기 액체종균은 4℃에서 0∼60일 또는 실온에서 0∼30일 동안 보관된 균주를 사용한다.

본 발명 자낭균문 또는 담자균문의 자실체 대량생산방법에 있어서, 상기 대립교배형 단포자 균주의 액체종균은 2개의 단포자 균주를 각각 액체배양한 다음 현미를 포함한 자실체형성배지에 함께 접종하거나 또는 2개의 대립교배형 단포자 균주를 함께 액체배양하여 이를 자실체형성배지에 접종함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 인공자실체 형성이 우수한 번데기동충하초 균주의 선발

본 발명 인공자실체 형성이 우수한 번데기동충하초 균주를 선발하기 위해 국내에서 채집·분리되어 EFCC(Entomopathogenic Fungal Culture Collection)에서 보관 중인 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균주 C-5736을 포함 10균주(C-5736, C-5941, C-5976, C-6040, C-6849, C-7268, C-7342, C-7992, C-8027, C-8549)를 우수 균주 선발을 위해 사용하였으며, 이 공시균주는 SDAY 고체배지에 이식하여 24±1℃에서 배양하고 4℃에서 보관하며 사용하였다. 각 공시균주의 포자(multi-ascospore)를 접종원으로 이용하여 인공자실체를 형성하였다. 인공자실체 형성 배지로는 1,000cc pp병에 현미 60g과 번데기 10g, 증류수 70mL로 조제한 배지를 121℃, 1.2 기압(kgf/cm²)에서 20분간 살균하였다. 이렇게 조제된 배지에 액체종균을 접종하여 균사배양 온도 24±1℃, 자실체 형성 온도 20℃의 배양환경에서 자실체 형성을 유도하였다.

그 결과, C-5736 균주를 포함한 10균주의 인공자실체 형성 실험에서는 C-5941, C-5976, C-6040, C-6849, C-8549, C-7992 균주는 자좌와 자낭각을 형성하였으며, 번데기동충하초(C. militaris)의 자연적인 자실체의 색인 주황색을 띠어 자실체의 형태가 양호하였다. 그러나 C-5736과 C-8027 균주는 자좌와 자낭각이 형성되었지만 자실체의 색이 주황색이 아닌 흰색을 띠어 자실체의 형태가 양호하지 않았다. 또한 C-7268과 C-7342는 자실체가 발이는 되었으나 더 이상 생장하지 못해 자좌와 자낭각을 형성하지 않았다.

단포자의 분리

상기 인공자실체 형성 시 자낭각이 형성된 자좌를 이용하여 단포자를 분리하였다. WA(Water agar)상에 포자를 받은 후 해부현미경상에서 단포자(single ascospore)를 분리하여 미리 제조해 놓은 SDAY 고체배지에 접종 후 균사 배양실(24±1℃)에서 2주간 배양하였다. SDAY 고체배지에서 2주간 배양된 단포자 균주의 콜로니 색을 조사하였다.

번호	단포자균주 번호^a
번호	1	2	3	4	5	6
C-5736	O^b	LO	LY	PY	Y	Y
C-5941	PO	Y	Y	OW	Y	Y
C-5976	PY	PY	PO	PY	Y	LY
C-6040	PY	Y	LO	Y	OW	LO
C-6849	YW	LO	Y	Y	LY	OW
C-8549	Y	LO	LY	Y	LO	Y
C-7992	LY	OW	LY	Y	LO	PY
C-8027	LY	YW	OW	LO	LO	PO

^a생육조건: SDAY, 25℃, 2주간.

^bO : Orange(5A6, 5A7), Y : Yellow(4A6), LO : Light orange(5A4, 5A5), LY : Light yellow(4A4, 4A5), PO : Pale orange(5A3), PY : Pale yellow(4A3), OW : Orange white(5A2), YW : Yellowish white(4A2).

표 1에 나타난 바와 같이, C-5736을 포함하여 8균주에서는 자좌와 자낭각이 모두 형성되어 단포자를 6개씩 분리하였다. 각 균주에서 분리된 단포자의 콜로니 색을 조사한 조사한 결과, yellow(4A6), light yellow(4A4, 4A5), pale yellow(4A3), yellowish white(4A2), orange (5A6, 5A7), light orange(5A4, 5A5), pale orange(5A3), orange white(5A2) 등 다양한 색깔의 콜로니를 형성하였다.

단포자의 교배형(mating type) 조사

상기 동충하초 균주의 인공자실체에서 분리한 단포자 균주의 mating type을 조사하기 위해, 각 균주의 인공 자실체에서 분리된 단포자 균주를 6개씩 선발하였다. 6개의 단포자 균주에 번호를 부여하여 균사 선단부분을 직경 5 cork borer로 절단한 후 서로 다른 단포자 균주의 균총을 두 개씩 250mL-Erlenmeyer flask에 상기에서 제조된 살균 SDAY 액체배지 100 mL에 접종하였다. 접종 후 120rpm, 24±1℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 3일간 배양시켰다. 이 액체종균을 자실체형성배지에 접종한 후 24±1℃의 균사배양실로 옮겨 10일간, 20±1℃의 자실체 형성 배양실에서 32일간 배양 후 인공 자실체 형성을 유도하여 mating type을 조사하였다.

그 결과, 각 균주에서 분리된 단포자를 이용하여 mating 실험한 결과 C-5736, C-5941, C-6040, C-7992, C-8549 단포자 균주에서는 mating이 확인되었으며, C-5976, C-6849, C-8027 단포자 균주에서는 mating이 확인되지 않았다.

mating type	균주
mating type	C-5736	C-5941	C-5976	C-6040	C-6849	C-8549	C-7992	C-8027
A	1^a	5		6		1	1
	3	6				4	2
	6						5
a	2	1	1	1	1	2	3	1
	4	2	2	2	2	3	4	2
	5	3	3	3	3	5	6	3
		4	4	4	4	6		4
			5	5	5			5
			6		6			6

a: 단포자 균주 수

표 2에 나타난 바와 같이, C-5736-1을 A 형, C-5736-2를 a 형으로 임의로 분류하여 단포자 균주의 mating type을 조사한 결과, mating이 확인된 5개의 균주에서 A형과 a형의 단포자 균주가 분리되었고, mating이 확인되지 않은 3개의 균주는 a형의 단포자 균주만이 분리되었다. 실험된 8개의 균주에서 A형의 단포자 균주는 총 11개, a 형의 단포자 균주는 37개로 분리되었다.

단포자 균주의 sister-crossing을 통한 균주 선발

상기 단포자 균주의 mating type을 조사하여 얻은 결과로부터 sister-crossing을 통해 단포자 균주 간의 인공자실체를 형성시켰다.

우선, 각 단포자 균주를 1부터 6까지 번호를 부여하여 조합된 15개의 조합을 이용하여 액체배지에 균사 선단부분을 직경 5 cork borer로 절단한 후 15개의 다른 조합의 액체종균을 제조하였다. 준비된 액체종균을 상기에서 제조된 살균 SDAY 액체배지에 접종한 후, 상기의 자실체 생산 조건 하에서 인공자실체 형성을 유도하여 자실체의 길이, 자실체 생체중, 자실체 건중량, 총중량, 생물학적 효율(B.E.)을 조사하였다. 각 단포자 균주의 조합 중 가장 양호한 인공자실체를 조사하여 우수 균주로 선발하였다.

조합	자좌의 길이 (mm)	자실체 생중량 (g/bottle)	자실체 건중량 (g/bottle)	총량 (g/bottle)	생물학적 효율 (%)^a
C-8549 2×4	48	63.8	8.23	129.1	27.1
C-5736 1×4	67	53.8	8.86	134.9	24.2
C-6040 1×6	83	57.7	7.93	134.3	23.0
C-7992 2×4	63	60.4	8.47	137.9	23.0
C-5941 1×5	42	38.1	6.57	124.7	17.3

a: 생물학적 효율(%)=(자실체 건중량/기질 중량)×100

표 3에 나타난 바와 같이, C-5736 균주의 9개 조합에서는 1×4 조합의 생물학적 효율(Biological efficiency(%))은 24.2%로 가장 높았으며 자실체의 생체중과 건중량이 다른 단포자 균주 조합에 비해 높았다. 비록 자실체의 길이는 67mm로 짧았으나 상대적으로 밀도가 높은 것을 알 수 있었다. C-5941 균주의 8개 조합에서는 1×5 조합의 생물학적 효율이 17.3%로 가장 높았다. C-6040 균주의 5개 조합에서는 1×6 조합의 생물학적 효율이 23.6%로 가장 높았으며, 자실체의 생체중과 건중량도 높게 조사되었다. C-7992 균주의 9개 조합에서는 2×4 조합의 생물학적 효율이 23.0%로 가장 높았으나, 자실체의 형태가 불규칙적이며 흰색의 자실체가 보였다. C-8549 균주의 8개 조합에서는 2×4 조합의 생물학적 효율이 27.1%로 각 균주의 조합들 중에서 가장 높은 생물학적 효율이 조사되었다. C-8549의 단포자 균주 조합의 인공자실체의 형태는 불규칙적이며 자좌가 붙어서 나오는 기형과 자실체에 흰 균사가 더 자람을 볼 수가 있었다.

이 결과는 양호한 인공자실체에서 분리한 단포자와 양호하지 못한 인공자실체에서 분리한 단포자는 인공자실체 형성에 있어 차이를 보이지 않았으며, 단지 단포자의 교배형이 인공자실체 형성에 큰 영향을 미치는 것으로 사료된다.

실험예 1: 단포자 균주의 콜로니 색과 인공자실체 형성 관계

상기 교배 실험으로 획득한 39개 조합의 단포자 균주의 콜로니 색과 인공자실체 형성과의 연관성을 조사하였다.

그 결과, 각 단포자 균주의 콜로니 색 조합 수는 차이가 있었지만 생물학적 효율 평균을 보면 모두 비슷한 결과를 보였다. 인공자실체의 형성은 단포자 균주의 분리 시 대립 교배형 비율에 따른 차이일 뿐이며, 콜로니 색과 인공자실체의 형성의 상호연관성은 매우 적은 것으로 사료된다. 또한 각 콜로니 조합의 생물학적 효율 평균을 보면 차이가 없었다. 이것은 어떠한 콜로니 조합이라도 인공자실체를 형성시킬 수 있으며, 수량적인 면에서도 차이가 없다는 것을 말한다. 즉 인공자실체 형성과 콜로니 색 조합의 연관성은 없는 것으로 사료된다.

실시예 2: 번데기동충하초 균주의 인공자실체 최적생산조건 규명

실시예 1에서 선발된 인공자실체 생산이 우수한 번데기동충하초 균주의 인공자실체 생산을 위한 최적조건을 규명하기 위해, 균주의 활력에 따른 인공자실체 형성 실험을 실시하였다. 이때 사용한 균주는 2003년 8월 30일자로 충청도 소백산에서 채집·분리되어 EFCC(Entomopathogenic Fungal Culture Collection)에서 보관 중인 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균주 C-10995의 10개 단포자 균주를 사용하였다. 이 공시균주는 SDAY 고체배지에 이식하여 24±1℃에서 배양하고 4℃에서 보관하며 사용하였다.

인공자실체 형성을 위해, 10개의 C-10995-1~10의 단포자를 SDAY 고체배지에 분리하였다. 250mL-삼각플라스크에 SDAY 액체배지를 100mL씩 분주한 후 121℃, 1.2 기압(kgf/cm²)에서 20분간 살균하여 조제한 후 배양실에서 2주간 배양된 단포자 균주를 SDAY 액체배지에 접종하여 120rpm, 24±1℃의 진탕배양기에서 3일간 배양시켰다.

Mating 실험을 위해 1,000cc pp(polypropylene)병에 현미 60g과 번데기 10g, 증류수 70mL을 넣고 121℃, 1.2psi에서 20분간 살균하여 만든 배지에 액체종균을 접종하였다. 24±1℃의 균사배양실로 옮겨 10일간 배양 후 20℃의 자실체 배양실에서 32일간 배양 후 자좌와 자낭각의 형성유무를 통한 mating type을 조사하여 균주를 선발하였다.

그 결과, C-10995 균주의 10개의 단포자를 이용하여 Mating 실험을 통해 두 가지 교배형으로 분리할 수 있었다. C-10995의 단포자 균주 번호인 1, 3, 5, 7, 9, 10번과 2, 4, 6, 8번이 대립 교배형으로 나타났다. 이에 각 대립 교배형인 단포자 균주 C-10995-3, C-10995-5와 C-10995-6, C-10995-8의 4균주를 선발하였다.

실험예 1: 원균의 보관방법에 따른 인공자실체 형성

원균의 보관방법에 따른 인공자실체 형성을 실험하기 위해, 공시균주 C-10995 단포자 균주를 4℃ 냉장보관에서 기간을 2주로 하여 균주의 활력을 실험하였다. 기간은 2주마다 250mL-Erlenmeyer flask에 액체종균 100mL를 배양한 후 준비된 현미배지에 접종하였다. 24±1℃의 균사배양실로 옮겨 10일간, 20℃의 자실체 형성 배양실에서 32일간 배양 후 인공 자실체 형성을 유도하여 자실체의 길이, 자실체 생체중, 자실체 건중량, 총중량, 생물학적 효율(B.E.)을 조사하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 원균의 보관(4℃) 기간에 따른 인공 자실체 형성 결과 균주 18주 보관 기간까지 번데기동충하초 인공자실체 수확량의 생물학적 효율이 4개 조합 모두에서 양호하였고, 균주 20주 보관에서는 C-10995 3×6 조합이 다른 조합에 비교하여 불량하였다. 균주 22주 보관에서는 C-10995 3×6 조합을 포함하여, C-10995 3×8, C-10995 5×6 조합의 인공자실체 생물학적 효율이 각 9.5%, 4.0%, 3.6%로 매우 낮았으나, C-10995 5×8 조합은 생물학적 효율이 21.9%로 양호하였다. 이 결과 균주의 4℃ 냉장보관 시 적정보관 기간은 18주로 조사되었다.

실험예 2: 액체종균의 제조방법에 따른 인공자실체 형성

C-10995-3과 C-10995-6의 단포자 균주를 이용하여 액체종균의 제조방법에 따른 실험을 하였다. A형으로 단포자 균주를 같은 250mL-Erlenmeyer flask에 100mL SDAY 액체종균을 제조하여 배양한 후 같은 배양병인 8L의 SMS 배지에 접종하였다. B형으로 단포자 균주를 각 다른 250mL-Erlenmeyer flask에 100mL SDAY 액체종균을 제조하여 배양한 후 같은 배양병인 8L의 SMS배지에 접종하였다. C형으로 단포자 균주를 각 다른 250mL-Erlenmeyer flask에 100mL SDAY 액체종균을 제조하여 각 다른 8l의 액체 배지에 접종하였다. 세 종류의 액체종균을 20~25mL씩 접종한 후 실험예 1의 조건에서 인공자실체 형성을 유도하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, B형이 가장 높은 생물학적 효율(24.3%)을 나타내었으며, 다음으로 A형, C형 순으로 생물학적 효율이 조사되었다. 그러나 세 가지 유형의 덩컨의 다중범위 검정 결과 A, B형은 5% 수준에서 유의한 차이가 없었으며, C형과는 5% 수준에서 유의하였다.

실험예 3: 액체종균의 균총 접종비율에 따른 인공자실체 형성

액체종균을 Erlenmeyer flask에서 배양 시 균총 접종 비율을 실험하기 위해 단포자 균주 C-10995-3과 C-10995-6 균주의 균총 접종 비를 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1, 4:1로 하여 250mL-Erlenmeyer flask에 SDAY 액체배지를 100mL씩 분주하여 제조한 액체배지에 균사 선단부분을 직경 5 cork borer로 절단한 후 접종하여 액체종균을 제조하였다. 이를 현미배지에 접종하여 실험예 1의 조건에서 인공자실체 형성을 유도하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, Erlenmeyer flask 배양에서 균총 접종 비율을 조사 결과 단포자 균주 C-10995-3과 C-10995-6 균주의 균총 접종 비율을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1, 4:1로 하였을 때 각 생물학적 효율 범위가 21.2~24.7%로 차이가 없었다. 이는 액체종균 제조 시 같은 flask에 단포자 균주를 접종하였을 때 대립 단포자간에 서로 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 액체종균의 접종량에 따른 인공자실체 형성

액체종균의 접종량에 따른 인공자실체 형성을 알아보기 위해, 공시균주 C-10995 단포자 균주의 C-10995-3×C-10995-6, C-10995-5×C-10995-8 조합으로 각 균주 균사 선단부분을 직경 5 cork borer로 절단한 후 각 2개씩 균총을 살균 SDAY 액체배지에 접종하여 120rpm, 24±1℃의 진탕배양기에서 3일간 배양시켰다. 2L의 배양병에 SDAY 액체배지를 만든 후 121℃, 1.2psi에서 50분간 고압 살균하였다. 100mL의 액체종균을 2L 액체배지에 접종하여 통기량 0.5vvm으로 4일간 배양하였다. 1000cc pp병에 현미 60g과 번데기 10g, 수분량 70mL을 넣고 121℃, 1.2psi에서 20분간 살균하여 현미배지를 만든 다음, 현미배지 1L 당 상기 액체종균을 5∼40mL 씩 각각 접종한 후 실험예 1의 조건에서 인공자실체 형성을 유도하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 액체종균의 접종량에 따른 인공자실체 형성 결과 C-10995 3×6 조합의 생물학적 효율은 접종량 5~20mL까지 증가하였으며, 25mL 이상 접종 시 비슷한 생물학적 효율이 조사되었다. C-10995 5×8 조합의 생물학적 효율은 접종량 5~15mL 까지 증가하였으며, 20mL 이상 접종 시 비슷한 생물학적 효율이 조사되었다. 이에 액체종균의 적정 접종량은 20~25mL로 조사되었다. 또한, 접종량이 증가할수록 자실체 생육이 떨어지거나 증가하지는 않았다.

실험예 5: 액체종균의 보관 온도 및 기간에 따른 인공자실체 형성

100mL의 액체종균을 SMS 배지의 8L, 18L SDAY 액체배지에 접종하여 통기량 1.5vvm으로 5일간 배양하였다. 각 종균을 4℃ 냉장보관과 25℃의 보관온도에서 5일 간격으로 준비된 현미배지에 접종하고, 실험예 1의 조건에서 인공자실체 형성을 유도하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 4℃ 냉장보관 방법과 25℃의 실온 보관 방법에서 보관 기간 결과는 60일까지 생물학적 효율은 양호하였으나, 25℃ 실온 보관 방법에서는 35일 보관 후 인공자실체 형성에 있어 자실체 모양이 구부러짐과 기형적으로 발생하여 4℃ 냉장보관에 비해 품질 저하를 보였다. 이에 4℃ 냉장보관에서는 60일간, 25℃ 실온 보관에서는 30일간 보관하는 것이 적당한 것으로 조사되었다. 또한 배양병 8L와 18L에서 액체종균의 보관에 있어 차이점은 보이지 않았다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 단포자의 액체종균배양을 이용한 자낭균문 자실체의 대량생산방법에 관한 것으로, 번데기동충하초의 균주를 액체배양하여 인공자실체의 형성을 유도하고 이로부터 단포자를 분리하여 교배형을 조사한 다음, 단포자의 교배를 통해 인공자실체 형성이 우수한 균주를 선발하고, 상기 균주의 단포자로부터 인공자실체의 최적생산조건을 확립하여 인공자실체를 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 항균, 항암 기능등이 뛰어난 동충하초 자실체를 대량으로 생산할 수 있어 기능성식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

자낭균문 또는 담자균문의 자실체 대량생산방법에 있어서,

자낭균문 또는 담자균문 균주에서 단포자를 분리하고,

상기 단포자를 교배하여 2개의 서로 다른 대립교배형 단포자 균주를 얻고,

상기 대립교배형 단포자 균주의 균사 선단 일부를 살균 SDAY 액체배지에 접종하여 3일간 배양한 후, 100mL의 상기 액체종균을 2L SDAY 액체배지에 접종하여 4일간 액체배양하고,

상기로부터 얻은 2개의 대립교배형 단포자 균주들의 액체종균을 1:4 ∼ 4:1의 비율로 혼합하고,

상기 혼합 종균을 현미와 번데기로 제조된 자실체형성배지 1L당 20∼25 mL로 접종하고 액체배양하여 자실체를 생산하는 것을 특징으로 하는 자낭균문 또는 담자균문의 자실체 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 상기 자낭균문 또는 담자균문은 번데기동충하초, 느타리버섯, 표고버섯 또는 양송이버섯을 포함함을 특징으로 하는 자낭균문 또는 담자균문 자실체의 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 상기 대립교배형 단포자 균주의 액체종균은 2개의 단포자 균주를 각각 액체배양한 다음 현미와 번데기로 제조된 자실체형성배지에 함께 접종하거나 또는 2개의 대립교배형 단포자 균주를 함께 액체배양하여 이를 자실체형성배지에 접종함을 특징으로 하는 자낭균문 또는 담자균문 자실체의 대량생산방법.