KR100607031B1 - 다이옥신을 분해하는 신규한 미생물 슈도모나스속 균주 피에이치-03 - Google Patents

다이옥신을 분해하는 신규한 미생물 슈도모나스속 균주 피에이치-03 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다이옥신 화합물을 분해하는 새로운 미생물인 슈도모나스 (Pseudomonas) 균주 PH-03(KCTC 10614BP)에 관한 것이다.
본 발명에 의해 다이옥신 화합물을 분해하는 새로운 미생물인 슈도모나스속 균주 PH-03이 제공된다.
또한, 이 균주를 활성성분으로 함유하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해, 제거용 미생물 처리제가 제공되어 환경을 경제적이고 효율적으로 정화, 복원할 수 있다.
다이옥신, 분해, 미생물, 디벤조퓨란, 슈도모나스

Description

다이옥신을 분해하는 신규한 미생물 슈도모나스속 균주 피에이치-03{NEW MICROORGANISM PSEUDOMONAS SP. PH-03, CAPABLE OF DEGRADING DIOXINS}
도 1은 본 발명의 슈도모나스 속 균주 PH-03 에 의한 디벤조퓨란의 생물학적 분해과정을 나타내는 그림.
본 발명은 다이옥신을 분해하는 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 PH-03 (KCTC 10614BP)에 관한 것이다.
보다 상세하게는 소각장 주변의 토양으로부터 분리된 신규 미생물로서 다이옥신을 분해하는 슈도모나스 속 균주 PH-03(Pseudomonas sp. PH-03)과, 상기 미생물을 활성성분으로 함유하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해.제거용 미생물 처리제 및 상기 미생물 또는 처리제를 이용하여 다이옥신을 분해.제거하는 방법에 관한 것이다.
다이옥신(dioxin)은 인류가 만들어낸 환경호르몬 중 그 독성 및 위험성에 있 어서 최악의 독성물질로 꼽히고 있다. 보통 다이옥신이라는 말을 사용 할 때는 다이옥신과 다이옥신 유사물질들을 총칭해서 말하게 되며 다이옥신과 구조적으로 유사한 화학물질들로서 다이옥신과 비슷한 특성 및 독성을 가지고 있는 화합물에는 염화디벤조 퓨란(다염화디벤조퓨란[polychlorinated dibenzofurans, PCDFs], 퓨란)과 염화비페닐(다염화비페닐[polychlorinated biphenyls, PCBs], 디페닐 에테르, 나프탈렌) 등이 있다.
다이옥신은 인위적으로 제조되거나 사용되는 물질은 아니며 염소나 브롬을 함유하는 산업공정에서 화학적인 오염물로서 또는 염소가 함유되어 있는 화합물을 소각하는 과정에서 생성된다.
다이옥신은 자연계에 한 번 생성되면 잘 분해되지 않고 안정적으로 존재하게 된다. 다이옥신은 공기와 물속에서 입자(먼지)에 가장 잘 결합하며 토양과 침전물 중에 있을 때는 유기물과 결합한다. 한번 입자와 결합한 다이옥신은 쉽게 분해되지 않고, 잘 기화되지도 않는다.
현재까지 다이옥신을 처리하는 방법은 열분해, 촉매분해, 활성탄흡착 등 물리화학적인 방법이 주류를 이루고 있고 미생물에 의한 처리에 관한 연구는 매우 미진하다. 그 이유는 효과적으로 다이옥신을 분해 또는 제거하는 미생물이 밝혀진 것이 매우 적으며 이를 이용한 생물공정 또한 개발이 되지 않고 있기 때문이다.
본 발명의 출원인의 선발명으로서, 한국등록특허공보 10-0403267(다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착. 제거하는 신규미생물 바실러스 퍼밀러스 BS-019 및 이를 이용한 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착.제거 방법)이 공개되어 있다.
또한, 본 발명의 출원인의 선발명인 한국공개특허공보 특2003-0091603(다이옥신을 분해하는 신규 미생물 페니바실러스속 균주 Probio-41), 한국공개특허공보 특2003-0091604(다이옥신을 분해하는 신규 미생물 로도코커스속 균주 Probio-42), 한국공개특허공보 특2003-0091605(다이옥신을 분해하는 신규 미생물 로도코커스속 균주 Probio-43)가 공개되어 있다.
본 발명은 다양한 쓰레기를 소각하거나 산업활동 과정에서 발생하는 유독물질인 다이옥신을 분해-제거하는 미생물 PH-03을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 상기 미생물을 활성성분으로 함유하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해용 미생물 처리제를 제공하는데 그 목적이 있으며, 상기 미생물 및 처리제를 이용하여 다이옥신을 분해하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 다이옥신을 분해하는 신규한 균주 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주 PH-03(KCTC 10614BP)에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 다이옥신을 분해하는 신규한 균주 슈도모나스 속 균주 PH-03(Pseudomonas sp. PH-03)과, 상기 미생물을 활성성분으로 함유하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해.제거용 미생물 처리제 및 상기 미생물 또는 처리제를 이용하여 다이옥신을 분해.제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 소각장 주변의 토양으로부터 분리된 신규 미생물이다.
본 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 이용한 분자계통분류학적 분석에서 상기 균주는 Pseudomonas 속에 속하는 균주로서 99%의 상동성으로서 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii)와 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
본 균주의 16S rDNA 유전자의 염기 서열은 서열목록에 기재하였다(서열번호 1).
또한, 상기 균주를 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 슈도모나스속 균주 PH-03(Pseudomonas sp. PH-03)으로 명명하고, 특허출원을 위한 국제미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2004년 3월 23일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10614BP).
본 발명자들은 다이옥신을 제거할 수 있는 미생물의 탐색을 시도한 결과, 소각장 주변의 토양으로부터 분리한 한 균주가 다이옥신류 물질의 하나인 디벤조퓨란 (dibenzofuran)을 분해 제거하는 능력이 뛰어난 것을 확인하였으며, 상기 균주로 디벤조퓨란에 대한 생분해 실험과 미생물 동정을 한 결과, 이 균주가 다이옥신을 효울적으로 분해.제거할 수 있는 슈도모나스 속의 유용한 균주임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 다이옥신을 분해-제거하는 미생물을 탐색하는 과정은 하기와 같이 수행하였다. 세균의 분리용 배지로는 탄소원으로 디벤조퓨란을 포함하는 minimal salts medium (MSM : 1.0g K2HPO4, 0.5g NaH2PO4, 1.0g NH4NO3, 0.25g KCl, 0.25g MgSO4·7H2O, 1 ml trace element solution /1 liter)를 사용하였다.
이때 미량원소용액(Trace element solution)의 조성은 다음과 같다: 2.1g FeSO4·7H2O, 0.25g CoCl2·6H2O, 0.024 NiCl2·6H 2O, 0.005g CuCl2, 0.1g MnCl2·4H2O, 0.144g ZnCl2, 0.1g H3BO3, 0.036 Na2MoO4·2H2O, 5.78g Na-EDTA.
고체 MSM 배지에서 자라는 콜로니들을 선택하여 액체 MSM 배지에 접종한 후 약 28 ℃에서 진탕배양하였다.
일정시간이 지난 후 배양액 일정량을 고체 배지에 도말·배양하여 균주들을 순수 분리하였다. 이러한 균주들 중에서 다이옥신 분해 활성이 우수한 균주를 선별하여 PH-03으로 명명하였다.
균주의 성장을 위한 액체배지는 minimal salts medium (MSM : 1.0g K2HPO4, 0.5g NaH2PO4, 1.0g NH4NO3, 0.25g KCl, 0.25g MgSO4 ·7H2O, 1 ml trace element solution / 1 liter, 다이옥신은 아세톤에 녹아있는 상태로 최종 농도가 200 mg/L가 되도록 첨가)을 사용하였다.
다이옥신의 분해능을 테스트하기 위해서는 디벤조퓨란이 첨가된 실험구 (아세톤과 메탄올에 녹인 디벤조퓨란), 디벤조퓨란이 첨가되지 않은 대조구 (아세톤과 메탄올만 첨가), 그리고 상기균주를 첨가하지 않은 대조구를 가지고 배양 실험을 수행하였다.
상기 균주의 균체의 성장 및 디벤조퓨란의 농도를 분석하였다. 균체의 성장은 spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 측정하였고, 다이옥신의 분석은 고성능 액체 크로마토그래피, 가스크로마토그래피 (Thermoquest Trace 2000 GC system) 및 저분해능 질량분석계 (Finnigan Polaris Q)를 사용하였다.
상기 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주를 배양한 후, 16S rDNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석 실험 등을 수행하였다.
본 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 이용한 분자계통분류학적 분석에서 상기 균주는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 균주로서 99%의 상동성으로서 슈도모나스 베로니 (Pseudomonas veronii)와 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
한편, PH-03의 16S rDNA 유전자의 염기 서열은 서열목록에 서열번호 1로 기재된다(서열번호 1).
따라서, 상기 균주를 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 슈도모나스속 균주 PH-03 (Pseudomonas sp. PH-03)으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2004년 3월 23일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10614BP).
또한, 본 발명은 상기 신규의 미생물 균주를 이용하여 다이옥신 및 그 유사물질을 분해, 제거하는 방법을 제공한다. 상기 분해-제거 방법에서, 슈도모나스 속 균주 PH-03이 다이옥신 및 유사물질을 분해, 제거하기 위한 조건으로는 28 ℃가 바람직하다.
본 발명 균주는 순수배양한 후, 배양액 상태로 또는 동결건조하거나 또는 담 체에 고정화하여 다이옥신 또는 그의 유사물질이 오염된 지역에 투입함으로써 다이옥신 오염지역을 정화할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 슈도모나스 속 균주 PH-03은 디벤조퓨란을 유일한 탄소원으로 이용하여 성장하며, 디벤조퓨란을 효과적으로 분해할 수 있었다.
도 1에서는 PH-03 균주의 디벤조퓨란 분해에 관한 데이터를 보여준다. 본 발명 실험 조건에서 PH-03 균주는 1 mM 디벤조퓨란을 60 시간동안 77 % 분해할 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 신규 미생물 균주를 포함하는 폐수, 하수, 하천, 해수 또는 토양 처리제(조성물)를 제공한다.
상기 미생물 처리제는 다이옥신 및 유사물질로 오염된 (1) 다양한 소각로, (2) PVC, 염화용제, 농약을 제조하는 화학공장, (3) 펄프, 제지, 도금 공장 (4) 산불, 화산재 피해를 입은 자연재해지역 및 (5) 이러한 물질을 사용하는 산업 및 농약을 살포한 지역 주변의 폐수, 하수, 하천, 해수 또는 토양등에 적용시 미생물을 이용한 흡착 및 분해 과정을 통하여 환경의 2차 오염 문제를 일으키지 않고, 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효율적으로 정화하는데 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 상기 미생물 처리제는 다이옥신 분해 활성을 갖는 다른 미생물, 예컨대 로도코커스 속 균주 Probio-42(KCCM 10379), 로도코커스 속 균주 Probio-43(KCCM 10380) 등을 추가로 포함하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 출원인이 선출원한 세리포리옵시스속 균주 Probio-57(KCTC 10600BP), 트라메테스속 균주 Probio-58(KCTC 10601BP), 후사리움속 균주 Probio- 59(KCTC 10601BP)을 추가로 포함하여 사용할 수 있으며, 오염지역의 특성에 따라서는 다른 물질의 분해 활성을 갖는 미생물도 선택적으로 포함할 수 있다.
상기 처리제는 본 발명의 미생물을 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 -80 ℃에 보관하거나 멸균된 10 % 탈지유에 현탁하여 동결건조하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 관하여 실시예와 실험예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 다이옥신을 분해하는 미생물의 분리
쓰레기 소각장 주변의 토양으로부터 다이옥신을 분해하는 미생물을 농화배양을 통하여 분리하였다.
세균의 분리용 배지로는 탄소원으로 디벤조퓨란을 포함하는 minimal salts medium (MSM : 1.0g K2HPO4, 0.5g NaH2PO4, 1.0g NH4 NO3, 0.25g KCl, 0.25g MgSO4·7H2O, 1 ml trace element solution / 1 liter)를 사용하였다.
디벤조퓨란 (200 mg/L)이 함유된 액체배지 (50 ml)에 토양 1 g을 넣고 28 ℃에서 1 차 농화배양하였다.
2주일 후 디벤조퓨란이 완전히 분해되고 균체가 충분히 성장하였을 때, 디벤조퓨란이 포함된 새로운 배지에 1차 농화배양액 1 ml을 접종하여 2차 농화배양을 수행하였다.
같은 방법으로 1 주일 후에 3 차 농화배양을 수행하였다.
디벤조퓨란이 완전히 분해되고 얻은 3차 농화배양액을 적절하게 희석하여 고체 영양배지 및 MSM 배지에 도말하였다.
고체 배지에서 자라는 콜로니들을 순수분리 하고, 분해능을 확인하기 위하여 디벤조퓨란이 함유된 액체 MSM 배지 접종한 후 약 28 ℃에서 진탕배양하며 디벤조퓨란의 농도와 균체의 성장을 측정하였다.
이러한 균주들 중에서 다이옥신 분해능이 우수한 균주를 선별하였다.
<실시예 2> 분리한 미생물의 동정
실시예 1에서 분리한 미생물을 준비 하였다.
이 균주의 성장을 위한 한천배지는 영양 배지 (nutrient agar, Difco사 제품)를 사용하였다.
상기의 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주에 대한 16S rDNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하여 수행하였다.
본 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열중 1581 염기서열을 결정하였으며 이 염기서열을 이용한 분자계통분류학적 분석에서 상기 균주는 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 균주로서 99 %의 상동성으로서 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii)와 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
한편, 본 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열은 서열목록(서열번호 1)에 나 타내었다.
따라서, 상기 균주를 슈도모나스(Pseudomonas)에 속하는 슈도모나스속 균주 PH-03(Pseudomonas sp. PH-03)으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2004년 3월 23일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10614BP).
<실험예 1> 슈도모나스 속 균주 PH-03의 디벤조퓨란 분해능 조사
실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 슈도모나스 속 균주 PH-03의 디벤조퓨란을 분해하는 활성을 조사하기 위해서 액체배지 minimal salts medium (MSM : 1.0g K2HPO4, 0.5g NaH2PO4, 1.0g NH4NO3 , 0.25g KCl, 0.25g MgSO4·7H2O, 1 ml trace element solution / 1 liter)에 다이옥신을 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 그 분해정도를 측정하였다.
다이옥신의 분해정도를 측정하기 위해서 디벤조퓨란이 첨가된 실험구(아세톤과 메탄올에 녹인 디벤조퓨란), 디벤조퓨란이 첨가되지 않은 대조구(아세톤과 메탄올만 첨가), 그리고 PH-03을 첨가하지 않은 대조구를 가지고 배양 실험을 수행하였다.
일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 PH-03 균체의 성장 및 디벤조퓨란의 농도를 분석하였다.
균체의 성장은 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 측정하였고, 다이옥신의 분석은 고성능 액체 크로마토그래피, 가스크로마토그래피 (Thermoquest Trace GC 2000 system) 및 저분해능 질량분석계 (Finnigan Polaris Q)를 사용하였다.
그 결과, 본 발명의 슈도모나스 속 균주 PH-03은 디벤조퓨란을 탄소원으로 이용하여 효과적으로 성장할 수 있으며 이과정에서 디벤조퓨란을 물과 이산화탄소로 분해함을 알 수 있었다.
디벤조퓨란의 분해에 관한 데이터를 도 1에 나타내었다.
PH-03 균주는 1 mM 디벤조퓨란을 60 시간동안 77 % 분해할 수 있었다.
본 발명에 의해, 다양한 쓰레기를 소각하거나 산업활동 과정에서 발생하는 유독물질인 다이옥신을 분해하는 미생물 PH-03이 제공된다.
또한, 상기 미생물을 활성성분으로 함유하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해용 미생물 처리제가 제공되며, 상기의 미생물 또는 처리제를 이용하여 다이옥신을 분해하는 방법이 제공된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해활성을 갖는 미생물인 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주 PH-03(KCTC 10614BP).
  2. 제1항의 미생물인 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주 PH-03(KCTC 10614BP)이 함유된 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해용 미생물처리제.
  3. 제2항의 미생물 처리제는, 소각로, PVC, 염화용제, 농약을 제조하는 화학공장, 펄프, 제지, 도금공장, 산불, 화산재 피해를 입은 자연재해지역 및 이러한 물질을 사용하는 지역주변의 폐수, 하수, 하천, 해수, 토양 중에서 선택된 곳에 사용하는 것을 특징으로 하는,
    다이옥신 및 다이옥신 유사물질 분해용 미생물처리제.
  4. 제1항의 미생물 또는 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물처리제를 이용하여 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 분해하는 방법.
KR1020040026597A 2004-04-19 2004-04-19 다이옥신을 분해하는 신규한 미생물 슈도모나스속 균주 피에이치-03 KR100607031B1 (ko)

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