KR100595060B1 - GENE FOR FLORAL INDUTION IN Pharbitis PROTEIN ENCODING BY THE SAME EXPRESSION VECTOR CONTAINING THE SAME - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 나팔꽃의 자엽 특이 개화 유도 유전자, 이에 의해코딩 되는 단백질, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 나팔꽃의 개화 유도와 관련해 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a cotyledon specific flowering induction gene, a protein encoded by the morning glory having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the expression vector comprising the gene, the gene of the present invention can be effectively used in connection with induction of morning glory have.
단백질protein
Description
본 발명은 나팔꽃의 자엽 특이적 개화 유도 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.The present invention relates to a cotyledon-specific flowering induction gene of morning glory, a protein encoded thereby, and an expression vector comprising the same.
고등식물의 발생단계에서 개화의 유도는 가장 중요하고 복잡한 단계중의 하나이다. 식물들 속의 개화는 광주기를 포함해서 몇 개의 환경적 요인들에 의존한다. 많은 식물들 속에서, 광주기의 변화에 의해 유성생식의 단계인 개화가 시작되는데 이 현상을 광주성이라고 한다. 식물들의 광주기적 종들은 대략 24시간을 사이클로 해서 빛과 어둠의 지속에 의해서 조절된다 (Garner and Allard, 1920; Vince-Prue, 1975). 광주기적 반응은 적어도 두 개의 사건으로 분리 되서 일어난다: 잎들과 자엽들 속에서의 유도적 광주기의 감지, 그리고, 정단 분열 조직 속에서 영양단계에서 생식단계로의 이동이 그것이다 (Bernier, 1988). 이것은 정단의 잎과 자엽으로 부터의 신호의 이동, 개화자극 또는 개화 유도 호르몬을 포함한다. 생화학적 연구의 발전에도 불구하고, 정단 끝에서의 이동을 초래하는 개화자극의 주체와 신호 전이 경로의 분자적 요소들이 수수께끼로 남아있다. 개화자극과 억제의 전도를 위한 물리적 증거들과 활성도는 많은 연구자들에 의해서 연구되고 있다. 잎과 자엽의 광주기적 유도 단계는 유전자 발현 속에서의 변화를 포함하는 것을 목적으로 꽃의 정단에서 유도가 된다. 몇 개의 보고에 의하면 약간의 변화들을 위해서 간접적으로 공급 되어 지며 증거들이 제공이 된다 (Bernier, 1988). 분자유전학적으로 개화시간의 유전적 조절을 10년 동안 접근해 왔으며, 개화의 시작을 조절하는 유전자들의 탐구가 증가되어 왔으며, 주로 애기장대를 가지고 이 유전자들이 잠재적 전사 조절자 들로 생각되어져 왔다 (CONSTANS, LUMINIDEPENDENDENS) (Lee et al., 1994; Putterill et al., 1995), (RNA 연결 단백질들) (FCA) (Macknight et al., 1997). 최근에는, 애기장대에서 개화에 관여하는 CONSTANS의 acting down stream과 상동성을 가지는 유전자들 (FT and TFL1)이 밝혀졌다 (Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999). 나팔꽃 속에서 또는 다른 식물 시스템 속에서 광주기적 개화 유도와 관련된 과정의 조절들이 아마도 유전자 발현의 양을 포함해서 수적으로 일어날 것이다. 개화유도 반응 속에서 암기 유도 동안에 자엽 속에서의 몇몇의 단백질과 mRNAs 의 변화를 예상 할 수가 있겠다 (Bassett et al., 1991; Gressel et al., 1978; Lay-Yee et al., 1987; Li and Tan, 1991; Maeng, 1982; Ono et al., 1991, 1993, 1996; Stiles and Davies, 1976). 분자적 수준의 몇몇의 연구들에 의하면, 개화와 관련된 몇몇의 유전자들을 밝히려고 시도했었다 (Bassett et al., 2000; Lay-Yee et al., 1987; O'Neill et al., 1994; Ono et al., 1993; Sage-On et al., 1998; Zheng et al., 1993, 1998). mRNA의 differential display를 이용해서 최근에는 애기장대의 암기 동안의 광주기에 관여하는 CONSTANS 유전자와 상동성을 가지는 PnCO 유전자의 탐구가 이루어지고 있다. 그러나, 개화 시작 속에서의 이 유전자의 작동에 관해서 알려진 증거는 없다. Induction of flowering at the stage of development of higher plants is one of the most important and complex stages. Blooming in plants depends on several environmental factors, including photoperiod. In many plants, the change of photoperiod begins flowering, the stage of sexual reproduction, which is called Gwangju. Photogenic species of plants are regulated by the duration of light and dark over a period of approximately 24 hours (Garner and Allard, 1920; Vince-Prue, 1975). The photoperiod response occurs in at least two separate events: the detection of induced photoperiods in leaves and cotyledons, and the shift from the trophic to the reproductive stages in apical meristem (Bernier, 1988). . This includes signal transduction, flowering stimulation, or flowering-inducing hormones from apical leaves and cotyledon. Despite advances in biochemical research, the molecular components of the signal stimulus and the subjects of flowering stimuli that lead to apical tip movements remain enigmatic. Physical evidence and activity for the induction of flowering stimulation and inhibition have been studied by many researchers. The photogenic step of leaves and cotyledons is induced at the apex of the flower with the aim of including changes in gene expression. Some reports provide indirect supply for some changes and provide evidence (Bernier, 1988). Molecular genetics have approached the genetic regulation of flowering time for 10 years, the search for genes that regulate the onset of flowering has increased, and these genes have been thought of as potential transcriptional regulators, mainly with Arabidopsis ( CONSTANS , LUMINIDE PENDENDENS) (Lee et al ., 1994; Putterill et al ., 1995), (RNA linking proteins) (FCA) (Macknight et al ., 1997). Recently, genes ( FT and TFL1 ) homologous to acting down stream of CONSTANS involved in flowering in Arabidopsis have been identified (Kardailsky et al ., 1999; Kobayashi et al ., 1999). Modulations of processes associated with photogenic induction in morning glory or in other plant systems will probably occur numerically, including the amount of gene expression. Changes in several proteins and mRNAs in cotyledon can be expected during memorization induction in flowering response (Bassett et al ., 1991; Gressel et al ., 1978; Lay-Yee et al ., 1987; Li and Tan, 1991; Maeng, 1982; Ono et al ., 1991, 1993, 1996; Stiles and Davies, 1976). Several studies at the molecular level have attempted to identify several genes associated with flowering (Bassett et al ., 2000; Lay-Yee et al ., 1987; O'Neill et al ., 1994; Ono et al , 1993; Sage-On et al ., 1998; Zheng et al ., 1993, 1998). Recently, the differential display of mRNA has been used to explore the PnCO gene, which has homology with the CONSTANS gene involved in photoperiod during the mesmerizing stage. However, there is no known evidence for the operation of this gene in the beginning of flowering.
본 발명은 광주기 반응 속에서 개화유도와 관련된 유전자들의 분리에 초점을 맞추고 있다. 나팔꽃은 자엽이 다 자란 후에 적어도 14시간의 암기에 의해서 어릴 때 개화의 유도가 일어난다 (Takimoto, 1969). 물리적 증거로 자엽들 속에서 생산되는 암기 동안의 개화자극을 들 수가 있으며, 하부적으로는 정단 분열조직에서도 나타난다 (Zeevaart, 1962). 이 물리적 특징은 단일에서 개화의 광주기적 유도 동안에 나팔꽃을 인기 있는 식물로 만들어 줬다 (Vince-Prue and Gressel, 1985). The present invention focuses on the isolation of genes related to flowering induction during photoperiod reactions. In the morning glory, induction of flowering occurs when the child is young by at least 14 hours of memorization after the cotyledons have grown (Takimoto, 1969). Physical evidence suggests flowering stimulation during memorization produced in cotyledons, and below it also in apical meristem (Zeevaart, 1962). This physical feature has made morning glory a popular plant during the photogenic induction of flowering from single (Vince-Prue and Gressel, 1985).
본 발명에서 우리는 단일 유도 암기 동안에 특정 발현하는 나팔꽃 속의 유전자를 분리해 내고 동정을 했다. 그리고, 이것이 개화의 유도와 관련이 있을 것이다 In the present invention, we isolated and identified genes in the morning glory that express specific expression during a single induced memorization. And this may be related to the induction of flowering
본 발명의 목적은 나팔꽃의 자엽 특이적 개화 유도 유전자를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a cotyledon-specific flowering induction gene of morning glory.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 자엽 특이적 개화 유도 단백질을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a cotyledon-specific flowering induction protein encoded by the gene.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 데 있다. Another object of the present invention to provide an expression vector containing the gene.
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상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 자엽 특이적 개화 유도 유전자 PnFL2를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.In accordance with the above object, the present invention provides a cotyledon specific flowering induction gene PnFL 2 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In the present invention, the gene may be characterized by having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 자엽 특이적 개화 유도 단백질을 제공한다.According to the above another object, the present invention provides a cotyledon-specific flowering induction protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 함유하는 발현벡터를 제공한다.According to another object, the present invention provides an expression vector containing the gene.
삭제delete
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열로 표시되는 특이적 개화 유도 유전자 (PnFL2)로서, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루지 질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴 클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.The gene of the present invention is a specific flowering induction gene ( PnFL 2) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and various modifications may be made to the coding region without changing the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region. In addition, various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of genes in parts other than coding regions, and such modified genes are also included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention also encompasses polynucleotides having fragment sequences that are substantially identical to those of the genes. Substantially identical polynucleotides refer to those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 95%.
본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 206개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 22.8 Kd이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.The protein expressed from the gene of the present invention consists of 206 amino acid residues, has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has a size of 22.8 Kd. However, even in the amino acid sequence of the protein, substitution, addition or deletion of amino acids may be made within a range that does not affect the function of the protein, and only a part of the protein may be used depending on the purpose. Such modified amino acid sequences are also within the scope of the present invention. Thus, the present invention also encompasses polypeptides and fragments thereof having substantially the same amino acid sequence as said protein, wherein substantially identical polypeptides have at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95% sequence homology. It means things that have.
본 발명의 유전자 및 단백질은 나팔꽃으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크린닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 이렇게 만들어진 유전자를 가지고 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. The genes and proteins of the present invention may be isolated from morning glory or synthesized according to known DNA or peptide synthesis methods. For example, the gene of the present invention can be obtained by screening and cloning according to a conventional method based on the nucleotide sequence information of SEQ ID NO: 1. The genes thus produced can be used to replicate DNA in large quantities or to produce proteins in bulk.
나팔꽃의 개화는 광주기에 의해 조절된다. 이 단일 식물은 자엽이 성장한 후에 적어도 14시간은 단일 암기에 의해서 꽃이 유도가 된다 (Imamura, 1967). 물리적 증거는 암기유도 동안에 개화 자극이 자엽 속에서 만들어지며 하부적으로 정단 분열조직에 나타난다 (Zeevaart, 1962).The blooming of morning glory is controlled by photoperiod. This single plant is induced by flowering at least 14 hours after cotyledon growth (Imamura, 1967). Physical evidence suggests that during stimulation, flowering stimuli are produced in the cotyledons and underlying them in apical meristem (Zeevaart, 1962).
본 발명의 유전자를 추출하기 위해서 PCR에 의한 differential display방법을 사용했다. 우리는 PnFL-2 로 디자인된 cDNA클론을 얻었으며 나팔꽃 게놈에서 단일 copy 유전자임을 알 수 있었다. databases search결과 PnFL-2 유전자의 nucleotide는 이전의 밝혀진 유전자들과 별로 상동성이 없는 novel 유전자였다. 본 발명의 유전자는 폴리펩타이드가 애기장대의 알려지지 않은 단백질(GenBank accession no. NP_173352)또는 다른 단백질 (GenBank accession no. NP_177633) 과 50%의 상동성을 가진다. 벼의 알려지지 않은 단백질 (GenBank accession no. AC091734)과는 53%의 상동성을 가진다. PnFL-2 의 아미노산 서열은 mitochondrial energy transfer motif를 포함하고 있다. 그러나, 이 motif가 개화유도와 관계하는 직접적인 증거는 감지 할 수가 없었다.In order to extract the gene of the present invention, a differential display method by PCR was used. We obtained a cDNA clone designed with PnFL-2 and found that it was a single copy gene in the morning glory genome. In the database search, the nucleotide of the PnFL-2 gene was a novel gene with little homology with previous genes. The gene of the present invention has a 50% homology with the polypeptide of the Arabidopsis unknown protein (GenBank accession no. NP_173352) or other protein (GenBank accession no. NP_177633). It has a 53% homology with the unknown protein of rice (GenBank accession no. AC091734). The amino acid sequence of PnFL-2 contains a mitochondrial energy transfer motif. However, the direct evidence that this motif is related to flowering induction could not be detected.
광주기 처리 동안에 자엽속에서의 PnFL-2 mRNA의 양의 시간별 양의 변화는 이 유전자가 개화가 근접하게 관계가 있는 것을 설명 할 수가 있다. PnFL-2 mRNA의 양은 천천히 증가하며, 10시간째에 시작하며 암기의 16시간째에 peak에 도달한다. 명주기에 PnFL-2 mRNA양은 눈에 띄게 감소한다. 나팔꽃의 개화유도는 발생학적 반응으로 단일 처리에 의한 촉진되는 것으로 잘 분석되어져 있다 (Imamura, 1967). 기른 지 6일된 나팔꽃은 단일 14시간암기에 의해서 개화가 유도될 수 있다. 생략된 실험들에서 보면 자엽을 암기나 명기 속에서 4시간을 더 있으면 완벽하게 유도되는 것을 얻을 수 있으며 그 시간에서 개화자극의 양이 포화가 되는 것을 알 수가 있다 (Zeevaart, 1962). 그러므로, 만약에 나팔꽃 자엽 속에서 광주기 유도와 함께 하나 또는 더 많은 유전자의 발현이 변화하면, 14시간 암기 이내에서 감지가 될 것이다. 나팔꽃 속에서 개화유도의 밤 길이와 PnFL-2유전자의 발현패턴의 상관관계는 주목할 만 하다. PnFL-2 의 전사체의 발현은 암 주기의 중간에 15분의 빛을 주면 감소하며 (Fig. 5B), 이것으로 개화유도가 night break 처리에 의해서 억제되는 것을 알 수가 있다. 나팔꽃 (PnGLP, PnC401, PnTCTP, PnZIP, PnCO)의 다른 밝혀진 유전자들은 night break 반응 속에서 발현이 증가하거나 감소하며 circadian 발현양상을 잘 보여준다 (Bassett et al., 2000; Liu et al., 2001; Ono et al., 1996; Sage-Ono et al., 1998; Zheng et al, 1998). 그러나, 암기 동안에 발현이 증가하는 것과 night break 반응 속에 낮은 발현이 개화유도에 관여하는지 분명하지는 않다. 왜냐하면 이 발현 양상은 다른 생화학적 그리고 발생학적 과정과 함께 이에 관여하는 유전자들이 함께 하기 때문이다 (Millar and Kay, 1991; O'neil et al., 1994; Pepper and Chory, 1997; Sage-Ono, 1998). 그러므로, 우리의 결과로 나팔꽃 속의 시간 메카니즘의 존재는 밤 길이와 광주기적 통제의 유전자들의 조절의 관찰로 가능하다고 지적 할 수 있겠다. PnFL-2 mRNA의 기관 특이적 축적은 개화에서 이 유전자의 관여를 반영하며, 자엽이나 잎에서 광주기적 신호의 감지의 기관적 수용과 개화 유도 물질의 합성을 하는 것으로 알려져 있다. The time -dependent change in the amount of PnFL-2 mRNA in cotyledon during photoperiod treatment may explain the close association of this gene with flowering. The amount of PnFL-2 mRNA slowly increases, starting at 10 hours and reaching peak at 16 hours of memorization. In the light cycle, the amount of PnFL-2 mRNA is markedly reduced. The induction of morning glory blooms is well analyzed as a developmental response that is facilitated by a single treatment (Imamura, 1967). A six-day-old morning glory can induce flowering by a single 14-hour memorization. Omitted experiments show that the cotyledons are fully induced by memorizing or specifying the cotyledons for 4 hours and at that time the amount of flowering stimulus is saturated (Zeevaart, 1962). Therefore, if the expression of one or more genes changes with photoperiod induction in morning glory cotyledons, it will be detected within 14 hours of memorization. The correlation between the night length of flowering induction and the expression pattern of PnFL-2 gene in morning glory is notable. The expression of PnFL-2 transcripts decreased with 15 minutes of light in the middle of the cancer cycle (Fig. 5B), indicating that flowering induction was inhibited by night break treatment. Other identified genes of morning glory ( PnGLP , PnC401, PnTCTP, PnZIP, PnCO ) increase or decrease expression during the night break reaction and show good circadian expression (Bassett et al ., 2000; Liu et al ., 2001; Ono et al ., 1996; Sage-Ono et al ., 1998; Zheng et al , 1998). However, it is not clear whether increased expression during memorization and low expression during night break reactions are involved in flowering induction. Because this expression pattern is accompanied by other biochemical and developmental processes, the genes involved in it (Millar and Kay, 1991; O'neil et al ., 1994; Pepper and Chory, 1997; Sage-Ono, 1998). ). Therefore, our results indicate that the presence of the time mechanism in the morning glory is possible by observation of the regulation of the genes of night length and photoperiodic control. Organ- specific accumulation of PnFL-2 mRNA reflects the involvement of this gene in flowering, and is known to synthesize organ induction and flowering-inducing substances in the detection of photoperiodic signals in cotyledons and leaves.
본 발명자들은 PnFL-2 유전자의 기능을 정확하게 설명하기 위해 PnFL-2 유전자 과발현 애기장대를 가지고 표현형 분석을 실시 했다. 장일 조건에서 과발현 애기장대와 야생형의 bolting시간의 차이를 봤을 때 3~4일정도의 시간적 차이가 나는 것을 확인 할 수가 있었으며 이것으로 PnFL-2 유전자가 개화 유도에 간접적으로 관련이 있는 것을 확인 할 수가 있었다. The present inventors in order to accurately describe the function of PnFL-2 gene has PnFL-2 gene over-expressing Arabidopsis thaliana and subjected to the phenotype analysis. When the bolting time of overexpression baby pole and wild type was observed in long-term conditions, it was confirmed that there was a time difference of about 3-4 days, which confirmed that the PnFL-2 gene was indirectly related to induction of flowering. there was.
본 발명에서는 나팔꽃 속에서의 PnFL-2 유전자의 개화 유도의 직접적인 증거는 없을 지라도 결과로 볼 때, 이 novel 유전자는 개화유도과정과 함께 기능적으로 관련되어 있을 수 있다. In the present invention, although there is no direct evidence of the induction of flowering of the PnFL-2 gene in the morning glory, as a result, this novel gene may be functionally related with the flowering induction process.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예 1: PnFL-2 유전자의 클로닝Example 1 Cloning of the PnFL-2 Gene
Chomczynski and Sacchi (1987)의 방법으로 지속적으로 빛과 어둠 속에서 16시간 처리를 한 6일된 자엽 으로부터 Total RNAs를 추출했다. Poly(A+) RNA는 제작자에 방법에 따라 paramagnetic oligo (dT) beads (PolyAtract mRNA isolation II, Promega)를 이용해서 얻었다. Reverse transcription으로 , differential display (Liang and Pardee, 1992)방법을 이용해서 그들이 서로 다르게 발현되는 유전자를 RNAimage kit (GenHunter)를 이용해서 보았다. Differential display PCR은 20개의 다른 조합의 프라이머로 수행했으며 T12MN 프라이머들은 모두 4종류이다. 그리고, 6% polyacrylamide gel에서 한가지 다른 cDNA밴드를 얻을 수 있었다. 그리고, 이 cDNA 절편은 pBluescript SK+ vector (Stratagen)에 서브클로닝 하였다. 이 클론은 나중에 PnFL-1 유전자로 디자인된 같은 유전자에서 나누어진 것이며, 이 cDNAs를 가지고 cDNA library 스크리닝의 probe로 사용했다.Total RNAs were extracted from 6-day cotyledons treated with 16 hours of continuous light and dark by the method of Chomczynski and Sacchi (1987). Poly (A + ) RNA was obtained using paramagnetic oligo (dT) beads (PolyAtract mRNA isolation II, Promega) according to the manufacturer's method. For reverse transcription, the genes they expressed differently using differential display (Liang and Pardee, 1992) were examined using the RNAimage kit (GenHunter). Differential display PCR was performed with 20 different combinations of primers and all four T12MN primers. In addition, one different cDNA band was obtained on 6% polyacrylamide gel. The cDNA fragments were then subcloned into the pBluescript SK + vector (Stratagen). The clone was divided from the same gene, which was later designed as the PnFL-1 gene, and used the cDNAs as a probe for cDNA library screening.
cDNA libraries는 16시간 암기에 노출된 자엽 조직으로부터 Poly(A+) RNA를 이용해서 제작했다. cDNAs는 제작자의 방법으로 λZAPII phage vector (Stratagen)를 이용해서 클로닝 하였다. cDNA library에서 differential display PCR product를 probe (Sambrook et al. 1989)로 가지고 스크리닝 하였으며 스트라타진의 프로토콜에서 묘사된 λZAPII phage vector로부터 in vivo excision pBluescript에 의해 pBluescript SK+ plasmids에 서브클로닝해서 full length PnFL-2 cDNA를 얻었다. cDNA libraries were constructed using Poly (A + ) RNA from cotyledon tissue exposed to 16-hour memory. cDNAs were cloned using λZAPII phage vector (Stratagen) by the manufacturer's method. In the cDNA library, differential display PCR products were screened with probes (Sambrook et al . 1989) and subcloned into pBluescript SK + plasmids by in vivo excision pBluescript from the λZAPII phage vector depicted in the stratazine protocol and in full length PnFL-2 cDNA. Got.
실시예 2: 염기서열 분석 Example 2: Sequencing
PnFL-2 cDNA의 염기서열 분석은 BigDye terminator RR mix (PerkinElmer)와 automated DNA sequencer (model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer)를 이용했다. 뉴클레오티드와 아미노산 서열분석은 DNASIS program (Hitachi Software Inc, Japan)을 이용해서 수행했다. 데이터는 BLAST system (Altschu et al., 1990)과 ExPASy system (Molecular Biology Center at Genova, University Hospital and University of Genova, Genova, Switzerland)을 이용해서 수행했다. The sequencing of PnFL-2 cDNA was performed using BigDye terminator RR mix (PerkinElmer) and automated DNA sequencer (model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer). Nucleotide and amino acid sequencing was performed using the DNASIS program (Hitachi Software Inc, Japan). Data was performed using the BLAST system (Altschu et al ., 1990) and the ExPASy system (Molecular Biology Center at Genova, University Hospital and University of Genova, Genova, Switzerland).
실시예 3: genomic DNA의 분리와 Southern blot 분석 Example 3: Isolation of Genomic DNA and Southern Blot Analysis
Genomic DNA는 Rogers와 Bendich (1988)의 방법에 의해서 나팔꽃 자엽으로부터 분리했다. 그리고, BamHI, BglII, EcoRI, and HindIII (DAKARA)으로 잘라냈다. 잘라낸 DNA는 0.8% agarose gel에 전기영동 했으며, 그리고, nylon membrane filter (Schleicher & Schuell)에 blotting했다. 이 DNA는 6X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS and 100 ㎍/ml salmon sperm DNA이 포함된 hybridization solution속에 32P-labeled full length PnFL-2 cDNA 를 16시간 동안 65℃에서 혼성화 시켰다. 그리고, 실내온도에서 5분 동안 2X SSPE와 0.1% SDS로 두 번 세척했다. 그리고, 60℃에서 30분 동안 2번 더 실시했다. 3일 후에 intensifying screen을 이용해서 Kodak XAR-5 film을 -80℃에서 노출시켰다. Genomic DNA was isolated from morning glory cotyledons by the method of Rogers and Bendich (1988). And it cut out with Bam HI, Bg lII, Eco RI, and Hin dIII (DAKARA). The excised DNA was electrophoresed on 0.8% agarose gel and blotting on a nylon membrane filter (Schleicher & Schuell). The DNA was hybridized with 32 P-labeled full length PnFL-2 cDNA at 65 ° C. for 16 hours in a hybridization solution containing 6X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS and 100 μg / ml salmon sperm DNA. And, washed twice with 2X SSPE and 0.1% SDS for 5 minutes at room temperature. And it carried out twice more for 30 minutes at 60 degreeC. After 3 days, the Kodak XAR-5 film was exposed at -80 ° C using an intensifying screen.
실시예 4: Northern blot 혼성화Example 4: Northern blot hybridization
RNA추출과 northern blot 혼성화 방법은 앞에서 이미 설명했다. total RNAs의 30㎍을 1% formaldehyde-agarose gel에 전기영동하고 nylon membrane filter (Schleicher & Schuell)에 트랜스퍼 했다. RNAs는 UV cross-linking에 의해 membrane과 결합시켰다. RNA의 같은 양을 전기영동하기 위하여, 젤을 전기 영동 후에 ethidium bromide로 염색했다. 필터 위에 RNA는 42℃에서 16시간 동안 50% formamide, 5X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS 그리고 100 ㎍/ml salmon sperm DNA가 포함된 혼성화 용액 속에 32P-labeled full-length PnFL-2 cDNA와 함께 혼성화 시켰다. 이 필터는 실내온도에서 5분 동안 2X SSPE 와 0.1% SDS에 두 번 세척했으며 42℃에서 30분 동안 다시 두 번 세척했다. 이 필터는 3일 동안 intensifying screen을 이용해서 Kodak XAR-5 film을 -80℃에서 노출시켰다. RNA extraction and northern blot hybridization methods have already been described above. 30 μg of total RNAs were electrophoresed on 1% formaldehyde-agarose gel and transferred to nylon membrane filter (Schleicher & Schuell). RNAs were bound to the membrane by UV cross-linking. To electrophoretize the same amount of RNA, the gels were stained with ethidium bromide after electrophoresis. RNA on the filter was mixed with 32 P-labeled full-length PnFL-2 cDNA in a hybridization solution containing 50% formamide, 5X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS and 100 μg / ml salmon sperm DNA for 16 hours at 42 ° C. Hybridized together. The filter was washed twice in 2X SSPE and 0.1% SDS for 5 minutes at room temperature and again for 30 minutes at 42 ° C. The filter was exposed to Kodak XAR-5 film at -80 ° C using an intensifying screen for 3 days.
실시예 5: DNA construct제작Example 5: DNA construct preparation
PnFL2 유전자의 construct를 만들기 위해서 CaMV 35S promoter가 포함된 백터를 사용했으며 Bar 유전자 그리고, β-glucuronidase (GUS) 유전자가 포함된 바이너리 백터 pCB302-1 vector (Xiang, 1999)를 사용했다. Bar 유전자는 식물에서 Glufosinate ammonium (Basta) 저항성을 가지며, Bar 유전자와 GUS 유전자가 포함된 T-DNA에서 BamHI-PstI 절편(β-glucuronidase gene)을 CaMV 35S 프로모터가 포함된 pCB302-1 vector 에서 꺼낸다. PnFL2 유전자의 coding sequence를 BamHI 과 PstI (Roche)으로 잘라서 pCB302-1 vector에 삽입한다. PnFL2 유전자가 들어간 pCB302-1 vector는 Agrobacterium-tumefaciens strain GV3101에 freeze and thaw 방법을 이용해서 형질전환 시키며 흙에서 2주 동안 기른 후에 0.15% Glufosinate ammonium (Basta)로 selection 한다. A vector containing the CaMV 35S promoter was used to construct the PnFL2 gene, and the binary vector pCB302-1 vector (Xiang, 1999) containing the Bar gene and β-glucuronidase ( GUS ) gene. The Bar gene is resistant to Glufosinate ammonium (Basta) in plants, and the Bam HI- Pst I fragment (β-glucuronidase gene) in T-DNA containing Bar and GUS genes is expressed in pCB302-1 vector containing CaMV 35S promoter. Take it out. The coding sequence of the PnFL2 gene is cut into Bam HI and Pst I (Roche) and inserted into the pCB302-1 vector. The pCB302-1 vector containing the PnFL2 gene was transformed to Agrobacterium-tumefaciens strain GV3101 using the freeze and thaw method and grown in soil for 2 weeks before being selected as 0.15% Glufosinate ammonium (Basta).
실시예 6: 식물 형질전환Example 6: Plant Transformation
애기장대 (콜롬비아종)는 vacuum infiltration 형질전환방법 (Bechtold et al., 1994)을 사용 했으며, pCB302-1 vector가 포함된 Agrobacterium-tumefaciens은 50 ㎍/㎖ kanamycin과 50 ㎍/㎖ rifampicin이 포함된 LB액체배지에서 OD600 에서 2.0이 될 때까지 기른다. 이 시점에서 배양된 배지를 centrifuge 시켜서 pellet을 얻은 다음 1/2 Murashige and Skoog(MS) salts (Murashige and Skoog, 1962)에 5% sucrose, 44 nM benzylamino purine and 0.005% (V/V) Silwet L-77 (Lehle Seeds)을 넣고 pH 5.7로 맞춘 medium에 애기장대를 담가서 형질전환 시킨다. 형질 전환할 애기장대는 정상 빛 아래서 기르면서 첫번째 bolt가 나온 것을 잘라준다. 형질전환 시킬 애기장대는 첫 번째 꽃이 피고 두 번째 bolt가 나올 때 Agrobacterium-tumefaciens mixture에 형질전환 시킨다. 형질전환 할 때는 둥근 용기에 Agrobacterium-tumefaciens solution을 담고서 600 mmHg의 진공을 걸어서 7 min동안 지속시켜준다. 형질전환 후에 식물들은 이틀 동안 저온실에 두며 다음세대의 씨를 받을 때까지 다시 배양실로 옮긴다. 형질 전환한 애기장대는 MS salts, 1.5% sucrose, 0.75% Phyto-agar (Duchefa) and 50 ㎍/㎖ kanamycin and 250 ㎍/㎖ carbenicillin이 포함된 배지에서 1주일 동안 선별을 한다. 다른 형질전환 라인들도 같은 배지에서 선별 작업을 수행한다. 야생형 컨트롤은 콜롬비아종을 이용한다. Arabidopsis (Colombia spp.) Was subjected to vacuum infiltration transformation method (Bechtold et al ., 1994). Agrobacterium-tumefaciens containing pCB302-1 vector was 50 μg / ml kanamycin and 50 μg / ml rifampicin. Grow in liquid medium until OD600 reaches 2.0. At this point, pellets were obtained by centrifuging the cultured medium, followed by 5% sucrose, 44 nM benzylamino purine and 0.005% (V / V) Silwet L- in 1/2 Murashige and Skoog (MS) salts (Murashige and Skoog, 1962). Add 77 (Lehle Seeds) and immerse the Arabidopsis in medium adjusted to pH 5.7 to transform. The baby pole to be transformed is raised under normal light and cut off the first bolt. The Arabidopsis to be transformed is transformed into the Agrobacterium-tumefaciens mixture when the first flower blooms and the second bolt comes out. When transforming, Agrobacterium-tumefaciens solution is placed in a round container and vacuum is applied at 600 mmHg for 7 min. After transformation, the plants are placed in a cold room for two days and transferred back to the culture room until they receive the next generation of seeds. The transformed Arabidopsis was screened for one week in medium containing MS salts, 1.5% sucrose, 0.75% Phyto-agar (Duchefa) and 50 μg / ml kanamycin and 250 μg / ml carbenicillin. Other transformation lines are also screened in the same medium. Wild type controls use Colombian species.
도 1은 PnFL-2 mRNA의 Northern blot 분석이며 1열은 지속적인 빛에 노출시킨 후 2열은 한 사이클, 3열을 3사이클, 4열은 5사이클 동안의 단일처리 후에 자엽에서 추출한 총 RNA에서 증폭한 PnFL-2 cDNA 절편이다. 각 열은 자엽 총RNA 30㎍이며 rRNA 양은 동량임을 확인할 수 가 있다. 이것으로 단일 처리 후에 발현이 커지는 것을 알 수가 있다. 1 is a Northern blot analysis of PnFL-2 mRNA and column 1 is amplified from total RNA extracted from cotyledons after single treatment for one cycle, row 3 for 3 cycles, column 4 for 5 cycles after continuous exposure to light. One PnFL-2 cDNA fragment. Each row is 30 μg of cotyledon total RNA, and the amount of rRNA is equivalent. This shows that expression increases after a single treatment.
도 2는 PnFL-2 cDNA의 nucleotide와 아미노산 서열을 분석한 그림으로. 밑줄은 . restriction enzyme BglⅡ의 인식서열이다.Figure 2 is a diagram analyzing the nucleotide and amino acid sequence of PnFL-2 cDNA. Underscore is. Recognition sequence of restriction enzyme Bgl Ⅱ.
도 3은 PnFL-2의 아미노산 서열과 다른 상동성을 갖는 단백질과의 정렬을 통해 비교한 그림으로 애기장대의 알져 지지 않은 단백질1 (Genbank accession no. NP_173352), 애기장대의 알려지지 않은 단백질2 (Genbank accession no. NP_177633), and 벼의 알려지지 않은 단백질 (Genbank accession no. AC091734).과 비교한 그림으로 갭은 최적의 정렬을 위한 것이다. 그림상으로 애기장대와 50%의 상동성을 보이는 것을 눈으로 확인할 수가 있다.FIG. 3 is a diagram comparing the amino acid sequence of PnFL-2 with another homologous protein. (Genbank accession no.NP_173352), unknown protein 2 of Arabidopsis (Genbank accession no. NP_177633), and unknown protein of rice (Genbank accession no.AC091734) . In comparison to the figure, the gap is for optimal alignment. In the picture, you can see 50% homology with baby pole.
도 4는 PnFL-2 유전자의 Southern blot 분석그림으로 Genomic DNA는 자엽으로부터 추출했으며 1열은 BamHⅠ, 2열은 BglⅡ, 3열은 EcoRⅠ그리고 4열은 Hin d,로 자르고 DNA gel-blot hybridization를 실시 했다. Full-length PnFL-2 cDNA는 32P-dCTP로 레이블링해서 probe로 사용했다.4 shows Southern blot analysis of PnFL-2 gene. Genomic DNA was extracted from cotyledons. Row 1 was Bam HI, row 2 Bgl II, row 3 Eco RI and row 4 Hin d, and DNA gel-blot. hybridization was carried out. Full-length PnFL-2 cDNA was labeled as 32 P-dCTP and used as a probe.
도 5는 PnFL-2 전사량의 Northern blot 분석그림이며 5A는 단일에서 자엽으로부터 total RNAs를 매 2시간에서 4시간 간격으로 추출 한 것이며 5B는 15분 동안의 나이트 브레이크 처리를 8시간째에 준 것이다. Fig. 5 is a Northern blot analysis of PnFL-2 transcripts. 5A is the total RNAs extracted from the cotyledons at a single interval every 2 to 4 hours, and 5B is the 15-minute night break treatment at 8 hours. .
도 6은 PnFL-2 유전자의 조직특이 발현을 나타내는 그림으로 총 RNA를 나팔꽃 어린개체의 서로 다른 조직에서 추출했으며 RNA gel-blot 혼성화를 실시했다. Full-length PnFL-2 cDNA는 32P-dCTP로 레이블링해서 probe로 사용했다. L열은 첫번째 잎, C열은 자엽, S열은 줄기, R열은 뿌리이다. 각 열은 총 RNA 30 ㎍씩이다. FIG. 6 shows tissue specific expression of PnFL-2 gene. Total RNA was extracted from different tissues of morning glory young individuals, and RNA gel-blot hybridization was performed. Full-length PnFL-2 cDNA was labeled as 32 P-dCTP and used as a probe. Row L is the first leaf, row C is the cotyledons, row S is the stem, row R is the root. Each row is 30 μg total RNA.
도 7은 과발현 애기장대와 야생형의 표현형 분석한 그림으로 7A는 기른 지 3주된 야생형 애기장대이고 7B는 기른 지 3주된 PnFL-2 과발현 애기장대이며 7C는 기른 지 5주된 야생형과 형질전환체의 RT-PCR 결과이며 하기 서열을 가지는 프라이머를 사용하여 나타난 결과이다. 7D는 기른 지 5주된 야생형과 형질전환체의 northern blot결과이다.Figure 7 is a phenotype analysis of overexpressing Arabidopsis and wild type, 7A is a wild-type Arabidopsis cultivated three weeks, 7B is a three-week PnFL-2 overexpressed Arabidopsis and 7C is a five-week wild-type and transformant RT It is a -PCR result and is shown using a primer having the following sequence. 7D is the northern blot of wild type and transformants 5 weeks old.
Forward 5`-cggcaagatatgggttcatcggaaa-3`(서열번호 3)Forward 5`-cggcaagatatgggttcatcggaaa-3` (SEQ ID NO: 3)
Reverse 5`-cggcaaaccctataattcaggttca-3`(서열번호 4)Reverse 5`-cggcaaaccctataattcaggttca-3` (SEQ ID NO: 4)
본 발명의 PnFL2 유전자는 나팔꽃의 자엽에서 특이적으로 발현하며 개화 유도에 관여하는 것으로 볼 때 식물의 빠른 개화를 통해 식물체에 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.
The PnFL 2 gene of the present invention is specifically expressed in the cotyledon of morning glory and may be useful for plants through rapid flowering of plants as it is involved in induction of flowering.
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