KR100585984B1 - 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)유충을 이용한 곤충병원성 선충의 생산방법 - Google Patents

꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)유충을 이용한 곤충병원성 선충의 생산방법 Download PDF

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이동운
하판정
한건영
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Abstract

본 발명은 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 유충을 이용한 곤충병원성 선충의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 꿀벌부채명나방 유충을 영하 5 내지 20 ℃에서 20 내지 60분 동안 저온처리 함으로서 곤충병원성 선충의 대량생산을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생산방법은 꿀벌부채명나방 유충을 상기와 같은 조건에서 저온처리 함에 따라 고치형성율을 감소시키고, 기존의 소규모 배양이라는 제약을 극복하여 단기간 내에 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
곤충병원성 선충, 스테이너나마 카르포캅새, 꿀벌부채명나방 유충.

Description

꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 유충을 이용한 곤충병원성 선충의 생산방법{MASS CULTURE METHOD FOR NEMATODES WHICH INFECT INSECTS USING GALLERIA MELLONELLA}
도 1은 실시예 25에 의하여 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1(Steinernama carpocapsae GSN 1) KCTC 0981BP를 대량 생산하는 사진이다.
도 2는 실시예 7 내지 12에 의하여 꿀벌부채명나방을 저온처리하여 활력도는 떨어뜨리면서 생존하게 하는 실험의 사진이다.
[산업상 이용분야]
본 발명은 꿀벌부채명나방 유충을 이용한 곤충병원성 선충의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 꿀벌부채명나방 유충을 저온처리 함으로서 곤충병원성 선충의 대량 생산을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
지금까지 우리나라의 해충방제는 주로 화학살충제에 의존하여 왔다. 그러나 이로 인하여 저항성 해충의 출현, 잠재해충의 해충화, 환경오염에 의한 생태계 파괴, 국민 건강 저해 등의 많은 부작용이 초래되고 있다. 따라서 새로운 해충 방제법이 요구되어 왔다. 이에 따른 새로운 해충 방제법으로 가장 효과적인 것은 곤충병원성 선충에 의한 해충의 미생물적 방제법이다.
곤충병원성 선충은 기주에게 패혈증을 일으켜 24 내지 48 시간의 짧은 시간에 기주를 치사시킬 수 있는 활용가능성 높은 생물농약이다. 그 외에도 곤충병원성 선충은 높은 병원성, 효과의 지속성, 대량생산성, 광범위한 기주범위, 유용 동식물에 대한 안전성, 살포의 용이함, 다른 방제인자와의 혼용 가능성 등으로 인하여 방제방법으로 무한한 가능성을 가진다.
특히, 최근에는 경제성장에 따른 국민생활의 질적 향상으로 인한 식품안전과 환경오염에 대한 사회적 관심의 증대, 재배자의 고령화에 따른 농약 살포의 회피, 외래 유입 해충에 대한 효과적인 농약의 부재, 과다한 살충제의 남용으로 인한 저항성 해충의 출현, 농약처리에 의한 값비싼 수분매개 곤충의 피해 등에 현명하게 대체할 수 있는 방제 수단이 요구되고 있으며, 이러한 시대적 상황에 가장 현실적으로 접근할 수 있는 해충방제법이 바로 생물농약인 곤충병원성 선충을 이용한 생물적 방제법이라 할 수 있다. 또한 특정 지역에 분포하고 있는 고유 곤충병원성 선충의 경우는 이미 지역해충들과 함께 생태적으로 공존해 왔을 뿐 아니라, 유용 유기체에 대하여 안전할 수 있기 때문에 이용상의 장점이 있다.
이러한 선충을 생물적 방제수단으로 사용하기 위해서는 이들 곤충병원성 선충의 대량증식이 필요하다. 선충의 대량증식법은 각종 배지를 최적화하고 표면적이 큰 지지체를 공급하기 위한 연구가 초기에 이루어졌다. 그러나 배지의 최적화가 이루어진 경우라 하더라도 유충을 이용하는 선충의 증식법에 있어서, 유충이 고치를 형성하는 경우 해충방제를 위하여 이용가능한 선충의 수가 현저히 감소하는 문제점은 해결되지 못하고 있다.
또한, 해충의 생물적 방제를 위하여 곤충병원성 선충의 대량증식법에 대한 연구는 계속하여 진행되고 있으며, 국내에서 출원되어 등록된 것으로는 특허공개번호 특2001-0108793호의 곤충병원성 선충 배양용 배지 및 그를 이용한 선충의 대량생산방법이 있다. 지금까지 꿀벌부채명나방을 이용한 곤충병원성 선충의 증식과 생산은 페트리 접시에 여과지를 깔고, 꿀벌부채명나방 노숙유충을 넣은 뒤, 곤충병원성 선충을 접종하여 일정 조건에서 7일 내지 10일간 배양한 뒤, 화이트 트랩을 이용하여 생산해 왔다. 이 경우 실험실 수준에서 소규모 선충 생산에는 적합하나, 대규모 생산에는 시간의 소비와 많은 페트리 접시와 같은 실험 도구의 이용에 따른 비용 증가, 노동력의 과다 투입 등의 단점이 있다. 또한, 곤충병원성 선충의 접종 후, 꿀벌부채명나방 유충이 고치를 만들게 되면 선충의 감염이 잘 이루어지지 않는 단점이 있어 대량생산에 어려움을 겪었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 꿀벌부채명나방 유충을 저온처리 함으로서 꿀벌부채명나방 유충의 고치형성을 방지하고, 활력도를 저하시켜 곤충병원성 선충의 접종을 용이하게 하고 대량 생산을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 꿀벌부채명나방 유충을 -5 내지 -20 ℃에서 10 내지 60분 동안 처리하는 단계, 상기 처리된 꿀벌부채명나방 유충 한 마리당 곤충병원성 선충을 80 내지 640 마리의 농도로 접종하는 단계 및 20 내지 30 ℃하에서 7일 내지 10일동안 이를 배양하는 단계를 포함하는 곤충병원성 선충 생산방법을 제공한다.
꿀벌부채명나방 유충을 이용하여 선충을 증식하는 방법에 있어서, 유충이 고치를 형성하는 경우 선충에 접종시켜도 감염이 제대로 이루어지지 않을 뿐만 아니라, 형성된 고치는 모두 제거되어야 해충의 생물학적 방제에 이용할 수 있는 선충을 수확할 수 있다. 특히 꿀벌부채명나방 유충은 선충에 접종 후 고치를 형성하는 비율이 높아, 실질적으로 형성된 유충의 고치를 제거하는 과정에 있어서 수작업을 거쳐야 하므로 시간 및 노력이 상당히 소요된다.
본 발명자들은 유충의 고치형성율을 낮추는 것이 가능하다면 수작업으로 이루어지므로 상당한 시간 및 인력을 필요로 하는 고치제거단계를 축소시킬 수 있고, 고치의 제거 없이 단기간에 실질적으로 해충의 생물학적 방제에 이용할 수 있는 곤충병원성 선충을 대량으로 수확할 수 있는 유충의 저온처리 조건을 알아냈다.
상기 곤충병원성 선충의 예로는 스테이너나마 롱지카우둠(Steinernema longicaudum), 스테이너나마 몬티콜리(Steinernema monticoli), 스테이너나마 글라이저리(Steinernema glaseri), 헤테로라브디티스 박테리오포라 (Heterorhabditis bacteriophora) 일 수 있다. 본 발명의 일실시예인 기탁된 스테이너나마 카르포캅세 GSN 1(Steinernama carpocapsae) GSN 1KCTC 09821BP의 생활사는 알, 1령충, 2령충, 3령충, 4령충, 성충의 단계로, 토양에서 3령 유충(감염태 유충)의 상태로 기주 곤충에 침입하여 성충이 되어 기주 곤충의 체내에서 교미 후 2 내지 3세대를 경과한다. 이후 충체 내에서 증식되는 것은 온도와 수분 조건 등에 따라 다르나, 일반적으로 20 내지 30℃에서 5 내지 10일정도 소요된다. 본원발명의 실시예에서 사용된 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae ) GSN 1KCTC 09821BP는 2001년 4월 9일 한국생명과학연구원에 기탁된 세포주이다.
또한 인위적으로 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) 선충에 감염된 치사충을 화이트 트랩(White trap)에 올려놓고, 20 내지 30℃에서 24 내지 60 시간이 경과되면 충외로 나오는 선충을 수득할 수 있다. 수득한 성충은 증식을 위하여 미끼곤충인 꿀벌부채명나방 노숙유충에 접종시켜 유충 한 마리당 10 만 마리 내외의 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) 선충을 수확할 수 있다. 선충의 수확 시, 일반적으로 사용된 꿀벌부채명나방 노숙유충이 접종단계를 거친 후 고치를 형성하기 때문에 상기 고치를 제거하는 단계까지 거쳐야 최종적인 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) 선충을 수확할 수 있게 되는데, 형성된 고치를 제거하는 단계에서 상당한 시간 및 노력이 소요된다.
본 발명자들은 곤충병원성 선충이 증식된 후, 유충으로부터 형성된 고치를 제거하고 선충을 수거하기 위하여는 상당한 시간 및 노력이 소요되는 문제점을 해결하기 위하여, 유충을 곤충병원성 선충에 접종하기 전 고치형성을 저지할 수 있는 저온처리의 조건을 발견하였다.
따라서 본 발명은 선충의 증식을 위하여 사용되는 꿀벌부채명나방 노숙유충을 선충에 접종하기 전, -5 내지 -20 ℃에서 10 내지 60 분 동안 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. -20℃ 이하인 경우는 꿀벌부채명나방 노숙유충이 치사될 수 있으며, -5℃ 이상인 경우는 고치 형성이 많아질 수 있다.
또한, 10 분 이하로 처리하는 경우는 고치의 형성율이 높고, 60 분 이상으로 처리하는 경우는 꿀벌부채명나방 노숙유충의 치사율이 높아질 수 있으며, 접종시 소요되는 시간이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 온도 및 시간조건은 -5 내지 -10 ℃에서는 30 내지 60분 동안 저온처리하는 것이 바람직하고, -11 내지 -20℃에서는 20 내지 60분 동안 저온처리하는 것이 바람직하다.
상기 방법으로 저온처리된 꿀벌부채명나방 노숙유충은 곤충병원성 선충의 증식을 위하여 접종할 수 있는데, 이 경우 꿀벌부채명나방 유충 한 마리당 80 내지 640 마리의 농도로 접종하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100 내지 500 마리의 농도로 접종할 수 있다. 80 마리 이하인 경우는 접종을 위한 감염율이 떨어질 수 있고, 640 마리 이상인 경우는 불필요한 선충의 소비가 많아질 수 있다.
상기의 방법으로 접종된 곤충병원성 선충은 20 내지 30 ℃ 하에서 7 내지 10일 동안 이를 배양하여 선충을 대량으로 생산한다.
본 발명은 곤충병원성 선충의 대량생산을 위하여, 꿀벌부채명나방 노숙유충으로 접종하는 경우 통풍이 잘되는 바구니를 이용하여 그 위에 화장지나 타올, 키친타올 등을 1 내지 5 매 깔고, 랩을 씌운 후 15 내지 35℃에서 보관할 수 있다. 접종이 실시되는 경우, 감염된 꿀벌부채명나방 유충이 건조해 지게 되면, 선충은 더 이상 증식하지 않는 습성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 선충 생산방법의 수행시 바구니 바닥에 화장지나 타올 등을 깔고, 랩을 씌움으로써 수분의 손실을 예방 하고 선충에 감염된 꿀벌부채명나방의 유충이 건조되는 것을 방지함으로서 선충의 증식을 더욱 도모할 수 있다.
상기 바구니의 재질은 플라스틱, 금속 또는 나무류 등일 수 있으며, 이러한 바구니는 지름 0.1 내지 5 mm 크기의 구멍을 가지고 있을 수 있다. 이와 같이, 구멍이 있는 바구니를 사용함으로서 선충을 용이하게 수확할 수 있으며 통풍이 되게 함으로서 부패를 막을 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 24 : 꿀벌부채명나방의 저온처리
꿀벌부채명나방을 노숙유충시까지 30일 내지 40일 동안 사육한 후, 직경 8.5㎝의 플라스틱 1회용 페트리접시 각각에 여과지 1장을 깔고, 사육한 꿀벌부채명나방 노숙유충을 10마리씩 넣었다. 상기 페트리접시를 여섯번 반복하여 비닐로 싼 후, 하기 표 1과 같은 온도 및 시간 조건으로 저온처리 하였다.
실시예 처리온도(℃) 처리시간(분)
1 0 10
2 20
3 30
4 40
5 50
6 60
7 -5 10
8 20
9 30
10 40
11 50
12 60
13 -10 10
14 20
15 30
16 40
17 50
18 60
19 -15 10
20 20
21 30
22 40
23 50
24 60
비교예 20 60
실시예 25 : 저온처리된 꿀벌부채명나방을 이용한 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1 KCTC 0981BP주의 증식
실시예 1 내지 24 및 비교예의 조건으로 저온처리 된 꿀벌부채명나방 노숙유충 10마리가 포함된 페트리접시에 꿀벌부채명나방 한 마리 당 20마리의 농도로 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주 1㎖를 고루 접종하였다. 접종 후 각각의 페트리접시는 25℃ 항온기에 7일간 보관하고, 화이트트랩을 설치하여 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주를 증식하였다.
실험예 1:저온처리에 의한 꿀벌부채명나방 노숙유충의 고치형성율 및 치사율 측정
실시예 1 내지 24 및 비교예에 의하여 저온처리하고 1일이 지난다음, 고치 형성의 유무와 치사유무를 조사하여 하기 표2에 나타냈다.
실시예 고치형성율(%) 치사율(%)
1 98.3 0
2 98.3 0
3 93.3 0
4 86.7 0
5 85.0 0
6 81.7 0
7 88.3 0
8 83.3 0
9 28.3 1.7
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 98.3 0
14 91.7 0
15 56.7 0
16 13.3 0
17 0 0
18 0 8.3
19 86.7 0
20 31.7 0
21 1.7 8.3
22 0 5.0
23 0 36.7
24 0 66.7
비교예 100 0
표 2에 나타나듯이, 저온에서 처리하는 시간을 증가시킴에 따라 꿀벌부채명나방 노숙유충의 고치 형성정도는 감소하였으나, 일반적으로 치사율이 증가되었다. 그러나 실시예 9 내지 12, 실시예 15 내지 18, 실시예 20 내지 24의 저온처리를 한 페트리접시의 경우는 낮은 고치형성율 뿐 아니라, 낮은 치사율을 보였다.
따라서, 실시예 9 내지 12, 실시예 15 내지 18 및 실시예 20 내지 24의 경우 유충의 고치형성을 저지 함으로서, 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주의 증식에 있어서의 종래의 문제점을 해결하였다.
실험예 2: 저온처리 조건의 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1 KCTC 0981BP 증식에 대한 영향
실시예 1 내지 24 및 비교예의 유충을 접종 전 이미 형성된 고치를 제거한 경우 및 접종 전 형성된 고치를 제거하는 작업을 수행하지 아니한 경우에 대하여 실시예 25의 방법으로 증식시키면서 6일째부터 증식되는 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1(Steinernama carpocapsae) KCTC 0981BP주를 2주간 수확하여 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
실시예 고치제거 공정 작업 수행후 선충 접종 시 수확된 선충수/ 꿀벌부채명나방 유충 고치제거 공정작업 미수행 조건에서 수확된 선충수/ 꿀벌부채명나방 유충
1 116,600 1,943
2 91,843 1,531
3 82,150 5,477
4 85,550 11,407
5 92,125 13,819
6 83,575 15,322
7 78,556 9,165
8 76,906 12,818
9 118,562 84,969
10 105,343 105,343
11 83,656 83,656
12 83,187 83,187
13 90,797 1,513
14 101,865 8,489
15 100,062 43,360
16 56,631 54,742
17 53,243 53,243
18 44,435 44,435
19 85,031 11,337
20 83,000 56,717
21 83,750 82,354
22 85,487 85,487
23 97,406 97,406
24 55,531 55,531
비교예 126,850 0
표 3에 나타나듯이, 바람직하게는 실시예 9 내지 12, 실시예 15 내지 18 및 실시예 20 내지 24와 같이, 영하 5 내지 20℃에서 20 내지 60분 동안 저온처리한 과정을 거친 꿀벌부채명나방 유충을 이용하는 경우, 유충의 접종 전 고치를 제거하는 공정을 거친 후, 증식되어 수확된 선충의 수와 접종 전 고치를 제거하지 아니하고 접종하여 선충을 증식시키고, 별도의 고치제거 공정을 수행하지 아니한 경우의 수확된 선충의 수는 큰 차이를 보이지 않았다.
이와 같이, 본 발명의 곤충병원성 선충의 대량증식 방법은 꿀벌부채명나방 유충을 저온처리하는 경우, 수작업으로 이루어지므로 상당한 시간 및 노력이 소요되는 고치제거 단계를 거치지 아니할 수 있고, 고치제거 단계 없이도 실질적으로 해충의 생물학적 방제용으로 이용할 수 있는 곤충병원성 선충을 수작업으로 고치제거 단계를 수행한 경우와 동일한 정도로 얻을 수 있는 획기적인 방법임을 알아냈다.
또한, 본 발명의 곤충병원성 선충의 대량증식방법은 상기의 바람직한 조건에서 저온처리한 유충을 이용함으로써, 스테이너나마 카르포캅새 선충세포의 증식 공정단계를 단축하여 고치제거 공정단계에서 소요되는 시간 및 노력을 감소시켜 비용을 절감시키는 효과도 가져올 수 있다.
실험예 3: 꿀벌부채명나방 유충에서 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1 KCTC 0981BP주의 접종농도가 증식에 미치는 영향
저온처리된 꿀벌부채명나방 유충에 스테이너나마 카르포캅새 (Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주의 접종농도별 증식수를 알아보기 위하여 접종 트래이 바닥에 키친타올을 깔고, 스프레이를 이용하여 상기 선충주를 꿀벌부채명나방 유충 한 마리 당 하기 표 4와 같은 농도로 4㎖를 분무하였다. 여기에 실시예 10에서 얻은 꿀벌부채명나방 50 마리씩을 각각 넣고, 랩을 씌운 후, 27℃ 증식실에 두었다. 7일이 경과된 후, 화이트트랩을 설치하여 일별 증식되는 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주의 수를 조사하여 표 4에 함께 나타냈다.
접종농도(마리/유충) 스테이너나마 카르포캅새 GSN 1 KCTC 0981BP 증식수
80 71,300
160 83,900
320 96,505
640 74,000
표 4에 나타낸 바와 같이, 유충 한 마리당 80 내지 640 마리의 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주를 접종시키는 경우, 선충 주의 증식이 뛰어난 것으로 관찰되었다. 특히 유충 한 마리 당 160 또는 320 마리의 상기 선충 주를 접종시키는 경우, 증식이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 따라서 유충 한 마리 당 100 내지 500마리의 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주를 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명은 꿀벌부채명나방을 저온처리 하여 스테이너나마 카르포캅새 (Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP주의 대량생산방법에 관한 것으로, 꿀벌부채명나방 유충이 고치를 만드는 것을 억제하면서 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0981BP 증식에는 영향을 미치지 아니하는 효과를 갖는다.

Claims (4)

  1. a) 꿀벌부채명나방 유충을 -5 내지 -20 ℃ 에서 10 내지 60분 동안 처리하는 단계; 및
    b) 상기 처리된 꿀벌부채명나방 유충 한 마리당 곤충병원성 선충을 80 내지 640 마리의 농도로 접종하는 단계
    를 포함하는 곤충병원성 선충 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 접종된 곤충병원성 선충을 20 내지 30 ℃의 온도에서 7 내지 10일 동안 배양하는 단계를 더욱 포함하는 곤충병원성 선충 생산방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충병원성 선충을 스테이너나마 카르포캅새(Steinernama carpocapsae) GSN 1 KCTC 0921BP 주인 것인 곤충병원성 선충 생산방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 접종은 0.1 내지 5 ㎜ 크기의 지름을 갖는 구멍을 가진 바구니에 종이를 깔고, 랩을 씌워 15 내지 35 ℃에서 보관하는 것인 곤충병원성 선충 생산방법.
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