KR100575598B1 - 건선 환자로부터 유래된 침윤성 ｔ 세포의 수용체ｃｄｒ3에 특이적으로 존재하는 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건선 환자의 건선 병변 또는 비병변 조직으로부터 유래된 침윤성 T 세포의 수용체 CDR3내에 특이적으로 존재하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 상기 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산, 또는 상기 펩타이드에 대한 항체에 관한 것으로서, 건선의 병인 및 발병기작 연구에 유용한 도구를 제공할뿐 아니라, 나아가 건선의 진단, 및 예방 및 전신 치료에 유용하다.

Description

건선 환자로부터 유래된 침윤성 Ｔ 세포의 수용체 ＣＤＲ3에 특이적으로 존재하는 펩타이드 및 그의 용도{Peptides specific in TCR CDR3 of infiltrating T cells derived from patients with psoriasis and uses thereof}

도 1은 Cβ 영역 증폭으로 간접 정량된 Vβ8, Vβ13, Vβ15 및 Vβ22 유전자를 이용하는 TCR 발현의 RT-PCR 분석결과를 나타내는 도면이다.
N: 비병변 부위
L: 건선 병변 부위

도 2는 4명의 정상인 및 6명의 건선 환자(Ps-7 내지 Ps-12)로부터 유래된 피부 생검 표본에서 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7에 상보적인 표적 DNA 서열의 검출을 나타내는 도면이다.
A: CDR3 영역
B: 불변 영역

도 3은 10명의 건선 환자(Ps-13 내지 Ps-22)로부터 유래된 비병변 부위(N) 및 건선 병변 부위(L)의 피부 생검 표본에서 표적 DWTSGV-Jβ2.7 모티프의 검출을 나타내는 도면이다.
A: CDR3 영역
B: 불변 영역

도 4는 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7-Cβ를 암호화하는 DNA의 염기 서열을 나타내는 도면이다.

본 발명은 건선(psoriasis)-특이적 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 건선 환자로부터 유래된 침윤된(infiltrating) T 세포 의 T 세포 수용체(T cell receptor; 이하, " TCR"이라 함) 상보성 결정 부위(complementarity determining regions; 이하, "CDR"이라 함)3내에 특이적으로 존재하는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

건선은 많은 집단에서 약 2∼3%의 비율로 발생하는 일반적인 만성 염증성, 과증식성, 다인성 피부 질환이다(Lomholt, G. 1963. Psoriasis. Prevalence, spontaneous course, and genetics. GEL Gad, Copenhagen). 건선의 병인은 아직 명확히 규명되지 않았으나, 다양한 증거들에 의해 활성화된 T 세포로부터 방출된 사이토카인(cytokines)이 각질세포(keratinocytes)의 증식을 증진시키는, T-세포 매개 염증성 질환인 것으로 보고 있다(Prinz, J. C. J. Immunol. 45: 583-586, 1997; Chang, J. C. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9282-9286, 1994). 상이한 인종 및 민족에 속하는 환자들간의 변화에도 불구하고, 특정 HLA(human leukocyte antigen) 대립형질(Cw6, B13, BW53 및 DRB1*07)을 포함한 강력한 유전 요소가 질병 감염의 민감성과 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다(Elder, J. T. et al., Arch. Dermatol., 130: 216-224, 1994; Kim, T.-G. et al., J. Invest. Dermatol. 114: 309-313, 2000). 최근 견해에 따르면, T 세포 조절의 결함이 질환의 일차적인 원인인 것으로 여겨진다(Bos, J. D. et al., Immunol. Today. 20: 40-46, 1999).

이와 같이 건선 발병과 연관된 세포로서 T 세포에 초점이 맞추어짐에 따라, 건선 치료에 대해 새로운 접근들이 이루어지고 있다. 즉, 건선 특이적 T-세포의 면역억제(항-CD3 및 -CD4 단일 항체), T 세포 면역억제제(사이클로스포린 A 및 FK506), 변형된 IL-2를 기초로 한 임파구(lymphocyte)-선택적 독소의 사용, 및 세포독성 T 림포사이트-관련 항원 4-면역글로불린(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin; CTLA-4Ig)을 사용한 T 세포 동시자극(costimulation)의 차단 등이 건선 치료에 효과적인 것으로 확인되었다(Gottlieb, S. L. et al., Nat. Med. 1: 442-447, 1995; Bagel, J. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 38(6 Pt 1): 938-44, 1998; Abrams, J. R. et al., J. Exp. Med. 192: 681-693, 2000). 그러나, 반응을 주도하는 추정 항원의 성질은 여전히 규명되지 않고 있는 실정이다.

이전부터 건선에서 T-세포 반응에 관여하는 T 세포 레퍼토리(repertoire)를 분석하기 위하여 많은 연구가 수행되어 왔다(Chang, J. C. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9282-9286, 1994; Prinz, J. C. et al., Eur. J. Immunol. 29: 3360-3368, 1999). 또한, 항원-특이적 T 세포에 대한 수용체의 Vβ제한물의 특정 서열들이 많은 시스템에서 동정되었으며, 이것은 선택된 TCR Vβ의 표적화가 유효한 것으로 증명된 바 있는 면역요법적 접근에 이르게 하였다(Matsumoto, Y. et al., J. Immunol. 164: 2248-2254, 2000; Zipp, F. et al., Brain 121: 1395-1407, 1998; Hong, J. et al., J. immunol., 163: 3530-3538, 1999; Zang, Y. C. Q. et al., J. Immunol. 164: 4011-4017, 2000). 특히, CDR3 내의 DNA 서열이 항원 인식에 가장 결정적인 TCR β-사슬의 고가변성(hypervariable) V-D-J 연결부위를 암호화한다는 사실은 잘 확립되어 있다(Davis, M. M. and Bjorkman, P. J. Nature 334: 395-402, 1998). 동일한 펩타이드 특이성을 갖는 T 세포 클론들이 특정 에피토프의 TCR 인지에 특징적인 보존된 CDR3 아미노산 서열을 공유하는 것으로 가정할 수 있다. 펩타이드 인지에 대한 TCR CDR3 배열의 중심적인 역할과 일치하게, 보존된 CDR3 모티프가 몇몇 자가면역 질환에서 관찰된 바 있다(Casanova, J. L. and Maryanski, J. L. Immunol. Today 14: 391-394, 1993). 따라서, 건선 병변에 침윤된 T 세포중 공통적인 CDR3 모티프를 동정해 내는 것이야 말로 미지의 인간 피부 항원 TCR 및 건선에서 질병의 진전과 그의 연관성을 이해하는 데 결정적인 것이 될 것이다. 그것은 또한 건선의 치료법을 찾아내고 제공하는데 유용한 TCR 마커를 개발하기 위한 시도에 있어서도 매우 중요하다. 그러나, 종전에도 동일 또는 고도의 상동성을 갖는 CDR3 서열 모티프가 건선 병변 및 혈액 샘플에서 보고된 바 있지만, 그것들은 대부분 특정 개인에게만 국한되고 특이적인 것에 불과하였다(Chang, J. C. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9282-9286, 1994; Prinz, J. C. et al., Eur. J. Immunol. 29: 3360-3368, 1999). 따라서, 모든 건선 환자에 공통적인 T 세포의 보존된 CDR3 서열 모티프의 존재 여부에 대한 확인 및 나아가 그의 동정이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 건선 병변에 침윤하는 T 세포의 수용체 CDR3 내에 공통적인 서열 모티프가 존재하는지 여부를 조사하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, PCR에 기초한 스펙트라타이핑(PCR-based spectratyping), DNA 서열분석 및 RT-PCR-서던 혼성화의 복합 시스템을 사용하여 건선 환자로부터 유래된 피부 생검체에서 특이적 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프를 최초로 동정해내었다. 부수적으로, 본 발명자들은 Vβ15를 이용한 침윤성 T 세포에서도 아미노산 조성이 동일하거나 매우 유사한 반복성 TCR VDJ 재배열을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 건선 환자로부터 유래된 침윤성 T 세포의 수용체 CDR3내에 특이적으로 존재하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산 및 상기 펩타이드에 대한 항체, 및 건선의 진단, 예방 및 치료에 있어서의 그들의 용도를 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열(DWTSGV)을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 C-말단측에 TCR Jβ2.7의 아미노산 서열, 특히 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열(YEQYFGPGTRLTVT)을 추가로 갖고/거나, N-말단측에 TCR Vβ13의 아미노산 서열, 특히 서열번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열(CASR, CASRS 또는 CASY)을 추가로 가질 수 있다(Vβ13-DWTSGV- Jβ2.7 모티프).

본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 핵산, 특히 서열번호 6(도 4 참조)에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 엄격한(high stringency) 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화할 수 있는(hybridizable) 핵산, 특히 상기 핵산의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드에 대한 항체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 유효성분으로서 상기 항체 또는 상기 핵산을 포함하는 건선의 진단, 또는 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 항체 또는 상기 핵산을 사용하여 건선의 진단, 또는 예방 또는 치료용 약제를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 건선 환자의 병변 및 비병변 부위 피부의 침윤된 T 세포에 공통적인 CDR3 모티프가 존재하는지를 밝혀내기 위하여 연구를 수행하였고, 특히 Vβ13 및 Vβ15를 이용하는 TCR의 CDR3 부위에 초점을 맞추었다.

RT-PCR, 클로닝 및 DNA 서열분석 기술을 이용하여 CDR3 서열을 분석하기 위하여, 건선 환자로부터 얻은 건선 병변 샘플을 조사하였다. 또한, 방사성표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 서던 블럿 분석기술을 이용하여 CDR3 서열을 확인하기 위하여, 건선 환자로부터 얻은 건선 병변 샘플을 정상인으로부터 얻은 정상 피부 생검 샘플과 비교하였다. 건선 환자의 병변 및 비병변 피부 조직, 및 4 명의 정상인의 피부 조직으로부터 유래된 다수의 침윤성 T 세포에서 동일한 서열을 추적하기 위하여, 복합 RT-PCR-서던 혼성화 검출 시스템에서 공유 모티프에 상보적인 올리고뉴클레오타이드(서열번호 36)를 탐침으로 사용하였다. 그 결과, Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프가 건선 환자로부터 유래된 침윤성 T 세포에서 우선적으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드(서열번호 36)를 탐침으로 사용한 RT-PCR-서던 혼성화 복합 분석기술로 10 명의 다른 건선 환자 유래의 비병변 피부 생검체에서도 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프를 갖는 T 세포를 검출하였다. 이것은 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프의 발현이 특정 개인에게만 국한되는 것이 아니라 일부 침윤성 T 세포가 공통적인 건선 항원의 한정된 에피토프를 인지함을 암시해주는 것이다. 나아가, 건선 환자의 비병변 피부에서 발생하는 가장 특징적인 징후의 하나인 쾌브너(Koebner) 현상(하기 참조)을 규명할 수 있을 것으로 기대된다.

보다 상세하게는, 본 발명에서는 CDR3 영역의 PCR-기초 스펙트라타이핑 및 서열분석, 그리고 CDR3 모티프를 핑거프린트(fingerprint)로 사용하는 PCR 시스템-결합된 DNA 혼성화(RT-PCR-서던 혼성화)가 유사하거나 동일한 CDR3-J 영역 서열을 검출함으로써 침윤성 T 세포를 추적하는데 강력한 도구를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 건선 환자로부터 유래된 피부 생검체에서 특이적인 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프를 최초로 동정할 수 있었다. 부수적으로, 본 발명자들은 아미노산 조성이 동일하거나 매우 유사한 반복성 TCR VDJ 재배열도 입증하였다. TCR 항원 특이성은 TCR β-사슬 CDR3 영역에 매우 의존적이므로, 아미노산 조성에서 동일(Vβ13) 및/또는 매우 유사한(Vβ15) 이들 CDR3 서열의 TCR을 갖는 T 세포는 질병-관련 항원을 인지하고/거나 건선의 발병에 결정적인 요소에 기여할 것으로 추정된다.

이상으로부터, 본 발명은 건선 병변으로 침윤된 T 세포의 잠재적 역할 및 구조적 특징을 규명하는데 하기와 같은 몇 가지 핵심적인 논점을 제공한다.

첫째, 비록 공통적인 모티프가 일부 환자에서는 낮은 빈도로 검출되지만, 동정된 모티프는 특정의 건선 환자에게만 국한되는 것이 아니라 상이한 환자로부터 의 공통적인 특징을 갖는 침윤성 T 세포중에 존재한다.

둘째, 몇몇 TCR β-사슬 VDJ 재배열이 CDR3 영역의 아미노산 조성에서 동일하거나 매우 유사함을 발견하였으며, 이는 상이한 환자의 피부 병변에서 몇몇 클론 확장된 T 세포의 TCR β-사슬 CDR3가 N-말단측에서 아미노산 S 또는 R, 및 C-말단측에서 G, GG, GS에 의해 플랭킹(flanked)될 수 있는 공통 핵, GLA로 구성된다는 종래의 보고(Prinz, J. C. et al., Eur. J. Immunol. 29: 3360-3368, 1999)와 일치하는 것이다. 이들 결과는 일부 침윤성 T 세포가 자가항원상의 공유 에피토프를 인지한다는 것을 강하게 암시하는 것이다. 나아가, 고도로 보존된 모티프는 항원상의 공유 에피토프가 매우 제한적임을 뒷받침하는 것이다.

셋째, 공통 모티프의 검출이 건선 환자의 비병변 조직에서도 관찰되는 것은 실로 주목할 만하다. 건선 환자의 무징후 피부(비병변 부위의 피부)는 건선 병변을 출현하게 하는 손상에 대해 반응할 수 있다(쾌브너 반응; Koebner, H. Berliner Klinische Wochenschrift. 21: 631-632, 1878). 건선이 발병하지 않은 피부에 물리적 손상을 가하면 질병을 유도할 수 있으며, 이것은 실무율(all-or-none) 현상이다; 만약 유발이 한 위치에서 발생하면, 모든 위치에서 발생한다. 어느 형의 T 세포가 쾌브너 반응과 직접적으로 관련있는지는 불분명하지만, T 세포가 이 반응에 관여하는 것으로 보고된 바 있다(Baker, B. S. et al., Br. J. Dermatol. 110(5): 555-64, 1984; Placek, W. et al., Acta Dermato-Venereologica 68: 369-372, 1988). 일부 증거에 의하면, 무징후 피부에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 수가 증가되는 것으로 확인되었다(Baker, B. S. et al., Br. J. Dermatol. 110(5): 555-64, 1984; Placek, W. et al., Acta Dermato-Venereologica 68: 369-372, 1988). 따라서, 본 발명에 따르면, 환자의 비병변 부위에서 이 보존된 CDR3을 갖는 침윤된 T 세포가 쾌브너 반응에 관여하는 것으로 가정할 수 있다.

넷째, 나아가 본 발명의 임상적 적용이 가능하다. 본 발명에 따른 동일한 공통 모티프는 질병을 모니터링(monitering)하기 위한 특이적 마커로 사용될 수 있고, 공통 서열을 갖는 TCR 특정 펩타이드는 일군의 환자에서 T 세포의 특이적 서브세트(subset)를 억제하기 위한 항이디오타입(anti-idiotypic) T 세포를 찾아내는데 사용될 수 있을 것이다. 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 통상의 기술을 이용하여, 본 발명에 따른 공통 모티프를 암호화하는 핵산이나, 그에 상보적인 핵산을 비롯하여, 엄격한 조건, 예를 들면, 56 ℃, 6×SSPE에서 그와 혼성화할 수 있는 핵산을 제조하거나, 본 발명의 공통 모티프에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제조하여, 이들을 전세계적인 피부 자가면역질환인 건선을 진단하고/거나 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있을 것이다. 이들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 기술들을 이용하여 실시할 수 있는 것으로서, 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다.

한편, 다양한 연구결과, 염증성 T 세포 침윤물에서 반복성 TCR 재배열이 항원-주도된 자극에 의해 증식된 클론 확장된 T 세포에 상응하는 것으로 나타났다. 비록 한정된 항원-MHC 복합체에 의해 선별된 TCR 레퍼토리가 다양할 수 있다 하더라도, 보존된 TCR 재배열이 몇몇 자가면역 질환에서 확인되었다(Okesenberg, J. R. et al., Nature 362: 68-70, 1993; Mantegazza, R. J. Clin. Invest. 91: 2880-2886, 1993; Matsumoto, I. et al., J. Clin. Invest. 97: 1969-1977, 1996). TCR-사슬 CDR3 모티프의 보존은 다양한 자가면역 질환에서 관찰되고 피부에서 공통적인 질병-관련 항원의 존재를 반영하는 것이다. 따라서, 동일 및/또는 매우 유사한 CDR3 T 세포의 존재는 건선의 병인적 특징에 필요한 면역 활성화의 개시 및 유지에 관여하는 것으로 판단된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 22 명의 건선 환자로부터 유래된 건선 병변 부위 및 비병변 부위에서 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 결합을 사용하는 T 세포 집단을 발견하고 대조군인 정상인에서는 발견하지 못하였다. 또한, 건선 병변이 아미노산 조성에서 동일하거나 매우 유사한 CDR3 영역의 Vβ15를 갖는 T 세포에 의해 침윤되는 것을 밝혀내었다. 비록 건선 병인을 담당하는 항원의 존재는 불분명하나, 본 발명에서 공유 CDR3 영역을 갖는 T 세포 집단의 침윤은 건선이 단순히 슈퍼항원에 의해 매개된 질환이라기 보다(Bos, J. D. and De Rie, M. A. Immunol. Today. 20: 40-46, 1999) 미지의 항원에 대한 특이적 T-세포 매개된 질환임을 설명해 준다. 따라서, 본 발명에서 사용된 방법은 건선의 발병기작에 대한 통찰을 제공할 뿐 아니라 전세계적인 피부 자가면역 질환의 진단, 예방 또는 전신 치료방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 이에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.

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실시예 1: Cβ 영역 증폭으로 간접 정량된 Vβ8, Vβ13, Vβ15 및 Vβ22 유전자를 이용하는 TCR 발현의 RT-PCR 분석

<1-1> 샘플 채취 및 총 세포 RNA 분리
한국가톨릭대학교 부설 강남성모병원을 방문한 6명의 건선 환자(Ps-1 내지 Ps-6)로부터 환자들의 동의 하에 피부 생검 표본을 채취하였다. 치료 시작 전 등, 팔 또는 복부에 위치한 건선 병변 부위(L) 및 비병변 부위(N)의 각 조직으로부터 생검 표본을 채취하였다. 또한, 대조군을 위해 5명의 건강한 정상인으로부터 생검 표본을 채취하였다. 채취된 각 생검 표본을 용액 D(4M 구아니디움 티오시아네이트, 25 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0, 0.5% 사르코실(sarkosyl) 및 100 mM β-머캅토에탄올) 내에서 균질화시켰다. 총 세포 RNA의 제조 및 추출을 공지의 방법(Chomczynski P., and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)에 따라 수행하였다.
<1-2> RT-PCR 수행
상기 실시예 <1-1>에서 추출된 총 세포 RNA를 올리고(dT)프라이머 및 MMLV 역전사효소(Life Technologies)를 이용하여 제1사슬 cDNA로 역전사시켰다. 이후, 상기 cDNA를 주형으로 하고 하기 표 1에 기재된 TCR Vβ유전자 훼밀리 및 서브 훼밀리, Vβ1-24에 특이적인 프라이머 26 개의 상이한 프라이머(서열번호 7 내지 서열번호 32)(Gorski, J., et al., J. Immunol. 152: 5109-5119, 1994) 중 하나와 TCR β사슬의 하류 불변영역에 특이적인 Cβ3 프라이머(서열번호 33)를 사용하여 제1라운드 PCR을 수행하였다.

유전자명	프라이머 서열번호	유전자명	프라이머 서열번호
hVβ1	7	hVβ12	20
hVβ2	8	hVβ13	21
hVβ3	9	hVβ14	22
hVβ4	10	hVβ15	23
hVβ5.1	11	hVβ16	24
hVβ5.3	12	hVβ17	25
hVβ6.1	13	hVβ18	26
hVβ6.2	14	hVβ19	27
hVβ7	15	hVβ20	28
hVβ8	16	hVβ21	29
hVβ9	17	hVβ22	30
hVβ10	18	hVβ23	31
hVβ11	19	hVβ24	32

PCR은 총 25 ㎕의 반응 혼합물[2.5 ㎕의 10×PCR 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 5 ㎍/㎖ 아세틸화 BSA), 2.5 ㎕의 10 mM dNTP 혼합물, 0.15 ㎕의 Taq 폴리머라제(5 U/㎕)(Bioneer), 순방향(forward) 프라이머로서 각각의 TCR Vβ-특이적 프라이머 10 pmol 및 역방향(reverse) 프라이머로서 TCR Cβ-특이적 프라이머(Cβ3) 10 pmol]를 이용하여 다음과 같은 PCR 증폭 파일로 수행하였다: 94 ℃에서 30 초간 변성, 58 ℃에서 30 초간 어닐링 및 72.5 ℃에서 1 분간 연장의 총 23 사이클. 대조군으로서 GADPH를 규정화시켰다.
이후, 0.5 ㎕의 제1라운드 PCR 산물을 주형으로 하고, 순방향 프라이머로서 불변영역에 특이적인 Cβ2 프라이머(서열번호 34) 및 역방향 프라이머로서 Cβ3 프라이머(서열번호 33)을 이용하여 제2라운드 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 프로파일은 다음과 같다: 94 ℃에서 30 초간 변성, 58 ℃에서 30 초간 어닐링 및 72.5 ℃에서 1 분간 연장의 총 25 사이클. 제2라운드 PCR 산물을 1.3% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 분리하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 불변영역의 밴드 강도로부터 판단할 때 일부 정량적인 변화가 몇몇 Vβ 증폭에서 나타났다. 특히, Vβ13 및 Vβ15 영역을 함유하는 TCR 유전자 훼밀리는 밴드 강도에 있어서 6 명의 환자로부터 유래된 건선 병변 부위와 비병변 부위 간에 약간의 차이를 나타내었다(도 1, B 및 C).
실시예 2: Vβ13 및 Vβ15를 사용한 TCR β-사슬 CDR3 영역의 PCR-기초 스펙트라타이핑 및 서열분석
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법에 따라 6명의 건선 환자로부터 얻은 제1사슬 cDNA를 TCR Vβ-Cβ3 프라이머쌍으로 1차 증폭하였다(제1라운드 PCR). 이후, CDR3 영역의 크기에 따른 크기 분획화를 위해 공지된 방법(Gorski, J., et al., J. Immunol. 152: 5109-5119, 1994)을 약간 변형하여 1 ㎕의 제1라운드 PCR 산물에 대해 ³²P-표지화 TCR V β 프라이머 및 Cβ5 프라이머(서열번호 35)를 이용하여 총 25 사이클의 제2라운드 PCR을 수행하였다. 방사성 PCR 산물을 동일 부피량의 변성 완충액과 혼합하고 95℃에서 5분간 가열하였다. 5 ㎕의 샘플을 6% 아크릴아미드 서열분석 겔에 로딩하여 특이적 PCR 산물을 결정하고 코닥(Rochester) X-OMAT LS 필름에 노출시킨 후 분석하였다. 그 결과, 각각의 환자 상호간의 밴드 패턴에서 전형적인 CDR3의 형태인 가우스 분포(Gaussian distribution)을 확인하였다. 그러나, 비병변 부위에 비해 병변 부위에서 그 발현정도가 증가한 밴드는 확인되지 않았다(결과 미도시). 특히, 건선 환자의 병변을 침윤하는 Vβ13 및 Vβ15를 사용한 TCR β-사슬의 다양성을 분석한 결과, CDR3 스펙트라타입은 피부에서 벌크 T 세포중 CDR3 크기의 전형적인 이질적 분포를 가리키는 가우스 분포를 나타내었다(결과 미도시).
이후, CDR3 이질성의 정도를 분석하고 반복성 TCR VDJ 재배열을 함유하는 TCR β-사슬 유전자 훼밀리를 동정하기 위하여, 각각의 밴드를 잘라내서 클로닝한 후, 서열분석을 하였다. 특히, Vβ13 및 Vβ15를 이용한 TCR Vβ CDR3 영역에 해당하는 밴드를 겔로부터 분리하여 PCR로 총 30사이클 증폭시켰다. 이 때 순방향 프라이머로는 TCR Vβ13-특이적 프라이머(서열번호 21) 및 TCR Vβ15-특이적 프라이머(서열번호 23)를, 그리고 역방향 프라이머로는 Cβ5 프라이머(서열번호 35)를 각각 사용하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터로 클로닝한 후, 염기 서열 분석 키트(USB)로 디데옥시 사슬 종결방법을 이용하여 서열 분석을 수행한 후, 아미노산 서열로 변환시켰다(Sanger, F. et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977).
그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 각각 나타내었다(표 2: 6 명의 환자의 건선 병변에서 Vβ13을 갖는 침윤된 T 세포의 TCR VDJ 영역 서열, 표 3: 6 명의 환자의 건선 병변에서 Vβ15를 갖는 침윤된 T 세포의 TCR VDJ 영역 서열).

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* 여기에 사용된 명명은 IMGT 데이터베이스(Lefranc M.P. et al., the international ImMunoGeneTics database, Nucleic Acid Res. 26: 297-303, 1998)에 따른 것이다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 6 명의 건선 환자로부터 유래된 Vβ13을 갖는 T 세포 클론이 동일한 CDR3 모티프, 소수의 연결 변화를 갖는 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 재배열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. Jβ2.7을 함유하는 동일한 공통 CDR3 모티프가 침윤성 세포에 특이적이고 특정 건선 환자에 국한되지 않는다는 것은 확실히 주목할 만하다. 참고로, Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7-Cβ를 암호화하는 핵산의 염기 서열을 대표적인 예로서 도 4에 나타내었다.

또한, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 소수의 개개 변화를 갖는 6 명의 환자중 5 명의 Vβ15를 사용하여 침윤성 T 세포에서 CDR3의 아미노산 조성(D, L, G, A 또는 R)에 있어서 동일하거나 고도로 유사한 반복성 TCR VDJ 재배열을 관찰하였다. Vβ15를 갖는 침윤성 T 세포를 이용한 결과는 특정 아미노산 모티프가 상이한 환자의 피부 병변에서 몇몇 클론 확장된 T 세포의 TCR β-사슬 CDR3를 특징으로 한다는 발견과 일치한다(Prinz, J. C. et al., Eur. J. Immunol. 29: 3360-3368, 1999).

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실시예 3: 정상인 및 건선 환자로부터 유래된 피부 생검 표본에서 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7에 상보적인 표적 DNA 서열의 검출

상기 실시예 2에서 동정된 Vβ13 서열을 갖는 침윤성 T 세포의 동정된 CDR3 DNA 서열에 따라 CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드(서열번호 36)를 합성하였다. 순방향 프라이머로서 상기 올리고뉴클레오타이드 및 역방향 프라이머로서 3'Cβ(Cβ5)를 사용하여 합성된 CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드의 특이성을 RT-PCR로 조사하였다.
구체적으로는, 4명의 정상인 및 6명의 건선 환자(Ps-7 내지 Ps-12)의 2 mm 피부 생검체으로부터 제조된 cDNA를 먼저 TCR Vβ13-특이적 프라이머(서열번호 21) 및 Cβ3 프라이머(서열번호 33)를 사용하는 RT-PCR로 증폭시켰다(제1라운드 PCR). 이후, 증폭된 PCR 산물을 CDR3 영역에 대해서는 TCR Vβ13-특이적 프라이머 및 Cβ5(서열번호 35), 그리고 불변영역에 대해서는 Cβ2 프라이머(서열번호 34) 및 Cβ3 프라이머(서열번호 33)를 각각 사용하여 2차 증폭시켰다(제2라운드 PCR). 대조군으로서 GADPH를 규정화시켰다. 그 결과, CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드가 그것이 유래된 본래의 침유선 T 세포의 DNA 서열을 증폭시킬 수 있음을 확인하였다(결과 미도시).
이후, 건선 환자에서 표적 DNA 서열을 검출하기 위하여, RT-PCR을 CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 DNA 혼성화와 결합시킨 다음의 실험을 수행하였다. 이를 위해, CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Life Technologies)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 γ³²P-ATP(Amersham Pharmacia Biotech)로 표지화하였다. 이 올리고뉴클레오타이드의 특이성을 그 서열이 유래된 본래의 클론과 몇몇 관계가 없는 클론을 교차조사함으로써 확인하였다. 즉, 표지된 CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드 탐침을 건선 환자의 침윤성 T 세포에서 유사/동일한 서열을 추적하기 위하여 사용하였다. 또한, 내부 콘트롤로서 각각의 환자로부터 유래된 각각의 cDNA 샘플에서 Cβ 발현을 추적하기 위하여 방사성표지된 Cβ3를 탐침으로 사용하였다. 제2라운드 PCR 산물을 1.3% 아가로스겔에서 분리하고 모세관 작용에 의해 양전하로 하전된 나일론 막(Schleicher & Schuell)으로 전이시키고 UV-가교제(Spectrolinker)로 막에 공유적으로 고정시켰다. 가교된 나일론막을 6×SSPE, 1% SDS, 10×덴하르트 용액, 20 ㎍/㎖의 효모 tRNA 및 50 ㎍/㎖ 연어 정자 DNA의 혼합 용액 내에서 적어도 3 시간 동안 42 ℃에서 예비혼성화시켰다. 혼성화 용액(6×SSPE, 1% SDS, 10×덴하르트 용액, 20 ㎍/㎖의 효모 tRNA 및 50 ㎍/㎖의 연어정자 DNA)내에서 제조사(Schleicher & Schuell)의 권고에 따라 약간 변형하여 42 ℃(Cβ3 탐침을 위해) 및 56 ℃(CDR3-특이적 탐침을 위해)에서 혼성화를 밤새 수행하였다. Cβ3 탐침에 대해 51 ℃에서, CDR3-특이적 탐침에 대해 61 ℃에서 세척한 후, 막을 -70 ℃에서 Cβ3 탐침에 대해 30 분간, CDR3-특이적 탐침에 대해 3∼4 시간 동안 X-레이 필름 상에 각각 노출시켰다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 재배열의 사용에 약간의 정량적 변화는 있지만, 공통된 서열을 갖는 T 세포가 6 명의 모든 시험 환자에서 침윤되는 것으로 나타났다. 그러나, 정상인으로부터 수득된 조직에서는 CDR3-특이적 탐침을 이용한 동일한 실험 조건 하에서 표적 서열이 검출되지 않았다. 상기 실험결과로부터 CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드가 건선 환자에 특이적으로 존재한다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 CDR3 영역 서열을 핑거프린트로 사용하는 복합 RT-PCR-서던 혼성화 시스템이 매우 특이적이고 감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.

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실시예 4: 건선 환자로부터 유래된 병변 부위 및 비병변 부위의 피부 생검 표본에서 표적 DWTSGV-Jβ2.7 모티프의 검출

다음으로, 상기 실시예 2에서 동정된 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7에 상응하는 표적 DNA 서열이 건선 환자의 임상적으로 활성인 병변 조직 및 비병변 조직 모두에서 검출될 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 3에 사용된 검출 시스템(복합 RT-PCR-서던 혼성화 시스템)을 사용하였다. 즉, 10 명의 상이한 건선 환자(Ps-13 내지 Ps-22)로부터 수득한 피부 생검 표본을 상기 실시예 3과 동일한 조건 하에서 분석하였다: (A) DWTSGV-Jβ2.7 모티프(CDR3-특이적 탐침)에 대해, (B) 불변영역(Cβ3)에 대해. 최초 증폭된 PCR 산물을 1× 및 1/5 희석된 주형을 사용하는 제2라운드 PCR에 사용하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CDR3-특이적 올리고뉴클레오타이드 탐침이 다른 10 명의 환자의 건선 병변 및 비병변 부위 조직의 침윤성 T 세포에 의해 공유되는 것으로 나타났다.

또한, 환자의 표본에서 DWTSGV-Jβ2.7 모티프의 발현을 확인하기 위하여 일련의 PCR 증폭을 수행하였다. 그러나, 밴드 강도를 비교하였을 때, 건선 병변 부위보다 비병변 부위에 있는 상응하는 펩타이드의 발현은 상대적으로 낮았다(결과 미도시).
이들 결과로부터 모티프가 건선 병변의 침윤된 T 세포에서 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 건선 환자로부터 유래된 침윤된 T 세포의 수용체 CDR3 Vβ13-DWTSGV-Jβ2.7 모티프는 건선의 병인 및 발병기작 연구에 유용한 도구를 제공할 뿐 아니라, 나아가 건선의 진단, 및 예방 및 전신 치료에 유용하다.

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<110> Bio Clue & Solution Co., Ltd. KIM, TAE YOON BAHK, YOUNG YIL <120> Peptides specific in TCR CDR3 of infiltrating T cells derived from patients with psoriasis and uses thereof <130> NP03-0140 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Trp Thr Ser Gly Val 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Ala Ser Arg 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ala Ser Arg Ser 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Ala Ser Tyr 1 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gattggacta gcggggtc 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta1 <400> 7 ctaaacctga gctctctgga g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta2 <400> 8 gcttctacat ctgcagtgc 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta3 <400> 9 ctggagtccg ccagcacc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta4 <400> 10 gcaacatgag ccctgaag 18 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta5.1 <400> 11 gatgaatgtg agcaccttgg ag 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta5.3 <400> 12 gctgaatgtg aacgccttgt tg 22 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta6.1 <400> 13 gatccagcgc acacagc 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta6.2 <400> 14 gatccagcgc acagagc 17 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta7 <400> 15 cctgaatgcc ccaacagc 18 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta8 <400> 16 ccagccctca gaaccag 17 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta9 <400> 17 ccctggagct tggtgactct g 21 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta10 <400> 18 ccagtccacg gagtcagg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta11 <400> 19 ccctggagtc tgccaggc 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta12 <400> 20 ctctggagtc cgctaccag 19 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta13 <400> 21 gctcaggctg ctgtcggctg c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta14 <400> 22 gtctctcgaa aagagaagag g 21 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta15 <400> 23 ccctagagtc tgccatcc 18 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta16 <400> 24 ggtgcagcct gcagaac 17 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta17 <400> 25 ggatccagca ggtagtgcg 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta18 <400> 26 cctcctcagt gactctggc 19 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta19 <400> 27 cactgtgaca tcggcccaaa ag 22 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta20 <400> 28 cctgtcctca gaaccggg 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta21 <400> 29 ccagccagca gagcttgg 18 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta22 <400> 30 ctgaacatga gctccttgg 19 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta23 <400> 31 ccggtccaca aagctgg 17 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for hVbeta24 <400> 32 catccgctca ccaggcctg 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for Cbeta3 <400> 33 ctcttgacca tggccatc 18 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for Cbeta2 <400> 34 ccgaggtcgc tgtgtttgag ccat 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for Cbeta5 <400> 35 agatctctgc ttctgatggc tc 22 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-specific oligonucletide <400> 36 gattggacta gcggggtcta cgagt 25

Claims (12)

1. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서, C-말단측에 서열번호 2로 기재된 TCR Jβ2.7의 아미노산 서열을 추가로 갖는 펩타이드.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서, N-말단측에 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 TCR Vβ13의 아미노산 서열을 추가로 갖는 펩타이드.
5. 삭제
6. 제1항에 따른 펩타이드를 암호화하는 핵산.
7. 제6항에 있어서, 서열번호 6에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산.
8. 엄격한(high stringency) 조건하에서 제6항에 따른 핵산의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산.
9. 삭제
10. 제1항에 따른 펩타이드에 대한 항체.
11. 유효성분으로서 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 또는 제10항에 따른 항체를 포함하는 건선의 진단, 또는 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
12. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 또는 제10항에 따른 항체를 사용하여 건선의 진단, 또는 예방 또는 치료용 약제를 제조하는 방법.

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