KR100572919B1

KR100572919B1 - 표면증강 라만 분광을 이용한 가수분해 효소반응 분석 방법

Info

Publication number: KR100572919B1
Application number: KR1020040006392A
Authority: KR
Inventors: 김민곤; 정봉현; 신용범
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-01-31
Filing date: 2004-01-31
Publication date: 2006-04-24
Also published as: KR20050078669A

Abstract

본 발명은 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy)을 이용한 가수분해 효소반응 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 난수용성 효소반응 기질과 수용성 생성물이 혼합된 가수분해 효소반응 수용액을 유기용매로 추출하는 단계; 상기 추출한 유기용매층을 금속나노 입자가 분산된 수용액과 혼합하는 단계; 상기 혼합 용액의 효소반응 생성물을 나노입자에 의하여 선택적으로 신호증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 효소반응 생성물의 라만분광을 측정하는 단계를 포함하는 표면증강 라만분광을 이용한 효소반응 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 효소반응 분석방법을 사용하면 자동화된 액체수송 시스템과 결합하여 마이크로웰 형태의 효소반응의 초고속 분석이 가능하다.

표면증강 라만분광, 효소반응, 나노입자, 초고속분석

Description

표면증강 라만 분광을 이용한 가수분해 효소반응 분석 방법{Measuring method of hydrolytic enzyme reactions using surface-enhanced Raman spectroscopy}

도 1은 효소반응 기질과 생성물의 혼합 용액으로부터 효소반응 생성물의 농도만을 선택적으로 측정할 수 있는 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy) 분석법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,

도 2a 내지 도 2f는 케토프로펜(ketoprofen)의 표면증강 라만 스펙트럼을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이고,

도 2a는 메탄올에 케토프로펜을 10 mM의 농도로 용해시킨 용액과 은 나노입자 용액을 1:9의 부피비로 혼합한 용액의 라만 스펙트럼이고,

도 2b는 1 M 수산화나트륨 수용액에 케토프로펜을 1 M의 농도로 용해시킨 용액의 라만 스펙트럼이고,

도 2c는 은 나노입자 수용액의 라만 스펙트럼이고,

도 2d는 메탄올과 은 나노입자 수용액을 1:9의 부피비로 혼합한 용액의 라만 스펙트럼이고,

도 2e는 메탄올에 케토프로펜에틸에스터(ketoprofenethylester)를 10 mM의 농도로 용해시킨 용액과 은 나노입자 용액을 1:9의 부피비로 혼합한 용액의 라만 스펙트럼이고,

도 2f는 메탄올에 케토프로펜을 10 mM의 농도로 용해시킨 용액과 증류수를 1:9의 부피비로 혼합한 용액의 라만 스펙트럼이고,

도 3은 클로로포름에 케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터을 일정한 농도비로 혼합한 용액에서 선택적으로 케토프로펜만 신호증폭한 표면증강 라만 스펙트럼을 나타낸 그래프이고,

a : 클로로포름에 5 mM의 케토프로펜에틸에스터를 용해시킨 시료,

b : 클로로포름에 0.5 mM의 케토프로펜과 4.5 mM의 케토프로펜에틸에스터를 용해시킨 시료,

c : 클로로포름에 1.0 mM의 케토프로펜과 4.0 mM의 케토프로펜에틸에스터를 용해시킨 시료,

d : 클로로포름에 2.3 mM의 케토프로펜과 3.0 mM의 케토프로펜에틸에스터를 용해시킨 시료,

도 4는 케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터를 혼합한 용액에서 케토프로펜의 농도에 따른 표면증강 라만 스펙트럼의 강도(intensity) 변화를 나타낸 그래프이고,

도 5는 플러비프로펜(flurbiprofen)과 플러비프로펜에틸에스터(flurbiprofenethylester)를 혼합한 용액에서 플러비프로펜의 농도에 따른 표면증강 라만 스펙트럼의 강도 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 가수분해 효소반응 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy)을 이용한 가수분해 효소반응 분석방법에 관한 것이다.

효소는 식품 및 의약품 생산에 폭넓게 응용되고 있을 뿐만 아니라, 효소의 광학선택성(stereoselectivity) 및 위치선택성(regioselectivity) 등과 같은 특성에 의하여 청정화학공정, 환경복원, 키랄(chiral) 의약품 생산 등 그 응용이 크게 확대되어 가고 있다. 이러한 효소의 응용성에 힘입어 종래에 자연계 미생물로부터 분리, 정제하여 확보하는 수준을 넘어, 미생물의 화학적 변이, 오류-유발(error-prone) PCR, 변이 PCR, 포화 돌연변이유발(saturation mutagenesis), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 증대 절단(incremental truncation), 동형재조합(homologous recombination), 세균 돌연변이 균주(bacterial mutator strain), 엇물림 증폭과정(staggered extention process), DNA 혼화(DNA shuffling) 등과 같은 다양한 생체외 조건(in vitro)에서 분자 진화에 의한 효소 확보기술이 개발되고 있다(Current Opiniom in Chemical Biology, 2001, 5: 152-158).

특히, 최근에는 미생물 유전체의 확보에 의하여 효소를 유전자로부터 변형하는 단계에서 유전체로부터 진화시키는 초고속 선별(high-throughput screening) 시스템 기술의 개발이 활발히 진행되고 있다(Current Opiniom in Chemical Biology, 2001, 12: 535-544). 이러한 효소의 초고속 선별기술에 있어서 가장 장애(bottleneck)가 되고 있는 기술이 초고속 효소활성 분석기술이라 할 수 있다. 종래에 많이 사용되는 방법은 GC(gas chromatography) 및 HPLC(high performance liquid chromatography) 방법을 사용하게 되는데, 이 방법은 지금까지 보고된 바에 의하면 가장 최적화된 방법에 의해 하루에 500개정도 분석할 수 있는 것으로 알려져 있다. 마이크로웰(micro-well) 방식에 의한 고속 효소 분석방법에서는 효소반응을 이용한 발색 및 형광이 나타나도록 하는 방법이 있으나, 상기 방법은 효소 기질을 특수하게 설계해야 하며 이렇게 선별된 효소가 실제로 사용되는 효소반응 기질에 반응성이 없는 경우가 생기는 문제점이 있다. 따라서, 보다 빠른 효소반응 분석속도가 필요하며, 특정 반응에 대해 분석 방법을 최적화해야 하는 번거로움을 탈피하여 일반화된 분석 기술이 요구되고 있다.

라만(Raman) 분광법은 물질의 고유한 진동 스펙트럼을 측정하는 것으로 물질의 고유한 스펙트럼을 찾아내어 각 물질의 정성, 정량 분석이 가능하게 한다. 특히, 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy, 이하 'SERS'이라 약칭함)은 금속 나노입자의 표면에 결합 또는 흡착된 화학물질의 라만 스펙트럼만 증폭하는 효과를 가져 기존의 라만분광 분석법에 비하여 감도가 매우 높으며 표면선 택성이 있는 장점이 있다. 따라서, SERS를 활용하여 다양한 생화학 물질들을 분석한 연구결과들이 많이 발표되고 있다(Sensors & Actuator B, 1995, 29: 183-189).

이에, 본 발명자들은 상기 SERS 분석기법을 가수분해 효소반응 분석에 도입하여 효소 반응물, 즉 효소반응 기질과 생성물의 혼합 용액에서 효소반응 생성물의 농도만을 선택적으로 분석하는 방법을 이용하여, 범용적인 효소반응 기질에 대해 마이크로웰 형태의 분석이 가능한 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 발색 및 형광 반응을 유도하지 않는 범용적인 가수분해 효소반응 기질의 효소반응을 마이크로웰 형태로 효소반응의 SERS 분석방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 수용액 상에서 난수용성 효소반응 기질과 가수분해 효소와 혼합하여 가수분해 효소 반응을 진행시키는 단계; ⅱ) 상기 난수용성 효소반응 기질과 효소반응 결과 생성된 수용성 효소반응 생성물이 혼합된 반응 수용액을 유기용매로 추출하는 단계; ⅲ) 상기 추출한 유기용매층을 금속나노 입자가 분산된 수용액과 혼합하는 단계; 및 ⅳ) 상기 수용성 효소반응 생성물의 라만분광을 측정하는 단계를 포함하는 표면증강라만분광을 이용한 가수분해 효소반응의 분석방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본원발명은 가수분해 효소반응 기질과 생성물의 혼합 용액과 나노입자가 분산되어 있는 수용액을 혼합한 후, 라만분광을 측정하여 효소반응 생성물이 나타내는 고유한 라만 피크의 세기를 측정함으로써, 효소반응 정도를 쉽게 측정할 수 있는 분석방법을 제공한다.

본 발명의 분석방법은 종래의 효소반응을 분석하기 위한 방법보다도 빠른 초고속 분석방법을 제공해야 할 뿐만 아니라, 종래 기술에서는 특정 반응을 분석하기 위해서 그 반응에 고유화된 최적화 조건을 구비해야 하는 번거로움이 있었으나, 일반적인 가수분해 반응에는 모두 적용 가능한 장점이 있다.

도 1은 효소반응 기질과 생성물의 혼합 용액으로부터 효소반응 생성물의 농도만을 선택적으로 측정할 수 있는 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy)을 이용한 본원발명의 효소반응 분석방법의 특징을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

본 발명에 있어서, 상기 효소반응 기질은 효소에 의해서 가수분해될 수 있는 기질이면 특별히 제한되는 것은 아니나 케토프로펜에틸에스터 또는 플러비프로펜에틸에스터이 것이 바람직하고, 이에 따른 효소반응 생성물은 케토프로펜 또는 플러비프로펜인 것이 바람직하다.

또한, 상기 효소반응 생성물의 농도는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일반적 인 효소반응 분석시 사용되는 0.01 내지 5 mM인 것이 바람직하다.

또한, 상기 가수분해 효소(hydrolase)는 기질에 물의 첨가에 의해서 분해되는 반응으로 에스터라제(esterase), 리파제(lipase) 및 프로테아제(protease)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 가수분해 반응에 의하여, 효소반응 기질과 비교하여 효소반응 생성물의 수용성이 증가하므로, 수용액상에 존재하는 금속나노입자에 흡착 등으로 라만분석을 위한 신호증폭이 용이하게 된다.

그렇지만, 효소반응 기질과 생성물 모두가 금속나노입자에 결합하는 경우에도 본원발명의 표면증강 라만분광을 이용한 효소반응의 분석이 가능하다. 효소반응 기질과 생성물이 금속나노입자에 동시에 결합하는 경우에도 두 물질의 라만 스펙트럼 차이에 의해 구별될 수 있기 때문이다. 이것은 금속나노입자의 결합에 의하여, 본래의 기질과 생성물에 존재하는 라만 스펙트럼 차이가 보다 강화됨으로써 미량의 농도에서도 그 분석이 가능해지기 때문이다.

또한, 상기 유기용매는 클로로포름, 사염화탄소, 이염화메탄, 에틸에테르, 부탄올, 펜탄올 및 옥탄올 등과 같이 수용액과 층 분리를 일으키는 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 무엇보다 유기용매의 라만 스펙트럼 피크는 분석하고자 효소반응 생성물의 라만 스펙트럼 피크와 일치하지 않는 것이 바람직하다.

일반적으로 효소반응은 수용액상에서 진행된다. SERS 효과를 이용한 효소반응 분석의 활용성을 높이기 위해서는 효소반응 기질과 효소반응 생성물을 수용액과 층 분리가 일어나는 유기용매에 용해시키는 것이 바람직하다. 즉, 효소반응 기질 과 생성물을 유기용매에 용해시키고, 상기 유기용매는 효소반응 수용액과 층분리를 생성함으로써 상기 수용액으로부터 효과적으로 추출될 수 있다.

수용액에서 효소반응이 진행되면 효소반응 기질과 생성물이 혼합된 상태로 존재하게 되므로, 본원발명의 바람직한 실시예에서는 상기 효소반응 용액을 유기용매로 추출한 후, 유기용매층만 분리하여 다시 은 나노입자 수용액과 혼합하였다. 이때, 수용성의 효소반응 생성물은 난수용성의 기질보다 나노입자와 용이하게 결합한다. 이를 확인하기 위하여, 본원발명의 실시예에서는 클로로포름(chloroform)에 반응 기질인 케토프로펜에틸에스터(ketoprofenethylester)와 반응 생성물인 케토프로펜(ketoprofen)의 총농도를 5 mM로 일정하게 용해시킨 용액을 은 나노입자 수용액과 혼합한 후, 케토프로펜의 농도에 따른 수용액층의 라만분광 분석을 수행하였다(도 3 참조). 그 결과, 케토프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,000 ㎝^-1에서의 피크가 증가함을 확인하였다.

또한, 상기 금속나노 입자는 은, 금 및 구리 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 은 나노입자인 것이 가장 바람직하다.

본원발명의 실시예에서는 효소반응 기질의 하나인 케토프로펜에틸에스터와 이에 따른 효소반응 생성물인 케토프로펜에 대한 SERS를 측정하였다(도 2a 내지 도 2f 참조). 구체적으로, 메탄올에 케토프로펜을 10 mM의 농도로 용해시킨 후, 은 나노입자 수용액과 1:9의 부피비로 혼합한 용액(케토프로펜의 최종농도는 1 mM)의 라만 분석을 수행한 결과, 230, 615, 715, 1,000, 1,598 ㎝^-1등에서 라만(Raman) 피크를 확인할 수 있었다(도 2a 참조). 케토프로펜을 케토프로펜에틸에스터로 대치한 용액에 대한 라만 분석을 수행한 경우에는 라만 피크가 나타나지 않음을 확인하였다(도 2e 참조). 또한, 은 나노입자 수용액을 증류수로 대체한 경우에도 라만 피크를 얻을 수 없었다(도 2f 참조). 상기 결과는 케토프로펜이 은 나노입자에 선택적으로 결합하여 SERS 효과를 나타냄을 의미한다.

또한, 상기 각 단계는 마이크로웰 상에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 분석방법은 종래의 HPLC나 GC와 같은 방법을 사용하지 않고 두 단계의 추출과정과 라만분광 분석을 통하여 간단하게 효소반응 생성물의 분석이 가능하므로, 자동화된 액체수송 시스템과 결합하여 마이크로웰(micro-well) 형태의 초고속 분석이 가능하다.

케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터의 혼합 용액에서 케토프로펜의 농도에 따른 표면증강라만분광 스펙트럼 강도(intensity)의 변화를 측정한 결과, 케토프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,000 ㎝^-1에서 라만 피크가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 또한, 플러비프로펜(flurbiprofen)과 플러비프로펜에틸에스터(flurbiprofenethylester)의 혼합 용액에서 플러비프로펜의 농도에 따른 표면증강라만 스펙트럼 강도의 변화를 측정한 결과, 플러비프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,620 ㎝^-1에서 라만 피크가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 결국, 본원발명의 분석방법을 활용하면 마이크로웰 형태의 초고속 효소반응 분석이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터 혼합물로부터 케토프로펜의 농도분석

<1-1> 은 나노입자 제조

4℃에서 2 mM 농도로 NaBH₄를 용해시킨 수용액 30 ㎖에 1 mM 농도의 AgNO₃를 용해시킨 수용액 10 ㎖을 서서히 첨가하여 은 이온을 온 나노입자로 환원시켰다. 상기 방법에 의하여 제조된 나노입자는 맑은 노란색의 콜로이드 액상을 나타내었다.

<1-2> 케토프로펜의 SERS 분석

케토프로펜의 SERS 분석을 위하여, 메탄올에 10 mM 농도의 케토프로펜을 용해시킨 후, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 나노입자 용액과 1:9의 부피비로 혼합하 였다(케토프로펜의 최종농도는 1 mM). 상기 혼합 용액 2 ㎖을 1 ㎝ 지름의 유리병에 넣은 후, 라만분석을 실행하였다. 라만분석은 488 ㎚ 파장의 아르곤 레이저를 조사하여 조빈-이본 이중 단색분광계(Jobin-Yvon double monochromater spectrometer)(Jobin-Yvon, 프랑스)로 측정하는 방식으로 수행하였다(도 2a). 대조군으로 1 M 수산화나트륨 수용액에 케토프로펜을 1 M 농도로 용해시킨 용액(도 2b), 은 나노입자 수용액(도 2c), 메탄올과 상기 은 나노입자 수용액을 1:9의 부피비로 혼합한 용액(도 2d), 메탄올에 케토프로펜에틸에스터를 10 mM 농도로 용해시킨 용액과 상기 은 나노입자 수용액을 1:9의 부피비로 혼합한 용액(도 2e), 메탄올에 케토프로펜을 10 mM의 농도로 용해시킨 용액과 증류수를 1:9의 부피비로 혼합한 용액(도 2f)을 사용하여 라만 측정을 수행하였다.

도 2a 내지 도 2f에 상기 용액들에 대하여 측정한 라만 스펙트럼의 결과를 도시하였다. 도 2a는 1 mM 농도의 케토프로펜의 SERS 스펙트럼이고, 도 2b는 1 M 농도의 케토프로펜의 SERS 스펙트럼이다. 도 2c 내지 도 2f는 상기 도 2a와 비교하기 위한 스펙트럼이다. 구체적으로 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 1 M의 케토프로펜의 라만 피크 중에서 230, 615, 715, 1000, 1598 ㎝^-1등의 피크가 은 나노입자의 SERS 효과에 의하여 1 mM의 케토프로펜에서도 나타남을 확인하였다. 도 2c는 은 나노입자 수용액의 라만 스펙트럼으로 특정한 피크가 나타나지 않으며, 도 2d는 도 2a와 비교할 때 케토프로펜만을 제외하였으므로 메탄올만의 라만 피크가 나타났다. 도 2e는 도 2a와 비교할 때, 케토프로펜 대신 케토프로펜에틸에스터를 첨가한 것으로 도 2a와 같은 다양한 피크가 나타나지 않으므로, 케토프로펜에 대한 선택적인 SERS 효과를 보여주는 결과이며, 도 2f는 도 2a와 비교할 때 은 나노입자 수용액 대신 증류수를 사용한 것으로 라만 피크를 확인할 수 없는 것으로 나타났다. 상기 결과를 통하여, 1 mM 농도의 미량의 케토프로펜도 SERS 효과에 의해 분석이 가능함을 확인하였다.

<1-3> SERS를 이용한 케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터 혼합물로부터 케토프로펜 농도 분석

클로로포름 유기용매에 케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터를 각각 0.0/5.0, 0.5/4.5, 1.0/4.0, 2.0/3.0 mM의 비율로 혼합하여 용해시킨 용액과 상기 은 나노입자 수용액을 1:1의 비율로 혼합한 후, 상기 수용액과 유기용매의 층 분리가 일어난 뒤, 수용액층만 분리하여 라만 측정을 실시하였다(도 3). 그 결과, 케토프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,000 ㎝^-1의 라만 피크가 증가하였으며, 케토프로펜이 함유되어 있지 않은 a의 경우 1000 cm^-1에서 라만 피크가 나타나지 않음을 확인하였다.

케토프로펜과 케토프로펜에틸에스터를 혼합한 용액에서 케토프로펜의 농도에 따른 표면증강 라만 스펙트럼의 강도(intensity) 변화를 측정하기 위하여, 케토프로펜의 농도에 따른 도 3의 1,000 ㎝^-1에서의 피크 세기를 측정하였다(도 4). 그 결과, 5 mM의 케토프로펜에틸에스터를 수용액에서 에스터라제(esterase) 가수분해 효소로 반응을 수행한 후, 효소반응 기질인 케토프로펜에틸에스터와 생성물인 케토프로펜을 클로로포름으로 추출한 후, 은 나노입자 수용액으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 도 4에 제시한 바와 같이, 케토프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,000 ㎝^-1에서 라만 피크가 증가하는 것을 확인할 수 있으므로, 본원발명의 분석방법을 활용하면 마이크로웰 형태의 초고속 효소반응 분석이 가능하다.

<실시예 2> SERS를 이용한 플러비프로펜과 플러비프로펜에틸에스터 혼합물로부터 플러비프로펜의 농도 분석

실시예 <1-1> 내지 실시예 <1-3>과 동일한 절차에 따라 플러비프로펜과 플러비프로펜에틸에스터의 총농도를 5 mM로 하여 플러비프로펜의 농도를 변화시키며 라만분석을 수행하였다. 그 결과, 플러비프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,620 ㎝^-1 의 라만 피크가 증가함을 확인하였다. 또한, 플러비프로펜(flurbiprofen)과 플러비프로펜에틸에스터(flurbiprofenethylester)를 혼합한 용액에서 플러비프로펜의 농도에 따른 표면증강 라만 스펙트럼의 강도 변화를 측정하기 위하여, 케토프로펜의 농도에 따른 1,620 ㎝^-1에서의 피크 세기를 측정하였다(도 5).

그 결과, 5 mM의 플러비프로펜에틸에스터를 수용액에서 에스터라제 가수분해 효소로 반응을 수행한 후, 효소반응 기질인 플러비프로펜에틸에스터와 생성물인 플러비프로펜을 클로로포름으로 추출한 후, 은 나노입자 수용액으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 도 5에 제시한 바와 같이, 플러비프로펜의 농도가 증가함에 따라 1,620 ㎝^-1에서 라만 피크가 증가하는 것을 확인할 수 있으므로, 본원발명의 분석방법을 활용하면 마이크로웰 형태의 초고속 효소반응 분석이 가능하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 분석방법은 두 단계의 추출과정과 라만 분광분석에 의해 간단하게 가수분해 효소반응 생성물의 분석이 가능하므로, 자동화된 액체수송 시스템과 결합하여 마이크로웰 형태의 효소반응 초고속 분석이 가능하여 초고속 효소 선별에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

에스테라제, 리파제 및 단백질 가수분해 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 효소반응을 분석하는 방법에 있어서,

ⅰ) 수용액 상에서 난수용성 효소반응 기질과 가수분해 효소와 혼합하여 가수분해 효소 반응을 진행시키는 단계;

ⅱ) 상기 난수용성 효소반응 기질과 효소반응 결과 생성된 수용성 효소반응 생성물이 혼합된 반응 수용액을 유기용매로 추출하는 단계;

ⅲ) 상기 추출한 유기용매층을 금속나노 입자가 분산된 수용액과 혼합하는 단계; 및

ⅳ) 상기 수용성 효소반응 생성물의 라만분광을 측정하는 단계를 포함하는 표면증강라만분광을 이용한 가수분해 효소반응의 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 난수용성 효소반응 기질은 케토프로펜에틸에스터 또는 플러비프로펜에틸에스터이고, 효소반응 생성물은 케토프로펜 또는 플러비프로펜인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 수용성 효소반응 생성물의 농도는 0.01 내지 5 mM인 것을 특징으로 하는 분석방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름, 사염화탄소, 이염화메탄, 에틸에테르, 부탄올, 펜탄올 및 옥탄올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 금속나노 입자는 은, 금 및 구리 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 6항에 있어서, 상기 금속나노 입자는 은 나노입자인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 각 단계는 마이크로웰 상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석방법.