KR100559243B1 - 계란으로부터 분리한 신규한 물추출물 ｐｆ-01, ｐｆ-02및 ｐｆ-03 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항혈전제로서 이용될 수 있는 계란의 물추출물 PF-01, PF-02 및 PF-03에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명에 따른 계란의 물추출물 PF-01은 계란으로부터 난각을 제거한 부위를 클로로포름/메탄올로 추출한 후, 상층을 건조시킨 다음, 건조분말을 클로로포름/물로 다시 추출하여 수층을 얻어냄으로써 분리해내며, 본 발명에 따른 계란의 물추출물 PF-02 및 PF-03은 상기 분리한 PF-01에 함유되어 있는 지용성물질, 예를 들어 인지질 및 콜레스테롤을 클로로포름/메탄올로 추출하여 제거한 후, 물에 녹는 수층만을 다시 여과하여 얻어짐을 특징으로 한다.

계란의 물추출물*항혈전*cAMP/cGMP 생성촉진*콜라겐 유인 혈소판 응집*혈액응고

Description

계란으로부터 분리한 신규한 물추출물 ＰＦ-01, ＰＦ-02 및 ＰＦ-03{Novel extracts PF-01, PF-02 and PF-03 from chicken egg}

도 1은 본 발명에 따른 계란 물추출물인 PF-01, PF-02 및 PF-03을 얻어내는 방법에 관한 개요를 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 계란 물추출물인 PF-01이 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제함을 보여주는 도면이다(도 2에서, A는 1mM의 칼슘 이온 존재 하에서, B는 2mM의 칼슘 이온의 존재 하에서 콜라겐에 의한 혈소판 응집을 유발시킨 것으로, PF-01에 대한 혈소판 응집 반응 억제를 보고자 한 것이다.)

도 3은 본 발명에 따른 계란 물추출물인 PF-02 및 PF-03이 1mM의 칼슘 이온 존재 하에서 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제함을 보여주는 도면이다.

도 4는 본 발명에 따른 계란 물추출물인 PF-02 및 PF-03이 2mM의 칼슘 이온 존재 하에서 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제함을 보여주는 도면이다.

도 5는 본 발명에 따른 계란 물추출물 PF-01, PF-02 및 PF-03이 혈액 응고에 관련된 PT값 및 APTT값을 연장시킴을 보여주는 도면이다.

도 6은 본 발명에 따른 계란 물추출물 PF-01의 인지질 구성 성분을 분석한 도면이다.

도 7은 PF-02 및 PF-03 추출물 내에 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄 올아민(PE) 등의 인지질 성분이 포함되어 있는지를 확인한 도면이다(도 7에서 레인 1은 PC, 레인 2는 PE, 레인 3은 PF-02 및 레인 4는 PF-03을 나타낸다.).

도 8은 PF-02 및 PF-03 추출물 내에 콜레스테롤 성분이 포함되어 있는지를 확인한 도면이다(도 8에서, 레인 1은 콜레스테롤, 레인 2는 PF-02, 레인 3은 PF-03 및 레인 4는 PF-01을 나타낸다.).

도 9는 PF-01 추출물 내에 포함되어 있는 단백질들의 분자량을 측정한 도면이다.

도 10은 PF-03 추출물 내에 포함되어 있는 단백질들의 분자량을 측정한 도면이다.

도 11은 PF-03 추출물 내에 존재하는 단백질에는 포스비틴이 포함되어 있지 않음을 보여주는 도면이다.

본 발명은 항혈전제로서 이용될 수 있는 계란의 물추출물 PF-01, PF-02 및 PF-03에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명에 따른 계란의 물추출물 PF-01은 계란으로부터 난각을 제거한 부위를 클로로포름/메탄올로 추출한 후, 상층을 건조시킨 다음, 건조분말을 클로로포름/물로 다시 추출하여 수층을 얻어냄으로써 분리해내며, 본 발명에 따른 계란의 물추출물 PF-02 및 PF-03은 상기 분리한 PF-01에 함유되어 있는 지용성물질, 예를 들어 인지질 및 콜레스테롤을 클로로포름/메탄올 로 추출하여 제거한 후, 물에 녹는 수층만을 다시 여과하여 얻어짐을 특징으로 한다.

최근에 식생활이 서구화됨에 따라 고혈압, 동맥경화, 심혈관 질환들의 순환기계 질병이 증가되고 있다. 최근 선진국의 조사에 의하면 혈관 순환기계 질환이 현대인의 사망 원인의 1위를 차지하고 있으며, 우리 나라의 경우에도 통계청의 보고에 의하면 2000년 기준으로 암(21.4%), 뇌혈관 질환(16%), 심장병(8.3%)의 순위로 나타나 있어 심혈관계 질환으로 인한 사망률의 합계가 암에 의한 사망률을 상회하고 있는 실정이다. 이러한 순환기계 질병의 원인은 혈관 손상 부위에서의 혈전의 형성인데, 이러한 현상은 ① 혈관 (vascular compartments) 손상 ② 혈소판 응집 (platelet aggregation) ③ 혈장 응고 인자 (plasma coagulation factor)에 의한 혈액 응고가 동일한 영역에서 일어나는 병리 현상이다. 이와 같이 혈전을 예방하고 치료하기 위하여 현재 많은 약물들이 개발되었으나 혈관 손상 부위에서의 출혈 시간의 연장과 위장 점막에서의 내출혈 또는 전신성 출혈 등의 부작용으로 인하여 장기 치료의 목적에는 적합하지 못하다. 그러므로, 좀 더 안전하고 효과적인 항혈소판제의 개발을 위해 많은 연구가 집중되고 있으며, 여러 가지 부작용을 일으키는 의약품과는 달리 반복해서 장기간 섭취하기 때문에, 유효 성분이 미량이거나 그 활성이 매우 적은 경우라 하더라도 항상 공급됨으로서 중요한 영향을 줄 수 있는 식품으로부터 그 성분을 찾고자 많은 연구가 진행되었다.

또한, 항혈전 기능을 갖는 펩티드에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 즉, 펩티드는 구조 및 활성이 다양하고, 프로테아제(protease)들에 의해 분리되며 유전 공학 기술에 의한 생산 및 개조가 가능하고, 높은 안전성을 기대할 수 있다는 장점이 있어 이에 대한 연구가 진행되고 있다.

그 결과로, 지금까지 혈소판 응집 저해 활성을 갖는 식품 유래의 펩티드로서 우유 단백질 κ-카제인 유래의 Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys (MAIPPKKNQDK)과 Pro-His-Leu-Ser-Phe (PHLSF), 인유 단백질 lactoferrin유래의 Lys-Arg-Asp-Ser (KRDS) 그리고 쌀 단백질의 trypsin 분해물로부터 분리한 Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg (RGDLER) 등이 보고되어 있다.

그러나, 펩티드를 약제로서 사용하는 것은 생체 투여 경로의 선택에 문제점이 있다. 즉, 경구 투여의 경우에는 위산 및 장내 여러 효소에서 분해되는 문제점이 있다. 또한, 설사 많은 양을 섭취하거나, 여러 다른 제제를 사용하여, 위산 등의 효소 분해에 대비하였다고 하더라도, 장내에서 혈관으로 흡수되는 효율이 낮다. 또한, 주사에 의해 직접 펩티드 약제를 투여한다고 하더라도, 세포내로 삽입되기가 어렵고, 표적 부위로 이동하는 도중 대부분이 분해되기 때문에, 펩티드 약제의 효율성은 매우 낮아, 상업화하기가 매우 어렵다.

따라서, 펩티드와는 다른 항혈전 기능을 갖는 물질을 찾기 위한 노력이 당업계에서 행해지고 있다.

이에 본 발명자들 또한, 그러한 항혈전 기능을 갖는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 클로로포름/메탄올로 추출한 후, 상층을 건조시킨 다음, 건조 분말을 클로로포름/물로 다시 추출하여 수층을 얻어냄으로써 분리해 낸 계란의 물 추출물 PF-01과 상기 분리한 PF-01을 클로로포름/메탄올로 한번 더 추출하여 lipid를 최대한 제거한 후 얻어낸 PF-02 및 PF-03이 콜라겐에 의해 활성화된 혈소판 응집을 억제하고, 혈액 응고 시간을 상당히 지연시키며, 혈소판 응집 및 혈액 응고가 발생하지 않도록 세포내 신호전달 기작에 억제 방향으로 관여함을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 계란으로부터 분리한 물추출물들을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 항혈전 기능을 갖는 물질로서 상기 계란의 물추출물들을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 계란으로부터 물추출물을 분리해내는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 계란 물추출물 PF-01은 클로로포름/메탄올로 추출한 후, 상층을 건조시켜 분말을 제조한 다음, 얻어진 건조분말을 클로로포름/물로 다시 추출하여 수층을 분리한 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 계란 물추출물 PF-02는 상기 분리된 PF-01에 함유되어 있는 인지질 및 콜레스테롤을 클로로포름/메탄올로 다시 추출하여 제거하고, 얻어지는 물에 녹는 물질만을 포함하고 있는 수층만을 다시 여과하여 얻어지는 상층 용액을 분리해냄으로써 얻어진다.

또한, 본 발명에 따른 계란 물추출물 PF-03은 상기 분리된 PF-01에 함유되어 있는 인지질 및 콜레스테롤을 클로로포름/메탄올로 다시 추출하여 제거하고, 얻어지는 물에 녹는 물질만을 포함하고 있는 수층만을 다시 여과하여 얻어지는 하층 용액을 분리해냄으로써 얻어진다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

내피 세포는 정상 상태에서 프로스타사이클린(prostacyclin; PGI₂), 헤파린설페이트(heparin sulfate) 등 여러 물질을 분비하여, 혈관 내 혈전 형성을 억제하는 비혈전 형성의 특성을 가지고 있다.

여기에서 프로스타사이클린은 아라키돈산(arachidonic acid)의 대사 산물로서 내피 세포에서 생성되며, 그의 생물학적 작용은 크게 두 가지로 구분된다. 즉, 하나는 혈소판 응집을 억제하는 작용이며, 다른 하나는 혈관을 확장시키는 작용이다. 이러한 기능을 통해, PGI₂는 혈관벽에서 생성되어 혈액의 적절한 흐름을 유지하도록 작용한다.

한편, 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드(prostaglandin endoperoxides)로서 프로스타글란딘 G₂(PGG₂) 및 프로스타글란딘 H₂(PGH₂)는 혈소판에서 비-프로스타글란딘 복합물인 트롬복세인 A₂(thromboxane A₂; TXA₂)로 전환될 수 있으며, 이는 혈소판 응집을 활성화시킨다.

그러므로, 혈소판에 의해 생성된 TXA₂의 양과 혈관에 의해 생성된 PGI₂ 양 사이의 균형은 정상 지혈 과정 유지에 매우 중요하다 ^1,2). 예를 들어, 혈소판의 과잉 응집으로 TXA₂가 많이 생성될 경우에는 혈관벽을 수축시켜 혈전 형성을 촉진시키며, 심장 질환, 고혈압, 동맥경화증 및 뇌혈전 등은 TXA₂ 및 PGI₂의 불균형으로 인해 유발된다고 알려져 있다.

한편, 혈소판 응집 반응은 혈전 형성의 초기 반응으로, 혈소판 응집 반응의 기작은 다음과 같이 알려져 있다. 즉, 혈관에 구멍이 나거나 절단되게 되면, 혈관 내피세포(endothelium)가 손상을 입게 되며, 혈관 내피세포 밑층인 교원 섬유(collagen fiber)에 혈소판이 작용하여, 막 수용체(receptor) ^3-5)를 거쳐 G-프로테인이 활성화되고, 이에 의한 Ca²⁺-의존성 포스포리파아제 C가 활성화된다. 그 결과로 혈소판 막에 존재하는 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(이하, PIP₂) 등의 포스포이노시타이드들이 분해된다. 이 때 생성된 IP₃는 ER(endoplasmic reticulum)로부터 Ca²⁺을 이동시키고, 이 Ca²⁺은 Ca²⁺ 결합 단백질인 칼모듈린(calmodulin)과 결합하여 Ca²⁺/칼모듈린-의존성 키나아제의 활성을 촉진시키며, 키나아제에 의해 인산화된 단백질 20(또는 22)kDa 단백질은 혈소판 응집 반응과 분비 반응에 깊이 관여한다 ^6-22).

또한, PIP₂의 분해에 의해서 생성된 디아실글리세롤(이하, DG)은 C-키나아제(DG/Ca²⁺-의존성 프로테인 키나아제)와 결합해서 47kDa 단백질을 인산화 시키고, 인산화된 47kDa 단백질은 혈소판 응집 반응 및 분비 반응에 관여한다. 또한, DG는 모노아실글리세롤(MG)로 분해되어, 아라키돈산을 세포질로 제공하고, 생성된 아라키돈산에 사이클로옥시게나아제가 작용하여, PGG₂/PGH₂를 생성시키고, 여기에 트로복세인 A₂ 신타아제가 작용하여 TXA₂가 생성된다. 상기 설명한 바와 같이, TXA₂는 혈소판을 강력하게 응집시키는 인자로서, 혈전 형성에 있어서 깊숙히 관여한다.

결과적으로, Ca²⁺/칼모듈린-의존성 프로테인 키나아제 및 C-키나아제에 의한 단백질 인산화 반응과 TXA₂의 생성에 있어서, 혈소판 내부에 축적되어 있는 Ca²⁺이 혈소판 응집 인자로서 중요한 작용을 한다. 따라서, Ca²⁺의 동원을 억제시키거나, Ca²⁺의 작용을 억제시켜 주는 Ca²⁺ 길항제(antagonists)는 혈소판 응집반응을 억제시킬 수 있는 항혈소판제로서 기능할 수 있다.

한편, 쎄오필린(theophylline), 몰시도마인(molsidomine) 등과 같은 혈관 확장제(vasodilator)는 cAMP-특이적 포스포디에스터라아제 또는 cGMP-특이적 포스포디에스터라아제의 활성을 억제시키거나, 아데닐레이트 사이클라아제 및 구아닐레이트 사이클라아제의 활성을 촉진시킴으로서 cAMP 또는 cGMP의 생성을 촉진시켜 혈소판 응집 반응을 억제시키는 항혈소판제로서 알려져 있다. cAMP와 cGMP는 Ca²⁺의 동원을 억제시켜 혈소판 응집반응을 억제시킨다는 것은 당업계에 통상적으로 알려져 있다 ^23-28). 따라서, 혈소판 응집 반응에 있어서 cAMP와 cGMP 등의 사이클릭 뉴클레오타이드의 생성과 Ca²⁺ 동원의 밀접한 관계에 대한 연구 결과는 항혈소판제 개발에 많은 정보를 제공할 수 있다.

한편, 혈액 응고체계는 혈관 손상에 의한 내인성 혈액 응고계(intrinsic blood coagulation system)와 조직 유래의 외인성 혈액 응고계(extrinsic blood coagulation system)로 나누어진다²⁹⁾.

내인성 응고계는 인자 Ⅶa를 시발점으로 하여 섬유 피브린 덩어리(fibrin clot)가 생성될 때까지 과정을 포함하며, 이는 APTT(activated partial thromboplastin time)로 그 임상적 기능이 평가된다. 또한, 외인성 응고계는 조직 유래의 트롬보플라스틴(thromboplastin; 인자 Ⅲ)을 시발점으로 피브린 덩어리를 형성하는 과정을 포함하며, 이는 PT(prothrombin time)로 그 임상적 의의가 판단된다.

상술한 내인성 응고계와 외인성 응고계는 공통적으로 혈액응고 인자 Ⅴa, Ⅹa, Ca²⁺ 등의 복합체에 의해 프로트롬빈이 트롬빈으로 분해되는 것과, 피브리노겐(fibrinogen)이 피브린으로 분해되는 과정이 동시에 일어난다.

특히, 혈액 응고 시스템에서 생성되는 트롬빈은 혈소판을 강력하게 응집하는 작용 물질(agonist)로 작용하기 때문에, APTT와 PT의 연장은 트롬빈의 생성을 지연시키는 것을 의미한다. 이것은 혈전 형성의 초기 반응인 혈관 손상시 노출되는 콜 라겐에 의한 혈소판 응집 반응을 억제시켜야 함을 의미한다. 즉, APTT와 PT를 연장시킴과 동시에 혈소판 응집 반응을 억제시키는 생리 활성을 갖는 물질은 항혈전제로서의 기능성 물질로 유용하게 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 따르면, 계란 물추출물로서 PF-01, PF-02 및 PF-03은 매우 우수한 항혈소판 응집 억제작용을 갖고 있으며, 특히 PF-03은 각종 성인병을 유발하는 콜레스테롤을 함유하고 있지 않기 때문에, 고지혈증, 심근 경색, 고혈압 등의 혈전 형성에 의해서 유발되는 순환기계 질환을 치료하는데 더욱 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 계란 물추출물로서 PF-01, PF-02 및 PF-03은 화학적으로 합성된 것이 아니라, 천연물로부터 분리해 낸 물질이기 때문에, 간의 손상, 인체의 항상성 파괴, 약물 내성 등의 부작용을 최소화시킬 수 있으며, 계란은 우리나라 음식 문화에서 단백질의 공급원으로서 가장 손쉽게 접할 수 있는 식품이므로, 장기간 꾸준히 섭취할 수 있다는 장점과 함께 경제적으로도 아주 저렴하다는 이점이 있다.

계란 물추출물로서 PF-01, PF-02 및 PF-03은 콜라겐에 의해 유발되는 혈소판 응집반응을 매우 현저하게 억제할 수 있으며, 이들 중에서 PF-03이 가장 그 효과가 크다.

또한, PF-01, PF-02 및 PF-03은 외인성 혈액 응고 억제 작용을 평가하는데 사용하는 PT값 및 내인성 혈액 응고 억제 작용을 평가하는데 사용하는 APTT값을 유의적으로 지연시킬 수 있으며, 이러한 사실로부터 본 발명에 따른 계란의 물추출물이 항혈전제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

한편, 본 발명에 의하면, 이러한 계란의 물추출물로서 PF-01, PF-02 및 PF-03은 수용성 구아닐레이트 사이클라아제(soluble guanylate cyclase; 이하, sGC) 및 수용성 아데닐레이트 사이클라아제(soluble adenylate cyclase; 이하, sAC)를 활성화시킬 수 있으며, 세포내 cGMP 및 cAMP 양을 증가시킬 수 있다. 이러한 cGMP 및 cAMP 양의 세포내 증가는, cAMP/cGMP-의존성 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화 반응 ⁶²⁾을 유발시키며, 이는 세포막에 존재하는 인지질의 대사 반응에 관여하여, 세포질내 Ca²⁺의 동원을 억제하고, TXA₂의 생성을 억제하며, 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 부착, 분비, 응집 등의 혈소판 활성화를 억제시킬 수 있다. 이에 더하여, cAMP/cGMP-의존성 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화 반응은 혈관 확장인자(vasodilator)의 활성화를 초래하여, 혈전 형성에 의한 질병을 완화시킬 수도 있다.

결과적으로, 계란으로부터 추출한 물추출물 PF-01, PF-02 및 PF-03은 혈소판 응집 반응 억제 작용 및 항혈전 작용이 매우 우수하고, PF-03은 콜레스테롤을 전혀 함유하지 않기 때문에, 고지혈증, 심근 경색, 뇌혈전증, 고혈압 등의 순환기계 질환을 치료하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 각종 실시예, 실험예 및 참고 실시예 등을 통해서, 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 행하여지고, 주지되어 있는 변형 등을 가할 수 있고, 이러한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

한편, 모든 결과들은 최소한 두 번의 실험을 수행한 결과이며, 평균±S.D.로 결과를 나타내었다. 통계분석은 Student's t-test를 통해서 검증하였고, P〈 0.01일 때, 결과의 유효성이 있는 것으로 간주하였다.

[실시예 1] 온전한 계란으로부터의 물추출물 제조

온전한 계란으로부터 본 발명의 물추출물을 제조하는 방법은 도 1에 나타낸 바와 같다. 즉, 시판되고 있는 계란(바이오 황금란, 생산지: 경남 사천)에서 난각(卵殼)을 제거하고, 난황(卵黃)을 균질화기(glass potter homogenizer)를 이용하여 증류수와 함께 균질화시킨 다음, 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)을 첨가하여, 24시간 동안 추출 혼합기(Extraction Mixer; Lab - Line)로 3번 추출한 후, 상층의 흰색 분획을 얻어내었다. 그런 다음, 이 분획을 진공 감압기(Vacuum evaporator; Heidolph)와 N₂ 가스를 이용하여 완전히 농축하였다. 그런 다음, 이를 다시 클로로포름/증류수(1:1, v/v)로 하룻밤 동안 추출하고, 상층을 진공 감압기 및 N₂ 가스로 완전히 농축하여 PF-01을 얻어내었다.

상기 분리한 PF-01을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)의 용액으로 추출하여 지질 성분을 제거한 후, 원심 분리 여과 장치를 이용하여 3,000rpm으로, 4℃에서 10분간 원심 분리한 후, 상층의 PF-02 및 하층의 PF-03을 얻어내었다.

[참고 실시예 1] 사람 농축 세척 혈소판의 제조

건강한 사람의 정맥혈로부터 분리한 PRP를 600rpm 또는 1,000rpm으로 25℃에서 10분간 원심 분리하여 혈장에 잔존하는 적혈구를 침전시키고, 순수한 PRP를 함 유하는 상청액을 얻었다. 이를 다시 3,000rpm으로 25℃에서 10분 동안 원심 분리하여 비중차를 이용하여 PPP(Platelet Poor Plasma) 및 혈소판을 분리한 후, 침전된 혈소판을 세척 완충액(129mM NaCl, 10.9mM 구연산 나트륨, 8.9mM 중탄산염 나트륨, 1mg/ml 포도당, 10mM 트리스, 2.8mM KCl, 0.8mM 인산칼륨, 2mM EDTA, pH 6.5)로 두 번 세척하고, 그런 다음 EDTA를 함유하지 않은 세척 완충액(pH 6.9, 현탁 완충액)으로 혈소판 현탁액을 제조하였다.

일정하게 5×10⁸ 혈소판/ml로 혈소판 수를 맞추기 위해, 상기 제조된 세척 혈소판 현탁액의 일부를 현탁 완충액으로 적당히 희석한 후, 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 660nm에서 흡광도가 1.1일 때, 1×10⁸ 혈소판/ml이며, 측정된 흡광도 값을 통해, 혈소판 수를 현탁 완충액으로 희석하여 혈소판 수를 5×10⁸ 혈소판/ml으로 조정하였다.

한편, 상기에서 상청액에 포함된 PPP 용액은 이후의 혈액 응고 검사에 이용하였다.

[참고 실시예 2] 단백질 정량

본 실시예에서는 브래드포드 방법(Bradford (1976)의 방법)을 이용하여 단백질을 정량하였다. PF-01의 적당량을 취하여, H₂O로 전체 부피가 100㎕이 되도록 조절한 후, 브래드포드 염색약(Bradford dye; Sigma Co.)을 3.0ml 첨가하고, 잘 혼합하였다. 그런 다음, 595nm에서 흡광도를 측정하여 계란 추출물의 단백질 함량을 결 정하였다.

[실시예 2] 사람 농축 세척 혈소판의 응집 측정

1. PF-01 분획의 혈소판 응집 억제 효과

계란에서 추출한 PF-01이 사람의 혈소판에 어떠한 영향력을 갖는지 알아보기 위해서 사람 세척 혈소판을 10㎍/ml의 콜라겐으로 자극시킨 후 PF-01을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 혈소판 응집반응 양상을 관찰하였다.

즉, 5×10⁸ 혈소판/ml의 세척 혈소판을 최종부피가 250㎕가 되도록 첨가하고, 1mM CaCl₂ 또는 2mM CaCl₂ 존재하에서 10㎍/ml의 콜라겐으로 혈소판 응집을 자극하였다. 그런 다음, PF-01을 첨가한 후, 3분 동안 사전 배양하고, 10㎍/ml의 콜라겐(Chrono - Log)을 더 첨가한 후, 5분 동안 응집반응을 관찰하였다. 응집의 정도는 Lumi Aggregometer(Chrono - Log, PA)를 이용하여 빛 투과성(light transmission)을 측정함으로써 확인하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, PF-01은 콜라겐-유도 사람 혈소판 응집 반응을 농도 의존적으로 강하게 억제시킨다는 것을 확인하였다.

2. PF-02 및 PF-03 분획의 혈소판 응집 억제 효과

또한, PF-01 분획 대신에, PF-02 또는 PF-03 분획을 사용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법에 의해서, PF-02 또는 PF-03 분획의 혈소판 응집 억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1, 도 3 및 도 4에 나타내었다.

		Aggregation (%)	Inhibition (%)
Collagen (10㎍/ml)		37.5	0
Collagen (10㎍/ml) + PF-02 (㎍-protein/ml)	50	7.5	80.0
	100	6.9	81.6
	300	3.75	90.0
Collagen (10㎍/ml) + PF-03 (㎍-protein/ml)	5	3.75	90.0
	10	2.5	93.3
	30	1.9	94.9
	50	0	100

상기 표 1에서 보는 바와 같이, PF-02와 PF-03 분획은 콜라겐-유도 사람 혈소판 반응을 농도-의존적으로 강하게 억제시킴을 확인하였다. 또한, PF-03 분획은, 1mM CaCl₂ 및 2mM CaCl₂ 반응계에서 모두 PF-01, PF-02 분획보다 혈소판 응집 억제 효과가 더 강력하다는 것을 확인하였다. 즉, 단백질의 절대량이 50㎍일 때를 기준으로 비교하면, 콜라겐 단독 처리 결과를 기준으로, PF-03은 100%의 억제율을 나타낸 반면, PF-02는 80%의 억제율만을 보여주고 있다. 또한, PF-02의 50㎍에서의 억제율은 PF-03의 5㎍에서의 억제율과 비슷하므로, PF-03는 PF-02 보다 60배의 혈소판 응집 억제 효과를 갖는다고 볼 수 있다. 따라서, PF-03는 PF-01, PF-02에 비해 사람 혈소판에 있어서 항혈전 효과가 더 강력하다는 것을 나타낸다.

3. 기존의 항혈소판제와의 상승 작용

또한, 상기와 동일한 방법을 수행하여, 기존의 항혈소판제로서 적절한 농도의 몰시도마인, 쎄오필린(Sigma Co.)을 단독 처리하거나, PF-03과 동시에 처리하여 혈소판 응집 억제의 상승 작용을 확인하고자 하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타 내었다.

Contents		Collagen (10㎍/ml)		Collagen (10㎍/ml) + Molsidomine (10μM)		Collagen (10㎍/ml) + Theophylline (10μM)
		Aggregation (%)	Inhibition (% of control)	Aggregation (%)	Inhibition (% of control)	Aggregation (%)	Inhibition (% of control)
PF-03 (㎍-protein /ml)	0	65.0	0	65.0	0	60.0	7.7
	5	36.2	44.3	38.8	40.3	27.5	57.7
	10	7.5	88.5	8.1	87.5	3.8	94.2

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 콜라겐 단독 처리에 비하여, 몰시도마인 단독으로는 혈소판 응집 억제 효과가 전혀 없었으며, 쎄오필린 단독으로도 단지 7.7%의 응집 억제 효과만을 나타내었다. 또한, 결과로 보여주지는 않았지만, 몰시도마인 및 쎄오필린은 100μM의 농도에서도 혈소판 응집 억제 효과가 10μM일 때와 비교하여 별반 차이를 보이지 않았다. 이는 기존에 알려져 있는 몰시도마인 ^50,51) 이나 쎄오필린 ^52,53)은 항혈전 효과와는 전혀 다른 결과였다.

한편, PF-03과 몰시도마인 또는 쎄오필린을 동시에 처리하면, 몰시도마인에 대해서는 상승효과가 거의 나타나지 않았으며, 쎄오필린의 경우에만 약간의 상승작용이 나타났지만, 그 효과가 거의 미비한 것으로 관찰되었다.

몰시도마인이 cGMP 생성 촉진제로서 항혈소판제이고, 쎄오필린이 cAMP 생성 촉진제로서 항혈소판제임을 생각해 보면, 이러한 결과는 본 실시예의 결과에 대한 분석을 새로운 시각으로 접근해야 됨을 의미한다. 즉, 이러한 결과는, 본 발명의 추출물의 cGMP와 cAMP 생성에 미치는 영향을 검토하고, cGMP/cAMP-의존성 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화 반응 ^54-57)을 확인해 봄으로써, 본 발명의 추출물이 혈관확장자(vasodilator)로서의 기능을 검토해야 된다는 것을 의미한다.

[실시예 3] 혈액 응집 측정

혈관 및 혈액의 응고 정도를 측정하기 위해 사용되는 전체 외인성 응고시간(Total extrinsic clotting time)을 나타내는 프로트롬빈 시간(Prothrombin Time; 이하, PT) 및 전체 내인성 응고시간(Total intrinsic clotting time)을 나타내는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboplastin Time; 이하, APTT)을 측정하였다.

1. PT

PT는 외인성 또는 공통 응고기전 전체에 대한 비특이적인 측정 방법으로, 피브린 덩어리(fibrin clot)가 형성될 때까지의 시간을 의미하며, 응고 기전 중 외인성 및 공통 기전에 관여하는 혈장 인자 기능을 선별하는데 이용된다.

본 실시예에서는 Quick등 (1980)이 개발한 한 단계(one-stage) PT 측정법을 응용하여 PT를 측정하였다. 즉, PT 측정용 세포에 0.1ml의 PPP와 농도를 달리한 본 발명의 분획들(PF-01, PF-02 또는 PF-03)을 0.1ml 첨가한 다음, 37℃에서 20분간 사전 배양하고, PT 측정용 시약인 칼슘 함유 활성화 트롬보플라스틴(bioerieux sa, France)을 첨가하여 혈장의 응고 시간을 측정하였다. 측정 단위는 초 단위로 나타냈으며, 측정 기계는 Two-Channel Coagulator(Behnk Elektronik, Germany)를 사용 하였다.

B. APTT

인자 Ⅶ 및 인자 ⅩⅢ 등의 응고 인자는 내인성 및 공통 응고 기전에 관여하는 응고 인자를 선별하는 APTT에 영향을 미친다.

APTT 검사는 혈장 내의 인지질 성분으로서 세팔린(cephalin) 또는 인시틴(insithin)를 처리하고, 순간 잠복기를 거쳐 표면 활성화를 시키고, CaCl₂를 첨가한 후부터 응고가 될 때까지의 시간을 측정함으로써 수행된다. 본 실시예에서도 유사한 방법을 이용하였다. 즉, APTT 측정용 세포에 0.1ml의 PPP, APTT 측정용 시약으로서 0.1ml의 활성화 세팔라이트(activated Cerhalite; bioerieux sa, France) 및 농도를 달리한 PF-01, PF-02 또는 PF-03 분획 처리한 다음, 37℃에서 10분간 사전배양한 후, 25mM CaCl₂를 0.1ml 첨가하여 혈장이 응고되는 시간을 측정하였다. 측정단위는 초 단위로 나타냈으며, 측정 기계는 Two-Channel Coagulator (Behnk Elektronik, Germany)를 사용하였다.

결과

(1) PF-01의 PT 및 APTT에 대한 영향

상기의 방법에 의해서 측정된 PF-01의 PT 및 APTT에 미치는 영향은 하기 표 3에 나타내었다.

Content		PT	APTT
Control		11.7	40.1
PF-01 (㎍-protein/ml)	500	15.8	44.8
	1000	20.8	55.6

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 대조군으로서 PPP를 처리한 값에 비하여, PF-01은 현저하게 PT 및 APTT를 연장시킨다. 이러한 결과는 손상된 혈관벽의 교원 섬유에 혈소판이 점착하면서 일어나는 혈소판 응집 반응에 이은 혈소판으로부터 방출되는 혈소판 인자와 혈액 응고 인자와의 상호작용으로 일어나는 혈전 형성에 있어서 PF-01은 내/외인적으로 모두 억제함을 나타내고, 따라서, PF-01은 강력한 항혈전 작용을 갖고 있음을 나타낸다.

(2) PF-02 및 PF-03의 PT 및 APTT에 대한 영향

상기의 방법과 동일하게 측정된 PF-02, PF-03의 PT 및 APTT에 미치는 영향은 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다. 표 4 및 도 5에서 대조군은 본 발명의 분획 대신에 PPP를 사용 처리한 것이다.

Content		PT	APTT
Control		11.7	40.1
PF-02 (㎍-protein/ml)	500	16.7	47.8
	1000	30.1	76.1
PF-03 (㎍-protein/ml)	500	37.6	223.8
	1000	73.2	No clot

상기 표 4 및 도 4에서 보는 바와 같이, 대조군으로서 PPP를 처리한 값에 비하여, PF-02 및 PF-03은 PF-01의 결과보다 더욱 현저하게 PT 및 APTT를 연장시킨다. 따라서, PF-02 및 PF-03은 PF-01보다 더 강력한 항혈전 작용을 갖고 있음을 알 수 있다.

[실시예 4] 세포내 cGMP 및 cAMP의 RIA

세포내 이차 신호 물질로 작용하며, 항혈소판 작용이 갖는 cGMP와 cAMP는 Radioimmunoassay(이하 RIA)로 측정하였다 ^30,31). 이 실험은 시료의 부피를 달리하여, 중복 실험을 수행하였다.

1. cGMP에 대한 검사

PRP(1×10⁸ 혈소판/ml)에 계란의 물추출물(PF-01, PF-02 또는 PF-03 분획)을 첨가하지 않거나, 농도를 달리하여 첨가하여 37℃에서 3분 동안 사전 배양시킨 다음, 10㎍/ml의 콜라겐을 첨가하여 5분 동안 배양하였다. 배양 후, 반응액에 얼음으로 냉각한 80% 에탄올을 첨가하여 cGMP를 2번 추출하였다. cGMP의 농도는 [³H]-cGMP 검사 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 측정하였다.

2. Assay of cAMP

cAMP 측정을 위한 cAMP 추출 과정은 상기 cGMP의 추출 과정과 동일하며, cAMP의 농도는 [¹²⁵I]-cAMP 검사키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 측정하였다.

결과.

1. PF-01이 Cyclic Nucleotides의 생성에 미치는 영향

상기와 동일한 방법에 의해서, PF-01 분획의 cAMP 및 cGMP의 생산 촉진 효과를 측정하였으며, 그 결과를 표 5(cAMP), 표 6(cGMP)에 나타내었다. 표 5 및 표 6의 결과는 3∼4회의 반복 실험을 통해 얻어진 값이며, **의 표시는 p<0.01로 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다.

	Base	Collagen (10㎍/ml)	Collagen(10㎍/ml) +
			PF-01 (450㎍-protein/ml)	PF-01 (500㎍-protein/ml)
cAMP (fmol/108platelets)	3,269±173.2	2,952±188.7**	3,510±39.5**	4,858±56.17**

	Base	Collagen (10㎍/ml)	Collagen(10㎍/ml) +
			PF-01 (450㎍-protein/ml)	PF-01 (500㎍-protein/ml)
cGMP (fmol/108platelets)	489.5±51.7	214±33.5*	1060±261.9*	1428±271.3*

상기 표 5 및 표 6과 도 5의 결과에서 보는 바와 같이, PF-01 추출물은 콜라겐의 처리에 의해 유의적으로 감소된 cAMP 및 cGMP의 생성량을, 농도 의존적으로 증가시켰다. 이러한 결과는 PF-01이 콜라겐-유인 혈소판 응집 반응에서 세포내 cAMP 및 cGMP의 양을 농도 의존적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.

하기 표 7은 상기 결과 값으로부터 cAMP의 생산에 대한 상대적 cGMP의 생산 비율을 계산한 값이다.

	Base	Collagen (10㎍/ml)	Collagen(10㎍/ml) +
			PF-01 (450㎍-protein/ml)	PF-01 (500㎍-protein/ml)
cGMP/cAMP	0.15	0.07	0.30	0.29

상기 표 7에서 보는 바와 같이, 콜라겐에 의해서 유인되는 혈소판 응집 반응에서 PF-01은 cAMP보다 cGMP의 생성을 더욱 증가시켰다. 이러한 결과는 PF-01이 콜라겐 유인 혈소판 응집 반응을 억제시키기 위해서 cAMP보다 cGMP의 생성을 더 많이 증가시킨다는 것을 의미한다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 계란 물추출물로서 PF-01, PF-02 및 PF-03이 혈소판 응집 반응의 억제제로서 기능을 갖는 것은, 이들이 cAMP보다 cGMP의 생산량을 더 증가시켜, 혈소판 활성화 인자인 Ca²⁺의 이동을 억제시키고, 더 나아가 이들 추출물에 의해 생성된 cGMP가 cGMP-의존성 단백질 키나아제를 활성화시켜, cGMP-의존성 단백질 키나아제(이하 cGK)-매개 단백질의 인산화를 유도하여, 생체내 여러 항혈소판 기작이 진행될 수 있도록 관여한다는 것을 의미한다.

[실시예 5] 성분분석

1. 콜린(choline) 정량

콜린의 함량은 Glick(1944)의 방법에 준해 실행되었다 ³³⁾. 즉, 일정량의 시료에 물을 첨가하여 2ml이 되도록 하고, 여기에 메탄올 2ml과 6N HCl 2ml을 첨가하여 100℃에서 용매가 완전히 제거될 때까지, 가열시켜 자유 콜린( free choline) 물질을 분리하였다. 실온에서 냉각시킨 후, 석유 에테르로 지방산을 3회 추출하여 제거하였다. 그런 다음, 1% 페놀프탈레인(phenolphthalein, 용매 ; 물:에탄올 = 1:1, v/v)을 80㎕ 정도씩 첨가한 후, 2N NaOH로 pH를 강알칼리로 적정하였다. 반응계에 레인넥(Reineck)산 암모늄 용액(2%, 용매 ; 메탄올 )을 첨가한 후 5℃에서 2시간 동안 방치시켜, 콜린-레인넥산 암모늄염의 발색단을 형성시켰다. 이 침전물을 n-프로판올로 3회 세척한 후, 잔여분에 아세톤을 5ml씩 첨가하여 조심스럽게 혼합하여 용해시켰다. 용해된 잔여분을 526nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 콜린 함량을 측정하였다.

2. 전체 인성분의 측정

인성분은 Bartlett (1959) 방법에 준해 실행되었다 ³⁴⁾. 즉, 적당한 시료가 함유된 반응계에 0.5ml의 10N H₂SO₄을 첨가하고, 유리로 된 비드(bead)를 유리 튜브(glass tube) 위에 얹고, 건조 오븐(dry oven)을 이용하여 160℃에서 3시간 동안 가열한 다음, 실온에서 냉각시켰다. 그런 다음, 계속해서 반응계에 30% H₂O₂을 약 80㎕ 첨가한 후, 160℃에서 90분간 다시 가열한 후, 0.22% 암모늄 몰리브데이트(Ammonium molybdate) 4.6ml 및 피스크 서바로우 시약(Fisk - Subbarow reagent) 0.2ml을 첨가한 다음, 100℃에서 7분간 끓였다. 이 때, 나타나는 정색을 830nm에서 흡광도를 측정하여 인 성분을 정량하였다.

3. 인지질 성분의 분석

TLC에 전체 지질 분획을 스포팅(spotting)한 후, 1차 전개 용매 (클로로포름/아세톤/메탄올/H₂O/아세트산 = 100/100/50/10/4, v/v) 및 2차 전개 용 매(클로로포름/메탄올/아세트산/H₂O = 180/150/30/10, v/v)로 전개시킨 다음, I₂ 증기로 동정한 후, 분리된 인지질 분획을 스크랩(scrap)해서 전체 인지질 정량법²⁾과 동일한 방법을 수행하여 발색시킨 후, 이소부틸알콜을 첨가하고, 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액(이소부틸알콜층)의 흡광도를 790nm에서 측정하여 각각의 시료에서 인지질 분획의 함량을 측정하였다.

4. 콜레스테롤 검출

TLC에 시료를 스포팅(spotting)한 후, 헥산/디에틸에테르(7:3)의 전개 용매로 전개한 후, I₂ 증기로 동정한 다음, Jatzkewitz and Mehl (1960)의 방법에 의해 농축된 H₂SO₄/빙초산(1:1, v/v)으로 염색한 후, 120℃에서 콜레스테롤을 검출하였다.

<PF-01의 성분 분석>

인지질 및 단백질 성분 분석

상기한 방법에 의해서 PF-01이 함유하는 단백질 및 인지질 성분의 함량을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

Contents	Protein (㎍-protein/mg-powder)	Phospholipids (mg-PLs/mg-powder)	Phospholipids/Protein
PF-01	561.0	636.50	1134.58
결과값은 mean ± S.D.( n = 3 )으로 나타냄.

상기 표 8에서 보는 바와 같이, PF-01에는 인지질 성분이 단백질에 비해 약 1000배 가량의 비율을 차지하고 있다.

전체 인성분 및 콜린 성분 분석

상기 실험 결과에서, PF-01에는 인지질 성분이 다량 함유되어 있다는 사실에 근거하여, 뇌발단, 간기능 및 암예방 ^46,47)에 중요한 작용을 하는 콜린의 함량을 상기한 방법에 의해서 측정하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

	Phosphorus (㎍/powder-mg)	Choline (㎍/powder-mg)	Choline/phosphorus
PF-01	30.51±1.08	70.89±3.4	2.32±3.15
결과값은 mean ± S.D.( n = 3 )으로 나타냄.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, PF-01은 인 성분에 비해 콜린 성분이 2.32배 더 많은 비율을 차지하고 있음을 확인하였다.

인지질 성분 분석

PF-01의 인지질 성분에서 주요 성분이 무엇인지를 확인하기 위하여 문헌에 공지된 방법 ^48,49)으로 인지질 성분을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, PF-01의 인지질 성분에서는 포스파티딜콜린( phosphatidylcholine; PC)이 61.57%로 가장 많은 비율을 차지하였으며, 이러한 결과는 PF-01의 인지질 성분에는 콜린의 전구체가 많이 함유되어 있음을 의미한다. 또한, PF-01에는 뇌 발단에 중요한 기능을 하는 스핑고미엘린(sphingomyelin)도 4.53% 정도 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.

<PF-02 및 PF-03의 성분 분석>

PF-02/PF-03의 인지질 분석

상기에 기재된 TLC(thin-layer chromatography) 방법에 의해서, PF-02 및 PF-03에 함유된 인지질 성분을 분석하였다. PF-02 및 PF-03의 인지질 분석을 위해 TLC 방법을 사용하면서, 표준 물질로서 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올-아민(PE)을 같이 전개하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, PF-02에는 PC와 PE가 소량 포함되어 있으며, PF-03에는 인지질 성분이 전혀 검출되지 않았다.

콜레스테롤 검출

상기한 방법에 의해서, PF-02 및 PF-03에 함유된 콜레스테롤을 검출하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, PF-03 성분에는 콜레스테롤 성분이 전혀 포함되어 있지 않다. 이러한 결과는, 본 발명의 계란의 물추출물 PF-03은 장기적인 섭취에도 콜레스테롤에 의한 성인병에 대한 우려가 없음을 나타낸다.

[실시예 8] SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석(SDS-PAGE)

SDS-PAGE는 Laemmli ^35,36)와 Hegenauer et al.³⁷⁾의 방법에 따라 수행되었으며, 17%(w/w) 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였다. 분자량 표준 물질은 Silver stain용 High Range Specifications ^38-42)와 Low Range Specifications ^40-45) (BIO-RAD Lab.)를 사용하였다. Laemmli에 따른 SDS-폴리아크릴아미드 겔 시스템은 Bio-Rad Silver Stain Plus Kit로 염색하였다.

PF-01내 함유된 단백질의 분자량 분석

상기한 바와 같이 SDS-PAGE 분석을 수행하여, PF-01에 함유된 단백질의 분자량을 분석하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보는 바와 같이, PF-01에는 6.5, 14.3, 18.4, 23, 24.5, 28.9, 40, 45 kDa의 분자량을 갖는 단백질을 함유하고 있다는 것을 확인하였다.

PF-03내 함유된 단백질의 분자량 분석

상기와 동일한 방법에 의해서, PF-03에 함유된 단백질들의 분자량을 확인하였다(도 10참조). 도 10에서 보는 바와 같이, PF-03에는 6.5, 14.3, 23, 24.5, 28.9 kDa의 분자량을 갖는 단백질을 함유하고 있다는 것이 확인하였다.

PF-03과 포스비틴(Phosvitin)과의 상관성 조사

최근 계란에서 발견된 단백질 성분 중에, 매우 안정한 형태를 갖는 35kDa의 분자량을 갖는 포스비틴이 보고되었다. 이 성분은 비-지질 포스포글리코프로테인(non lipid phosphoglycoprotein) ⁵⁸⁾으로서 10%의 인 성분을 포함하며, 금속 킬레이터(metal chelator) ⁵⁹⁾로 작용한다고 알려져 있다. 이에 PF-03과 포스비틴과의 상관성을 조사하기 위해 SDS-PAGE를 실시한 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 P2는 포스비틴과는 상관성이 없는 것으로 밝혀졌다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 신규한 추출물 PF-01, PF-02 및 PF-03의 계란 물추출물은 콜라겐에 의해 유발하는 혈소판 응집의 억제, 혈액 응고 시간의 지연 및 cAMP와 cGMP의 생산 증가 등과 같이 항혈전 효과에 관련된 활성을 갖는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 추출물들은 고지혈증, 심근 경색, 뇌혈전증, 고혈압 등의 혈전 형성이 원인이 되는 순환기계 질환의 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

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Claims (9)

1. 클로로포름/메탄올 2:1(v/v)의 부피비로 추출한 후, 상층을 건조시켜 분말을 제조한 다음, 얻어진 건조분말을 클로로포름/물 1:1(v/v)의 부피비로 다시 추출하여 수층을 분리한 PF-01 분획으로 이루어진 항혈전용 계란 난황의 물추출물.
2. 제 1항에 기재된 PF-01 분획에서 클로로포름/메탄올 2:1(v/v)의 부피비로 지용성물질을 제거하고, 물층을 다시 여과하여 얻어지는 상층 용액을 분리한 PF-02 분획으로 이루어진 항혈전용 계란 난황의 물추출물.
3. 제 1항에 기재된 PF-01 분획에서 클로로포름/메탄올 2:1(v/v)의 부피비로 지용성물질을 제거하고, 물층을 다시 여과하여 얻어지는 하층 용액을 분리한 PF-03 분획으로 이루어진 항혈전용 계란 난황의 물추출물.
4. 삭제
5. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 물추출물은 혈액응고 지연 작용에 의해 항혈전 작용을 가짐을 특징으로 하는 계란 난황의 물추출물.
6. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 물추출물은 혈소판 응집반응의 억제 작용에 의해 항혈전 작용을 가짐을 특징으로 하는 계란 난황의 물추출물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 혈소판 응집반응은 콜라겐에 의해 유도됨을 특징으로 하는 계란 난황의 물추출물.
8. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 물추출물은 혈소판 세포내 cAMP 및 cGMP의 생성량을 증가시켜 항혈전작용을 가짐을 특징으로 하는 계란 난황의 물추출물.
9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계란의 물추출물은 고지혈증, 심근 경색, 뇌혈전증 및 고혈압으로 구성된 군으로부터 선택된 혈전형성에 의해 유발되는 순환기계 질환의 치료를 위해 투여됨을 특징으로 하는 계란 난황의 물추출물.

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