KR100543978B1 - Ｌｂ막법과 자기조립법의 융합기법에 의한 단백질 칩의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 LB막법과 자기조립법의 융합기법에 의하여 제조된 단백질 칩의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질을 용해시킨 인산완충용액에 기판을 담그었다가 서서히 상승시키는 방법으로 제조하여 단백질 응집체의 생성을 감소시킨 단백질 LB막과, 상기 단백질과 자기조립 가능한 유기물이 고정된 기판을 별도로 제조한 후, 상기 단백질 LB막과 상기 유기물이 고정된 기판을 마주보도록 위치시켜 단백질과 유기물의 화학결합을 유도함으로써, 단백질의 응집현상(aggregation)이 효율적으로 제어되어 단분자체 상태인 단백질이 유기물과 화학적으로 단단하게 결합할 수 있기 때문에 단위 면적 당 소자로서의 역할이 가능한 단백질 분자들의 고집적화를 구현한 단백질 LB막을 자기조립하여 제조된 단백질 칩의 제조방법에 관한 것이다.

단백질 칩, 자기조립, 단백질 LB 막, 응집현상

Description

ＬＢ막법과 자기조립법의 융합기법에 의한 단백질 칩의 제조방법{Fabrication of Protein Chip by Self-assembly Technique Combined with Langmuir-Blodgett Method}

도 1은 LB막 제조방법에 의해 물리적인 결합으로 고정되어 있는 단백질( 예: cytochrome c )이 골드 기판에 고정된 MUA와 화학결합을 함으로서 보다 강력한 결합인 MUA와의 결합 쪽으로 시토크롬 C가 이동함을 나타내는 개념도이다.

도 2는 순수한 골드기판(a)과 LB막 제조방법에 의해 시토크롬 C분자들이 고정된 골드기판(b)의 주사 터널 현미경(STM) 사진이다.

도 3은 MUA가 고정된 골드기판(a)과 MUA와 EDC가 함께 고정된 골드기판(b)의 X-선 광전자 분광 스펙트럼이다.

도 4는 시토크롬 C가 LB막으로부터 MUA와 화학결합을 통해 이동하였음을 나타내는 표면 플라즈몬 분석 스펙트럼이다.

도 5는 실시예에 따라 제조된 단백질 칩의 STM 사진(a)과 이의 일부를 확대하여 나타낸 사진(b)을 나타내는 그림이다.

도 6은 비교예에 따라 제조된 단백질 칩의 STM 사진이다.

본 발명은 LB막(Langmuir-Blodgett film)법과 자기조립법의 융합기법에 의하여 제조된 단백질 칩의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질을 용해시킨 인산완충용액에 기판을 담그었다가 서서히 상승시키는 방법으로 제조하여 단백질 응집체의 생성을 감소시킨 단백질 LB막과, 상기 단백질과 자기조립 가능한 유기물이 고정된 기판을 별도로 제조한 후, 상기 단백질 LB막과 상기 유기물이 고정된 기판을 마주보도록 위치시켜 단백질과 유기물의 화학결합을 유도함으로써, 단백질의 응집현상(aggregation)이 효율적으로 제어되어 단분자체 상태인 단백질이 유기물과 화학적으로 단단하게 결합할 수 있기 때문에 단위 면적 당 소자로서의 역할이 가능한 단백질 분자들의 고집적화를 구현한 단백질 LB막을 자기조립하여 제조된 단백질 칩의 제조방법에 관한 것이다.

1990년부터 게놈 프로젝트의 활발한 연구와 생체분자를 이용한 칩의 개발 역시 관심이 급증하고 있다. 그중 단백질 칩은 기존의 반도체 칩의 밀도에 비해 현저하게 높은 밀도의 고집적화를 이룰 수 있기 때문에 더욱 좁은 공간에 더욱 많은 정보를 저장하는 것을 가능케 함으로서 많은 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, 상기한 단백질 칩이 보다 높은 효율의 칩이 되기 위해서 극복해야 할 가장 큰 문제가 단백질의 응집현상(aggregation)이다.

기존의 대표적인 단백질 정렬 기술인 자기조립(self-assembly)기술은 화학적 인 결합을 통한 단백질과 칩을 구성하는 금속판(metal substrate)과의 결합력이 높은 반면에 단백질 자체의 수용액 상에서 발생하는 응집체(aggregate) 문제로 인해 수백 나노미터 단위 이하로 제작이 불가능하여, 이상적인 단백질 단일막(monolayer)을 제조하는데 한계가 있었다.

반면에 랭무어-블로짓 막(Langmuir-Blodgett film, LB막)의 제조방법은 상기한 자기조립법에 비해 단백질을 용액 표면에 고루 분포시킴으로써 단백질 자체가 수용액상에서 발생되는 응집현상을 줄일 수는 있지만, 단백질과 기판이 물리적으로 결합되어 있기 때문에 그 결합력이 자기조립방법에 비해 현저히 떨어진다.

또한, 상기 제시된 기술에 비하여 분자단위의 조절이 용이하게 하기 위하여 노광(Lithography)기술과 원자현미경(Atomic Force Microscopy)을 이용한 기술이 있으나, 상기한 노광의 경우 대부분 직경이 수 나노대인 단백질 단분자를 제어할 수 있는 정도로 좁은 폭의 패턴을 제작하는 것은 현재의 기술로는 불가능하며, 원자현미경을 이용한 단 분자체의 정렬 기술은 분자 하나 하나를 원자현미경의 탐침(probe)을 이용하여 정렬시켜야 되기 때문에 소요되는 시간이 너무 길어 실용화 할 수 없는 문제점을 가지고 있다. 또한, 현재 상용화되어 있는 대부분의 마이크로 배열장치(micro-arrayer; pin형, ink jet형)의 경우 실질적으로 100 ㎛ 이하로 제어하기 어려운 단점을 가지고 있다.

마찬가지로 단백질의 응집현상은 단백질을 용해한 용액의 pH의 변화를 통해 조절이 가능하지만 일정 범위 이상의 pH변화는 단백질의 3 차원 구조를 변형시킬 수 있기 때문에 pH에 의한 단백질의 밀도제어는 많은 문제점을 가지고 있다. 이러한 단백질의 변성되기 쉬운 특성은 단백질 칩이 DNA칩보다 개발이 늦은 주된 이유라 할 수 있다. 그러므로, 단백질 칩에 제작에 있어 기존의 노광(Lithography)법, 원자현미경(Atomic Force Microscopy)의 이용 및 pH 변경과 같은 방법이 아닌 보다 효율적인 방법으로 단백질을 분자 단위로 정렬시킬 수 있는 방법이 필요하다.

이에 본 발명자는 상기 제시된 기존의 단백질 칩이 가지고 있는 집적도의 문제점과 단백질의 변성되기 쉬운 특성으로 인한 단백질 칩 제작시의 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 단백질의 응집현상을 현저하게 줄일 수 있는 LB법으로 단백질 LB막을 제조하고, 상기 단백질과 자기조립 가능한 유기물이 부착된 기판을 별도로 제조한 후 상기 단백질 LB막과 유기물이 고정된 기판을 마주보도록 위치시켜서 상기 단백질과 유기물의 화학결합을 유도함으로써, 단백질의 응집체 형성을 효율적으로 제어하여 단백질을 단분자체 상태로 정렬시킬 수 있으면서 또한 기판과 단단하게 결합한 단백질 칩을 제조할 수 있게 한 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 단 분자체 상태로 정렬되어 단위 면적당 소자로서 결합가능한 단백질 분자체의 집적도가 높은 단백질 칩과 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 인산완충용액에 용해시킨 단백질 용액에 기판을 담근 후 서서히 상승시켜서 단백질 LB(Langmuir-Blodgett)막을 제조하는 단계와 상기 단백질과 자기조립할 수 있는 유기물이 함유된 용액에 기판을 담궈서 상기 유기물이 고정된 기판을 제조하는 단계, 상기 단백질 LB 막이 고정된 기판을 인산완충용액에 침지한 후 단백질 LB막이 고정된 기판 면과 상기 유기물이 고정된 기판 면을 마주보도록 위치시켜서 상기 단백질과 상기 유기물이 유기물의 화학결합을 유도하는 단계를 포함하는 단백질 칩의 제조방법을 특징으로 한다.

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이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 단백질을 용해시킨 인산완충용액에 기판을 담그었다가 서서히 상승시키는 방법으로 제조하여 단백질 응집체의 생성을 감소시킨 단백질 LB막과, 상기 단백질과 자기조립 가능한 유기물이 고정된 기판을 별도로 제조한 후, 상기 단백질 LB막과 상기 유기물이 고정된 기판을 마주보도록 위치시켜 단백질과 유기물의 화학결합을 유도함으로써, 단백질의 응집현상(aggregation)이 효율적으로 제어되어 단분자체 상태인 단백질이 유기물과 화학적으로 단단하게 결합할 수 있기 때문에 단위 면적 당 소자로서의 역할이 가능한 단백질 분자들의 고집적화를 구현한 단백질 LB막을 자기조립하여 제조된 단백질 칩의 제조방법에 관한 것이다.

단백질은 수백, 수천개의 아미노산이 펩타이드 결합(peptide linkage)에 의해 이루어진 물질이다. 이러한 단백질은 상기한 펩타이드 결합에 의해 형성된 폴리펩타이드 체인이 물리적 및 화학적인 인력 등에 의하여 접혀지면서 3차원 구조로 존재하게 된다. 이때 단백질을 구성하고 있는 아미노산의 특성에 따라 염기성, 산성, 중성의 단백질로 존재하게 되는데, 이러한 성질에 의해서 단백질의 응집현상이 나타나게 되는 것이다.

본 발명은 상기한 단백질을 구성하는 아미노산의 종류에 따라 이와 상응하여 자기결합할 수 있는 유기물이 있음에 착안하여 제안된 것으로서, 자기조립법에 의한 단백질 칩 제조시 문제점으로 지적되던 단백질의 응집체 형성을 제한하기 위하여 LB법을 적용하여 단백질의 응집현상을 최소화시킨 단백질 LB막을 제조하여 적용하였으며, 상기한 단백질과 자기조립할 수 있는 특성을 가지는 유기물을 선택사용하되 상기 유기물을 기판 위에 단단히 고정시킨 후 상기 단백질과의 화학 결합을 유도함으로써 기존의 단백질 칩의 두가지 커다란 문제점으로 지적되던 단백질의 응집체 형성과 LB법에 의한 막제조에 있어 기판과의 약한 결합력을 동시에 해결하고자 한 것이다.

이와 같은 본 발명에서 사용할 수 있는 단백질과 유기물은 특별히 제한되는 것이 아니라, 각각의 특성에 맞도록 자기결합 할 수 있는 단백질과 유기물의 쌍이면 충분하다. 즉, 단백질을 구성하는 아미노산의 종류에 따라 유기물을 선택적으로 사용하는데, 이러한 유기물로서 아민기와 화학결합하기 쉬운 카르복실기를 가지고 있는 것을 사용할 수 있으며, 기판에 화학적으로 고정될 수 있는 것이면 가능하다. 또한, 본 발명에서 단백질 LB막이나 유기물이 고정된 기판을 제조할 경우에 사용하는 기판은 해당분야에서 사용하는 기판을 별도의 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 예를 들면, 골드기판, 실리콘기판, ITO기판, 은기판 및 구리기판 등을 사용할 수 있다.

이러한 본 발명을 단백질로서 104개의 아미노산을 가지고 있으며 분자량은 11,685 달톤인 시토크롬 C(Cytochrome c)과, 상기한 시토크롬 C와 자기조립 가능한 유기물로서 11-머캅도운데칸산(11-Mercaptoundecanoic acid ; MUA)을 사용하여 단백질 칩을 제조하는 방법을 예로 들어 구체적으로 설명하고자 하는데, 이는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 일례이며 이로써 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

즉, 단백질로서 상기한 시토크롬 C를 구성하는 아미노산 중 라이신(Lysine)의 아민기가 카르복실기와 쉽게 결합하는 성질을 이용한 것으로서, 이는 일반적으로 단백질 분자를 고정화시킬 때 많이 이용되는 방법이다. 본 발명에서는 위 원리를 이용하여 LB막에 존재하는 단백질의 라이신을 또 다른 골드 기판에 고정화 되어있는 MUA의 카르복실기와 화학적으로 결합시킴으로서 LB막에 존재하는 단백질들을 단분자체 상태로 유기물이 고정된 기판으로 이동시키는 것을 그 기술구성상의 특징으로 하는 것이다.

먼저, 단백질 시토크롬 C의 LB막을 제조하는 과정이다. 시토크롬 C를 인산완충 용액(phosphate buffer solution, PBS)에 용해시킨 후 상기한 시토크롬 C 용액이 침전되지 않고 공기와 물의 계면에 일정하게 분포시키기 위해서 시토크롬 C 용액을 이차증류수와 에탄올로 희석하여, 이 희석된 용액을 장치의 물에 혼합한 후 골드 기판을 담갔다가 서서히 상승시킴으로서 시토크롬 C의 LB막을 형성한다. 이때, 시토크롬 C의 LB막 형성 여부는 주사 터널 현미경(STM)을 통해서 확인할 수 있다(도 2 참고).

다음으로, 유기물이 고정된 기판을 제조하는 과정이다. 단백질을 구성하는 아미노산의 하나인 라이신은 말단에 아민기를 가지고 있어 MUA의 카르복실 그룹과 화학적인 결합을 한다. 이러한 성질을 이용하여 유기물로서 MUA를 기판에 고정시켜서 사용한다. 상기한 MUA가 고정화되어 있는 골드기판에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC]를 사용하여 처리함으로서 상기 MUA의 카르복실 그룹이 보다 쉽게 단백질인 시토크롬 C와 반응할 수 있도록 활성화 시켜주는 작용을 한다.

마지막으로 기판에 고정된 단백질을 다른 기판에 고정된 유기물과 자기조립시키는 과정이다. 본 과정은 첨부도면 도 1에서 볼 수 있듯이 각각의 골드기판을 마주보게 함으로서 물리적인 결합으로 고정화되어 있는 상태인 LB막의 시토크롬 C가 MUA와 반응하여 화학결합에 의한 시토크롬 C 자기조립막을 형성하게 하는 과정이다.

시토크롬 C는 19개의 라이신을 갖고 있는데 이중 16개의 라이신이 표면에 분포되어 있어 보다 쉽게 MUA와 결합하게 되는데, 상기한 라이신의 아민그룹과 MUA의 카르복실 그룹이 화학결합을 함으로서 LB막을 형성할 때의 물리적인 결합보다 강한 화학결합에 의해 자기조립막을 형성하게 되는 것이다. 이때 LB막을 형성하고 있는 단백질들은 대부분 단 분자체 또는 적은 수의 단백질로 이루어진 응집체로 존재하게 되며, 자기조립을 통해 반대편의 기판으로 이동시에 응집체를 형성하고 있 던 단백질 중에서 MUA와 자기조립을 형성한 단백질만이 이동하게 됨으로서 단 분자체로 존재하는 단백질 칩을 구현할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 : LB 막과 자기조립법에 의한 단백질 칩의 제조

본 발명의 실시예에서는 단백질로서 104개의 아미노산을 가지고 있으며 분자량은 11,685 달톤인 시토크롬 C를 사용하였으며, 상기한 시토크롬 C와 자기조립 가능한 유기물로서 11-머캅도운데칸산(MUA)을 사용하였다.

1) 단백질의 LB막을 제조하는 과정

시토크롬 C를 인산완충 용액(phosphate buffer solution, PBS)에 1 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 상기한 시토크롬 C 용액을 이차증류수와 에탄올로 희석하였으며, 이 희석된 용액을 장치의 물에 혼합한 후 골드 기판을 담갔다가 10 mm/mim비율로 서서히 상승시키는 방법으로 시토크롬 C의 LB막을 제조하였다. 이때 시토크롬 C의 LB막 형성 여부는 첨부도면 도 2에서와 같이 주사 터널 현미경(STM)을 통해서 확인하였다.

첨부도면 도 2에서 사진(a)는 순수한 골드기판이며, 표면에 현저한 차이를 보이고 있는 사진(b)는 골드기판 위에 형성된 단백질의 LB막이다. 사진(b)의 작은 덩어리들은 단백질이 골드표면에 물리적으로 흡착되어 있는 상태로서 실제 단백질 단 분자에 비해 2 내지 3배 정도의 크기인데, 이는 단백질을 이루고 있는 아미노산의 정전기적인 성질로 인해서 응집체를 형성하고 있음을 알 수 있다.

2) 유기물을 기판에 고정화시키는 과정

유기물로서 MUA와 EDC를 사용하였다. 새로운 골드 기판을 5 mM MUA를 용해시킨 99.9 % 에탄올에 넣고 2시간 반응 시켜서 MUA로 표면이 개질된 골드기판을, EDC를 10 %(W/V)비율로 용해시킨 10 mM PBS(PH7.4)에서 2 시간 동안 반응시켜서 유기물이 고정된 기판을 제조하였다.

상기한 MUA로 표면 개질된 골드 기판의 MUA와 그 위에 EDC로 개질된 기판의 EDC의 존재는 X-선 광전자 분광기(X-ray Photoelectron Spectrometer)로 확인하였다.

첨부도면 도 3의 사진(a)는 순수한 골드기판에 존재하지 않는 황(S)이 MUA와 EDC를 처리한 골드기판에서 존재함은 MUA가 골드기판에 고정화되어 있음을 보여주는 것이다. 또한 도 3의 사진(b)는 MUA를 흡착하였을 때 보이지 않던 질소(N)가 EDC를 고정화시킨 후 검출되었는데, 이는 EDC의 구성원소인 질소(N)이며 EDC가 MUA가 흡착되어 있는 골드 기판 위에 잘 고정화되어 있음을 확인시켜 주는 결과이다.

3) 단백질을 다른 기판에 고정된 유기물과 자기조립시키는 과정

PBS 용액에 시토크롬 C의 LB막을 형성하고 있는 골드 기판을 넣은 뒤 MUA와 EDC가 고정화된 골드기판으로 덮어준 후 10시간 동안 반응시켰다. 상기 반응의 결과는 표면 플라즈몬 분석기(SPR)와 STM으로 확인하였으며 상기한 확인 결과는 첨부도면 도 4와 도 5에 각각 나타내었다.

비교예 : 기존의 방법에 의한 단백질 칩의 제조

단백질을 용해시킨 용액에 단백질과 자기조립할 수 있는 유기물로 처리된 기판을 담그는 기존의 자기조립 법에 의하여 단백질 칩을 제조하였다. 즉, PBS 용액에 시토크롬 C를 20 μM 농도로 용해시킨 후 MUA와 EDC가 결합되어 있는 골드기판과 10시간 반응시켜 단백질 칩을 제조한 후 이로써 형성된 단백질 층의 STM 사진을 첨부도면 도 6에 나타내었다. 도 6에서 단백질 응집체의 크기는 100 ∼ 200 nm임을 알 수 있다.

이하 실험 예에 의하여 본 발명에 사용한 결합 물질을 실제 단백질 칩 제조 과정에 적용시켜서 단분자체로 구성된 단백질 칩 제작의 가능성을 자세히 살펴보면 다음과 같다.

실험예 1 : LB막의 단백질이 자기조립을 통한 이동 여부 확인

상기 실시에에 의하여 제조된 LB막의 단백질이 자기조립에 의하여 유기물과 결합함의 여부를 SPR과 STM을 사용하여 확인하였으며 그 결과는 첨부도면 도 4와 도 5에 각각 나타내었다.

도면 4에서 점선은 MUA와 EDC로 표면 개질한 골드기판이며 실선은 단백질이 LB막으로부터 이동되어 자기조립된 상태를 나타낸 것이다. 각각의 곡선은 표면의 상태를 나타내는 것으로 질량의 변화를 감지하여 차이가 생길 때마다 곡선이 우측으로 움직인다. 실제로 제시한 도면을 보면 단백질의 자기조립 형성 후 우측으로 이동했음을 보여준다. 이는 LB막에 존재하던 단백질이 MUA와의 자기조립을 통해서 MUA로 표면개질되어 있는 골드기판쪽으로 이동하였음을 확인시켜 주는 것이다. 따라서 상기한 실험을 통하여 도 4와 같은 SPR 결과를 얻어냄으로서 단백질 칩의 구현가능성을 확인할 수 있다.

실험예 2 : 단 분자 단백질 칩의 구현 여부 확인

STM을 이용하여 단 분자 단백질 칩의 구현 여부를 확인하여 첨부도면 도 5에 나타내었다. 상기 실시예에서 PBS 용액에 시토크롬 C의 LB막을 형성하고 있는 골드기판을 넣은 후 MUA와 EDC가 고정화된 골드기판과 10시간 동안 반응시킨 것 중 자기 조립이 형성된 골드기판을 STM으로 측정하였을 때 5 내지 6 nm정도의 분자들이 골드 표면 위에 존재함을 확인 할 수 있는데 이를 통해 단 분자 단백질 칩이 구현되었음을 알 수 있다.

도 5의 사진(a)는 LB막을 구성하는 단백질이 이동하여 자기조립된 단백질의 STM 사진을 나타낸 것이고, 사진(b)는 고정된 단백질 분자의 크기를 나타낸 것인데, 크기가 5 내지 6 nm로 단백질 단 분자의 크기가 거의 일치하므로, 대부분 단 분자체로 존재하는 단백질 칩의 구현가능성을 확인 할 수 있다.

실험예 3 : 기존의 자기조립을 이용한 단백질 칩과의 비교를 통한 단분자 단백질 칩 구현 평가

상기 비교예에 의하여 제조된 단백질 칩을 STM을 통해 측정하여 나타낸 도 6을 보면, 100 ∼ 200 nm 크기의 시토크롬 C의 응집체가 존재함을 확인 할 수 있다. 대부분의 단백질의 경우, 전형적인 방법의 자기조립을 통한 단백질 칩 구현 시 이와 같은 크기의 단백질 응집체가 존재하게 된다.

그러나, 도 5에서와 같이 본 실험을 통하여 형성된 단백질 칩의 경우 대부분의 단백질들이 단분자로 존재함으로서, 기존 단백질 칩보다 단위 면적 당 소자 또는 센서로서의 역할이 가능한 단백질 분자들의 고집적화를 구현할 수 있음을 보여주고 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 단백질의 응집체 형성을 효율적으로 제어하여 단분자체 상태로 존재할 수 있도록 함으로써, 단위 면적 당 소자 또는 센서로서의 역할이 가능한 단백질 분자들의 고집적화가 구현된 단백질 칩을 제조할 수 있으며, 또한 본 발명의 방법을 통한 응용의 다양성을 동시에 얻을 수 있다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 인산완충용액에 용해시킨 단백질 용액에 기판을 담근 후 서서히 상승시켜서 단백질 LB(Langmuir-Blodgett)막이 고정된 기판을 제조하는 단계와,

   상기 단백질과 자기조립할 수 있는 유기물이 함유된 용액에 기판을 담궈서 상기 유기물이 고정된 기판을 제조하는 단계, 및

   상기 단백질 LB 막이 고정된 기판을 인산완충용액에 침지한 후 단백질 LB막이 고정된 기판 면과, 상기 유기물이 고정된 기판 면을 마주보도록 위치시켜서 상 기 단백질과 상기 유기물이 유기물의 화학결합을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩의 제조방법.

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