KR100540043B1 - 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 첫번째 생물학적 종에서 유래한 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 발현 카세트, 및 E2 결합 부위를 포함하는 파필로마바이러스(papillomavirus) 벡터 DNA; 및, (b) 첫번째 생물학적 종과 서로 다른 두번째 생물학적 종에서 유래한 L1 구조단백질과 L2 구조단백질을 포함하며 전기 벡터 DNA를 캡시드화하는 캡시드를 포함하는, 유전자 전이에 유용한 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자를 제공한다.

Description

감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자{Infectious Papillomavirus Pseudoviral Particles}

본 발명은 유전자 전이에 유용한 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자에 관한 것이다.

유전자 전이(gene transfer)란 진핵세포의 유전형질을 변형시키는 실험실적 기법이다. 특히, 유전자 전이는 발현 카세트에 넣어진 한가지 혹은 그 이상의 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열들을 목적하는 세포들에게 전이되도록 하는 과정을 포함하며, 전기 발현 카세트가 적절히 작동할 수 있는 세포에 전이됨으로써 유전자 전이의 과정이 완료된다.

진핵세포 내에서 외부단백질을 발현하도록 하는 전이방법에 대한 연구와 노력이 계속되어 왔으며, 현재 개발된 전이방법은 크게 트랜스펙션(transfection)과 감염(infection)의 두 가지로 나뉠 수 있다.

클로닝된 DNA를 진핵세포로 도입하기 위한 첫번째의 전이방법은 트랜스펙션을 이용하는 것인데, 인산칼슘이나 DEAE-덱스트란에 의하여 매개되는 트랜스펙션법 이 가장 많이 사용되고 있다. 전기 방법에서 양이온화된 폴리브렌(polybrene)은 기존의 방법으로는 전이가 어려웠던 배양세포 안으로 효율적이고도 안정하게 외부 플라스미드 DNA를 도입할 수 있도록 도와준다(참조: Kawai, S., and Nishizawa, M., 1984, Mol. Cell. Biol. 4, 1172; Chaney, W.G., et al., 1986, Somatic Cell Mol. Genet. 12, 237). 원형질 융합(protoplast fusion) 방법에서는 원하는 플라스미드를 다량 함유하는 박테리아로부터 얻은 원형질을 배양된 동물세포와 직접 혼합하여 주는데, 이 때 폴리에틸렌 글리콜에 의해 융합이 일어나 플라스미드가 동물 세포 안으로 전이되는 결과를 얻을 수 있다(참조: Schaffner, W., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163; Rassoulzadegan, M., et al. 1982, Nature 295, 257). 한편, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법은 전기적인 펄스를 주어 동물세포나 식물세포의 세포질로 직접 DNA를 전이하는 방법이다(참조: Neumann, E., et al., 1982, EMBO J. 1, 841; Zimmermann, U., 1982, Biochem. Biophys. Acta 694, 227). 리포좀이나 양이온화된 지질 등과 같은 인공 멤브레인(membrane)은 실험실적 조건(in vitro)이나 생체 내 조건(in vivo)에서의 유전자 전이에 유용하게 사용될 수 있으며(참조: Mannino, R.J., and Gould-Fogerite, S., 1988, BioTechniques 6, 682; Felgner, P.L., and Holm, M., 1989, Bethesda Res. Lab. Focus 11, 21; Maurer, R.A., 1989, Bethesda Res. Lab. Focus 11, 25), 핵 속으로 유전자를 직접 주입하는 마이크로인젝션(microinjection) 방법은 유용하지만 많은 양의 DNA를 전이시키지 못하는 단점을 가진다(참조: Capecchi, M.S., et al., 1980, Cell 22, 479). 마지막으로 나형의(naked) DNA도 근육에 주입될 때에는 입 자 충격(partcle bombardment)의 힘으로 전이되든지(참조: Yang, N.S., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568), 세포에 의해 저절로 받아들여지는 경우가 있다(참조: Wolff, J.A., et al., 1990, Science 247, 1465).

다른 방법의 전이법으로는 감염을 이용하는 것으로, 바이러스성 발현벡터를 사용하게 되는데, 이때 사용되는 바이러스로는 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40)(참조: Elder, J.T., et al., 1981, Annu. Rev. Genet. 15, 295; Gethimg, M.J., and Sambrook, J., 1981, Nature 293, 620; Rigby, P.W.J., 1982, Genetic Engineering, R. Williamson, ed., Academic Press, London, vol. 3, p. 83; Rigby, P.W.J., 1983, J. Gen. Virol. 64, 255; Doyle, C., et al., 1985, J. Cell. Biol. 100, 704; Sambrook, J., et al., 1986, Mol. Biol. Med. 3, 459), 백시니아 바이러스(vaccinia virus)(참조: Mackett, M., et al., 1985, DNA cloning: A practical approach, D.M. Glover, ed., IRL Press, Oxford, vol. 2, p. 191; Moss, B., 1985, Virology, B.N. Fields, et al., eds., Raven Press, New York, p. 685; Fuerst, T.R., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8122; Fuerst, T.R.,et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2538), 아데노바이러스(adenovirus)(참조: Solnick, D., 1981, Cell 24, 135; Thummel, C., et al., 1981, Cell 23, 825; Thummel, C., et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1, 435; Thummel, c., et al., 1983, Cell 33, 455; Mansour, S.L., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1359; Karlsson, S., et al., 1986, EMBO J. 5, 2377; Berkner, K.L., 1988, BioTechniques 6, 616), 레트로바이러스(retrovirus)(참조: Dick, J.E., et al., 1986, Trends Genet. 2, 165; Gilboa, E., et al., 1986, BioTechniques 4, 504; Eglitis, M.A., and Anderson, W.F., 1988, BioTechniques 6, 608), 그리고 배큘로바이러스 (baculovirus)(참조: Luckow, V.A., and Summers, M.D., 1988, Bio/Technology 6, 47) 등이 있다.

진핵세포 안에서 클로닝된 유전자의 단백질을 발현시키는 기술은, 클로닝된 유전자와 전기 유전자가 코드하는 단백질과의 동일성을 면역학적 검정법으로 확인하기 위한 목적; 당쇄화나 단백질 프로세싱 등처럼 해독후 변형 (posttranslational modification)이 필요한 단백질의 유전자를 발현시키기 위한 목적; 자연상태에서 제한된 양만을 얻을 수 있는 생물학적으로 유용한 단백질을 대량으로 생산하기 위한 목적; 각기 다른 세포 종류에서의 발현 및 단백질의 생합성과 새포내 이동에 대한 연구를 위한 목적; 정상 단백질과 돌연변이 단백질을 발현시켜 이들 사이의 구조-기능 관계를 밝혀내기 위한 목적; 원핵세포에서 mRNA로 적절하게 전사되지 않는 인트론을 포함한 유전자 서열을 발현시키기 위한 목적; 및, 유전자 발현에 관여하는 DNA 서열을 밝혀내기 위한 목적 등과 같은 여러가지 목적으로 이용되어 왔다. 이와 같이 단백질의 발현이 다양한 목적으로 수행되고 있는 바, 진핵세포 안으로 외부 유전자를 효과적으로 전이하는 새로운 전이방법을 개발하여야 할 필요성이 있어왔으며, 본 발명은 이러한 요구를 만족시킨다.

본 발명의 전술한 목적 및 다른 목적들은 명세서 전체를 고려할 때 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

발명의 요약

우선, 본 발명은 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus)의 위바이러스성 입자(pseudoviral particle)를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 HPV16{BPV1} 비리온을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 E2 결합부위 및 외래 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 발현카세트를 포함하는 파필로마바이러스 벡터 DNA; 및, 전기 벡터 DNA를 캡시드화하는, L1과 L2 구조단백질로 이루어진 파필로마바이러스 캡시드(capsid)를 포함하는 감염성 파필로마바이러스의 위바이러스성 입자를 제공한다. 여기에서 전기 외래 유전자와 L1 구조단백질은 각각 서로 다른 생물종으로부터 유래된 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기술한 감염성 파필로마바이러스의 위바이러스성 입자를 제공하는데, 이때 외래 유전자가 유래되는 첫번째 생물종은 BPV1이며, L1 구조단백질이 유래되는 두번째 생물종은 HPV16 이다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명은 첫번째 생물학적 종에서 유래한 파필로마바이러스(papillomavirus) E2 DNA 결합 단백질, 전기 첫번째 생물학적 종과 서로 다른 두번째 생물학적 종에서 유래한 L1 구조단백질, 및 L2 구조단백질들을 발현하는 세포주를 제조하는 단계; 전기 세포주를 첫번째 생물학적 종에서 유래한 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 발현 카세트 및 전기 E2 DNA 결합 단백질의 동종(cognate) 결합 부위인 E2 결합 부위를 포함하는 파필로마 바이러스(papillomavirus) 벡터 DNA로 형질전환 시키는 단계; 전기 L1 및 L2 구조단백질들을 포함하는 캡시드에 의해 전기 벡터 DNA를 캡시드화하여 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 제조하기 위한 조건을 제공하는 단계; 및, 전기 입자들을 회수하는 단계를 포함하는, 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서, 세포주는 동물세포주, 곤충세포주, 또는 효모세포주를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 여기에 기술한 감염성 파필로마바이러스의 위바이러스성 입자를 포함하는 세포주를 제공한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 여기에 기술한 감염성 파필로마바이러스위바이러스성 입자를 제조하는 단계; 및, 배양된 동물세포를 외래 유전자로 형질전환시키기 위하여 전기 입자들을 배양된 동물세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 배양된 세포내로 유전자를 전이하는 방법을 제공한다.

또 다른 변형으로서, 본 발명은 바이러스성 입자로 감염될 수 있는 배양된 동물세포에 시험 입자(test particle)를 투여하고, 감염 정도를 계산하는 단계를 포함하는 감염성 파필로마바이러스의 위바이러스성 입자를 선별하는 방법을 제공한다.

또 다른 변형으로서, 본 발명은 여기에 기술한 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 때, 전기 감염성 파필로마바이러스의 위바이러스성 입자에 포함된 발현 카세트 내의 유전자는, 필요에 따라 숙주 대상에 유효량 만큼 투여될 때 치료효과를 가지는 산물을 코드한다.

또 다른 변형으로서, 본 발명은 여기에 기술한 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 때, 전기 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자에 포함된 발현 카세트 내의 유전자는, 필요에 따라 숙주 대상에 유효량 만큼 투여될 때 면역효과를 가지는 산물을 코드한다.

본 발명은 또한 면역 단백질을 코드하는 유전자가 들어있는 발현 카세트가 포함된 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자로 생체 내 조건에서 인간의 세포를 감염시켜, 전기 세포가 유효량의 면역 단백질을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 인간에게 면역 단백질을 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료 단백질을 코드하는 유전자가 들어있는 발현 카세트가 포함된 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자로 생체 내 조건에서 인간의 세포를 감염시켜, 전기 세포가 유효량의 치료 단백질을 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 인간에게 치료 단백질을 제공하는 방법을 제공한다.

전기 치료 단백질을 제공하는 방법에서, 세포는 상피세포일 수 있으며, 치료 단백질은 전신성의 효과를 나타내거나 또는 상피세포에 대해서만 국부적인 효과만 보일 수도 있다. 한편, 치료 단백질은 Factor IX일 수 있으며, 이 치료 단백질의 발현은 혈우병 치료에 효과적일 수 있다. 또한, 치료 단백질은 헤르페즈 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)의 티미딘 인산화효소일 수 있으며, 이 치료 단백질의 발현은 피부암의 치료에 효과적일 수 있다.

전기 치료 단백질을 제공하는 방법은 각기 다른 혈청형의 단계적인 투여를 포함하며, 첫번째 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자와는 다른 혈청형을 가지는 두번째 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자로 생체 내 조건에서 인간의 세포를 감염시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 파필로마바이러스 게놈 및 파필로마바이러스 캡시드를 포함하는 감염성 파필로마바이러스(papillomavirus) 위바이러스성 입자를 제공한다. 전기 파필로마바이러스 게놈은 첫번째 파필로마바이러스 혈청형에서 유래한 E2 결합 부위, 및 외래 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하며; 전기 파필로마바이러스 캡시드는 L1 및 L2 구조단백질을 포함하는데, 이때 전기 L1 단백질은 전기 첫번째 파필로마바이러스 혈청형과는 다른 혈청형을 가지는 두번째 파필로마바이러스로부터 유래된 것이다.

더 나아가, 본 발명은 비동물세포에서 감염성 위바이러스성 비리온을 제조하는 방법을 제공한다. 전기 방법은 첫번째 생물학적 종과 서로 다른 두번째 생물학적 종에서 유래한 바이러스의 빈 캡시드 내로 바이러스 게놈을 포장하기 위한 바이러스의 비구조단백질(들) 및 전기 바이러스 캡시드의 구조단백질을 발현하는 비동물 세포주를 제조하는 단계; 전기 포장을 위한 신호, 및 전기 첫번째 생물학적 종에서 유래한 유전자와 전기 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 게놈으로 전기 비동물 세포주를 형질전환시키는 단계; 전기 바이러스 캡시드에 의해 전기 바이러스 게놈을 캡시드화하여 비리온을 제조하기 위한 조건을 제공하는 단계; 및, 전기 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.

도 1은 L2에 의하여 매개되는 파필로마바이러스 비리온의 조립(assembly) 모델을 보여주는 모식도이다. 전기 모델에 대해서는 본문에서 상세히 설명된다. 약술하여, L2는 POD 내에 비리온 구성인자들을 모이게 함으로써 파필로마바이러스의 조립을 매개하리라고 예상된다. L2는 POD 내에서 다른 바이러스 단백질들과는 독립적으로 존재하게 된다. 이러한 L2의 국부화(locallization)는 게놈과 결합된 E2, 그리고 L1의 연속적인 보충(recruitment)을 야기시키며, 이러한 현상들은 각기 독립적으로 발생한다. 이와 같은 L2-L1-E2-게놈의 POD 내에서의 결합(association)은 비리온 조립에 필요한 환경 및/또는 농도조건을 제공한다.

바람직한 실시태양의 상세한 설명

본 발명은 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자들을 제공함으로써 클로닝된 DNA의 진핵세포 내로의 새로운 전이 시스템을 개발하고자 하는 요구에 부응한다. 섹션 I에서는 동물세포에서 감염성 BPV 비리온과 HPV16{BPV1} 위바이러스성 입자들을 실험실적 조건(in vitro)에서 생성하는 방법을 기술한다. 섹션 II에서는 캡시드화에 필요한 파필로마바이러스 캡시드 단백질, 바이러스의 전사/복제 단백질, E2, 및 POD 핵 구조물들에 대하여 상세히 기술한다. 섹션 III에는 비동물세포에서 감염성 BPV 비리온을 실험실적 조건에서 생성하는 방법이 기술되어 있다. 그리고, 섹션 IV에는 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자들을 이용하는 특정 한 유전자 전이방법들 즉, 유전자 치료(gene therapy)와 유전자 면역(gene immunization)에 대하여 상세히 설명하기로 한다.

I. 실험실적 조건에서 제 16형 인간 파필로마바이러스 비리온 위형의 제조

실시예 1에 개시된 방법을 이용하여, 파필로마바이러스의 조립 및 감염성을 분석할 수 있는 실험실적 조건에서의 감염성 파필로마바이러스 제조방법을 개발하였다. 자가복제하는 제 1형 소 파필로마바이러스(bovine papillomavirus type 1, BPV1)의 게놈을 포함하고 있는 배양된 햄스터 BPHE-1 세포를 BPV1의 구조단백질들을 발현하는 불완전한 셈리키삼림바이러스(semliki forest virus, SFV)로 감염시켰다. C127 세포에 도말하였을 때, L1 및 L2를 동시에 발현하는 세포의 추출물이 BPV 중화 항체에 의해 특이적으로 저해받는 다수의 형질전환된 병소(transformed foci)들을 야기시킴으로써, 병소의 생성에 BPV 감염이 직접적으로 관계됨을 보여주었다. 반면, L1 또는 L2를 발현하는 BPHE-1의 추출물은 감염성을 나타내지 않았다. 비록 SFV에서 발현된 L1이 스스로 조립되어 바이러스와 유사한 입자들을 만들었지만, L2가 L1과 같이 발현될 때에만 입자 내에서 바이러스의 DNA가 측정됨으로써, 게놈의 캡시드화에는 L2가 필수적으로 요구됨을 제시하였다. 제 16형 인간 파필로마바이러스(HPV16)의 L1과 L2 역시 BPHE-1 세포에서 감염성 바이러스를 생성시켰다. 이러한 위형(pseudotype) 비리온들은 유럽형(114/K)이나 아프리카형(Z-1194) HPV16 변종에서 유래한 HPV16 유사바이러스 입자(virus-like particles, VLPs)에 대한 항혈청으로 중화되었으나, BPV VLP, 제대로 조립되지 않은 돌연변이 HPV16 L1 단백질, 또는 비슷한 종류인 생식기 HPV의 VLP에 대한 항혈청으로는 중화되지 않았다.

동물세포에서 재조합 SFV로부터 발현된 BPV L1이 L2에 결합하여 VLP로 조립됨: SFV는 단순한 (+)가닥의 RNA 바이러스이다. pSFV-1 발현벡터는 SFV RNA 리플리카아제(replicase), 삽입된 유전자, 그리고 시스(cis)로 작용하는 비리온 조립 신호들을 위한 유전자를 포함한다. 전기 벡터로부터 실험실적 조건으로 합성된 RNA는 SFV 구조 유전자를 코드하는 보조벡터 pHelper-2 RNA와 함께 공동으로 트랜스펙션된다. 트랜스펙션시에 리플리카아제가 해독되면 연속적인 RNA 복제와 해독을 수행하게 되어 바이러스 RNA를 증폭시킨다. 보조 RNA의 해독은 보조벡터를 제외하고 SFV 비리온 단백질들의 생성과 발현벡터 RNA의 캡시드화만을 촉진하여, 결국 포장(packaging) 신호의 결핍이 초래된다. 따라서, 고역가의 바이러스가 만들어졌어도 SFV 비리온 단백질들을 만들어내지 않기 때문에 불완전하게 된다. BHK-21이나 BPHE-1과 같은 감염되기 쉬운 세포에 감염되면 전기 리플리카아제는 다시 감염성의 RNA를 증폭시킨다. 클로닝된 유전자를 코드하는 서브게놈 RNA들의 증폭은 코드된 단백질의 고농도 발현으로 이어진다.

불완전한 BPV1 L1과 BPV1 L2 재조합 셈리키삼림바이러스(SFV-BL1과 SFV-BL2)는 BHK-21 세포에 실험실적 조건에서 전사된 보조-2 RNA(Life Technologies)(참조: Berglund, p., et al., 1993, BioTechnology 11, 916-920)와 BPV1 L1이나 BPV1 L2 유전자를 코드하는 재조합 pSFV-1 RNA를 동시에 트랜스펙션시켜 제조하였다. BHK-21 세포는 재조합 SFV들로 감염시키고 72시간 경과 후 수득하였다. BPV1 L1 및 L2의 발현은 1H8 단일클론 항체(Chemicon)(참조: Cowsert, L.M., et al., 1988, Virology 165, 613-15)를 이용해 웨스턴 블랏으로 L1을, 박테리아에서 제조한 글루타치온-S-트랜스퍼라제-BPV1 L2 융합단백질에 대한 토끼 항혈청을 이용해 웨스턴 블랏으로 L2(참조: Kirnbauer, R., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12180-84)를 각각 확인하였다. 세포 분획(cell fractionation) 실험결과, 최소한 80%의 L1 및 L2가 수득 당시 핵 분획에 존재하고 있음을 보여주었다.

BHK-21 세포를 3일 동안 SFV-BL1 단독이나 SFV-BL2 단독, 혹은 두 불완전한 바이러스로 공동 감염(co-infection)시켰다. 세포를 모은 후, 40%(w/v) 수크로오즈 쿠션 및 세슘 클로라이드 이소피크닉 밀도구배 원심분리법으로 VLP들을 회수하였다(참조: Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36). SFV-BL1 단독 또는 SFV-BL1과 SFV-BL2로 공동감염된 세포 추출물을 각각 세슘 클로라이드 밀도구배 원심분리한 결과, 약 1.28 g/cm³의 밀도구배에서 밴드가 나타나, 이를 추출하여 0.5M 염화나트륨이 포함된 PBS에 대하여 투석하였다. SFV-BL2로만 감염시킨 세포 추출물의 밀도구배에서는 상응하는 밴드가 나타나지 않았다. L2 단독의 시료와는 달리 BPV1 L1 단독, 그리고 L1과 L2 공동 시료에서는 55nm 직경의 BPV 비리온과 모양이 비슷한 입자들이 전파 전자현미경으로 관찰되었다. L1 단독, 그리고 L1과 L2 공동 시료를 10% SDS-PAGE 젤로 전기영동하고 쿠마시 블루로 염색한 결과, L1에 해 당하는 55kDa의 단일 단백질이 나타났다. 박테리아에서 제조한 글루타치온-S-트랜스퍼라제-BPV1 L2 융합단백질에 대한 토끼 항혈청을 이용하여 웨스턴 블랏으로 L1과 L2 공동 시료에서 전체 길이(약 70kDa)의 L2를 탐지하였으나, L1 단독 시료에서는 탐지되지 않았다. 상술한 L1과 L2의 공동 면역침강법(co-immunoprecipitation)과 공동 정제 실험결과, L2가 L1과 함께 VLP 내로 조립되는 것으로 확인되었다.

BPHE-1 세포에서 BPV1 L1 및 L2의 공동발현에 의해 감염성 BPV1 비리온이 제조됨: 동물세포에서 재조합 SFV들의 발현에 의해 효과적인 VLP들의 조립이 이루어지므로, 실험실적 조건에서의 감염성 BPV의 제조와 비리온 형성을 위해 필요한 캡시드 단백질들의 규명을 수행하였다. 이를 위해, 세포당 50-200 개의 에피소말(episomal) BPV1 게놈을 유지하는 햄스터 세포주 BPHE-1을 재조합 SFV로 감염시켰다(참조: Zhang, Y.L., et al., 1987, J. Virol. 61, 2924-2928). BPHE-1 세포는 SFV-BL1 단독이나 SFV-BL2 단독, 또는 전기 두 재조합 바이러스를 공동으로 감염시켰다. 감염된 세포를 30시간 동안 유지시키고, 수득하여 소니케이션으로 분해시킨 다음, 추출물을 쥐 C127 섬유아세포가 단일층으로 도말되어 있는 배지에서 37℃의 온도조건으로 1시간동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 씻어주고 3주동안 완전 배지로 배양한 후, 염색하여 병소의 수를 세었다(참조: Dvoretzsky, I., et al., 1980, Virology 103, 369-375). 수차례의 실험 결과, 약 50개의 병소가 BPV L1 및 L2를 공동 발현하는 BPHE-1의 추출물을 처리한 C127 세포 플레이트에서 나타났으며, BPV L1이나 BPV L2 단독 발현 세포의 추출물은 병소를 야기하지 않았다.

병소의 형성 원인이 C127 세포로 BPV1 DNA가 전이된 결과인지를 규명하기 위하여, 병소들 중 여섯개를 따로 클로닝하여 연구하였다(참조: Law, M.F., et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2727-2731). 전기 여섯개의 클론으로부터 제조된 허트(Hirt) 추출물(참조: Hirt, B., 1967, J. Mol. Biol. 26, 365-369)을 0.8% 아가로오즈 젤로 전기영동하고, [³²P]로 표지된 BPV 게놈의 절편을 프로브로 이용하여 서던 블랏을 수행하였다. 그 결과, 여섯개의 클론 모두에서 높은 카피 수의 에피소말 BPV 게놈 DNA가 탐지되었다.

한편, 실험실적 조건에서 제조된 비리온에 의해 감염된 것이 아니라, BPV DNA가 C127 세포들에게 트랜스펙션 방법에 의해 전이되었을 가능성도 있다. 중화항체가 트랜스펙션을 저해하지 않아야 하므로, L1 및 L2를 공동 발현하는 BPHE-1 세포의 추출물을 C127 세포에 처리하기 전, 1시간 동안 4℃에서 1:100으로 희석(10㎕)된 BPV1, HPV16 L1 VLP(곤충세포에서 정제한 것), 또는 불활성화된 BPV 비리온(DAKO)에 대한 토끼 항혈청으로 처리해 주었다. BPV VLP에 대한 항혈청을 처리한 L1 및 L2 혼합 시료는 병소를 발생시키지 않았으나, HPV16 L1 VLP에 대한 항혈청이나 불활성화된 BPV 비리온에 대한 항혈청(BPV를 중화시키지 않는)이 처리된 추출물에서는 처리하지 않은 추출물과 비슷한 정도로 병소를 생성하였다. 전기와 동일한 추출물을 BPV를 중화시키는 5B6 단일클론 항체(Roden, R.B.S., et al., 1994, J. Virol. 68, 7570-74)로 처리하고, 같은 IgG 서브타입의 대조 단일클론 항체(PAb 101)로는 처리하지 않았을 때 역시 병소가 생성되었다. 이와 같이, 병소 생성 활성이 컨포메이션-의존적이고 형-특이적(type-specific)인 방법으로 중화된 다는 사실은, C127 세포의 형질전환이 BPV DNA의 트랜스펙션이 아니라, BPV 비리온의 감염에 의해 발생된 것임을 확인시켜 주었다.

BPV 게놈의 효율적인 캡시드화를 위해 L2가 필요함: 진핵세포에서 L1이 발현되면 VLP로 조립되지만, 감염성 바이러스의 생성에 관여하는 L2의 기능은 확실히 밝혀지지 않았다(참조: Kirnbauer, R., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12180-84). L2는 감염 과정이나 게놈의 캡시드화 과정에서 필요한 것으로 보인다(참조: Zhou, J., et al., 1993, J. Gen. Virol. 74, 763-68). 후자일 가능성을 확인하기 위하여, 열 개의 500㎠ BPHE-1 세포 플레이트를 SFV-L1 단독, SFV-L2 단독, 또는 두가지 공동으로 감염시켰다. 감염 30시간 후 세포를 수득하여 파쇄한 다음, DNAsel(2000 U)로 37℃에서 1시간 동안 처리하고 바이러스 입자들을 정제하였다. 세슘 클로라이드 밀도구배를 분획화하여 각 분획의 밀도를 측정하였다. 각 분획 200㎕로부터 핵산을 정제하여 서던 블랏으로 BPV DNA를 탐지하였다. 절단되지 않은 DNAse I-저항성 BPV 게놈에 대한 사이즈 마커로서는 0.1 ng의 BPV-pML 플라스미드 DNA를 사용하였다(참조: Sarver, N., et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7147-7151). 그 결과, L1 및 L2를 공동으로 발현하는 BPHE-1 추출물의 분획에서만 DNAse I-저항성 BPV DNA가 뚜렷하게 누적된 것이 관찰되었다. 전기 분획의 밀도(1.31 g/㎖)는 동일한 조건하에서 사마귀로부터 회수한 감염성 BPV 비리온의 밀도(1.32 g/㎖)와 일치하였다.

전기 분획을 냉각 전자현미경(cryo-electron microscopy)으로 관찰하였다. 음각으로 염색된(negatively stained) 바이러스 입자의 전파 전자현미경(transmission electron microscopy)과는 달리, 냉각 전자현미경은 비지 않은 캡시드 내의 DNA가 빈 입자들의 낮은 밀도 코어(core)에 반해 짙은 전자 코어로써 직접적으로 눈에 보이게 된다. 제대로 형성된 바이러스 입자들은 대부분 짙은 전자 코어로 관찰되었고, 적은 부분에서 저밀도 코어나 파괴된 모양, 막대 모양으로 보였다. 웨스턴 블랏 분석에 의하여 확인되었듯이, L1이 많은 분획에 걸쳐 분산되어 있기 때문에, 꽉 찬 입자와 비어있는 입자의 비율을 계산할 수는 없었다. 그러나, 클로닝된 BPV 게놈을 기준으로 비교 서던블랏을 수행한 결과, 약 10⁸ DNA 분자에 해당하는 1 ng의 전체 DNAse I-저항성 DNA가 전기 추출물에서 관찰되었다. 한편, 이 시료에서 오직 10⁴개의 감염 단위(infectious units)가 얻어져, 입자당 감염도의 비율이 약 10⁴으로 높음을 알 수 있었다. 같은 방법을 이용하여 감염 단위의 수와 소의 사마귀에서 정제한 BPV 비리온 내의 DNAsel-저항성 BPV 게놈 DNA의 양을 조사하였다. 입자당 감염도(C127 세포의 실험실적 조건에서의 형질전환에 의하여 측정된) 비율은 사마귀로부터 분리된 BPV 비리온(2x10⁴) 또는 BPHE-1 세포에서 생성된 BPV 비리온(1x10⁴)의 경우와 비슷하였다.

감염성 HPV16{BPV1} 위형(pseudotyped) 비리온의 제조와 중화: BPV L1 및 L2의 공동 발현이 BPV 게놈의 캡시드화를 초래하였으므로, 게놈의 캡시드화가 형-특이적(type-specific)인지 여부를 조사하고자 하였다. HPV16에서 유래한 L1과 L2가 BPV 게놈을 캡시드화하여 감염성 위형 비리온을 생성할 수 있는 지를 테스트하였다. 야생형 HPV16 분리형(114K)에서 유래한 L1과 L2를 SFV 벡터에 클로닝하여 BPHE-1 세포에서 발현시켰다(참조: Heino, P., et al., 1996, Virology 214, 349-359; Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36). 발현 확인은 L1의 경우 CamVir-1(Pharmingen) 단일클론 항체, L2의 경우 박테리아에서 제조한 글루타치온-S-트랜스퍼라제-BPV1 L2 융합단백질에 대한 토끼 항혈청을 이용한 웨스턴 블랏 방법으로 수행되었다. 상술한 C127 병소 형성 확인법으로 감염성 비리온의 생성을 측정하였다. HPV16에서 유래한 L1과 L2는 BPHE-1 세포에서 BPV L1 및 L2 보다는 5 내지 10배 적은 효율이지만 지속적으로 감염성 비리온(HPV16{BPV1}으로 명명함)을 생성하였다. BPV L1과 HPV16 L2, 또는 HPV16 L1과 BPV L2를 공동 발현시킨 경우, 병소가 생성되지 않았지만 낮은 효율로 이형 캡시드 단백질에 의한 켑시드화가 진행될 가능성은 있어보였다. 캡시드 조립이 불완전한 HPV16 돌연변이에서 유래한 L1 및 L2의 BPHE-1에서의 발현은 아무런 병소도 형성시키지 않았다(참조: Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36; Seedorf, K., et al., 1985, Virology 145, 181-185).

위형 비리온의 형-특이적 중화: 114K HPV16 VLP에 대한 토끼 항혈청 5 내지 50 ㎕를 HPV16{BPV1}에 처리하면 병소 형성이 저해되나, BPV1 VLP, 불활성화시 킨 BPV 비리온, 또는 조립이 불완전한 원형(prototype) 스트레인의 HPV16 L1에 대한 항혈청의 첨가는 병소 형성을 저해하지 않았다. HPV16 L1 단독에 대한 항혈청 및 L1/L2 VLP에 대한 항혈청 모두 중화력이 있었다. HPV16의 다른 분류인 자이레(Zairian) 분리종의 L1 VLP에 대한 항혈청 역시 HPV16{BPV1} 비리온을 중화시켰다(참조: Cheng, G., et al., 1995, J. Infect. Dis. 172, 1584-1587). 이러한 발견은 BPV 캡시드가 아닌, HPV16 캡시드를 가진 감염성 바이러스가 생성되며, BPV DNA에 의한 트랜스펙션이 아닌, C127 세포의 감염이 일어남을 제시하였다.

또한, 저위험성 HPV 6b나 11, 그리고, 고위험성 HPV18, 31, 33 또는 45에 대한 항혈청이 HPV16{BPV1} 비리온에 대한 감염을 저해하는 정도를 각각 측정하였다. 모든 혈청은 그에 상응하는 VLP를 효소결합면역흡수분석법(ELISA)과 혈구응집(hemagglutination) 저해 측정법에서 인식할 수 있는 충분한 항체(참조: ≥10⁴ , Roden, R.B.S., et al., 1996, J. Virol. 70, 3298-3301에서 기술됨)를 포함하지만, 그 중 어느 혈청도 50㎕(또는 5㎕)를 위비리온(pseudovirion) 추출물에 첨가하였을 때, HBV16{BPV1} 비리온의 감염을 막지 못했다.

토의: 여러 진전에도 불구하고, 실험실적 조건에서 감염성 파필로마바이러스 비리온을 생성하고 전기 비리온을 유전적으로 조작하는데 있어서의 어려움으로 인하여, 종양 바이러스인 감염성 파필로마바이러스에 대한 연구에 제한을 받아왔다(참조: Hagensee, M., and Galloway, D., 1993, Papillomavirus Report 4, 121-124). 쥐의 이종이식 체계(xenograft system)를 이용하여 HPV11의 제한된 생산과 이의 실험실적 조건의 분석법이 가능해졌다(참조: Christensen, N.D., and Kreider, J.W., 1990, J. Virol. 64, 3151-3156; Kreider, J.W., et al., 1987, J. Virol. 62, 590-93). 다른 접근 방법으로, 인간 케라티노사이트(keratinocyte)의 부양 배양(raft culture)은 상대적으로 정상적인 말단 분화가 진행되어 말기 단백질의 발현과 비리온 생합성을 가능하게 하여왔다(참조: Dollard, S.C., et al., 1992, Genes Dev. 6, 1131-42; Mayers, C., et al., 1992, Science 257, 971-73). 적은 양의 올바른 형태의 HPV31b 비리온이 이러한 방법으로 제조되어 왔으나, 이 체계를 이용한 여타의 정량적 감염도 측정법도 개발되지는 못했었다(참조: Meyers, C., et al., 1992, Science 257, 971-73). 더욱이 이종이식법이나 부양 배양법 모두 유전적 조작에는 용이한 방법이 아니다.

조우(Zhou) 등은 BPV1 L1 및 L2에 대한 벡터로 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 이용한 연구로부터, 바이러스 DNA의 캡시드화와 감염성 BPV 비리온을 제조하는 과정에 L1과 L2가 모두 필요하다는 결론을 내렸었다(참조: Zhou, J., et al., 1993, J. Gen. Virol. 763-68). 이 연구의 BPV 시료에는 C127 세포를 포함한 많은 세포들에게 세포독성이 있는 감염성 백시니아 바이러스가 포함되어 있었기 때문에, 실험시 바이러스 RNA의 일시적인 발현을 감염도의 마커로서 사용하였다. 본 발명의 실험과 그들의 연구에서 특이하게 구별되는 것은, 그들의 감염도 마커가 불활성화된 BPV1 비리온(DAKO)에 대한 항혈청에 의해 중화되었다는 것이다. 이와는 달리, 본 발명의 SFV-유래 비리온이나 가축의 사마귀에서 유래 된 비리온은 실험에 이용된 어느 혈청에 의해서도 저해되지 않는 병소를 야기시켰으며, 이는 DAKO의 혈청이나 다른 종류의 불활성화된 비리온에 대한 혈청이 중화능력이 없다는 보고와도 일치한다. 따라서, 조우(Zhou) 등의 연구 결과는 모호하다고 볼 수 있다.

여기에 기술한 바와 같이, 감염성 파필로마바이러스는 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 세포에서 불완전한 SFV 벡터를 통해 바이러스 캡시드 단백질을 발현시킴으로써 생산되었다. 감염성 BPV의 생산은 표준적이고 정량적인 실험실적 조건의 BPV 감염도 측정법으로 측정되었다(참조: Dvoretzky, I., et al., 1980, Virology 103, 369-375). BPV에 의하여 유발된 C127 세포의 병소 형성은 감염성 시료를 BPV 중화혈청과 함께 배양함으로써 특이적으로 저해되었으며, 이러한 결과는 형질전환이 바이러스 DNA의 트랜스펙션에 의해서가 아닌, BPV의 감염에 의해 발생하였음을 증명하는 것이다.

이러한 바이러스 생산 방법은 비리온 형성에서의 비리온 단백질의 기능을 규명하고, 특정한 변형의 비리온을 생성할 수 있는 기회를 제공한다.

L1 및 L2가 단독 발현이 아닌 공동으로 발현되는 추출물에서만 DNAse I-저항성 전체 길이 BPV DNA가 존재한다는 사실은 BPV 게놈의 캡시드화에 L2가 필요함을 입증하는 것이다.

HPV16 유래 L1 및 L2가 BPV 게놈을 캡시드화하는 능력은, 파필로마바이러스 게놈을 위해 존재하는 여타의 바이러스 DNA 조립 신호가 BPV1과 HPV16 사이에 잘 보전되어 있으며, BPV1과 HPV16이 진화적으로 변화가 심하기 때문에 그러한 신호는 파필로마바이러스 간에 더욱 더 잘 보존되어 있음을 의미한다.

BPV L1과 HPV16 L2, 혹은 HPV16 L1과 BPV L2에 의해 감염성 바이러스가 제조되지 않는다는 사실은 다양한 종류의 파필로마바이러스로부터의 L2가 감염성 바이러스의 제조를 저해함을 의미하나, 밀접하게 관련된 파필로마바이러스 사이에서는 저해가 일어나지 않을 수도 있을 것이다.

BPV 게놈을 포함하는 세포에서의 HPV16 L1 및 L2의 발현은 HPV16 캡시드와 감염성 위형 비리온을 생성하였다. 이들은 전형적인 BPV형 병소를 야기시켰고, 이러한 감염성은 BPV 항혈청이 아닌 HPV16 항혈청에 의해 중화되었다. HPV16과 BPV1 사이의 연결 관계는 다른 고위험성 HPV 타입과의 관계보다는 멀기 때문에, HPV16에 대해 여기에 기술한 것과 유사한 방식을 다른 고위험성 HPV, 즉 대부분의 파필로마바이러스에 대한 감염성 위형 비리온을 제조하는 데에 이용할 수 있을 것으로 기대된다(참조: 실시예 4).

병소 형성 측정법(foci transformation assay)을 수행하는 기간이 2 내지 3주 길게 소요되지만, 이 문제는 기본적으로 BPV 게놈 중 신속하고 간단하게 탐지 가능한 마커를 도입하여 해결 가능하다.

수차례의 실험실적 조건의 실험에서 나온 결과에 의하면, 파필로마바이러스는 비록 숙주 특이적인 경향이 강하지만, 여러 종에서 분화된 다양한 세포형에 결합할 수 있다(참조: Muller, M., et al., 1995, J. Virol. 69, 948-54; Roden, R.B.S., et al., 1994, J. Virol. 68, 7260-66; Volpers, C., et al., 1995, J. Virol. 69, 3258-3264). C127 세포에서 HPV16{BPV1} 비리온이 병소를 형성시키는 사실로 미루어, C127 세포가 HPV16 비리온에 대한 세포표면 수용체를 발현하며, 또한 바이러스 감염의 첫 단계에 일어나는 내부화(internalization)와 비코팅화(uncoating)에 필요한 환경을 제공함을 알 수 있다. 이러한 결과는 BPV와 HPV16이 감염 과정에 있어 공통적인 세포내 단계를 거치며, 또한 같은 세포표면 수용체를 가지는 것으로 해석될 수 있다.

감염성 HPV16이나 다른 고위험성 HPV에 대한 자원(source)이 없고, HPV16이나 고위험성 HPV 게놈을 쉽게 측정할 수 있는 정량법이 없기 때문에, HPV16{BPV1} 위형 바이러스의 실험실적 조건에서의 제조는 최초로 HPV16과 기타 고위험성 HPV에 대한 항체 중화 측정법의 개발을 가능하게 하였다. 종래에 개발된 대부분의 예방 백신의 경우, 백신화한 후 중화 항체의 역가(titer)로 가장 근사치의 예방능력을 평가하였고(참조: Robbins, J.B., et al., 1995, J. Infect. Dis. 171, 1387-98), 이는 동물 파필로마바이러스에 대한 예방 연구에도 마찬가지로 적용되었다(참조: Breitburd, F., et al., 1995, J. Virol. 69, 3959-63, Suzich, J.A., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11553-11557). 그러므로, HPV16 VLP들에 대해서도 이들이 높은 역가의 중화 항체를 유도하는지 여부와 여러 종류의 생식기 HPV 사이에 어느 정도의 교차 예방이 이루어지는지를 알아보는 것이 중요하다. 이제까지는 효소결합면역흡수분석법과 혈구응집 저해와 같은 간접 측정법으로 중화 정도를 가늠하였다(참조: Roden, R.B.S., et al., 1995, J. Virol. 69, 5147-51, Roden, R.B.S., et al., 1996, J. Virol. 70, 3298-3301, Rose, R.C., et al., 1994, J. Gen. Virol. 75, 2445-49). 중화와 비교하여, VLP 효소결합면역흡수분석 법은 VLP 중화 항체가 아닌 것들까지 인식할 수 있어 상대적으로 정확하지 않으며, 헤마글루티네이션은 중화 항체의 조합(BPV, CRPV, 그리고 HPV11에 대한 중화 항체로 정의함)이 측정에 포함되지 않으므로 지나치게 덜 인식될 수 있다(참조: Roden, R.B.S., et al., 1996, J. Virol. 70, 3298-3301). 이제 여기에 기술한 정량적인 실험실적 조건의 중화 측정법 덕분으로, 위와 같은 불확실한 측정법에 더이상 의지하지 않아도 될 것이다(참조: 실시예 5).

대조군인 HPV16의 조립이 불완전한 돌연변이 L1의 경우, 측정 가능한 정도의 중화 항체를 유도하지 못함으로써, 중화능에 대한 대부분의 에피토프(epitope)들이 완전히 조립된 입자 표면에만 나타난다는 개념을 다시 확인시켜 주었다. 114/K HPV16 분리종과 일곱 L1 아미노산이 틀린, 즉 조립이 완전한 다른 변종(Zaire 1194(참조: Cheng, G., et al., 1995, J. of Infect. Dis. 172, 1584-1587))이 114/K 분리종에서 만들어진 HPV16{BPV1} 비리온을 효과적으로 중화시킨다는 사실은 한가지 HPV16 변종의 VLP들에 의해 여러가지 HPV16 변종들을 막을 수 있음을 제시한다(참조: Cheng, G., et al., 1995, J. of Infect. Dis. 172, 1584-1587). 그러나, 여섯가지의 생식기 HPV 타입이나 BPV1에서 유래한 VLP들에 대한 항체로는 위형 비리온을 중화시킬 수 없었다. 이러한 결과는 HPV16과 각각 84%, 81%로 가장 근접한 L1 아미노산 서열 일치를 보이는 HPV31과 HPV33의 두가지 VLP 타입으로 실험하였을 때도 마찬가지였다. 이러한 VLP에 대한 혈청의 단일 VLP에 대한 효소결합면역흡수측정법과 혈구응집 측정법에서의 역가는 최소한 10,000으로서(참조: Roden, R.B.S., et al., 1996, J. Virol. 70, 3298-3301), HPV16{BPV1} 중화 실험에서의 부정적인 결과는 VLP들에 대한 약한 항체 반응 때문은 아니었다. 이러한 결과는 HPV16이 다른 유전형(genotype)들과 구별되는 단일 혈청형(serotype)임을 알려준다.

조립된 HPV16 VLP들에 의해 생성된 항체가 HPV16{BPV1} 비리온의 감염을 효과적으로 저해한다는 발견은, 이러한 VLP들을 예방 백신 후보들로 이용하는 잠재적 가능성을 제시한다. 생식기의 HPV 감염을 막을 수 있는 다중 VLP-기초 백신을 구성할 요소에 대한 정보 결정을 위하여, 한 타입의 HPV VLP에 대해 생성된 항체가 어느 정도의 양이 되어야 다른 타입들의 감염 역시 중화시킬 수 있을지를 확인하여야 할 필요가 있을 것이다. 다른 생식기 HPV 타입에서 유래한 VLP에 대한 토끼 항체가 HPV16{BPV1} 감염을 막지 못했다는 결과는, 이러한 생식기 HPV들에 대해 인간에게서 생성된 중화 항체의 저해 작용이 형-특이적임을 제시한다. HPV16{BPV1}과 함께 다른 HPV 타입의 위형 비리온을 개발함으로써, 좀 더 광범위하게 동물에서의 연구와 초기 단계 인간 백신 시험에서 교차-중화에 대한 답을 탐구할 수 있었다.

II. 파필로마바이러스의 부(minor) 캡시드 단백질 L2가 비리온 구성요소들과 바이러스 전사/복제 단백질인 E2의 배치(localization)를 통해 POD 핵 구조를 유도함.

실시예 2에 기술된 방법에 의해, 배양세포에서 소 파필로마바이러스(BPV)의 구조 및 비구조 단백질이 세포내에 배치되는 것을 면역형광 염색 (immunofluorescent staining)과 컨포칼 현미경(confocal microscopy)으로 조사하였다. 개별적으로 발현시, 주(major) 캡시드 단백질인 L1은 핵 내에 분산되어 있었고, 부 캡시드 단백질인 L2는 PML 종양원성 부위들(PML oncogenic domains, PODs)로 알려진 반점형 핵 지역들에 배치되어 있었다. L1 및 L2를 공동 발현시에는 L1이 POD 안으로 재배치되어 L1과 L2가 함께 배치되었다.

바이러스 DNA 게놈, 그리고 게놈 유지 및 바이러스 DNA 합성에 필요한 비구조 바이러스 단백질인 E1, E2의 배치에 L2 발현이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. L2 발현이 E1 단백질의 배치에 영향을 미치지는 않았다. 하지만 L2-발현 세포에서, E2에 대한 염색 패턴은 급격한 변화를 나타내어, L1의 경우와 비슷하게 E2는 분산된 핵 지역화에서 옮겨져 L2와 함께 POD 안으로 같이 배치됨을 알 수 있었다. L2에 의해 전체 길이의 E2가 도입되는 작용에는 다른 바이러스 구성 요소가 관여하지 않았다. 또한 BPV에 의해 형질전환된 섬유아세포에서 자가복제하는 BPV 게놈이 L2-의존적 방법에 의해 인접한 핵 지역에 합체되는 것이 발견되었다.

감염성 BPV를 제조하는 데에 L2의 역할은 필수적인 것으로 보여진다. 현재까지의 결과들은, 비리온 구성요소들을 조직하는 데에 L2가 그 요소들을 특정한 핵 지역들로 불러들이는 역할을 함을 뒷받침한다. 이러한 L2-의존성 공동배치화는 특정지역에서의 비리온 구성요소들의 분포 증가, 또는 효율적인 포장이나 조립을 위한 물리적 구조를 제공하게 됨으로써 파필로마바이러스의 조립 메카니즘을 촉진시킨다. 또한, 실험 결과는 비구조단백질인 E2가 바이러스 게놈이 POD로 배치될 때 파필로마바이러스 게놈의 보존된 서열 모티브(conserved sequence motif)에 결합하 는 역할을 함을 보여주었다.

BPV 캡시드 단백질의 부핵(subnuclear) 배치화: BPHE-1은 자가복제하는 BPV 게놈의 다수 복사본에 의해 잠복적으로 감염되어 비구조단백질들을 발현하는 햄스터 섬유아세포이다(참조: Zhang, Y.L., et al., 1987, J. Virol. 61, 2924-2928). L2 부 캡시드 단백질을 BPHE-1 세포로 도입시키고, 면역형광 염색과 컨포칼 현미경으로 L2의 배치를 보기 위해 SFV 발현 시스템이 사용되었다. SFV 감염 6시간 후 L2는 전형적으로 핵내 특정한 반점형 지역에 배치되어 있었다.

이러한 배치가 BPHE-1 세포의 BPV 구성요소들에 의해 일어나는 가능성을 배제시키기 위하여, 파필로마바이러스 서열을 가지지 않는 세포에서 SFV 벡터를 통해 L2를 발현시켰다. COS-7, BHK-21, 그리고 인간 섬유아세포인 1634에서 L2의 배치를 확인하였을 때 비슷한 핵내 양상을 보였다. 그러므로, 특징적인 L2 배치는 세포 계통(cell lineage)과는 관계없이 독립적으로 오직 세포 요소들(cellular factors)에 의해 일어나는 것이다. 또한, 이러한 배치화가 파필로마바이러스 L2의 공통적인 특징인지 조사하기 위해, 전기 세포주에서 SFV 벡터에 의하여 발현된 인간 파필로마바이러스 16(HPV16) L2 단백질의 분포를 확인한 결과, BPV L2와 비슷하게 HPV16 L2가 배치됨을 보여, 이러한 배치화는 파필로마바이러스 L2의 공통적인 특성임을 확인하였다.

L2를 포함하는 반점형 구조물(punctate structure)인 POD: BPV L2 단백질 이 배치되는 핵 지역을 확인하기 위해, 다수의 핵 단백질과 L2에 대한 양편 염색(double staining) 실험을 수행하였다. 코일드 바디(coiled bodies), 레티노블라스토마(retinoblastoma) 단백질, p53, 또는 스플라이싱 펙터(splicing factor) SC35 등과 L2와의 공동 배치화는 일어나지 않음이 밝혀졌다. 비록, 항-SC35 항체로 본 염색 양상이 항-L2 항체의 양상과 비슷하였지만, 모든 영상을 통합하여 보았을 때, 이 지역들은 예외임이 확실하였다. 그러나 항-프로미엘로사이틱 루케미아(promyelocytic leukemia, PML) 단백질 염색 결과는 L2 단백질의 분포와 거의 완전하게 일치하는 것으로 나타났다.

성장 저해 유전자(growth suppressor gene)의 산물로 추정되는 PML 단백질은 POD라 일컬어지는 부핵 조직물(subnuclear organelles) 내에 위치한다(참조: Chang, K.S., et al., 1995, Blood 85, 3646-3653; Dyck, J.A., et al., 1994, Cell 76, 333-43). L2 단백질의 발현이 PML의 분포에 영향을 미치지 않는 것으로 보였으며, 또한 세포내 L2의 양과 POD내 L2의 배치 사이에도 아무런 관계가 없었다. 즉, 세포가 높은 양, 중간 양, 낮은 양의 L2를 발현할 때 모두에서 같은 결과가 나타났다. L2를 발현하는 모든 세포에서 L2가 PML과 같이 배치되는 비슷한 분포현상이 관찰되었다. 그러므로, 이러한 공동 배치화가 단백질의 과발현에 의한 아티팩트(artifact)라고 보기는 힘들다.

L2는 L1을 POD로 재배치시킴: L1과 L2가 결합하여 캡시드를 만들기 때문에, L1의 경우 L2와 비슷한 핵 염색 양상을 보일 것인가에 대한 의문이 생겼다. 그러 나 BPHE-1 세포에서 L1을 발현시켰을 때, L1 단백질의 분포 양상은 상당히 틀리게 나타났다. L1 단백질의 경우는 분산된 형태에서 약한 반점 형태로 존재하는 것까지 다양하게 나타났다.

이러한 결과는 L2의 공동 발현에 의해 L1 단백질의 세포내 분포가 영향을 받을 것이라는 가능성을 보여주었다. 따라서, 재조합 L1 SFV와 L2 SFV를 BPHE-1 세포에 공동감염시켜 전기 세포에서 감염성 BPV가 생길 수 있는 조건을 만들어 주었다. 이 때, L1 SFV를 단독으로 감염시켰을 때의 분산된 핵 양상과 비교하여 뚜렷한 변화가 L1 염색에서 드러났으며, L2의 양상은 L1의 존재와는 관계없이 같은 결과를 보였다. 그리고 두 결과를 함께 비교하였을 때, L1과 L2의 분포가 상당히 겹쳐짐을 알 수 있었다. 대체적으로 L1이 L2에 강하게 합체되지는 않는 것으로 보였다. 어떤 세포에서는 L1이 L2에 겹쳐지는 것이 아니라 감싸고 있는 것으로 나타났다. 이러한 다양성은 개별 세포로의 감염 기작 차이에 기인하거나, L1이 재배치되는 중의 중간 단계가 반영된 까닭일 것이다. 결과적으로, L1의 상당한 양이 L2에 의해 POD 안으로 재지정(redirection)되는 것으로 사료된다.

L2가 E2의 공동 배치화를 유도함: 다음으로, BPV의 캡시드 단백질이 바이러스 게놈 복제와 바이러스 전사에 관여하는 비구조단백질인 E2의 분포에 미치는 영향을 조사하였다(참조: Chiang, C.M., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 5799-5803; Spalholz, B.A., et al., 1985, Cell 42, 183-191; Ustav, M., and Stenlind, A., 1991, EMBO J. 10, 449-457). BPHE-1 세포에서 E2는 분산 된 분포로 존재하는 핵 단백질로 나타났다. 전기 세포에 L1을 발현시켰을 때 뚜렷한 영향이 나타나지 않았다. 반면, L2를 발현시켰을 때는 항-E2 염색 양상으로 보았을 때의 결과와 마찬가지로 E2가 반점형 지역으로 옮겨졌다. 비록 L2의 발현이 E2의 배치를 결정하는 데에 저해가 되지는 않았지만, E2의 양이 재조합 SFV 감염이 진행될 때에 현저히 감소될 때가 있었는데, 이는 아마 SFV에 의한 호스트 단백질 합성 저해 작용때문일 것으로 추측된다(참조: Strauss, J.H., and Strauss, E.G., 1994, Micro. Rev. 58, 491-562). 이러한 현상은 특히 SFV에 의한 Na+K+ 이동 저해 때문이다(참조: Carrasco, L., 1977, FEBS Lett. 76, 11-15; Garry, R.F., et al., 1979, Virology 96, 108-120). 연관되지 않은 SFV 재조합체로 대조 감염을 시켰을 때에도 E2의 감소는 관찰되었다. 100mM 염화칼륨(KCl)의 존재하에 감염시킴으로써 이와 같은 문제를 해소할 수 있었다.

L2-염색된 POD로 E2 단백질이 L2에 의해 재분포되는지를 결정하기 위해, L2-SFV로 BPHE-1 세포를 감염시킨 후 양편 염색을 실시하였다. 대부분의 세포에서는 분산되어 분포하는 E2 염색의 핵 양상을 보였다. 그러나 많은 세포에서 E2의 반점형 양상으로의 재배치가 관찰되었으며, L2를 발현하는 모든 세포에서는 오직 L2의 반점형 양상만이 관찰되었다. 상당한 양의 E2를 유지하는 감염된 세포 조건에서의 E2 및 L2 염색의 이러한 일치는 놀라웠다.

전체 길이 E2의 재분포에 L2의 역할은 충분함: 자가복제하는 BPV 게놈에 의해 형질전환된 세포는 게놈 복제와 전사의 트랜스액티베이션(transactivation)에 작용하는 48kD의 전체 길이 형태와, 바이러스 전사에 억제자(repressor)로 작용하는 두가지의 작은 형태, 이러한 세가지 형태의 E2 단백질을 발현한다(참조: Hubbert, N.L., et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 5864-5868; Lambert, P.F., J. Virol. 63, 3151-3154; McBride, A.A., et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18411-18414). 면역형광 연구에서 사용되는 항체는 전기 세 단백질이 모두 공유하는 C-말단의 DNA 결합 위치 에피토프를 인식하므로, 서로를 구별하지는 못한다. BPHE-1 세포의 또 다른 특성은 바이러스 게놈에 E2 분자의 알려지지 않은 부분이 결합된다는 것이다. 그러므로, BPHE-1 세포에서 L2-의존성 E2의 재분포에 바이러스 게놈이 관여하는지의 여부는 아직 불투명하다.

바이러스 게놈과는 관계없이 이러한 재분포가 이루어지는지를 확인하기 위하여, BHK-21 세포(파필로마바이러스 게놈이 포함되지 않은)를 L2-SFV 재조합체와 전체 길이 E2를 발현하는 SFV 재조합체로 감염시켰다. 세포 원형질에 있는 SFV RNA-의존성 폴리머라아제에 의해서만 E2의 RNA가 만들어지므로, 다른 형태의 E2 mRNA가 만들어질 가능성은 배제되었다. 예상한 대로, SFV-E2 감염 세포의 추출물에서 48kD 형태만이 웨스턴 블랏으로 탐지되었다. 상술한 대로, BHK-21 세포에서의 L2 분포는 BPHE-1 세포에서의 양상과 비슷하다. BHK-21 세포에서 L2 없이 E2가 발현되면 대부분의 단백질들은 분산된 핵 분포로 존재하였다. L2 및 E2를 공동 감염시키자 L2의 양상에는 변화가 없었으나, E2는 두 단백질이 모두 발현된 세포에서 반점형 염색 양상으로 나타나는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들은 L2 이외의 바이러스 게놈이나 바이러스 유전자 산물에 관계없이 전체 길이 E2가 POD로 배치되는 것을 의미한다.

L2가 E1의 재배치에는 관여하지 않음: 바이러스 DNA의 복제에 참여하므로 BPHE-1 세포에서도 발현되리라 예상되는 E1의 배치에 대해 조사하였다. 항-E1 항체에 의한 면역염색 신호는 아주 약했다. 자가복제하는 BPV 게놈에 의해 오직 낮은 정도의 E1 발현이 이루어지는 것으로 보고된 바 있으므로(참조: Sun, S., et al., 1990, J. Virol. 64, 5093-5105), 이러한 결과는 예측된 것이었다. 어느 캡시드 단백질을 SFV를 매개로 하여 발현시키든지 반점형 염색 양상의 어떠한 변화도 일어나지 않았다. 염색의 정도가 너무 낮았기 때문에 BPHE-1 모세포주를 대조군으로 사용할 수 없었고, 이러한 세포들에서의 E1에 대한 분석으로부터 아무런 결론도 이끌어 낼 수 없었다.

이러한 문제들을 극복하기 위해, BHK-21 세포들을 E1 재조합 SFV로 감염시켜 감염되지 않은 세포에 비해 얼룩형(speckled) 핵 양상에서 확실한 면역염색이 일어나도록 하였다. L2와 E1 재조합 SFV의 공동 감염은 전형적인 반점형 L2 염색 양상을 보였으나 E1의 양상에는 변화가 일어나지 않았다. 그러므로, L2 단백질은 E1의 재분포에 영향을 미치지 않는다. 그러나 E1이 E2나 바이러스 게놈과 상호작용 한다는 보고들(아래 참조할 것)(참조: Mohr, I.J., 1990, Science 250, 1644-99, Wilson, V.G., and Ludes-Meyer, J., 1991, J. Virol. 65, 5314-5322)에서 알 수 있듯이, E1이 간접적으로 POD로 배치되는 가능성은 배제할 수 없다.

L2 발현에 의해 바이러스 게놈의 분포가 변화됨: BPHE-1 핵 속에는 50 내지 200개의 자가복제하는 BPV 게놈 복사본이 있는 것으로 추정된다(참조: Zhang, Y.L., et al., 1987, J. Virol. 61, 2924-2928). BPV 비리온 단백질들의 발현이 BPV 게놈의 분포에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, L1이나 L2 재조합 SFV에 의해 감염된 BPHE-1 세포에 대하여 피쉬(FISH) 분석을 수행하였다. 게놈의 상단 조절 부위에 해당하는 DNA 중합효소연쇄반응(PCR) 프로브를 형광 표지시켜서, DNA 불활성화 후에 인사이투(in situ) 방법으로 하이브리다이제이션(hybridization) 시켰다. L1-SFV로 감염시켰거나 감염시키지 않은 세포들을 조사하였을 때, 게놈 분포는 단지 약한 형광의 얼룩형으로 탐지되었다. 그러나 L2가 발현된 세포에서는 형광 프로브가 보다 분명한 지역에 결합되었다. 형광 신호는 세포에 DNase를 전처리하여 제거할 수 있었지만, RNase 처리에 의해서는 영향 받지 않았다.

L2-POD 구조와 게놈의 위치를 비교하였을 때, DNA들은 이 도메인들의 옆에 위치하고 있었다. 피쉬 분석 후 항-E2 염색을 하였을 때, 하이브리다이제이션과 세척 과정 때문에 단백질 탐지 신호가 약해짐을 알 수 있었다. 하지만, L2의 특이적인 반점형 양상은 확인할 수 있었다. 감염되지 않은 세포에서는 분산되고 겨우 확인할 수 있는 정도의 형광이 나타났으나, L2가 고발현된 세포에서는 핵 내의 10 내지 12개 지점에서 형광 프로브가 강하게 결합되었다. 합산된 영상을 분석하였을 때, BPV DNA와 L2 단백질은 인접한 도메인에 배치되는 것이 분명하였다. L2가 발현되지 않은 세포에서는 이러한 하이브리다이제이션 양상이 관찰되지 않았다. 그러나 이러한 분포는 L2를 발현하는 세포의 20-25%에서만 분명하였다. 이러한 변화는 감염된 세포 내의 게놈 복사본 수의 차이, 특정 감염의 시간이나 세포주기의 변화 때문인 것으로 예상되지만, L2가 바이러스 구성요소들과 바이러스 단백질들의 배치를 유도한다는 결과와 상반되지는 않는다.

토의: 상술한 바와 같이, 부 캡시드 단백질 L2는 다른 바이러스 구성요소들의 도움 없이 POD로 배치화를 가능케하는 내재적 능력을 가지고 있다. 더욱이, POD 내 L2의 존재는 주 캡시드 단백질인 L1, 비구조단백질 E2, 그리고 바이러스 게놈의 재배치와 연관되었다. 그러므로, POD가 파필로마바이러스의 조립에 주요 구조로 작용함이 분명해졌다.

POD는 대개의 세포에서 직경 0.3 mm 내지 0.5 mm인 크로마탄 내 매트릭스에 부착된 핵 구조물들(interchromatinic matrix-bound nuclear bodies)이다. POD의 세포내 기능은 아직 잘 알려져있지 않다(참조: Ascoli, C., and Maul, G.J., 1991, J. Cell. Biol. 112, 785-795; Grande, M.A., et al., 1996, J. Cell. Biochem. 63, 280-91). POD는 세포당 존재하는 수가 다르며 형질전환된 세포에서의 수가 많은 경향이 있지만, 그 수에 따라 이들은 Kr 몸체(Kr bodies)나 핵 도메인 10(nuclear domain 10, ND10)으로도 불린다(참조: Ascoli, C., and Maul, G.J., 1991, J. Cell. Biol. 112, 785-795; Lamond, A.I., and Carmo-Fonseca, M., 1993, trends in Cell. Biol. 3, 198-204). POD는 이들의 절단화(fragmentation)가 급성 프로미에로사이틱 루케미아에서 자주 보여지듯, 미엘로이드(myeloid) 세포의 정상 적 성숙화를 위해 필요한 듯 하다(참조: Dyck, J.A., et al., 1994, Cell 76, 333-43). 루케미아에서 POD가 분해되는 것은, t(15;17) 염색체 전이 때문에 발생하는 정상 PML 단백질과 PML-레티노인 산 수용체 a(PML-RARa) 융합 단백질 사이의 헤테로다이머 형성과 관련된다(참조: de The, H., et al., 1990, Nature 347, 558-561; de The, H., et al., 1991, Nature 347, 558-561; Kakizuka, A., et al., 1991, Cell 66, 663-674). PML과 마찬가지로 POD 역시 6개 이상의 단백질들을 포함한다. 쓸개즙 간견병증(primary biliary cirrhosis) 환자의 자가항원 (autoantigen)으로 알려진 SP100 단백질, Int-6, PIC-1 단백질, 52 kD(NP52), 55 kD(NDP55), 그리고 65 kD 단백질들이 이 구성요소들이다(참조: Ascoli, C., and Maul, G.J., 1991, J. Cell. Biol. 112, 785-795; Boddy, M.N., et al., 1996, Oncogene 13, 971-982; Desbois, C., et al., 1996, Science 273, 951-53; Epstein, A.L., 1984, J. Virol. 50, 372-379; Szostecki, D., et al., 1990, J. Immunol. 145, 4338-4347).

POD와 다른 DNA 바이러스의 복제 사이에 연관이 있음도 보고되었다. 헤르페즈 심플렉스 바이러스 1(herpes simplex virus 1, HSV-1), 아데노바이러스 5(adenovirus 5, Ad-5), 그리고 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40)의 경우, 바이러스의 복제 시작이 POD와 연관된다고 보고되었다(참조: Carvalho, T., et al., 1995, J. Cell. Biol. 131, 45-56; Doucas, V., et al., 1996, Genes Dev. 10, 196-207; Everette, R.D., and Maul, G.G., 1994, EMBO J. 13, 5062-69; Jiang, W.Q., et al., 1996, Exp. Cell. Res. 229, 289-300; Maul, G.G., et al., 1996, Virology 217, 67-75; Puvion-Dutilleul, F., 1995, Exp. Cell. Res. 218, 9-16). 유전적으로 연관되지 않은 이 세가지 바이러스에서 이 POD 구조물로 통합되는 놀라운 사실에도 불구하고, 바이러스와 세포간의 작용에서 이 배치가 수행하는 기능은 아직 불명확하다.

바이러스 복제에서 POD와 바이러스 구성요소들과의 연관이 가지는 기능에 대한 몇가지 추론이 있다. POD 연관은 첫단계의 바이러스 복제를 제한하기 위해 발달된 세포의 기작이라는 제안이 있다(참조: Ishov, A.M., and Maul, G.G., 1996, J. Cell. Biol. 134, 815-826). 아데노바이러스 5 E4-ORF3과 헤르페즈 심플렉스 바이러스 1 ICP0가 감염이 진행될 때에 POD들을 분해하는 단백질들을 코드한다는 사실이 이를 뒷받침한다(참조: Doucas, V., et al., 1996, Genes Dev. 10, 196-207; Everett, R.D., and Maul, G.G., 1994, EMBO J. 13, 5062-69; Maul, G.G., et al., 1996, Virology 217, 67-75; Puvion-Dutilleul, F., 1995, Exp. Cell. Res. 218, 9-16). 또한, 인터페론(interferon)이 POD의 발현을 증가시키고 이 POD는 항바이러스 방어 기작에 쓰이게 된다(참조: Chelbi-Alix, M.K., et al., 1995, Leukemia 9, 2027-2033; Grotzinger, T., et al., 1996, Mol. Cell. Biology 16, 1150-56; Lavau, C., et al., 1995, Oncogene 11, 871-876).

다르게는, POD 연관이 바이러스 복제에 도움을 줄 가능성도 있다. 이 배치화는 1) 바이러스 생산물의 농도를 높여 조립에 도움을 주거나, 2) 바이러스에 대한 상피 세포에서의 초기 복제의 시작점인 정상적 분화와 아팝토픽(apoptopic) 반응을 저해하거나, 3) 세포의 전사 및 복제 요소들의 흐름을 도와주거나, 4) 바이러스 산물들의 필수적인 기능을 돕는 기능을 할 가능성이 있다. 마지막 가능성에 부 가하여, 유비퀴틴(ubiquitin)-의존성 프로테아제(protease)는 최근 POD와 연관됨이 밝혀졌다(참조: Boddy, M.N., et al., 1996, Oncogene 13, 971-982). 본 발명에서 밝힌 실험실적 조건에서의 파필로마바이러스의 잠재성에서 활동성으로의 변환은 연관되는 바이러스 생산물들의 POD로의 재분포와 관련된다는 사실은, 파필로마바이러스의 복제에 있어서 POD들이 도움이 됨을 반증하는 것이다.

아데노바이러스 5(Ad-5), 헤르페즈 심플렉스 바이러스, 시미안 바이러스 40, 그리고 앱스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)로 실험한 결과, POD들과 작용하거나 어떤 경우에 이들을 분해하는 초기 유전자 산물들을 밝힐 수 있었으나, 어떠한 유전자가 바이러스 구성요소들의 POD 배치화와 관련되는지를 밝히지 못했었다(참조: Doucas, V., et al., 1996, Genes Dev. 10, 196-207; Everett, R.D., and Maul, G.G., 1994, EMBO J. 13, 5062-69; Jiang, W.Q., et al., 1996, Exp. Cell. Res. 229, 289-300; Maul, G.G., et al., 1996, Virology 217, 67-75; Puvion-Dutilleul, F., 1995, Exp. Cell. Res. 218, 9-16). 본 발명에서, 활동성 감염(productive infection)시 여러가지 파필로마바이러스 구성요소들의 POD와의 연관은 L2 부 단백질에 의존함이 밝혀졌다. 감염성 바이러스 제조에 필수적인 L2가 없을 때, 다른 바이러스 구성요소들은 여러가지의 다른 분포를 나타냈다. 이러한 결과는 L2가 바이러스 조립에 필요한 다른 구성요소들의 공동 배치화를 유도함으로써 바이러스 생산을 촉진시킴을 제시하였다. POD 내로의 재배치화는 파필로마바이러스 감염의 잠복성과 활동성 여부를 구분짓는 중요한 요건인 것으로 보인다. POD에 결합하는 단백질인 헤르페즈 심플렉스 바이러스-1 ICP0와 엡스타인 바 바이 러스(EBV) EBNA-5는 바이러스가 잠복기에서 벗어나는데 관여하는 것으로 알려져 왔으며, 각각의 바이러스에 있어 유사한 기능을 수행할 가능성도 있다.

본 발명은 파필로마바이러스 라이프 사이클(life cycle)의 활동기(productive phase)에 대하여 다음과 같은 모델을 제시한다(참조: 도 1). 감염된 상피세포에서 분화 특이적인 신호에 의해 L1 및 L2의 발현이 유도될 때 활동성 사이클이 시작된다(참조: Dollard, S.C., et al., 1992, Genes Dev. 6, 1131-42; Meyers, C., et al., 1992, Science 257, 971-73). 본 시스템에서의 SFV가 매개된 전기 두 단백질의 발현은 바이러스 생산에 분화와 관련된 신호 등이 필요하지 않음을 제시한다. 바이러스 조립은 L2의 POD와의 결합 및 L1의 공동 배치화에 의하여 촉발된다. 안정한 L1/L2 복합체가 생체 내 조건에서 완전히 조립된 VLP에서나 실험실적 조건에서 부분적으로 조립된 바이러스 캡시드 구조물(L1 펜타머(pentamer)가 포함된) 모두에서 형성되는 것으로 보아, L1과 POD의 결합은 L1과 L2의 직접적인 상호 작용의 결과이다. L2 없이도 L1이 자체적으로 조립되어 VLP가 되지만(참조: Kirnbauer, R., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 12180-84; Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6729-36), L2의 존재는 곤충세포에서 4배의, 동물세포에서 100배의 VLP 생산 증가를 유도하였다(참조: Hagensee, M.E., et al., 1993, J. Virol. 67, 315-22; Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36; Zhou, J., et al., 1993, J. Gen. Virol. 74, 763-68). 이와 같은 VLP 생산효율의 증가는 L2에 의해 L1이 POD 내로 농축되어 캡시드 조립 속도가 증가한 결과이다.

L2를 포함하는 일부 세포에서, L1은 L2에 겹쳐지는 것이 아니라 주변을 감싸고 있다. 이러한 변화는 모든 감염이 전기 두가지 패턴이 혼합된 양상을 나타내기 때문에, 개별 세포로 SFV 감염이 진행될 때의 순간적인 차이를 반영하는 것이다. 본 발명에 도입한 항-L1 항체를 이용하여 다양한 L1 조립 단계를 탐지할 수 있다. 실험실적 조건에서, 전기 항체는 비리온은 물론 L1 펜타머도 인식하였다. POD 주변에서 L1이 탐지되는 것은 성숙된 비리온들이 조립 지역에서 풀려나오기 때문인 듯하며, 이 때 항-E2 항체에 대한 반응성은 감소한 것으로 나타났다. 다르게 보면, 주변부의 L1-염색은 L2와의 결합 과정에 있는 L1 펜타머 때문일 수도 있다.

E2의 재배치 역시 L2에 의해 유도되었다. BHK-21 세포에서 행한 실험은 POD로의 E2 연관이 L2 의존적이며, L1이나 여타의 다른 파필로마바이러스 유전자 산물에 의존하지 않음을 보여주었다. 그러나, E2가 L2와 직접적으로 작용한다는 증거는 없었다. 공동면역침강 실험이나 수크로오즈 밀도구배에서의 공동분리 실험 등 많은 노력들에도 불구하고, E2-L2의 수용성 복합체를 생체 내 조건이나 실험실적 조건 모두에서 발견할 수 없었다. 현재까지는 L2와 E2가 약한 결합으로 존재하는지, L2에 의해 변형된 POD의 요소에 E2가 결합하는지, 또는 E2, L2, POD 구성요소들이 삼분자 복합체를 형성하는지의 여부를 확인할 수 없다.

개별적인 캡시드 단백질들이나 조립된 VLP들이 서열 특이적인 방법으로 게놈에 결합하지 않기 때문에, 파필로마바이러스가 세포의 DNA에 비하여 어떻게 바이러스 게놈 포장을 선호하는지의 여부를 확신할 수 없다(참조: Mallon, R.G., et al., 1987, J. Virol. 61, 1655-1660; Zhou, J., et al., 1994, J. Virol. 68, 619-25). 바이러스 게놈의 분포에 대하여 본 발명에서 밝혀진 결과들은 이 과정을 이해하는 데 중요한 단서가 될 것이다. 잠복성으로 감염된 세포에서 바이러스 DNA는 분산된 분포를 보였다. 한편, 감염성 비리온을 생산할 수 있는 어떤 종류의 세포에서 바이러스 DNA의 POD로의 배치가 확인되었기 때문에, 바이러스 게놈의 비리온으로의 포장이 이러한 직접적인 배치에 기인하는 것으로 사료된다.

비록 바이러스 게놈의 이러한 재배치화의 기작이 실험적으로 확인되지 않았지만, E2가 바이러스 게놈의 여러 부위에 활발히 결합하기 때문에, 바이러스 게놈의 재배치화는 E2가 POD로 재배치되는 것에 의존한다고 추론할 수 있다(참조: Androphy, A.J., et al., 1987, Nature 325, 70-73; Li, R., et al., 1989, Genes Dev. 3, 510-526). 소의 사마귀에서 분리한 감염성 BPV 비리온들로부터는 E2를 탐지할 수 없었기 때문에, E2는 비리온 조립 과정 중에서 촉매로써 작용한다고 사료되었다. 비구조단백질인 시미안 바이러스 40 T 항원 역시 이러한 견지에서 E2의 기능적인 유사체로 볼 수 있다. T 항원은 바이러스 게놈에 결합하는 전사/복제 요소로서 POD와 연결되지만 분해를 야기하지는 않는다(참조: Jiang, W.Q., et al., 1996, Exp. Cell. Res. 229, 289-300). 비리온으로의 포장에 필요한 시미안 바이러스 40 바이러스 게놈상의 신호는 T 항원 결합 부위를 포함하는 바이러스 DNA 부분 상에 위치하는 것으로 결정되었다(참조: Oppenheim, A., 1992, J. Virol. 66, 5320-5328).

III. 곤충세포에서 감염성 BPV 비리온의 실험실적 조건의 제조

실시예 3에 기술한 방법을 이용하여, Sf9 곤충세포에 먼저 전체 길이 원형 BPV DNA로 트랜스펙션시키고, 다음으로 다양한 조합의 BPV 단백질을 발현하는 배큘로바이러스 (Baculovirus)를 감염시키는 방법을 사용하여 감염성 BPV를 얻었다.

감염성 BPV의 제조에 E2가 요청됨: BPV 게놈으로 트랜스펙션시킨 Sf9 세포를 L1 단독, L2 단독, 또는 L1 및 L2가 공동 발현되는 배큘로바이러스로 감염시키고, 이로부터 추출물을 얻어 C127 세포에 처리하였으나 병소가 생성되지 않았다. 그러나 L1, L2, 및 E2가 발현되는 배큘로바이러스로 BPV DNA가 트랜스펙션된 Sf9 세포를 감염시키고, 이로부터 추출물을 얻어 C127 세포에 처리하자 전형적인 BPV 병소가 형성되었다. 위의 L1, L2, 및 E2가 발현되는 조건에 E1이 추가적으로 발현되는 배큘로바이러스를 감염에 사용하였을 때는 C127 세포 위에 더 적은 병소가 나타났고, L1, L2, 및 E1의 조합으로 발현되는 배큘로바이러스를 감염에 사용하자 병소가 생성되지 않았다. 또한 L1, L2, 및 E2가 발현되는 배큘로바이러스로 감염시켰을 때에도, BPV 게놈 사이에 박테리아 pML-2d 플라스미드가 삽입되어 있는 BPVpML 플라스미드로 트랜스펙션시키자 병소가 생성되지 않았다. 항-BPV 중화 혈청으로 감염성 추출물을 처리하면 L1, L2, 및 E2가 발현되는 배큘로바이러스로 감염시켜 얻은 추출물이라도 병소의 형성은 저해되었다.

외인성(exogenous) E2의 요구: 동물세포의 경우와는 다르게, 곤충세포에서는 감염성 바이러스를 얻기 위해 L1 및 L2 뿐만 아니라 E2가 요구되었다. 이는, 외인성 E2가 요구되지 않는 동물세포 환경과는 달리, 바이러스의 비구조단백질을 코드하는 BPV 유전자가 BPV DNA에 의해 형질전환된 Sf9 곤충세포에서는 발현되지 않기 때문으로 사료되었다. 이러한 가능성을 확인하기 위해, BPV DNA가 트랜스펙션된 Sf9 세포를 대상으로 λCII BPV E6 융합 단백질에 대한 토끼 항혈청을 1:500으로 희석하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(참조: Androphy, E.J., et al., 1985, Science 230, 442-445). 웨스턴 블랏 결과, 상기 조건에서 E6의 발현은 탐지되지 않았다. 이 결과로써, BPV 유전자는 동물세포 환경에서와는 달리 곤충세포 환경에서는 발현되지 않음이 입증되었다.

E2는 바이러스 전사/복제 조절자임: BPV 전체 길이 E2 유전자에 의해 코드되어 발현하는 E2는 모든 파필로마바이러스의 상위 조절 지역(upstream regulatory region, URR) 내에 다중 복사본으로 존재하는 서열들 위에 다이머(dimer)로 결합하여 작용한다(참조: Turek, L., 1994, Adv. Virus Res. 44, 305-356). 이 E2 단백질은 바이러스의 RNA 및 DNA 합성을 촉진한다고 보고되어 왔다. 이러한 활성은 E2가 URR 내의 동종(cognate) 결합 부위(E2BS)에 결합되는 작용에 의존되며, 이 단계에서 바이러스 DNA 복제를 위해 바이러스 E1이 E2와 마찬가지로 요구된다(참조: Chiang, C.M., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5799-5803).

외인성 E2는 BPV 전사를 촉진시키지 않음: BPV DNA로 트랜스펙션시킨 Sf9 세포에서, E2의 발현에 의해 비리온 조립에 필요한 다른 파필로마바이러스 유전자 발현이 촉진되는지를 조사하기 위해, E2 배큘로바이러스를 사용하여 감염시키고 BPV E6 단백질(동물세포에서 E2에 의해 발현이 조절되는)의 존재를 확인하였다. E2 배큘로바이러스 단독은 물론, E2 및 L1 + L2 배큘로바이러스로 감염시켰을 때에도, BPV DNA로 트랜스펙션된 E2를 발현하는 Sf9 세포에서 E6의 발현은 웨스턴 블랏으로 확인되지 않았다. 상기 결과에 의해 E2가 발현되는 조건에서 비구조 바이러스 유전자의 발현이 촉진되지 않음이 확인되었다.

외인성 E2는 BPV DNA의 복제를 촉진시키지 않음: 재조합 배큘로바이러스를 사용하여, BPV DNA가 트랜스펙션된 Sf9 세포에 BPV E1, E2, L1, 그리고 L2를 독립적이거나 조합으로 감염시켜 발현시키고 E2 배큘로바이러스에 의해 Sf9 세포에 도입된 BPV DNA의 복제가 촉진되는지 확인하였다. 3일이 경과한 후, 세포를 수득하여 허트(Hirt) 추출물로 준비하였다(참조: Hirt, B., 1967, J. Mol. Biol. 26, 365-369). Dpn I에 대한 저항성의 획득 현상을 이용하여 Sf9 세포에서의 BPV DNA 복제를 측정하였다. 외크로모소말 (extrachromosomal) DNA를 과량의 Dpn I으로 처리하여 1%의 아가로오즈 젤에서 전개시켰고, 서던 블랏(Southern blot)을 수행하였다. BPV DNA의 Spe I-Kpn I 절편을 무작위로 프라이밍(priming)하여 만들어진 [³²P]-표지된 프로브로 BPV DNA의 존재를 탐지하였으나, Dpn I 저항성 BPV DNA는 발 견되지 않았다(시료당 1 ng의 DNA 민감도). 상기 결과는, 곤충세포에서 E1이나 E2, 혹은 두 단백질 모두가 존재하더라도 바이러스 복제가 일어나지 않음을 의미하며, 그러므로 BPV DNA가 트랜스펙션된 Sf9 세포에서 포장을 위한 BPV 게놈의 복제에 E2가 요구되지 않음을 증명한다.

외인성 E2는 BPV L1이나 L2의 양을 증가시키지 않음: Sf9 세포에서 E2가 바이러스 비구조단백질의 발현이나 BPV DNA의 복제를 촉진하지 않음이 밝혀진 후, E2의 발현에 의해 L1이나 L2의 양이 비리온 조립에 필요한 정도로 증가되는지 확인하였다. 이를 위해, BPV DNA로 트랜스펙션시킨 Sf9 세포에 L1, L2, 및 E2의 모든 조합이 발현되도록 재조합 배큘로바이러스를 감염시키고, 3일이 경과한 후 웨스턴 블랏으로 L1 및 L2의 양을 측정하였다. 결과적으로, E2는 캡시드 유전자 발현의 양을 증가시키지 않았다. 오히려, 다수의 배큘로바이러스에 의해 감염된 Sf9 세포에서 유전자의 발현은 감소하였다.

토의: BPV DNA 게놈을 다중 복사본으로 안정되게 가지는 동물세포에서는, 셈리키삼림바이러스 벡터에 의해 BPV L1과 L2가 발현되면 감염성 BPV(BPV 항혈청으로 중화되는)가 만들어졌다. 같은 시스템에서 셈리키삼림바이러스 벡터에 의해 HPV16 L1과 L2를 발현시키면, HPV16 L1/L2 캡시드에 의해 둘러싸인 BPV 게놈을 포함하는 감염성 위형(HPV16 항혈청으로 중화되는)이 만들어졌다. L1이 혼자서는 비록 빈 캡시드를 만들지만, 바이러스 DNA의 캡시드화와 감염성 바이러스의 제조 모 두에 L1과 L2가 필요하였다.

곤충세포에서는, BPV DNA 게놈이 세포 안으로 도입되고 적절한 조합의 BPV 단백질들이 발현되는 배큘로바이러스에 의해 감염될 때에 감염성 BPV를 얻을 수 있었다. HPV를 포함한 비슷한 종류의 파필로마바이러스에 대해서 같은 접근을 하여도 같은 혈청형의 감염성 바이러스가 제조될 것이다. 이러한 접근 방법은, 바이러스의 구조단백질들에 의해 정확하게 만들어진 캡시드들이 자동적으로 조립되는 효모(yeast) 등 다른 비동물세포 시스템에도 성공적으로 적용되리라 예상된다(참조: Sasagawa, T., et al., 1995, Virology 206, 126-35).

곤충세포에서 실험을 통해 얻게 된 결론은, 이 세포에서의 감염성 BPV 생산을 위해서는 E2의 외인성 생산 및 바이러스 게놈, 바이러스 구조단백질들인 L1 및 L2가 필요하다는 것이다. 동물세포를 이용할 때 외인성 E2가 필요없는 것은, 동물세포에서의 E2는 곤충세포에는 없는 에피소말 BPV 게놈으로부터 발현되는 것으로 이해될 수 있다. BPV가 동물성 바이러스이므로, 동물세포에서 바이러스의 게놈으로부터 비구조 유전자의 발현이 허용되고(참조: Turek, L., 1994, Adv. Virus Res. 44, 305-356), 반면 진화적으로 상이한 곤충세포에서 이러한 발현이 저해된다는 사실은 그리 놀라운 것이 아니다.

또한, 곤충세포에서의 실험은 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 외인성 E2에 의해 BPV DNA의 합성, BPV 전사가 촉진되거나 BPV L1이나 L2 단백질의 양이 증가한다는 가능성을 부정하였다. 여기서 E2는 바이러스의 구조단백질들에 의한 BPV 게놈의 캡시드화를 매개하는 다른 역할을 하고 있었다. 이러한 결과에 이르게 하는 E2의 기능에 대한 기작은 알려지지 않았지만, 모델을 가정할 수는 있다. 이 모델에서, 바이러스 게놈 위의 동종 E2 결합부위에 붙는 E2 다이머는 완전하게 조립되는 입자를 형성하는 바이러스 캡시드와 연결된다. 아마도 E2-DNA 복합체의 어떤 기능이 바이러스 DNA의 캡시드화를 촉진시키는 방법을 통해 바이러스 캡시드의 조립을 인식한다. 이 모델에서는 E2가 바이러스 게놈과 함께 바이러스 캡시드 안으로 도입될 것이다. 다르게 보면, 바이러스 DNA의 캡시드화가 E2의 배출을 유도하고, 배출된 E2가 다시 바이러스 DNA 게놈의 캡시드화를 도울 수도 있을 것이다. 이 중 두번째의 가능성이 더 선호되는 이유는, 소의 사마귀에서 뽑은 감염성 BPV를 조사하였을 때 더욱 더 E2를 발견할 수 없었기 때문이다(10 비리온 당 1 E2 분자의 민감도 조건으로 실험하였슴). 이 모델의 가장 중요한 의미는, E2와 바이러스 DNA 서열들과의 널리 알려진 고 친화성 결합을 통해 게놈 캡시드화가 이루어진다는 특이성을 제공하는 것이다. 모든 파필로마바이러스들의 게놈은 이러한 기작에 의해 캡시드화 될 것으로 예상된다. L2가 E2 및 바이러스 게놈을 POD로 인도하는 결과들은 이 모델의 설명과 일치하는 것이다. 동물세포에서 HPV16 L1과 L2를 이용하여 BPV 게놈을 위형화 할 수 있다는 결과는 파필로마바이러스들 사이에서 캡시드화의 기작이 잘 보존되었음을 나타내는 것이다. 더욱이, 바이러스 DNA가 비구조 DNA 결합 단백질에 의해 비리온으로 유도된다는 이 모델은 다른 바이러스의 경우에도 적용될 수 있을지 모른다. 거의 모든 경우에 있어서 DNA 결합 단백질(혹은 RNA 바이러스의 경우 RNA 결합 단백질)은 바이러스에 의해 코드될 것이다. 하지만 DNA 결합 단백질이 세포에 의해 코드되는 경우의 바이러스도 있을 수 있다(참조: 실시예 6).

이 모델의 전반적인 모습을 참조할 때, 파필로마바이러스에 의해 DNA가 캡시드화하기 위해서는 E2BS를 포함하는 DNA가 요구된다. 이것의 의미는, E2BS를 포함만 한다면 유전자든 조절자 요소이든지와 관계없이 파필로마바이러스 위형으로 캡시드화될 수 있다는 것이다. E2BS의 수나 위치, E2BS를 포함하는 DNA가 반드시 에피소말이어야 하며, 구형에 약 8 kb이어야 한다는 것 등은 경험적인 것들이다. E2BS를 제외한 나머지 모든 바이러스 유전자를 제거했을 경우에도, 마찬가지로 파필로마바이러스의 캡시드 단백질들에 의해 효과적으로 위형화할 수 있음이 예상되어진다. HPV16 L1과 L2가 BPV 게놈을 위형화 할 수 있다는 발견으로부터 E2가 이형(heterologous)의 캡시드와 함께 기능할 수 있음을 알 수 있었다. 이것이 의미하는 바는, 새로운 바이러스 위형을 만들기 위해 반드시 동형(homologous)의 E2를 필요로 하지 않음을 의미한다. 대신 요구되는 것은, 파필로마바이러스 벡터 DNA에 도입되는 E2 DNA 결합 단백질과 그것의 동종 DNA 결합 부위를 위한 것들이며, E2와 이형이어도 되는 파필로마바이러스 캡시드들이다. 다른 바이러스의 경우에 있어서도 같은 기작이 적용될 수 있으리라 사료된다.

파필로마바이러스 위형은 동물세포에서 만들어질 수 있음이 기술되었다(참조: I). 곤충세포에서 감염성 BPV를 만드는 데 성공하였으므로(참조: III), 곤충세포에 E2, L1, 그리고 L2를 발현토록 하여 감염성 파필로마바이러스 위형을 만들 수 있을 것으로 기대된다. L1, 그리고 L1/L2의 바이러스와 비슷한 입자를 효모에서 만들 수 있고(참조: Sasagawa, T., et al., 1995, Virology 206, 126-35), 이곳에 서 E2가 E2BS-의존성 전사 요소로 기능한다고 보고되었으므로(참조: Lambert, P., et al., 1989, Genes Dev. 3, 38-48; Morrissey, L., et al., 1989, J. Virol. 63, 4422-4425), 효모에서도 환경을 곤충세포, 혹은 동물세포와 같게 만들어준다면 파필로마바이러스 위형을 제조할 수 있을 것이다. 효모나 곤충세포에서 작용하는 DNA 복제 오리진(origin)(동물세포의 경우 파필로마바이러스에 이 세포에서 기능할 수 있는 복제 오리진이 포함되어 있다)을 추가해 주면 동형 시스템에서의 감염성 바이러스 생산을 증가시킬 수 있으리라 사료된다. 더욱이, 바이러스와 비슷한 입자들은 박테리아에서도 제조할 수 있기 때문에(참조: Nardelli-Haefliger et al., 1-6 Dec. 1996, 15 Intl. Papillomavirus Workshop, 290), E2, L1, 그리고 L2 유전자가 적절히 코드되도록 해준다면 파필로마바이러스 위형을 박테리아에서도 제조할 수 있으리라 사료된다. 종합적으로 볼 때, 이러한 특성들은 파필로마바이러스 위형을 보다 경제적으로 생산할 수 있게 도와준다.

부가적으로, 세포를 이용하지 않고 실험실적 조건에서 바이러스 위형을 제조할 수 있어야 한다. 바이러스 구성요소인 L1 및 L2, 그리고 E2BS-포함 DNA들과 E2와의 상호 관계를 밝힌 것은, 실험실적 조건에서 바이러스 DNA를 포장하기 위해 필요한 인자들을 찾는 연구의 출발점을 제공하였다. 또한, 효율적인 포장을 위해서는 POD 내에 존재하는 세포 구성요소나 구조물들이 필요하다는 경험적인 결과도 얻게 되었다.

파필로마바이러스 위형은 넓은 범위의 다양한 세포에 감염성을 나타내기 때문에 유전자 전이 부분에 많은 적용을 기대할 수 있다.

IV. 유전자 치료 및 유전자 면역에 이용하는 감염성 파필로마바이러스 위형 입자

유전자 전이는 유전자 치료나 유전자 면역에 있어서, 치료나 면역 목적에 의해 체세포의 유전적 일람(genetic repertoire)에 변형을 주는 의료용 전략이다(참조: Crystal, R.G., 1995, Science 270, 404-410; Mulligan, R.C., 1993, Science 260, 926-932). 특히 유전자 전이에는 한가지 이상의 유전자와 그들의 발현을 조절하는 서열들로 이루어진 발현 카세트를 목적 세포(target cell)로 배달하는 기능을 포함하고 있다. 이 작업은 실험실적 조건에서 카세트를 세포로 옮겨준 다음, 이것에 의해 변형된 세포를 다시 수용자(recipient)에게 부여해주는 방식인 엑스 비보(ex vivo)로 수행될 수 있다. 다르게는, 발현 카세트를 직접적으로 수용자의 세포에 전달시키는 생체 내 조건(in vivo) 방식의 유전자 전이방법을 택할 수도 있다. 두 전략 모두에서, 전이의 과정은 카세트를 그 기능이 적절히 수행될 수 있는 세포로 배달해 주는 벡터의 도움을 받게 된다.

의료적인 목적에 따라 엑스 비보, 혹은 생체 내 조건 전략, 그리고 발현 카세트를 배달할 벡터 등을 선택하게 된다. 의료용 시도들에서 얻어진 결과들로부터 이러한 벡터 시스템들(레트로바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드-리포좀 복합체)은 각기 다른 기작에 의해 발현 카세트를 전이시키며, 이에 따라 각기 다른 장점과 단점, 다른 적용을 가지게 됨을 알 수 있다.

복제 기능이 없는 재조합 레트로바이러스 벡터는 9 kb 까지의 외인성 정보를 담을 수 있다. 레트로바이러스는 그 유전 정보를 목적 세포의 게놈으로 전이시킨다. 유전성(hereditary)이거나 만성 질병의 치료에 이 방법은 효과적이나, 만성적 과발현이나 삽입 돌연변이 등의 가능성으로 인한 위험이 수반된다. 이 방법은 목적 세포가 프로바이랄(proviral) DNA를 게놈 안으로 끼워들이기 위해 반드시 증식해야 한다는 이유 때문에, 벡터를 불활성화하는 민감도에 의해 제한받으며, 또한 재조합, 재정렬, 그리고 낮은 역가 등과 연관되는 생산 문제에 의해서도 제한받는다.

아데노바이러스 벡터의 경우, 현재 7.5 kb의 발현 벡터를 포함할 수 있다. 이 바이러스 벡터의 경우, 높은 역가로 생산되고, 유전자를 복제하거나 하지않는 세포로 효과적으로 전이시켜주기 때문에 다양한 전이방법으로 사용된다. 전이된 유전 정보는 염색체 밖에 존재하므로, 세포의 유전형이나 삽입 돌연변이 등의 위험을 피할 수 있다. 그러나, 현재 사용되는 아데노바이러스 벡터는 비특이적 염증과 항벡터 면역을 유발한다. 이러한 염증 및 면역 반응들과 염색체 밖에 존재한다는 이유 때문에, 발현의 기간은 몇 주에서 몇 달 정도로 제한된다. 그러므로, 항상적인 발현을 위해서는 아데노바이러스 벡터를 주기적으로 재주입 해주어야 한다. 반복되는 주입이 비록 위험을 수반하지는 않을지라도, 벡터 캡시드 단백질들에 대해 생기는 항체들 때문에, 이 벡터를 계속 사용하는 방법의 효과가 떨어질 수 있다.

플라스미드-리포좀 복합체의 경우, 발현 카세트의 크기에 제한을 받지 않고, 감염성 인자들을 형성하도록 재조합되거나 복제하지 않으며, 구성 성분 중 단백질 이 없기 때문에 염증이나 면역 반응을 적게 유도하는 등의 이유로, 이론적으로 유전자 전이에 많은 장점을 가진다. 이 방법의 단점이라면 성공적인 유전자 전이를 수행하기 위해 다량의 플라스미드를 목적 세포에 제공해야만 하는 비효율성이다.

성공적인 유전자 전이를 위해서는 단점이 보완된 완벽한 벡터를 얻어야 한다. 이상적인 벡터는 레트로바이러스 벡터의 삽입 돌연변이에 대한 위험을 줄인 것, 아데노바이러스 벡터의 면역 반응과 염증 유발을 줄인 것, 플라스미드-리포좀 복합체의 유전자의 세포로의 배달 효율을 증진시킨 것 등을 포함하는 것이다.

파필로마바이러스 벡터를 유전자 치료 및 유전자 면역에 사용하는 것은 벡터로서 요구되는 많은 장점을 가지는 것인데, 레트로바이러스 벡터의 특징적인 삽입 돌연변이 위험이 줄어들었고(파필로마바이러스의 특징적인 라이프 사이클 때문에), 아데노바이러스 벡터의 문제인 면역 및 염증 반응의 정도가 최소화되었으며(아래 참조), 플라스미드-리포좀 복합체의 문제인 배달의 비효율성이 극복되었기 때문이다(파필로마바이러스가 동물 바이러스이기 때문에).

파필로마바이러스 벡터의 큰 장점은, 이 바이러스가 아주 다양한 혈청형을 가지기 때문에 중화 항체가 약하게 반응하거나 아예 반응하지 못한다는 것이다. 중화 항체의 존재가 바이러스의 감염을 방해하기 때문에, 다양한 혈청형을 가진다는 것의 의미는, 환자가 파필로마바이러스의 한 혈청형에 대해 중화 항체를 형성하였다 해도 다른 혈청형의 파필로마바이러스를 계속 사용해서 감염을 진행시킬 수 있다는 것이다. 또한, 같은 DNA를 서로 다른 캡시드 타입에서 캡시드화 할 수 있으므로, 유전자 치료나 유전자 면역에 있어서 배달의 제한을 받지 않고 다중 부스 트(boosts)를 수행할 수 있다. 이 때, L1 분자를 바꿈으로써 혈청형을 변화시키는 것이 이상적이지만, L1 뿐 아니라 L2 분자까지 바꾸어야 할 필요가 있을 수도 있다. 비록 L1에 주요 중화 에피토프가 담겨있으나 L2에도 부수적인 중화 에피토프가 있기 때문이다. 이 점은 연속적인 투여 방법에 있어서 중요하게 고려해야 할 점이다.

배달 효율이 증진된다는 동물 바이러스 이용의 장점은 이러한 바이러스가 동물 세포 내에서 반드시 증식해야 한다는 한계 때문에 상쇄되어 왔다. 이러한 증식을 위해서는 비용이 들 뿐 아니라 인간에게 감염성이거나 병원성일 수 있는 다른 바이러스에 의한 오염의 가능성 때문에 위험할 수도 있었다. 파필로마바이러스 벡터의 강점은, 이것이 동물 바이러스라 하더라도 곤충세포나 효모 같은 비동물 세포에서 증식되기 때문에, 동물 바이러스의 장점을 살리는 동시에 이 때문에 수반되는 위험으로부터도 자유롭다는 것이다.

본 발명의 위바이러스성 입자는 유전자 치료와 유전자 면역에 이러한 내용에 있어서 유용하다. 본 파필로마바이러스 벡터는 E2BS-포함 DNA를 기본으로 하고, 바이러스의 다른 유전자를 삭제할 수 있게 되어있다. 발현 벡터가 삽입되면 E2, L1, 그리고 L2 등 바이러스의 포장에 필요한 단백질을 제공하는 세포주로부터 감염성 파필로마바이러스가 생산된다. 발현 카세트를 포함하는 벡터는 특이적인 수용체를 통해 목적 세포에 들어가며, 세포질로 인도되어 그 DNA 게놈과 발현 카세트를 핵 속으로 전이하기 위해 벗겨지고, 핵 속에서 염색체외(epichromosomal) 방식으로 발현을 수행하게 된다(참조: 실시예 7).

어떤 경우에 있어서는, 바이러스 게놈을 안정한 에피솜(episome)으로 유지시키기 위해 필요한 E1을 코드하는 유전자를 파필로마바이러스 벡터에 포함시키는 것이 좋다. 이렇게 하면 바이러스 DNA가 숙주 게놈으로 삽입되는 것을 방지할 수 있다. 물론, 이 때 발현 카세트의 크기는 적절히 조정되어야 한다.

유전자 치료와 유전자 면역을 위해 사용될 수 있는 단백질, 폴리펩타이드, 그리고 펩타이드(당쇄화나 인산화, 아미드화 등에 의해 변형된 것일 수도 있는) 등을 발현하는 유전자를 발현 카세트에 구성하여 이용할 수 있다(아래 참조). 이들의 발현을 조절하는 서열로는 프로모터(예를 들어 RSV 혹은 CMV), 인핸서(enhancer), 리더 펩타이드(leader peptide), 터미네이션과 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호, 스플라이싱(splicing) 신호, 바이러스 레플리콘(replicon), 그리고 선별 마커(selectable marker)를 코드하는 유전자 등이다.

유전자 치료는 유전적인 질병과 심장혈관계에서 암, 에이즈 등 얻어진 질병의 치료에 쓰이는 방법이다. 유전자 치료가 쓰이는 암의 종류는 흑색종(melanoma), 신장 세포(renal cell), 난소(ovarian), 자궁(cervical), 신경체(neuroblastoma), 뇌(brain), 머리와 목(head and neck), 허파(lung), 간(liver), 유방(breast), 대장(colon), 전립샘(prostate), 중피(mesothelioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 다중 골수종(multiple myeloma), 그리고 피부(skin) 등이다. 이 외에 유전자 치료가 쓰일 수 있는 질병은 헤모글로빈 부족증(hemoglobinpathies), 복합 면역결핍증(severe combined immunodeficiency), 혈우병(hemophilias), 가계 고콜레스테롤증(familial hypercholesterolemia), 유전성 기종(inherited emphysema), 낭 섬유화(cystic fibrosis), 근위축증(muscular dystrophy), 라이소좀 저장병(lysosomal storage disease), 가우셔씨 병(Gaucher's disease), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 결핍증(purine nucleoside phosphorylase deficiency), 알파-1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiency), 팔코니씨 빈혈증(Fanconi's anemia), 헌터씨 신드롬(Hunter's syndrome), 만성 과립구 질병(chronic granulomatous disease), 관절염(rheumatoid arthritis), 말초혈관 질병(peripheral vascular disease), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 당뇨병(diabetes), 골다공증(osteoporosis), 만성 상처(chronic wounds), 건선(psoriasis), 그리고 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 등이 있다.

유전자 면역에 있어서는 바람직한 면역 반응의 유도, 항체의 제조나 CTL의 반응을 유도하도록 하는 것이다. 이 방법은 대개 질병에 대한 방어 목적으로 쓰인다. 이 방법이 쓰일 수 있는 곳으로는 바이러스성 질병(예를 들어 바이러스성 인플루엔자(influenza)), 박테리아 질병, 그리고 기생충 질병 등의 감염성 질병이다.

본 발명의 위바이러스성 입자에 의해 이용할 수 있는 유전자는 제한이 없으나, 예를 들어 헤모글로빈 구성요소, 아데노신 디아미나아제(adenosine deanimase), 혈액 응고 인자(예를 들어 Factor VIII, Factor IX), 수용체(예를 들어 LDL 수용체, ACh 수용체, 호르몬 수용체), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포라아제, 알파-1 항트립신, 이온 채널(예를 들어 CFTR), 디스트로핀(dystrophin), 라이소좀 의 효소들, 인슐린, 칼시토닌(calcitonin), 호르몬, 성장인자, 사이토카인(cytokine); 성장 호르몬, 에리스로포에틴(erythropoietin), 파라타이로이드 호르몬(parathyroid hormone), TNF, CSF, IGF, MDR, IL-1, IL-2, IL-4, 인터페론 등의 사이토카인(cytokine), p53; 자살 유전자 산물(예를 들어 헤르페즈 심플렉스 바이러스의 티미딘 카이나아제(thymidine kinase), 사이토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 베르셀라(vericella) 티미딘 카이나아제); 항체들과 이들의 절편들, 주요 조직적합성 복합체의 구성 요소들(예를 들어 HLA-B7)과 부 조직적합체의 항원들; 안티센스(antisense)와 삼중 헬릭스(helix) 인자; 종양유전자; 암 억제 유전자; 바이러스, 박테리아, 기생충의 항원; 연결조직의 단백질(예를 들어 콜라겐, 일라스틴, 피브로넥틴), 그리고 외래 단백질들(예를 들어 라이소좀, BSA)의 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명의 위바이러스성 입자들은 세포를 감염시키는 방법으로 유전자 전이를 수행한다. 이 때, 엑스 비보 접근법도 가능하지만 생체 내 조건 방법이 더 선호된다. 이 방법을 이용하여 바이러스 입자들이 세포 내로 들어가기 위해 요구되는 세포 표면 수용체를 발현하는 어떤 세포에라도 감염은 수행될 수 있다. 상피세포로 파필로마바이러스 위바이러스성 입자가 매개된 유전자 전이를 수행하는 것이 특히 유용하다. 조직(tissue)을 이용하는 것은 바이오리엑터(bioreactor)로서(질병을 치료하기 위해 단백질을 체계적으로 배출하게 함), 또는 조직 자체에 처리하기 위해 고려될 수 있다. 그러한 이유로 상피세포, 특히 세포성 표피(epidermis)를 이용하는 것은 바이오리엑터로 작용할 수 있고, 또는 상피세포나 세포성 표피 자체를 치료하기 위함이다.

본 발명에서의 의약적, 혹은 생물학적으로 활성있는 화합물들은 일반적으로 동물, 특히 인간에게 투여되는 것이다.

이러한 활성 화합물들은 치료에 쓰이는 인자들을 생산하기 위한 종래의 생약학적 방법과 함께 환자들(예를 들어 인간을 포함한 포유류)에게 투여될 수 있게 가공될 수 있다.

본 발명의 화합물들은, 활성 화합물과 상쇄성 반응을 나타내지 않는 범위에서 비경구, 경구, 그리고 국부용으로의 사용에 적합한, 제약학적으로 이용 가능한 유기 및 무기 운반 물질들(carrier substances)과 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 운반 물질로는 물, 염 용액, 알코올, 식물성 오일(oil), 합성 지방 운반체(fatty vehicle) 등이 있다. 제약학적 조제에 있어서도 윤활제, 보존제, 안정제, 등의 보조적 요소들 역시 활성 화합물과 상쇄성 반응을 보이지 않는 범위 내에서 혼합하여 이용할 수 있으며, 조합하여 사용하는 것이 바람직할 경우에 비타민 등의 다른 활성 물질과 같이 사용할 수 있다.

비경구적 적용을 위해서는 현탁액(suspension), 유상액(emulsion), 이식물(implant)의 형태도 가능하고, 주사할 수 있는 무균의 용액, 특히 유성이나 수용성인 형태가 특히 바람직하다. 이러한 조성에 필요하다면 보조적 요소들인 보존제, 안정제, 삼투압 조절을 위한 버퍼, 염 등을 첨가하여 혼합 사용할 수 있다.

경구용 적용을 위해 특히 적당한 형태는 정제, 당의정, 유체, 드롭스, 좌약, 또는 캡슐이다. 또한 시럽, 만능약(elixir) 류의 것들을 가당 운반체(sweetened vehicle)가 이용되는 경우에 사용할 수 있다.

국부용 적용을 위해서는, 이러한 적용에 적당하며, 물보다 더 큰 점도를 가진 운반체를 함유한 분사되지 않는 형태(nonsprayable form), 점성형, 반고형, 또는 고형을 이용할 수 있다. 적당한 조성물으로는 용액, 현탁액, 유상액, 크림, 연고, 파우더, 바르는 약(liniment), 고약(salves), 에어졸(aerosol) 등이 있다. 또한 국부용 적용을 위해 분사되는 에어졸 조제를 사용할 수 있는데, 프레온 등의 가스 분사 물질이 압축되어 있는 용기에 고형 또는 액상형의 불활성 운반 물질과 활성 성분을 같이 혼합하여 사용할 수 있다.

이러한 조성물들은 정맥주사나 경구로, 또는 코나 폐를 통해 투여될 수 있다. 또한 이들은 비경구적 방법이나 피하주사 등으로도 투여할 수 있다. 상피나 세포성 표피에 투여할 때는 충격법(에를 들어 유전자 총)이나 국부요법(예를 들어 유전자 크림)를 이용하고, 테이프를 붙이거나 침투 증진자 사용을 필요에 의해 사용할 수 있다.

특정한 경우에 쓰이는 활성 화합물의 바람직한 양에 대해서는 어떤 화합물이 이용되는가, 어떤 조성물로 조성되었나, 어떤 적용 방법을 택하는가, 어떤 부위인가, 어떤 생물에 처리되는가 등에 의해 다를 수 있음이 양해되어야 할 것이다. 숙주에 대한 투약량은 전통적인 방법의 고려, 즉, 예를 들어 주된 화합물과 알려진 약품의 활성 차이를 관례적으로 비교하거나, 전통적인 제약학적 규약에 의해 결정할 수 있다.

파필로마바이러스 벡터를 유전자 전이, 그리고 이러한 견지에서 유전자 치료 및 유전자 면역에 이용함으로써 수반되는 유용성은 강력한 것이다. 또한 이 기술을 이용한 치료법과 예방법 또한 혁신적이라 할 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 자명하다.

실시예 1:

시약: BEHE-1 세포는 A. Lewis(NIH, Bethesda)로부터 얻었다(참조: Zhang, Y.L., et al., 1987, J. Virol. 61, 2924-2928). C127 클론 C 세포는 W. Vass(NIH, Bethesda), BHK-21 세포는 ATCC로부터 구하였다. VLP들에 대한 모든 항혈청(참조: Roden, R.B.S., et al., 1996, J. Virol. 70, 3298-3301)과 단일클론 항체에 대해서는 이미 기술한 바 있다(참조: Cowsert, L.M., et al., 1988, Virology 165, 613-15; Roden, R.B.S., et al., 1994, J. Virol. 68, 7570-74). SFV 발현 벡터를 포함한 모든 시약들은, 따로 설명하지 않았다면 모두 라이프 테크놀로지(Life Technologies Inc., Gaithersburg)로부터 구입하였다.

재조합 pSFV-1 플라스미드의 제조: 내부의 Spe I 부위를 없애기 위해, Bam HI-절단체로부터 두개의 다른 반응을 통해 PCR 방법으로 BPV L1을 증폭시켜 다시 BPVpML DNA로 연결시켰다. 이 때 사용한 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)는 CCGCTGGATCCCACTATTATATAGCACCATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAG (서열번호 1.)와, CAGTTGAGACTAGAGAGCCAC (서열번호 2.)로 한 반응을, 그리고 GTGGCTCTCTAGTCTCAACTG (서열번호 3.)와 GCGGTGGATCCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGGAAGTTTTTTGGC (서열번호 4.)로 다른 반응을 수행하였다. PCR 산물들은 젤에서 정제되어 혼합하였으며, 전체 길이 L1 유전자가 바깥쪽 프라이머에 의해 재증폭되었다. 이 PCR 산물(약 1.5kb)은 젤 정제되었고, Bam HI으로 절단된 후 pSFV-1의 Bam HI 부위로 클로닝되었다(참조: Liljestrom, P., and Garoff, H., 1991, BioTechnology 9, 1356-1361). 올바른 방향성 및 Spe I 부위가 없어졌는지의 여부, 그리고 증폭시의 오류는 염기서열 분석을 통해 확인하였다. GCGGTAGATCTAATATGAGTGCAGGAAAAAGAGTAAAACGTGCCAGT (서열번호 5.)와 CCGCTAGATCTAGGGAGATACAGCTTCTGGCCTTGTTGCCACAACGC (서열번호 6.)을 프라이머로 이용하여 Bam HI-절단체로부터 BPV L2를 PCR로 증폭시켜 다시 BPVpML로 연결하였다. 증폭 산물(약 1.5 kb)은 젤 정제되었고 Bgl II로 절단되어 pSFV-1의 Bam HI 부위에 클로닝되었다. 야생형(114/K)과 캡시드 조립 불량 돌연변이(pAT) HPV16 L1의 경우, pEVmod를 Bgl II로 절단하여 얻었고 이를 pSFV-1에 다시 클로닝하였다. HPV16 L2의 경우는 pEVmod 벡터로부터 얻어 pSFV-1.NruI(Spe I가 아닌 Nru I을 이용해 선형화되는)의 Bam HI 부위에 재클로닝하였다. 모든 플라스미드는 대장균 HB101을 알칼리 분해하여, 세슘 클로라이드 이소피닉 밀도차 원심분리 (cesium cloride isopynic density centrifugation) 방법으로 정제하였다.

재조합 SFV 저장물(stock)의 제조: Spe I(pSFV-1.NruI이 기본인 클론인 경우에는 Nru I)을 이용하여 재조합 pSFV-1 클론과 pHelper-2(참조: Berglund, P., et al., 1993, BioTechnology 11, 916-920) 플라스미드를 선형화시켰다. DNA들은 페놀/클로로포름으로 추출되어 에탄올 침전되었다. SFV RNA를 제조하기 위하여, 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 0.5 mM GTP, 1 mM RNA 캡핑 유사체 m7G(5')ppp(5')G, 5 mM DTT, 100U 인간 태반 RNase 저해제, 1x SP6 반응 버퍼 속의 75U SP6 RNA 폴리머라아제를 함유한 100 ㎕의 반응액에 1 ㎍씩의 선형화된 pSFV-1 클론과 pHelper-2를 넣어주었다. 반응 혼합액을 37℃에서 1시간 동안 방치한 후, 이 중 2.5 ㎕를 0.7% 아가로오즈 젤에서 분석하여 SFV RNA의 완전함을 확인하였다. 나머지의 RNA는 1 ㎖의 OptiMEM 배양액에 희석하였고, 1 ㎖ OptiMEM 배양액 속의 100 ㎕ 리포펙틴(Lipofectin)과 혼합한 후 실온에서 15분간 방치하였다. T-75 플라스크 안의 BHK-21 세포는 세척하여 준 후, 2 ㎖의 OptiMEM으로 덮어주었다. 다음으로 RNA/리포펙틴 혼합액을 세포에 가하였고 이 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이 세포를 세척하여 24시간 동안 13 ml의 완전 배양액(5% 소태아혈청, 10% 트립토우즈 포스페이트 브로쓰, 10 mM 헤페즈 pH 7.4, 1x 비필수 아미노산, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 글라스고우(Glasgow's)의 MEM). 이후 배양액을 모아 원심분리(1000 x g, 10분)하여 상층액만을 -80℃에 보관하였다.

BPHE-1 세포에서 파필로마바이러스의 제조: 재조합 SFV 저장물을 얼음 위 에서 30분 동안 0.5 mg/㎖ 키모트립신(chymotrypsin) A4(Boehringer Mannheim)와 반응시키고, 0.5 mg/㎖의 아프로티닌(aprotinin)(Sigma)을 처리하여 감염성을 얻게 활성화시켰다. 4 x 10⁶ BPHE-1 세포들을 100 mm 조직 배양 플레이트 위에서 10% 소태아혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 그리고 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배양액으로 12-20시간 동안 유지시킨 후, D-PBS(0.9 mM 칼슘과 0.5 mM 마그네슘을 함유한)로 세척해 주었다. 이 세포들은 D-PBS 25㎖에 희석된 활성화된 재조합 SFV(최고의 발현량을 보이도록 적정된, 그러나 각 고 역가 저장물로부터 약 0.5 ㎖)와 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 이 바이러스는 다시 빨아내어 제거되었고, 세포는 완전 배양액에서 30시간 동안 유지되었다. 다음으로 세포들을 긁어내어 배양액에 모았고, 원심분리하여(1000 x g, 10분) 펠렛을 1㎖ D-PBS에 재현탁시켰다. 이 세포들은 소니케이션으로 파쇄하였다(Fischer 모델 150 소닉 막제거기의 마이크로팁을 이용, 60% 세기로 10초).

실험실적 조건의 병소 형질전환 측정법: 세포 분해물을 C127 클론 C 세포가 단일층으로 깔려있는 60 mm 조직 배양 플레이트의 배양액(10% 소태아혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM)에 첨가하였다. 이 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양 후, 세척하고 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM에서 3주 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 메탄올 안의 0.5%(무게/부피) 메틸렌 블루, 0.25%(무게/부피)의 카볼 푸스킨(carbol fuschin)로 염색하여 병소의 수를 세 었다(참조: Dvoretzky, I., et al., 1980, Virology 103, 369-375).

동물세포로부터 입자들의 정제: VLP들을 준비하기 위해 재조합 SFV로 감염 후 3일 동안 BHK-21 세포를 유지시켰다. 비리온의 제조를 위해서는 BPHE-1 세포의 경우, 재조합 SFV로 감염 후 30시간 동안만 유지시켰다. 열 장의 500 ㎠ 세포 배양 플레이트 세포들을 긁어 배양액에 모은 후, 원심분리(1000 x g, 4℃에서 10분)하여 5 ㎖의 얼음 온도의 PBS에 재현탁시켰다. 세포들을 소니케이션으로 파쇄하고(60% 세기로 1분) 0.5% NP-40를 처리하였다. 이 추출물을 30 ㎖의 PBS 속 40% 수크로오즈 쿠션 위에 얹고 4℃, 80,000 x g에서 150분 동안 원심분리하였다. 다시 펠렛을 12 ㎖의 PBS 속 27%(무게/무게) 세슘 클로라이드에 현탁시켜 275,000 x g에서 20시간 동안 원심분리하였다. 이 이소피닉 밀도 구배를 분획하여 각 분획의 밀도를 Abbe3L 굴절계(Milton Roy, Rocherster, N.Y.)로 조사하였다(참조: Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36).

서던 블랏 분석: 세슘 클로라이드 구배 시료를 2.5배 에탄올과 혼합하여 -20℃에서 하루동안 저장시켰다. 이 시료를 원심분리(16,000 x g, 4℃에서 10분)하고 70% 에탄올로 세척 후, TE 버퍼(10 mM Tris와 1 mM EDTA, pH 8)에 녹였다. 각 시료에 프로테이나아제 K를 처리하고, 페놀/클로로포름 추출 후 다시 TE에 현탁시켰다. 시료를 0.8% 아가로오즈 젤에 전개시켜 나일론 멤브레인(Hybond N, Amersham)으로 옮긴 후, UV로 고정(12 μJ, UV Autocrosslink 1800, Stratagene)시 켰다. BPV DNA를 BPVpML의 Spe I-Kpn I 절편을 무작위적으로 [³²P]-표지시킨 프로브로 높은 스트린전시(high stringency) 조건에서 탐지하였다(참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

전자현미경: 5 ㎕의 시료를 카본-협착된 구리 격자에 붙여 1%(무게/부피)의 우라닐 아세테이트로 염색하고, Philips EM400RT 전자현미경을 이용하여 100KV에서 전파 전자현미경 조사를 하였다. 냉각-전파현미경의 경우는 카본-협착 구리 격자 위의 시료를 15분 동안 돌려주고 액체 에탄으로 얼린 후, Philips EM400RT 전자현미경을 이용하여 100KV에서 조사하였다(참조: Booy, F.P., et al., 1991, Cell 64, 1007-1015).

실시예 2:

항체: BPV E2 단백질에 대한 단일클론 항체 B201과 BPV E1 단백질을 인식하는 다중클론 항혈청 150-1은 Dr. Elliot Androphy(New England Medical Center, Tufts University School of Medicine)에 의해 제공되었다. BPV L1 캡시드 단백질에 대한 단일클론 항체 5B6와, 전체 길이 BPV L2 캡시드 단백질에 대한 토끼 다중클론 항혈청 17/28에 대해서는 이미 기술한 바 있다(참조: Roden, R.B.S., et al., 1994, J. Virol. 68, 7570-74). BPV L2에 대한 단일클론 항체 6A8은 A. Bennett Jenson(Georgetown University)에 의해 제공되었다(참조: Jin, X.W., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1133-40). SC35에 대한 항체는 시그마(Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 항-PML 항체인 5E10은 R. van Driel(University of Amsterdam)에 의해 제조된 것으로 Dr. Louis Staudt(NCI, NIH)가 제공해 주었다(참조: Stuurman, N., 1992, J. Cell. Science 101, 773-84). FITC-결합의 염소 항-쥐 IgG와 Texas-red-결합의 염소 항-토끼 igG는 Jackson Immunoresearch(West Grove, PA)로부터 구입하였다.

세포주: A. Lewis(NIH, Bethesda)로부터 얻은 BPHE-1 세포는 항생제와 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM에서 배양하였다(참조: Zhang, Y.L., et al., 1987, J. Virol. 61, 2924-2928). ATCC로부터 구한 BHK-21 세포는 5% 소태아혈청, 10% 트립토우즈 포스페이트 브로쓰, 10 mM 헤페즈 pH 7.4, 1x 비필수 아미노산, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 글라스고우(Glasgow's)의 배양액으로 배양하였다. 현미경 관찰을 위해서는 세포들을 24 웰 플레이트 속의 산으로 세척한 #01 커버슬립 위에 웰 당 1x10⁵의 밀도로 접종하여 약 12시간 동안 배양하였다.

재조합 셈리키삼림바이러스(semliki forest virus) 발현 시스템: 재조합 SFV RNA의 생산, BPV L1 및 L2 캡시드 단백질을 발현하는 복제 결핍성 바이러스의 생산 및 SFV 감염의 방법을 이 곳에 기술한다. BPV 게놈으로부터 PCR 증폭을 통해 얻은 BPV E1과 E2를 pSFV-1의 Bam HI 부위로 클로닝하였다. E1의 증폭에 사용한 프라이머는 5'CCGCTGGATCCGCACCATGGCAAACGATAAAGGTAGC (서열번호 7.)과 3'GCGGTGGATCCGATCTTGCAACTTATCACTAC (서열번호 8.)이었고 E2 증폭의 경우는 5'CCGCTGGATCCGCACCATGGAGACAGCATGCGAACG (서열번호 9.)와 3'GCGGTGGATCCGAAGAAAAGGCAATGGCAGTG (서열번호 10.)를 이용하였다. L1 및 L2의 경우에 기술한 것과 같이, 각 유전자를 발현하는 재조합 바이러스들이 제조되었다. 높은 역가의 재조합 SFV 저장물을 얼음 위에서 30분 동안 0.5 mg/㎖ 키모트립신(chymotrypsin) A4(Boehringer Mannheim)와 반응시키고, 0.5 mg/㎖의 아프로티닌(aprotinin)(Sigma)을 10분 동안 처리하였다. 이렇게 활성화된 바이러스는 칼슘과 마그네슘이 1/100씩 포함된 둘베코의 PBS에 희석된 후, 24 웰 플레이트에 첨가되었다. 37℃에서 60분이 경과한 후, 바이러스가 포함된 배양액을 제거하고, 세포에서 감염에 따른 단백질이 발현되도록 100 mM 염화칼륨이 부가된 정상 성장 배지로 바꿔주었다. 세포 고정과 면역배치화 전 5-6시간 동안 이러한 감염 과정이 게속되도록 하였다. 비록 SFV 감염 후 48시간이 지나면 세포가 사멸하였지만, 감염 후 시간이 많이 흐르지 않은 상태에서의 세포의 모양은 별다른 변화를 나타내지 않았다.

면역형광 염색: 차가운 PBS pH 7.4로 세 번 세포를 씻어주고 PBS에 희석된 1.0% 파라포름알데히드에 실온에서 10분 동안 방치하여 세포를 고정시킨 후, PBS/200 mM 글라이신으로 세 번 세척하였다. 다음으로, 세포를 PBS/0.1% 폴리옥시에틸렌 20 세틸에테르(polyoxyethylene 20 cetyl ether, Brij)(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)에 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 방치시켰다. 다중클론 항혈청의 경우, 1/1000으로 희석 사용하였고, 하이브리도마 상층액으로 사용한 단일클론 항체는 1/100으로 희석 사용하였다. 정제된 항체는 5 ㎍/㎖의 농도로 이용하였다. 이중 면역형광 염색에서는 일차 항체들을 동일한 조건으로 반응시켰다. 반응이 끝난 후엔 커버슬립을 PBS/0.1% Brij로 3 회 세척하였다. 이차항체를 5 ㎍/㎖ 되도록 PBS/0.1% Brij에 희석하였고 반응은 4℃에서 진행시켰다. 이 반응이 끝난 후, 세포를 PBS/0.1% Brij로 세척하였고, 유리 슬라이드 위에 플로로마운트-G 마운트 용액(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)을 이용하여 붙였다. Zeiss Axioplan 현미경에 장착된 BioRad MRC 1024 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템으로 형광을 조사하였으며, 모든 영상들은 광입자 산출 모드로 Zeiss 63x N.A. 1.4의 플라나포 객체(planapo objective)를 이용하여 얻었다. 대조군의 커버슬립은 녹색과 적색 채널의 형광이 겹쳐지지 않으며 항체의 항원으로의 결합이 특이적인 것으로 지정하였다. 아도브 포토샵 프로그램을 이용하여 모든 영상들을 조합, 재조정하였다.

형광 인 사이투 하이브리다이제이션(Fluorescent in situ hybridization, FISH): BPV 게놈의 상위 조절 지역에 대한 프로브(7173-28)를 PCR 증폭하였다. 증 폭에 이용된 프라이머는 5' 올리고로서 CGGC AAGCTTGCAATGTGCTGTGTCAGTTG (서열번호 11.), 3' 올리고로서 CGCG AAGCTTAACGGTGATGGTGTGATTAT (서열번호 12.) 였다. Hind III 클로닝 부위는 굵게, BPV 서열의 겹침은 밑줄로 나타낸 것이다. 이 때, PCR 반응은 PCR 산물에 형광이 표지된 dUTP가 삽입되어지는 형광 표지 혼합체(Boehringer Mannheim Indianapolis, IN)를 사용하여 수행하였다. 세포는 10분 동안 실온에서 5 mM 염화마그네슘이 포함된 2% 파라포름알데히드/PBS 용액으로 고정시켰다. PBS/200 mM 글라이신으로 3 회 세척한 후, PBS 속 0.2% 트라이톤X-100(부피.부피)을 5분 동안 처리하여 투과성을 주었고 다시 PBS로 세척하였다. 하이브리다이제이션을 수행하기 직전에 세포들을 2X SSC(1X SSC는 150 mM 염화나트륨과 15 mM 염화 사이트레이트이다)로 실온에서 세척해 주었다.

표지된 프로브(150 ng/커버슬립)를 1X SSC에 최종 부피 10 ㎕가 되도록 넣어 진공으로 말려 주었다. 이 프로브를 7 ㎕의 100% 탈이온화된 포름아마이드에 현탁시켜 5분 동안 90℃로 가열하였다. 여기에 7 ㎕의 하이브리다이제이션 버퍼를 혼합해주어 최종 농도가 50% 포름아마이드, 2X SSC, 1X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트, 그리고 50 mM 트리스 pH 7.5가 되게 하였다. 이 혼합액을 재빨리 커버슬립에 옮겨 유리 슬라이드 위에 뒤집어지게 하였고, 1 mm의 사이를 둔 두번째 유리 슬라이드를 덮어 파라필름(American National Can, Greenwich, CT)으로 밀봉한 후, 90℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이 슬라이드는 다시 37℃ 배양기로 옮겨져 약 12시간 동안 반응되었다. 반응이 끝난 후, 커버슬립은 여러 회에 걸쳐 37℃에서 60분 동안 50% 포름아마이드/2X SSC, 37℃에서 30분 동안 2X SSC, 그리고 실온에서 30분 동안 2X SSC로 바꿔가며 세척하였다.

단백질 배치화 실험이 요청될 경우에는, 마지막 하이브리다이제이션 후의 세척이 끝난 후 상기한 방법에 의해, 하지만 디터전트(detergent)를 사용하지 않고, 항체 염색을 수행하였다.

실시예 3:

BPV 게놈의 제조: 원형 BPV DNA를 생산하기 위해, 유일한 Bam HI 부위로 BPV 게놈이 클로닝된 BPVpML 플라스미드 DNA의 세슘 클로라이드 정제물을 Bam HI으로 절단하고 페놀/클로로포름 추출, 침전시켰다. 이 DNA를 0.05 Weiss 단위/㎍의 T4 DNA 라이게이즈를 포함하는 500 ㎍/㎖의 라이게이션 버퍼(50 mM 트리스-염산 pH7.6, 5 mM 염화마그네슘, 1 mM ATP, 1 mM DTT)에 현탁시켜 16℃에서 약 12시간 동안 반응시켜 BPV 게놈이 자가적으로 연결되도록 하였다. 연결된 DNA는 에탄올로 침전되었고, 1 ㎍/㎖의 농도로 맞춰져 TE 버퍼 속에서 약 12시간 동안 현탁되었다.

BPV 말기(late) 그리고/또는 전기(early) 유전자를 발현하는 배큘로바이러스의 제조: BPV L1 단독, L2 단독, 또는 L1과 L2(L1 + L2)를 동시에 발현하는 배큘로바이러스(참조: Summers, M.D., and Smith, G.E., 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures. Bulletin No. 1555, Texas Agricultural Experiment station, College station, Texas)에 대해서는 이미 기술한 바와 같다(참조: Kirnbauer, R., et al., 1993, J. Virol. 67, 6929-36). BPV E1을 발현하거나(참조: Blitz, I.L. and Laimins, L.A., 1991, J. Virol. 65, 649-656) E2를 발현하는(참조: Monini, P., et al., 1993, J. Virol. 67, 5668-5676) 배큘로바이러스의 경우는 Elliot Androphy(New England Medical Center, Boston, MA)로부터 얻었다.

곤충세포에서 파필로마바이러스의 제조: 감염 전, Sf9 세포를 10% 소태아혈청과 0.01%(부피/부피)의 플루오닉 (fluronic) F-68이 포함된 그레이스(Grace's) 배양액에 담아 스피너 플라스크에서 27℃를 유지하며 배양하였다. 원심분리(300 x g, 5분)로 세포를 수득하여 10⁶/㎖의 농도로 무혈청 그래이스 배양액에 재현탁시켰다. 3x10⁶ 개의 Sf9 세포를 60 mm 조직 배양 플레이트에 접종하여 30분 동안 달라붙도록 하였다. 각 플레이트에 대하여, 1 ㎖의 무혈청 그래이스 배양액 속의 15 ㎍ BPV DNA(연결된)와 1 ㎖의 무혈청 그래이스 배양액 속의 35 ㎕ 리포펙틴을 폴리스티렌 튜브에서 혼합하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 세포 배양 플레이트의 배양액을 빨아내어 제거하고, 상기한 2 ㎖ 무혈청 그래이스 배양액 속의 DNA/리포펙틴 복합체로 바꿔주었다. 세포를 4시간 동안 27℃에서 배양 후 배양액을 빨아냈고, 다양한 조합의 L1, L2, E1, 및 E2를 발현시키는 재조합 배큘로바이러스(MOI 약 10) 33 ㎕를 2 ㎖의 무혈청 그래이스 배양액에 담아 세포에 처리해 주었다. 감염 1시간 후, 이 배양액을 제거해 주었고 10% 소태아혈청, 100 U/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 5 ㎖의 그래이스 배양액으로 교체해 주었다. 세포 를 27℃, 습한 곳에서 72시간 동안 배양하였으며, 플레이트로부터 긁어내어 수득하였다. 플레이트를 다시 PBS로 세척하여 남아있는 세포들을 모았으며, 원심분리(300 x g, 5분) 후 상층액을 버리고 펠렛을 -80℃에 저장하였다.

실험실적 조건의 병소 형질전환 측정법: 감염성 BPV의 생산을 시험하기 위하여, 표준 방법의 병소 형질전환 측정법을 C127 세포에서 수행하였다(참조: Dvoretzsky, I., et al., 1980, Virology 103, 369-375). 1 ㎖의 D-PBS(0.9 mM 칼슘과 0.5 mM 마그네슘이 포함된)를 각 펠렛에 넣어주고 얼음 위에서 소니케이션(Fischer 모델 150 소닉 막제거기의 마이크로팁을 이용, 60% 세기로 15초)으로 파쇄시켰다. 중화 실험을 위해서는 이 단계에서 항체를 넣고 1시간 동안 얼음 위에서 반응시켰다. 세포 분해물을 5 ㎖의 배양액(10% 소태아혈청, 100 U/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 넣어 37℃, 습윤 상태의 5% 이산화탄소/95% 공기인 배양기에서 유지한 DMEM)과 혼합하여 60 mm 플레이트에서 낮은 페세지(passage)로 꽉 차게 자란 쥐 C127 클론 C 세포 위에 도말하였다. 37℃ 배양 1시간 후, 세포를 세척해 주었고 새로운 배양액을 첨가하였다. 다음날 배양액을 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM으로 교환해 주어 2-3주 동안 자랄 수 있게 하였고, 주 당 두번씩 배양액을 교환해 주었다. 병소들은 메탄올 속의 메틸렌 블루(Sigma, M9140)와 카볼 푸스킨(Sigma, C-4165)으로 염색하여 염색된 병소들의 수를 측정하였다.

실시예 4:

HPV16에 대해 이곳에 기술한 방법을 이용하여 다른 파필로마바이러스의 감염성 위형을 제조하였다. HPV11 DNA 클론을 분리하여 HPV11 게놈을 얻었다. HPV18의 유전자로부터 E2, L1, 그리고 L2를 발현하는 배큘로바이러스도 준비되었다. Sf9 곤충세포를 HPV11 게놈으로 트랜스펙션시킨 후, E2, L1, 그리고 L2를 발현하는 배큘로바이러스로 감염시켰다. HPV18{HPV11} 위형의 제조를 위한 조건이 제공되었으며, 이에 따라 입자들이 회수되었다. 감염성 위형들의 생산을 확인하기 위해서는, 배양된 동물세포가 HPV18 비리온으로 감염될 수 있는지로 판별하였다. 실험실적 조건의 감염 측정법이 다음으로 이 세포들에 대해 행해졌다. 비록 병소의 형질전환이 마지막 확인점은 아닐지라도, 감염의 확인은 빠르고 간단하게 파필로마바이러스 게놈으로 삽입될 수 있는 마커를 도입시키는 것으로 가능하였다. 형질전환이 트랜스펙션에 의해서 일어나는지, 아니면 감염에 의해 일어나는지를 알아보기 위해 중화 실험을 실시하였다. HPV18 비리온에 대한 중화 항체가 만들어졌다. HPV18{HPV11} 위형들을 이 중화 항체로 미리 반응시키고 세포에 투여하였다. 이런 중화 단계에 의해 감염성이 없어질 경우, HPV18{HPV11} 비리온에 의해 트랜스펙션이 아닌 감염이 일어나는 것으로 판단하였다.

실시예 5:

파필로마바이러스 VLP들은 파필로마바이러스 감염에 대한 백신으로 좋은 후보들인데, 이는 잠재적인 종양유전성 바이러스 게놈이 없으면서 비리온 표면에 에 피토프를 나타내기 때문이다. 감염성 파필로마바이러스에 대하여 높은 역가의 형-특이적인 중화 항체를 유도하기 때문에 VLP들의 이런 잠재성이 입증된다. 또한 높은 농도로 파필로마바이러스를 실험적으로 감염시키는 경우에 대해서도 VLP들로 면역시켰을 경우에, 생체 내 조건에서 형-특이적인 방어를 수행할 수 있었다. 여기에 기술한 대로, HPV16 등과 같은 고위험성 HPV들에 대해 직접적으로 중화 항체를 측정할 수 있는 실험실적 조건의 측정법이 현재 개발된 것이다. 이것을 위해 HPV16 비리온을 실험실적 조건 내에서 제조하는 것과 감염성을 측정하기 위한 실험실적 조건의 정량적 측정법이 필요하다. 이 측정법이 이곳에서 사용되었는데, 예를 들어 파필로마바이러스 감염에 대해 파필로마바이러스 VLP들로 면역 백신을 시도하여 그 중화 항체의 제조 여부를 확인하거나, 중화 항체의 역가가 방어 기작의 정도와 거의 비례하기 때문에, 예전에 개발된 면역 백신의 방어력을 시험할 때 등이다. 비록 병소의 형성에는 2-3주의 기간이 필요하지만, 이 문제는 파필로마바이러스의 게놈으로 빠르고 간단하게 탐지할 수 있는 마커를 도입시킴으로써 해소할 수 있다. 이에 따라, BPV 게놈과 같은 대부분의 바이러스 게놈은 베타-갈락토시다아제 (β-galactosidase)로 치환되고, 효율적인 캡시드화를 위해 필요한 E2 결합 부위 등의 시스로 작용하는 인자(cis-element)들만이 남겨진다. 이러한 예에서는 BPV 게놈이 HPV16 L1과 L2 구조단백질에 의해 캡시드화되어 HPV16{BPV1/β-galactosidase} 위형 비리온이 된다. HPV16 VLP들을 이용하여 HPV16 감염에 대한 면역 백신을 시도하는 것은 HPV16에 대한 중화 항체를 확인하여 알 수 있다. 백신을 투여받은 이로부터 얻은 시료를 HPV16{BPV1/β-galactosidase} 위형 비리온과 혼합한다. C127 세포를 HPV16{BPV1/β-galactosidase}로 감염시키면 감염이 색의 변화로 나타나 3-4일 안으로 실험실적 조건의 중화 실험을 수행할 수 있게 한다. 중화 항체는 감염성을 저해할 것이다. 그러므로 중화 항체의 존재 여부는 중화 항체가 없는 대조군의 시료에서 얻어진 감염성 정도를 시료에서 나타나는 감염성 정도와 비교하여 알아낼 수 있다. 또한 중화 항체의 농도는, 중화 항체의 농도를 아는 대조군의 시료에서 얻어진 감염성 정도를 시료에서 나타나는 감염성 정도와 비교하여 알아낼 수 있다. 백신을 투여받은 자의 중화 항체가 줄어드는 것으로써 HPV16 VLP 백신의 부스터 접종이 필요한 것을 알아낼 수 있다.

실시예 6:

다음은 감염성 헤르페즈 바이러스 위바이러스 비리온을 비동물세포에서 준비하는 실험실적 조건의 방법이다. 헤르페즈 바이러스 DNA 클론을 분리하여 헤르페즈 바이러스 게놈을 얻는다. 발현 카세트는 클로닝된 DNA를 적절히 코드되도록 준비된다. 헤르페즈 바이러스 벡터 DNA를 얻기 위한 포장 신호들은 유지시키면서 바이러스의 유전자를 발현 카세트로 치환한다. 비워진 캡시드로 바이러스 게놈을 포장하기 위한 비구조 단백질들과 헤르페즈 바이러스의 구조단백질들을 발현하는 배큘로바이러스가 다음으로 준비된다. Sf9 곤충세포가 헤르페즈 바이러스 벡터 DNA에 의해 트랜스펙션되고, 뒤이어 비구조단백질 및 구조단백질을 발현하는 배큘로바이러스에 의해 감염된다. 헤르페즈 바이러스 위형을 만들기에 적당한 조건이 제공된 후, 비리온들이 회수된다. 감염성 비리온들이 생산되었는지를 알아보기 위해서 는, 배양된 동물세포가 야생형 비리온들에 의해 감염될 수 있는지를 확인하면 된다. 이 세포들을 이용하여 다음으로 실험실적 조건의 감염성 측정법을 수행한다. 감염은 클로닝된 DNA에 의해 코드된 단백질의 생산을 확인하는 것으로 판단할 수 있다. 형질전환이 트랜스펙션에 의해서 일어나는지, 아니면 감염에 의해 일어나는지를 알아보기 위해서는 중화 실험을 수행하면 된다. 중화 항체는 야생형의 비리온에 대하여 제조된다. 헤르페즈 바이러스 위형을 이러한 중화 항체와 반응시키고 세포에 투여한다. 이런 중화 단계에 의해 감염성이 없어졌다면 위형 비리온에 의한 트랜스펙션이 아닌 감염이 나타날 것이다. 중앙 신경 시스템(central nervous system)을 지닌 동물세포에 클로닝된 DNA를 전이시키려 할 때, 이러한 감염성 헤르페즈 바이러스 위바이러스 비리온을 사용할 수 있다.

실시예 7:

다음은 얼굴의 잔주름을 치료하는 의료용 방법이다. HPV1 DNA를 분리하여 HPV1 게놈을 얻는다. 피부의 연결조직에서 발견되는 일라스틴(elastin)의 선인자인 프로일라스틴(proelastin)이 적절히 코드되도록 발현 카세트를 준비한다. HPV1 벡터 DNA를 얻기 위한 E2BS를 유지한 채, 바이러스 유전자를 이 발현 카세트로 치환한다. HPV1의 E2, L1, 그리고 L2 유전자가 발현되는 배큘로바이러스를 준비한다. 다음으로 Sf9 세포가 HPV1 벡터 DNA로 트랜스펙션되고 이어서 E2, L1, 그리고 L2 유전자가 발현되는 배큘로바이러스가 감염된다. HPV1{HPV1/elastin} 위형이 생성되는 조건을 제공하고 입자들을 회수한다. 감염성 비리온들이 생산되었는지를 알아보기 위해서는, 배양된 동물세포가 HPV1 비리온에 의해 감염될 수 있는지를 확인하면 된다. 이 세포들을 이용하여 다음으로 실험실적 조건의 감염성 측정법을 수행한다. 감염의 여부는 클로닝된 DNA에 의해 일라스틴이 생산되는가를 확인하여 알 수 있다. 형질전환이 트랜스펙션에 의해서 일어나는지, 아니면 감염에 의해 일어나는지를 알아보기 위해서는 중화 실험을 수행하면 된다. HPV1 비리온에 대한 중화 항체가 제조된다. HPV1 위형들을 이러한 중화 항체와 반응시키고 세포에 투여한다. 이런 중화 단계에 의해 감염성이 없어졌다면, 트랜스펙션이 아닌 감염이 HPV1{HPV1/elastin} 비리온에 의해 나타날 것이다. 감염성 HPV1{HPV1/elastin} 입자들은 크림의 형태로 조성할 수 있다. 이 크림은 환자의 얼굴에 국부적으로 적용할 수 있다. 선택된 바이러스의 특정한 투여량은, 농도를 높였을 때 유전자 전이의 효율이 너무 크게 증가하지 않으며, 농도를 줄였을 때 유전자 전이의 효율이 심각하게 줄어들지 않는 범위의 의료용 시도를 통해 결정할 수 있다. 바이러스 투여 10일 정도 후에 얼굴의 잔주름이 줄어드는 정도를 환자에게서 확인하며, 필요한 정도에 따라 크림을 다시 투여할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 해당 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술이 단지 본보기일 뿐이며 제한된 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 본 발명의 실질적인 범위는 덧붙여진 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의되어 있다. 그러므로 여기에 인용된 모든 참고문들은 명백하게 참고로서만 이용된 것이다.

<110> The Government of the United States of America <120> INFECTIOUS PAPILLOMAVIRUS PSEUDOVIRAL PARTICLES <150> US 60/022,104 <151> 1996-07-17 <160> 12 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 1 ccgctggatc ccactattat atagcaccat ggcgttgtgg caacaaggcc ag 52 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 2 cagttgagac tagagagcca c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 3 gtggctctct agtctcaact g 21 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 4 gcggtggatc cttatttttt tttttttttt gcaggcttac tggaagtttt ttggc 55 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 5 gcggtagatc taatatgagt gcaggaaaaa gagtaaaacg tgccagt 47 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 6 ccgctagatc tagggagata cagcttctgg ccttgttgcc acaacgc 47 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 7 ccgctggatc cgcaccatgg caaacgataa aggtagc 37 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 8 gcggtggatc cgatcttgca acttatcact ac 32 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 9 ccgctggatc cgcaccatgg agacagcatg cgaacg 36 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 10 gcggtggatc cgaagaaaag gcaatggcag tg 32 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 11 cggcaagctt gcaatgtgct gtgtcagttg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single stranded oligonucleotide primer <400> 12 cgcgaagctt aacggtgatg gtgtgattat 30

Claims (20)

1. (a) E2 결합부위 및 외래 유전자와 외래 유전자의 발현조절 서열을 포함하는 발현카세트를 포함하는 파필로마바이러스 벡터 DNA; 및,

   (b) L1 및 L2 구조단백질을 포함하여 파필로마바이러스 벡터 DNA를 캡시드화하는 파필로마바이러스 캡시드를 포함하는(이때, 외래 유전자와 L1 구조단백질은 각각 서로 다른 생물종으로부터 유래하고, 발현카세트에 포함되는 외래 유전자는 치료효과 또는 면역효과를 갖는 산물을 암호화한다),

   감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자.
2. (a) 파필로마바이러스의 E2 DNA 결합단백질과 L1 및 L2 구조단백질을 발현하는 세포주를 제공하는 단계;

   (b) 세포주를 외래 유전자와 외래 유전자의 발현조절 서열을 포함하는 발현카세트 및 E2 DNA 결합단백질에 대한 동종(cognate)의 결합부위인 E2 결합부위를 포함하는 파필로마바이러스 벡터 DNA로 형질전환시키는 단계(이때, 발현카세트에 포함되는 외래 유전자는 치료효과 또는 면역효과를 갖는 산물을 암호화한다);

   (c) L1 및 L2 구조단백질을 포함하는 캡시드에 의해 파필로마바이러스 벡터 DNA를 캡시드화하여 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 생성하기 위한 조건을 제공하는 단계; 및,

   (d) 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 수득하는 단계를 포함하는,

   감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서,

   세포주는 동물세포주, 곤충세포주, 또는 효모세포주인 것을 특징으로 하는

   방법.
4. 제 1항의 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 포함하는 세포주.
5. (a) 제 1항의 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자를 제공하는 단계; 및,

   (b) 배양된 동물세포를 외래 유전자로 형질전환시키기 위하여, 제공된 감염성 파필로마바이러스 위바이러스성 입자로 배양된 동물세포를 감염시키는 단계를 포함하는,

   배양된 동물세포 내로 외래 유전자를 전이하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

Images