KR100536618B1 - 항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의분리정제방법 및 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의 분리정제방법 및 그것의 용도에 관한 것으로, 한국산 도꼬마리에서 생리활성물질을 안정적이고 효과적으로 분리·정제하는 신규한 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 한국산 도꼬마리 추출물로부터 분리 정제한 항균 및 항암 활성이 있는 생리활성물질을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의 분리정제방법 및 그것의 용도 {Method for isolating and purifying Xanthium strumarium L. extract having antimicrobial and antitumor activity, and the use of the extract}

본 발명은 항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의 분리정제방법 및 그것의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의 안정하고 효율적인 신규한 분리·정제방법을 제공하고, 상기 추출물의 항균제 및 항암제로써의 용도를 제공함에 관한 것이다.

식물은 인류에게 매우 유용한 물질을 제공할 뿐만 아니라, 훌륭한 화학공장으로서의 역할을 수행하며 이들에 의해 유래된 복잡하고 독특한 신규 생리활성물질들이 지금까지 20,000개 이상이 밝혀져 왔다. 대부분 이차대사산물인 이들 유용물질들은 의약품, 향신료, 방향제, 색소, 살충제 및 고순도 화학제품 등의 다양한 용도로 사용되고 있으며, 전 세계 의약품 시장의 25%을 차지하고, 미국에서만 90억 달러 이상의 판매고 및 매년 1,600개 이상 식물 유래의 신물질이 발견되어왔다. 본 연구의 재료로서 국화과(Compositae)에 속하는 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)는 전체에 거센 털이 나 있으며 줄기는 곧게 서고, 키는 1.5 m 정도이다. 꽃은 8-9월경에 황갈색을 띈 머리 꽃이 줄기 끝에서 핀다. 열매는 대추씨와 비슷하고 과피 부분에 갈고리 모양의 억센 털이 나 있으며 들이나 길가에서 주로 자라는 한해살이풀로 한국을 포함한 동북아시아 및 유럽 등지에 폭넓게 분포·자생하는 것으로 알려져 있다. 도꼬마리에 관한 연구는 중국산 도꼬마리(Xanthium sibiricum Patr. ex Widd)가 시초로서 열매의 씨(창이자)가 해열, 발한, 진통, 산풍, 거습, 궤양성 피부병, 신경통 및 악성 종양 등에 탁월한 효과가 있으며, 항균효과로서는 티푸스균, 이질균과 더불어 황색포도상구균에 상당한 저해효과가 있는 것으로 알려져 있다. 창이엽에는 거풍습, 진통, 해열, 살충 등 다양한 효능이 있으며, 창이자에 함유된 성분으로는 γ-lactone 구조를 가진 크산티닌(xanthinin)과 카로티노이드(carotenoid), 알칼로이드(alkaloid), 사포닌(saponine), 크산토스트루마린(xanthostrumarin), 크산토스트루나린(xanthostrunarin) 및 올레산(oleic acid) 등이 알려져 있다. 이러한 성분을 지닌 도꼬마리가 전통적 민간요법으로 정착되어 습진 등의 피부병 치료에 널리 이용되었을 뿐만 아니라, 다양한 약리 작용을 하는 것으로 보아 항균성 및 항암성 물질의 존재가 예상된다. 최근에는 생약 및 식용식물 그리고 각종 난배양성 유용미생물(VBNC) 등으로부터 새로운 기능을 가진 천연생리활성물질의 연구가 동·서양을 비롯하여 활발히 진행되면서, 천연 한약재 중에서 항균효과 및 항암효과를 갖는 성분에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히, 단풍나무에서 추출된 기날린(ginnalin), 황화호에서 추출된 아스테미스산(astemisic acid), 황백이나 황련 등에서 추출된 베베린(berberin), 감귤류의 과피에 포함된 헤스페리딘(hesperidin) 등의 성분이 항균효과를 가지며, 충치 유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 증식억제 효과를 가진 생약제 및 향신료, 초피 추출물의 항암효과, 심황(turmeric)으로부터 분비된 페놀 화합물의 항암효과 등 다수가 보고된 바 있으며, 약용식물의 성분 중 플라보노이드(flavonoids), 알칼로이드(alkaloids), 글리코시드(glycosides), 폴리페놀(polyphenols) 등 각종 성분의 항균·항암효과가 알려져 있다. 또한, 녹차를 비롯하여 식품 중에 함유된 성분을 분리하여 항균·항암 및 각종 생리기능 효과에 관한 수많은 연구가 수행되어 있다(You, Y. S. et al. (1993), Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 21, 187-191.; Kim, S. H. et al. (1993), Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 21, 628-634; Nagabhushan, M. and S. V. Bhide (1992), J. Am. Coll. Nutr., 11, 192-198; Dkai, Y. et al. (1993), J. Ferment. Bioeng., 76, 367-370; Mizuno, M. et al. (1989), Agric. Biol. Chem., 53, 959-964; Senji, S., M. et al. (1989), Agric. Biol. Chem., 53, 2307-2311).

이와 같은 관점에서 본 발명자는 한국산 도꼬마리로부터 새로운 항균 및 항암효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용을 위한 일환으로서 도꼬마리의 각 부위로부터 추출한 성분이 세균 및 진균류 등에 대한 광범위한 항균효과를 가진다는 사실과 더불어 분자량 386 및 230인 2종류의 항균성 물질을 분리 정제한 결과를 보고한 바 있다(Kim, H. S. et al. (1997), Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, 183-188.7). 그 후 계속된 연구에서 이들 항균성 물질이 직장암 세포주에 강력한 생육저해 효과를 보임에 따라 다양한 암 세포주에 대한 항암효과를 비롯하여 항돌연변이원성 효과, 기타 각종 생리활성기능을 가진 성분의 규명이 기대되고 있으나, 이전의 연구결과는 분리된 항균성 물질의 안정성에 문제가 야기되었다. 따라서, 본 발명자는 한국산 도꼬마리 중에 존재하는 모든 성분을 안정하고 효율적인 새로운 정제방법을 확립하여 항균효과 및 변이원성, 항돌연변이원성 등 생리활성 효과를 조사, 확인하여 우수한 항균 및 항암물질을 탐색하여 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국산 도꼬마리로부터 항균 및 항암 활성을 갖는 활성물질을 분리·정제하는 안정하고 효율적인 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 한국산 도꼬마리 추출물의 항균제 및 항암제로써의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 한국산 도꼬마리의 열수추출물에 에테르와 에틸아세테이트를 이용하여 중성, 산성 및 염기성 조건에서 생리활성물질을 추출하고, 각 추출물의 항균활성 및 항암활성을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 한국산 도꼬마리에서 생리활성물질의 분리·정제 단계와 상기로부터 얻은 생리활성물질의 항균 및 항암 효과 조사단계로 구성된다.

본 발명 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)유래의 생리활성물질의 분리정제방법은 한국산 도꼬마리 시료의 열수 추출물을 중성 조건 하에서 에테르를 이용하여 분별 추출하고, 상기로부터 얻은 에테르 중성추출물에 무수 Na₂SO₄를 처리하여 건조 및 농축하고, 상기 농축액을 메탄올에 용해시켜 CH₂Cl₂ 과 에틸아세테이트(9:1의 비율로 혼합함)를 전개용매로 이용하여 TLC 분석과 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한 다음, 용출용매로 메탄올과 물(6:4의 비율로 혼합함)을 사용하여 HPLC를 실시한 후 GC/MS를 통하여 분석하여 얻음을 특징으로 한다.

본 발명 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)유래의 생리활성물질의 분리정제방법은 한국산 도꼬마리의 열수 추출물을 산성 조건 하에서 에테르 분별 추출하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 상기 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)유래의 생리활성물질의 분리정제방법은 한국산 도꼬마리의 열수 추출물을 염기성 조건 하에서 에테르 분별 추출하는 단계를 더 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 상기 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)유래의 생리활성물질의 분리정제방법은 한국산 도꼬마리의 열수 추출물을 중성 조건 하에서 에틸아세테이트 분별 추출하는 단계를 더 포함함을 특징으로 한다.

본 발명 한국산 도꼬마리 추출물의 항균효과는 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei) KCTC 1932, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1927, 세라시아 마르세센스(Serratia marcescens) KCCM 11809^T, 스트렙토코커스 에퀴 (Streptococcus equii) KCCM 40306, , 스트렙토코커스 주에피더미쿠스(Streptococcus zooepidermicus) KCTC 3318, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) KCCM 11492, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) PCI 219, 바실러스 써모글루코시스(Bacillus thermoglucosis), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) IFO 12197의 9종의 그람 양성세균, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) K-12, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) KCTC 1923, 슈도모나스 아에로기노사(Pseudomonas aeroginosa) KCTC 1930, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) KCTC 1645, 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) KCTC 2190, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) KCTC 2425, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) KCTC 2512의 7종의 그람 음성세균 및 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) KCCM 50564, 한세눌라 아노말라(Hansenulla anomala) B-7 및 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) IFO 5840의 3종의 진균류를 선정하여 조사함을 특징으로 한다.

상기 항균효과를 조사하기 위한 시험균주의 생육배지는, 세균의 경우 LB 아가 (트립톤 10 g, NaCl 10 g, 효모 추출물 5 g/L)를, 효모류는 Y 아가 (효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g, 글루코우즈 20 g/L) 그리고 곰팡이는 YM 아가 (효모 추출물 3 g, 맥아 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 글루코우즈 10 g/L, pH 5.5)를 사용함을 특징으로 한다.

본 발명 한국산 도꼬마리 유래의 생리활성물질의 항암효과는 위암 세포주(SNU 668), 폐 편평세포암 세포주(NCI H1703), 폐 선암 세포주(NCI H 522), 전립선암 세포주(LN CAP clone), 흑색종 세포주(Clone M3), 대장암 세포주(HT29),자궁암 세포주인 HeLa cell, 간암 세포주인 HepG2 cell, 골육종 세포주인 Saos2 cell 및 인간 정상피부 섬유아세포(Human Normal Skin Fibroblast)에서 조사함을 특징으로 한다.

상기 항암효과를 조사하기 위한 시험세포주의 생육배지로, 위암 세포주(SNU 668), 폐 편평세포암 세포주(NCI H1703), 폐 선암 세포주(NCI H 522), 전립선암 세포주(LN CAP clone), 흑색종 세포주(Clone M3) 및 대장암 세포주(HT29)는 10% 페이탈 카프 씨럼(fetal calf serum), 2 mM 글루타민이 함유된 RPMI-1640 배지를 사용하였고, 자궁암 세포주인 HeLa cell과 간암 세포주인 HepG2 cell은 10% 페이탈 카프 씨럼, 2 mM 글루타민이 함유된 F10 배지를 사용하였으며, 골육종 세포주인 Saos2 cell 및 인간 정상피부 섬유아세포(Human Normal Skin Fibroblast)는 10% 페이탈 카프 씨럼, 2 mM 글루타민이 함유된 DMEM high glucose media를 사용하여 36℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 한국산 도꼬마리 추출물의 제조

본 발명 한국산 도꼬마리 유래의 생리활성물질을 분리 및 정제하기 위해, 경남·경북 지역의 산야에 자생하는 Xanthium strumarium L.(한국명: 도꼬마리)을 2000년 10월 중 채취하여 음건, 세절한 후 시료로 사용하였다. 도 1에 도꼬마리 잎과 열매로부터 생리활성물질의 분리 및 정제하는 공정을 도시하였다.

우선, 도꼬마리 잎과 열매를 300 g를 3-5 L의 물로 약 5시간씩 3∼5회 열수 추출하여 증발기(EYELA Co. Japan)로 농축한 추출액 1 L를 0.1N HCl 및 0.1N NaOH를 사용하여 중성, 산성 및 염기성 조건 하에서 유기용매인 에테르 및 에틸아세테이트를 이용하여 분별 추출하여 총 6개 분획을 얻었다.

실시예 2: 본 발명 한국산 도꼬마리의 유기용매 추출물의 항균활성 규명

상기 실시예 1에서 얻은 본 발명 한국산 도꼬마리 추출물의 6개 분획의 항균활성은 Agar diffusion 법을 사용하여 조사하였다.

Agar diffusion 법에 따라 항균활성을 조사하기 위해, 18∼24시간 배양한(아스퍼질러스 푸미가투스(A. fumigatus)는 7일간 사면배지에서 배양한 후 얻은 포자용액을 사용함) 각 시험균이 포함된 고체배지에 상기 실시예 1에서 얻은 각종 시료 20 ㎕를 첨가한 건조한 페이퍼 디스크 (φ: 6 mm, Whatman Co.)를 올려놓고, 28℃ (효모, 곰팡이)와 37℃(세균)에서 24시간 배양하였다. 항균력 테스트는 투명환(clear zone)의 형성유무로 확인하였으며 50, 100, 150 및 200 ㎍의 농도에 따른 항균효과를 검토하였다. 항균성 물질의 확인은 시험균이 함유된 아가 플레이트 위에 전개한 TLC 플레이트를 얹고 30분간 방치한 후, TLC 플레이트를 제거하고, 37℃에서 아가 플레이트를 24시간 배양하였을 때 스팟 부위의 투명환(clear zone) 형성유무로써 확인하였다.

이 콜라이(E. coli) 및 바실러스 서브틸러스(B. subtilis)를 대상으로 항균활성을 검토한 결과, 에테르 및 에틸아세테이트의 중성 및 산성 추출물에서 우수한 항균효과를 나타내었다(미도시됨). 따라서 이들 추출물을 각각의 농도로 희석하여 항균활성을 검토하였다.

시험균주시료 (㎍)		E. coliK-12	B. subtilis PCI 219
Inhibitory zone (φ, mm)
XE-N	50100150200	15161717	13172123
XE-A	50100150200	8101111.5	9111315
XEA-N	50100150200	－78.510.5	－－1011
XEA-A	50100150200	－－－－	－689

-: 억제하지 않음

표 1에 나타난 바와 같이, 50 g의 농도에서 에틸아세테이트의 중성추출물보다 에테르의 중성추출물의 항균효과가 더 우수하였다.

상기의 결과로부터, 각 추출물 중 항균효과가 가장 우수한 에테르 중성추출물(XE-N) 10 g에 대하여 그람 양성세균 9종, 그람 음성세균 7종 및 진균 3종에 대한 항균 스펙트럼을 조사하였다. 시험균주의 생육배지는, 세균의 경우 LB 아가 (트립톤 10 g, NaCl 10 g, 효모 추출물 5 g/L)를, 효모류는 Y 아가 (효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g, 글루코우즈 20 g/L), 그리고 곰팡이는 YM 아가 (효모 추출물 3 g, 맥아 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 글루코우즈 10 g/L, pH 5.5)를 사용하였다.

시료균주	XE-N (10 ㎍)
그람 양성균	Inhibitory zone (φ, mm)
Mycobacterium phleiKCTC 1932 Staphylococcus aureusKCTC 1927 Serratia marcescensKCCM 11809T Streptococcus equiiKCCM 40306 Streptococcus zooepidermicusKCTC 3318 Bacillus megateriumKCCM 11492 Bacillus subtilisPCI 219 Bacillus thermoglucosis Bacillus licheniformis IFO 12197	12.510.57.5137.587.5－7.5
그람 음성균
Escherichia coliK-12 Escherichia coliKCTC 1923 Pseudomonas aeroginosaKCTC 1930 Pseudomonas fluorescensKCTC 1645 Enterobacter aerogenesKCTC 2190 Salmonella typhiKCTC 2425 Proteus vulgarisKCTC 2512	10.5－91310.57.59
효모
Cryptococcus neoformansKCCM 50564 Hansenulla anomala B-7	7.5－
곰팡이
Aspergillus fumigatus IFO 5840	－

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명 한국산 도꼬마리에서 추출한 에테르 중성추출물(XE-N)의 항균 스펙트럼을 조사한 결과, 그람 양성세균 8종, 그람 음성세균 6종을 비롯하여 진균 중 병원성 효모인 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)에서도 항균효과를 나타내었다.

비교예 1 : FDA (fluorescein diacetate)법에 따른 본 발명 한국산 도꼬마리 추출물의 항균효과 조사

상기 Agar diffusion 법은 시료의 확산, 배지중의 성분, 장시간이 요구되는 점등에서 시료에 따라 다소 부정확한 경우도 있다. 따라서 액체배양을 통한 항균효과의 정량분석을 위해 시험균주가 생산하는 에스터라아제의 생산 저해를 지표로 하는 플루오레슨 디아세테이트(fluorescene diacetate, FDA)법을 사용하였다.

우선, 항균효과가 입증된 추출물을 대상으로 FDA 분석조건을 확립하기 위해 XE-N (에테르의 중성추출물)과 XEA-N (에틸아세테이트의 중성추출물)을 대상으로 항균효과를 분석하였다. FDA 측정은 Chand 등의 방법을 변형하여 사용하였다(Chand, S. et al.,(1994), J. Antibiotics, 47, 1295-1304). 즉, 대수증식기의 시험균주 175 ㎕와 시료 20 ㎕을(각 시료 당 3점씩) 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 30℃에서 40분간 배양한 후, 0.2% FDA (아세톤에 녹임) 5 ㎕을 첨가하여 90분간 배양을 계속하였다. 항균효과는 마이크로플레이트 리더 (Bio-rad Co. Model 550)를 사용하여 시험균주가 생산하는 에스터라아제(esterase)에 의한 FDA 분해산물인 플루오레신(fluorescein) 생성량을 흡광도 490 nm에서 그리고 균 생육도는 655 nm에서 측정하였으며, 항균효과는 시료의 첨가 유무의 차이로써 확인하였다.

파장시료		490 nm (FDA)				655 nm
		E	P	S	C	E	P	S	C
대조군		1.101	1.485	0.715	0.539	0.171	0.171	0.294	0.371
XE-N	30 ng	0.943	1.634	0.666	0.507	0.201	0.372	0.291	0.339
	50 ng	1.017	1.624	0.667	0.514	0.206	0.352	0.269	0.349
	100 ng	0.964	1.622	0.700	0.479	0.207	0.348	0.286	0.317
XEA-N	30 ng	0.907	1.474	0.608	0.477	0.190	0.398	0.281	0.325
	50 ng	0.917	1.568	0.667	0.536	0.183	0.366	0.302	0.384
	100 ng	0.910	1.525	0.683	0.526	0.192	0.350	0.289	0.366
대조군		1.391	0.543	0.578	0.559	0.175	0.180	0.245	0.371
XE-N	1 ㎍	1.237	0.641	0.653	0.494	0.197	0.195	0.258	0.319
	5 ㎍	0.935	0.693	0.550	0.482	0.221	0.282	0.215	0.292
	10 ㎍	0.816	0.738	0.556	0.516	0.228	0.362	0.233	0.321
XEA-N	1 ㎍	1.110	0.730	0.501	0.475	0.209	0.246	0.238	0.310
	5 ㎍	0.970	0.616	0.494	0.497	0.234	0.272	0.213	0.323
	10 ㎍	0.873	0.718	0.506	0.501	0.283	0.334	0.187	0.310

주: E, Escherichia coli; P, Pseudomonas aeruginosa; S, Staphylococcus aureus;

C, Candida albicans

표 3에 나타난 바와 같이, 시험균주로서 세균인 이 콜라이(E. coli), 슈도모나스 아에로기노사(P. aeroginosa), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 및 효모인 캔디다 알비칸스(C. albicans) 를 대상으로 검토한 결과, 슈도모나스 아에로기노사(P. aeroginosa) 를 제외한 3 균주에 대해 30 ng/mL 에서도 뚜렷한 저해효과를 나타내었다.

실시예 3: 본 발명 한국산 도꼬마리에서 항균활성이 우수한 에테르 중성추출물의 정제

상기 실시예 1과 2의 결과로부터 항균활성이 우수한 것으로 규명된 한국산 도꼬마리의 에테르 중성추출물을 정제하였다.

우선, 한국산 도꼬마리에서 추출한 에테르 중성추출물 분획(XE-N)을 농축하고 상기 농축액을 소량의 메탄올로 용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂와 에틸아세테이트를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 단파장 UV 램프(254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.71 (S1), 0.59 (S2) 및 0.39 (S3)로서 세 개의 시그날이 검출되었다. TLC 플레이트 분석을 통하여 항균활성이 우수한 시그날 S1, S2 및 S3을 실리카겔 컬럼을 이용하여 각각 분리하였다. 분리된 S1을 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column C₁₈, MeOH:H₂O = 1:1)를 이용하여 분석한 결과, retention time 20.664분에서 피크가 나타났으나 소량의 혼합물이 공존함으로 Second-HPLC로 2차 정제를 수행하였다. 분취용 Metachem nucleosil (C₁₈) 컬럼을 사용하여 MeOH:H₂O = 6:4의 용매로서 흡광도 254 nm에서 검출된 피크를 분취하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 22.477분에서 단일 피크로 검출되었으며, 크로마토팩(chromatopak, Shimadzu Co.)으로 분석한 결과, 순도가 100%로 정제되었음을 알 수 있었다.

정제된 XE-N-S1을 UV/Visible spectrophotometer(Parmacia Co. Biochrom 4060)를 사용하여 200∼900 nm에서 스캐닝한 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 215 nm에서 최대 흡광도를 나타냈으며, GC/MS를 통하여 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 분자량이 248인 단일물질로 확인되었다.

실험예 1: 정제된 본 발명 한국산 도꼬마리에서 에테르 중성추출물 중 S2 및 S3의 정제

에테르 중성추출물 중, 상기에서 분리한 S1 이외의 혼합된 S2와 S3을 분리하기 위하여 먼저 XE-N-S1을 분리한 후, Rf치가 0.59 (S2)와 0.39 (S3)를 포함한 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 다음, TLC를 사용하여 분석하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂와 에틸아세테이트를 각각 8.5:1.5의 비율로 혼합하여 사용하였으며 TLC분석 결과를 참조하여 동일용매 조건 하에서 실리카겔 컬럼을 사용하여 분리하였다. 분리된 XE-N-S3을 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil C₁₈, MeOH:H₂O = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 10.735분에서 주 피크가 나타났으며 정제도는 91%를 보였으며, 8.979분의 피크가 혼합되어 나타났다(미도시됨). 이들 화합물을 단리하기 위하여 Second-HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C₁₈, MeOH:H₂O = 1:1)을 실시하여 2차로 정제한 결과, retention time 20.275분의 단일 피크임을 확인하였다. 분리된 화합물의 분자량을 조사하기 위하여 GC/MS로 측정한 결과, 분자량 262인 단일 물질로 확인되었지만, 정제 후 수일 내에 분해되는 것으로 보아 상당히 불안정한 물질로 판단되었다.

실험예 2: 본 발명 한국산 도꼬마리에서 항균활성이 우수한 에테르 산성추출물의 정제

실시예 2로부터 항균효과가 입증된 에테르 산성추출물(XE-A) 로부터 생리활성물질의 분리 정제는 에테르 중성추출물(XE-N)의 정제과정과 동일한 방법을 사용하였다. 먼저 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 다음 TLC로 분석하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂와 에틸아세테이트를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 단파장 UV 램프 (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.74 (S1), 0.63 (S2), 0.55 (S3)와 0.38 (S4)로 4 종류의 시그날이 검출되었다. 이들 시그날에 대한 항균활성은 TLC 플레이트 분석을 통하여 확인한 결과, 3개의 시그날 즉, S1, S2, S3에서 각각 항균활성을 나타내었다. 따라서 이들을 분리하기 위해 TLC 분석 결과를 기초로 농축액을 실리카겔 60 컬럼에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과 4개의 시그날 중 분리가 용이한 XE-A-S3을 단리하였으며, HPLC (Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil C₁₈, MeOH:H₂O = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 11.222분에서 주 피크가 나타났으며 정제도가 92%를 보였으며, 8.930분의 피크가 약간 혼합되어 나타났다. 이들 물질을 단리하기 위해 용매조건을 달리하여 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C₁₈, MeOH:H₂O = 1:1)로 정제하였으나(미도시됨), XE-N-S3와 마찬가지로 수일 내에 분해되는 것으로 보아 이 물질 또한 상당히 불안정한 것으로 추정되었다.

실험예 3: 본 발명 한국산 도꼬마리에서 항균활성이 우수한 에틸아세테이트 중성추출물의 정제

상기 실시예 1과 2의 결과로부터 한국산 도꼬마리에서 항균활성이 우수한 에틸아세테이트 중성추출물을 정제하였으며, 에테르 중성추출물의 정제과정과 동일한 방법으로 실시하였다.

우선, 에틸아세테이트 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 후, TLC (Silica gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂와 에틸아세테이트를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 단파장 UV 램프 (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.73 (S1), 0.61 (S2) 및 0.46 (S3)으로서 3 종류의 물질이 검출되었다. TLC 분석 결과를 바탕으로 농축액을 실리카겔 60 컬럼에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과, XEA-N-S2를 분리하였으며, HPLC (Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil C₁₈, MeOH:H₂O = 6:4)를 이용하여 2차 정제한 결과, retention time 14.691분의 단일 피크임이 확인되었지만, 이 물질 또한 빠른 시간 내에 분해되었다.

실시예 4: 본 발명 한국산 도꼬마리 추출물에서 분리 정제한 생리활성물질의 항암효과 조사

상기 실시예 1 내지 3에 따라 항균활성이 규명된 본 발명 한국산 도꼬마리 추출물에서 분리 정제한 생리활성물질의 항암효과를 조사하였다.

이를 위해, 상기 실시예에서 분리 정제된 생리활성물질을 DMSO 및 EtOH에 용해하여 사용하였으며, XE-A와 XE-B 및 XEA-A와 XEA-B는 잘 용해되지 않았다.

또한, 항암효과를 조사하기 위해 사용된 세포주 중 위암 세포주(SNU 668), 폐 편평세포암 세포주(NCI H1703), 폐 선암 세포주(NCI H 522), 전립선암 세포주(LN CAP clone), 흑색종 세포주(Clone M3) 및 대장암 세포주(HT29)는 10% 페이탈 카프 씨럼, 2 mM 글루타민이 함유된 RPMI-1640 배지를 사용하였고, 자궁암 세포주인 HeLa cell과 간암 세포주인 HepG2 cell은 10% 페이탈 카프 씨럼, 2 mM 글루타민이 함유된 F10 배지를 사용하였으며, 골육종 세포주인 Saos2 cell 및 인간 정상피부 섬유아세포(Human Normal Skin Fibroblast)는 10% 페이탈 카프 씨럼, 2 mM 글루타민이 함유된 DMEM high glucose media를 사용하여 36℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

위암 세포주, 폐암 세포주, 자궁암 세포주, 간암 세포주, 대장암 세포주, 골육종 세포주, 전립선암 세포주, 흑색종 세포주 및 인간 정상피부 섬유아 세포주를 각각 배양하다가 대수증식기에 도달되면, 단계별로 희석된 농도의 추출물 시료를 각각의 배양세포에 접종하고 일정시간 배양한 후, 나타나는 항종양 효과를 검토하였다. 항종양 효과의 분석방법은 3-(4, 5-dimethyl-2-tetrazolyl)-2, 5-diphenyl-2H tetrazolium bromide (MTT)검사를 하였다. 즉, 대수증식기에 있는 세포 1x10⁴개씩을 180 ㎕의 배양액에 부유시켜 96-웰 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루동안 배양한 후 단계적으로 희석된 추출물 10 ㎕을 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/mL 농도의 MTT 10 ㎕을 첨가하여 4시간 더 배양하고, 상층액 180 ㎕을 제거한 다음 DMSO 150 ㎕을 첨가하여 락커(rocker)에서 20분간 흔들어 준다. ELISA 리더 (Dynatech Co.)를 이용하여 570 nm 파장에서 O.D를 측정하여 항암효과를 판정하였으며, 대조군으로 항암제를 녹인 용매를 사용하였다. 또한, 기존에 시판되는 항암제와 항암효과를 비교 검토하기 위하여 에토포사이드(etoposide), 시스플라틴(cisplatin) 및 5-플루오우라실(5-flurouracil, 5-FU) 등을 사용하였다.

또한, 생존 세포수는 0.4% 트립판 블루 50 ㎕에 트립신이 처리된 세포 50 ㎕을 넣고 섞은 후, 헤모사이토미터(hemocytometer)에 넣고 1분 후 세포수를 세었다.

시료	인간 유래의 암 세포주a의 MICs (㎍/mL)
	SUN668	HeLa	HepG2	HT29	Saos2
XE-N	228.8	110.9	110.9	55.4	13.8
XE-A	>1625.0	>1625.0	>1625.0	>1625.0	NT
XE-B	1250.0	625.0	625.0	312.5	NT
XE-N-S1	109.3	27.3	27.3	54.7	<13.6
XE-N-S3	365.0	46.8	46.8	93.7	NT
XE-A-S3	650.0	162.5	81.2	325.0	NT
XEA-N	425.0	425.0	425.0	106.2	106.2
XEA-A	>1800.0	>1800.0	>1800.0	>1800.0	NT
XEA-B	1700.0	1700.0	1700.0	1700.0	1700.0
Etoposide	125.0	250.0	125.0	125.0	250.0
Cisplatin	>75.0	50.0	>75.0	>75.0	75.0
5-FU	7500.0	5000.0	2500.0	>7500.0	5000.0

a: SNU668, 위암 세포주; HeLa, 자궁암 세포주; HepG2, 간암 세포주;

HT29, 대장암 세포주; Saos2, 골육종 세포주; NT, 시험안함

시료	인간 유래의 암세포주a 의 MICs (㎍/mL)
	NCI H522	NCI H1703	LN CAP	Clone M3	HSF
XE-N	NT	NT	NT	NT	NT
XE-A	NT	>1625.0	203.1	NT	>1625.0
XE-B	NT	625.0	78.1	NT	625.0
XE-N-S1	<6.8	<6.8	27.3	13.6	54.7
XE-N-S3	NT	46.8	<5.8	NT	46.8
XE-A-S3	NT	81.2	20.3	NT	162.5
XEA-N	NT	NT	NT	NT	NT
XEA-A	NT	>1800.0	>900.0	NT	>1800.0
XEA-B	NT	1700.0	850.0	NT	>1700.0
Etoposide	250.0	125.0	125.0	125.0	250.0
Cisplatin	50.0	50.0	50.0	>75.0	75.0
5-FU	5000.0	5000.0	5000.0	2500.0	5000.0

a: H522, 폐 선암 세포주; NCI H1703, 폐 편평세포암 세포주;

LN CAP, 전립선암 세포주; Clone M3, 흑색종 세포주;

HSF, 인간 정상피부 섬유아세포; NT, 시험안함.

표 4와 5에 나타난 바와 같이, 각종 시료에 대한 암세포 억제농도(MIC)는 HeLa 자궁암 세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1이 가장 우수하였고, XE-N-S3도 우수한 효과를 나타내었다. HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 2종류, XE-N-S1과 XE-N-S3의 물질, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N 추출물과 XE-N-S1의 물질이 우수하였고, Saos2 골육종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1이 가장 우수하였지만 XE-N 추출물도 우수하였다. 또한 NCI H522 폐 선암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1이 가장 우수하였고, NCI H1703 폐 편평세포암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1이 가장 우수하였으며, XE-N-S3 물질도 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다. LN CAP 전립선 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S3가 가장 우수하였고, XE-A-S3, XE-N-S1 물질도 우수한 효과를 나타내었다. Clone M3 흑색종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1이 가장 우수한 물질이었다. 실험에 사용한 추출물과 정제품중 XE-A, XE-B, XEA-A 및 XEA-B 추출물은 용매에 잘 녹지 않았기 때문에 실제로 이들에 대한 항암효과는 표 4와 5에 나타난 것보다 더 높은 항암효과를 가지고 있을 것으로 사료된다. 또한 HSF 인간 정상 피부 섬유아세포에 대한 각종 추출물 및 정제물의 세포독성을 조사하기 위해 기존에 시판되는 항암제 에토포사이드와 시스플라틴을 구입하여 비교 검토해 본 결과, XE-A, XEA-A 및 XEA-B 추출물이 가장 독성이 낮았으며, XE-B 추출물도 에토포사이드에 비해 상대적으로 독성이 낮았다. 한편 XE-N-S1과 XE-N-S3 물질은 항암제인 에토포사이드보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3 물질은 에토포사이드보다는 독성이 높았으나, 시스플라틴보다는 낮았다.

상기 실시예 및 실험예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 항균 및 항암 활성이 있는 한국산 도꼬마리 추출물의 분리정제방법 및 그것의 용도에 관한 것으로, 한국산 도꼬마리에서 생리활성물질을 안정적이고 효과적으로 분리 정제하는 신규한 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 한국산 도꼬마리 추출물로부터 분리 정제한 항균 및 항암 활성이 있는 생리활성물질을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 한국산 도꼬마리 추출물을 분리 정제하는 신규한 방법을 제공하므로 물질분리산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 한국산 도꼬마리에서 항균 및 항암 효과가 있는 생리활성물질의 분리 및 정제과정을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명 한국산 도꼬마리의 에테르 중성추출물 중 XE-N-S1의 2차 HPLC 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 한국산 도꼬마리의 에테르 중성추출물 중 XE-N-S1을 UV/Vis 분광광도계하에서 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명 한국산 도꼬마리의 에테르 중성추출물 중 XE-N-S1의 GC/MS 결과를 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 도꼬마리에서 생리활성물질을 추출하는 방법에 있어서,

   한국산 도꼬마리 시료의 열수 추출물을 중성 조건 하에서 에테르를 이용하여 분별 추출하고,

   상기로부터 얻은 에테르 중성추출물에 무수 Na₂SO₄를 처리하여 건조 및 농축하고,

   상기 농축액을 메탄올에 용해시켜 CH₂Cl₂ 과 에틸아세테이트(9:1의 비율로 혼합함)를 전개용매로 이용하여 TLC 분석과 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한 다음, 용출용매로 메탄올과 물(6:4의 비율로 혼합함)을 사용하여 HPLC를 실시한 후GC/MS를 통하여 분석하여 얻음을 특징으로 하는 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)유래의 항균 및 항암활성이 있는 분자량이 248인 물질의 분리정제방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 기재의 방법에 따라 분리정제되고, 분자량이 248임을 특징으로 하는 한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L.) 유래의 항균 및 항암활성이 있는 물질.
6. 제5항 기재의 물질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항균제.
7. 제5항 기재의 물질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암제.