KR100535245B1

KR100535245B1 - 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법

Info

Publication number: KR100535245B1
Application number: KR10-2004-0019849A
Authority: KR
Inventors: 김우식; 황지환; 김영은; 백남인; 김은기; 서경도; 정진호
Original assignee: 김우식
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2004-03-24
Publication date: 2005-12-08
Also published as: KR20050094959A

Abstract

본 발명은 가용성 변수를 이용하여 천연물로부터 생리활성물질을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특정 용매에 대한 가용성의 차이를 이용하여 천연물로부터 생리활성물질을 분리하는 방법에 있어서, (a) 천연물에서 생리활성물질을 가용하는 특정 용매에 대해 가용성 변수를 설정하고, 이를 생리활성물질의 지표로 데이타베이스화하는 단계; 및 (b) 생리활성물질의 추출시, 상기 생리활성물질을 상기 데이타베이스에 해당되는 가용성 변수의 용매로 추출하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 가용성 변수를 이용하여, 생리활성 및 생리활성물질추출률의 저하없이 천연물에서 생리활성물질을 추출하게 하는데 중요한 역할을 하는 추출용매의 선택을 효율적이면서 용이하게 하는 효과가 있다.

Description

가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법{Method for extrction of bio-active materials using solubility parameter}

본 발명은 가용성 변수를 이용하여 천연물로부터 생리활성물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연물에서 생리활성물질을 추출하는 추출용매를 가용성 변수로 수치화하고, 이를 생리활성물질의 지표로 데이타베이스화하여, 추출공정에서 추출용매의 제조가 용이하고, 추출용매를 효율적으로 선택할 수 있는 생리활성물질의 추출방법에 관한 것이다.

일반적으로, 하나의 벌크물질로부터 원하는 물질을 분리하는 방법은 거름법, 승화법, 분별증류법, 분별깔때기법, 재결정법, 추출법, 투석법 및 크로마토그래프가 알려져 있는데, 여기에서 추출법은 특정 용매의 용해도 차이에 의해 분리하는 것으로, 원료물질이나 벌크 물질에 추출용매를 사용하여 원하는 화합물이나 조성물을 가용하여 추출하는 방법이 업계에 널리 공지되어 있다.

하지만, 상업적으로 추출하기 위해서는 최적의 추출 수득율이나 추출물의 활성을 유지할 수 있는 추출용매를 선택하는 것이 가장 중요한데, 이를 선택하기 위해서 종래에는 많은 시행착오를 거치면서 추출용매를 선정하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자는 추출하고자 하는 화합물이나 조성물에 적합한 추출용매를 선택함에 있어서, 보다 용이하게 결정하고 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

특히, 천연물로부터 생리활성을 추출하는 방법에 있어서, 생리활성물질의 추출량을 증가시키고, 생리활성을 저하시키지 않는 추출용매를 선택하고, 제조하는 방법을 본 발명에 적용하고자 하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 추출하고자 하는 생리활성물질을 가용하여 추출하는 추출용매를 가용성 변수로 수치화하고, 상기 가용성 변수를 생리활성물질의 지표로 삼아, 데이타베이스화하고, 생리활성물질의 추출시, 상기 데이타베이스의 가용성 변수에 따르는 추출용매를 제조하여 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법은 특정 용매에 대한 가용성의 차이를 이용하여 천연물로부터 생리활성물질을 분리하는 방법에 있어서,

(a) 천연물에서 생리활성물질을 가용하는 특정 용매에 대해 가용성 변수를 설정하고, 이를 생리활성물질의 지표로 데이타베이스화하는 단계; 및

(b) 생리활성물질의 추출시, 상기 생리활성물질을 상기 데이타베이스에 해당되는 가용성 변수의 용매로 추출하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 가용성 변수를 설정하는 것은 천연물로부터 생리활성물질의 추출량이나 생리활성의 저감없이 우수한 추출효과를 나타내는 추출용매들의 공통된 가용성 변수를 일정 범위내로 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 천연물은 식물, 동물, 미생물인 것을 사용하는 데, 특히 식물을 사용하는 것이 바람직하다.

이는 식물에서는 플라보노이드, 페놀산, 페놀 디터펜 등의 폴리페놀류를 많은 함유하고 있는데(Pietta, 1998; Shahidi, 1992), 폴리페놀은 피부미백효과 및 과산화 지질의 생성을 억제하여 노화를 지연시켜주는 역할을 하며, 이외에 콜레스테롤 저하, 혈압상승억제, 항돌연변이 예방, 동맥경화예방, 식욕증진 및 체온조절효과 등이 알려져 있는 생리활성물질이기 때문이다.

따라서, 상기 식물은 폴리페놀류가 많이 함유한 것으로 알려진 뽕나무잎, 상백피, 녹차, 감잎, 대나무, 감초 및 쑥 등으로 이루어진 생리활성을 갖는 식물군에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 생리활성물질의 측정방법으로는 크게 정성적으로 항산화 효과와 미백효과로 나눌 수 있고, 정량적으로는 폴리페놀의 함량을 나누어 측정하는 것이 바람직하다.

그러나, 본 발명에서는 생리활성물질을 폴리페놀류만으로 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 클로르포름, 아세톤, 에틸 아세테이트, 프로필렌 클리콜, 에틸렌 글리콜 및 n-부탄올로 이루어지는 용매군에서 선택된 적어도 1개 이상의 극성용매를 사용하는데, 이에 한정되지 않고 물, 유기용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 용매에서 선택하여 사용하면 된다.

그리고, 본 발명에서는 천연물에 존재하는 것으로 알려진 생리활성물질에 대해 추출량이나 생리활성에 적합한 추출용매를 가용성 변수로 나타내어 데이타베이스화하고, 추후 미지 또는 공지의 천연물에서 생리활성물질을 추출할 시, 상기 데이타베이스로부터 추출하고자 하는 생리활성물질에 대해 설정된 가용성 변수의 범위에 해당되는 추출용매를 제조하여 사용하면 된다.

이때, 본 발명에서 상기 생리활성물질의 지표로 사용되는 추출용매의 가용성 변수는 힐데브란의 가용성 변수(Hildebrand Solubility Parameter)를 사용한다(SI Hildebrand values from Barton, Handbook of Solubility Parameters, CRC Press, 1983).

본 발명에서 사용되는 힐데브란드의 가용성 변수는 특정 용매의 전체적인 반데르 바알스 힘을 상대적으로 용해력 수치로 나타낸 것인데, 하기 식 1과 같이, 용매의 코헤시브 에너지 밀도(cohesive energy density)와 기화열로 나타낼 수 있다.

[식 1]

한편, 하기 표 1은 상기 식 1로부터 물과 유기용매별을 힐데브란드 가용성 변수로 나타낸 것이다(SI Hildebrand values from Barton, Handbook of Solubility Parameters, CRC Press, 1983 참조).

이때, 하기 표 1에서 가용성 변수로 표시된 용매가 본 발명에서 사용되는 용매로 국한하는 것은 아니다.

용매	가용성 변수(SI)
n-펜탄	14.4
n-헥산	14.9
n-헵탄	15.3
디에틸에테르	15.4
1,1,1-트리클로로에탄	15.8
n-도데칸	16.0
백유(White spirit)	16.1
시클로헥산	16.8
아밀 아세테이트	17.1
사염화탄소	18.0
자일렌	18.2
에틸 아세테이트	18.2
톨루엔	18.3
테트라히드로푸란	18.5
벤젠	18.7
클로로포름	18.7
트리클로로에틸렌	18.7
메틸에틸케톤	19.3
아세톤	19.7
디아세톤 알콜	20.0
이텔렌 디클로라이드	20.2
메틸렌 클로라이드	20.2
피리딘	21.7
모르폴린	22.1
디메틸포르마미드	24.7
n-프로판올	24.9
에탄올	26.2
디메틸 술폭시드	26.4
n-부탄올	28.7
메탄올	29.7
프로필렌 글리콜	30.7
에틸렌 글리콜	34.9
글리세롤	36.2
물	48.0

다음은 상기 힐데브란트 가용성 변수를 이용하여, 예시적으로 가정되는 혼합용매의 가용성 변수를 계산하는 방법을 간단히 설명한다.

예를들어, 0%(v/v)인 에탄올/ 물로 이루어진 혼합용매가 있다면, 상기 혼합용매의 가용성 변수는 에탄올의 가용성 변수 10.48(26.2×0.4)과 물의 가용성 변수 28.8 (48×0.6)를 더한 값으로 39.28(SI)으로 계산되는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

[실시예]

먼저, 천연물로부터 다양한 가용성 변수로 표시되는 혼합용매를 사용하여, 가용성 변수에 따라 추출되는 생리활성물질의 정량적인 추출량과 정성적인 생리활성의 관계를 체계화하고자 하였다.

이때, 본 실시예에서는 천연물로 폴리페놀 함량이 풍부하고, 상기 성분으로부터 항산화효과와 미백효과가 알려져 있는 뽕나무잎을 사용하였다.

[실시예 1] 뽕나무잎 추출액

뽕나무잎을 건조하여 분말화 한 것 2g을 증류수 또는 혼합용매 20㎖에 넣어 혼합한 후, 80℃에서 1시간동안 추출을 하고, 상기 추출물을 원심분리 (6,000×g, 10분간)로 고액분리를 하여 가용성분획만을 수집하여, 본 발명의 추출효과의 정량 및 정성분석의 시료로 사용하였다.

[실험예 2] 폴리페놀의 정량분석

상기 실시예 1의 가용성 변수가 다른 혼합용매별 뽕나무잎 시료를 가지고 폴리페놀의 정량을 분석하였다.

이때, 각 추출물 중의 폴리페놀 함량은 Folin and Denis (1915) 등의 방법을 따라 수행하였다.

표준물질로서는 탄닌산(Sigma)을 이용하였다.

그리고, 적당히 희석된 각 시료 100㎕는 증류수 1,150㎕ 및 폴린-데니스 (Folin-Denis reagent, Fluka) 125㎕를 첨가하고 균등히 혼합하고 3분경과 후, 포화된 탄산나트륨 용액 200㎕를 첨가한 다음, 25℃에서 20분간 방치하였다. 그리고, 20분경과 후 추출물 대신 증류수를 첨가한 것을 대조구로 하여 파장 760㎚에서 흡광도(spectrophotometer, JASCO V-570)를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2과 도1에 나타낸 바와 같이, 가용성 변수가 40∼45 사이에 있는 추출용매로 추출한 추출액인 경우, 공통적으로 폴리페놀의 추출량이 가장 많음을 알 수가 있었다.

증류수	가용성 변수	폴리페놀량
100% 증류수	47.86	21.56
20%(v/v) 메탄올	44.22	18.09
40%(v/v) 메탄올	40.58	20.28
60%(v/v) 메탄올	36.94	22.35
80%(v/v) 메탄올	33.30	20.72
100%(v/v) 메탄올	29.65	22.84
20%(v/v) 에탄올	43.48	19.88
40%(v/v) 에탄올	39.11	23.82
60%(v/v) 에탄올	34.60	15.08
80%(v/v) 에탄올	30.19	21.50
100%(v/v) 에탄올	25.97	14.75
20%(v/v) 이소프로판올	42.99	22.35
40%(v/v) 이소프로판올	38.12	19.88
60%(v/v) 이소프로판올	33.25	14.75
80%(v/v) 이소프로판올	28.39	11.8
100%(v/v) 이소프로판올	23.52	0.97
20%(v/v) n-부탄올	23.31	0.94

또한, 추출용매의 종류에 따라서는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, n-부탄올 등의 순서로 폴리페놀에 대한 추출율이 평가되었다. 추출 대상물질인 폴리페놀경우 극성을 띠어 용매의 극성 순서에 따라서 그 추출되어 나오는 효율의 정도가 나타난 것으로 판단된다.

그리고, 물과 혼합 가능한 유기용매들을 사용하여 추출하였을 경우, 60%(v/v) 메탄올 수용액, 40%(v/v) 에탄올 수용액, 20%(v/v) 이소프로판올 수용액, 그리고 20%(v/v) n-프로판올 수용액의 경우에서 단순 물을 이용하여 추출하였을 경우에서 보다 높은 폴리페놀 추출효율을 보였다. 이것은 물과 유기용매의 적정량이 혼합된 추출용매로 추출하였을 경우, 상엽에 존재하는 다양한 종류의 폴리페놀들 중에서 물에 용해되어 나오는 폴리페놀들 뿐 아니라 상대적으로 비극성이어서 물만으로는 추출되어 나오지 않았던 폴리페놀 성분들도 혼합용매에 의해 추출되어 나온 것으로 여겨진다.

[실시예 3] 라디칼 소거효과 측정

상기 실시예 1의 가용성 변수가 다른 혼합용매별 뽕나무잎 시료를 가지고 라디칼 소거 효과를 측정하여, 생리활성물질의 항산화효과를 정성분석하였다.

이때, 라디칼 소거효과는 Yamaguchi 등(1998)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시험관에 추출시료 10㎕, 0.1M 트리스·염산염 완충용액(pH 7.4) 1,800㎕, 100%(v/v) 에탄올 80㎕, 0.5%(w/v) 트윈 20 용액 100㎕, 그리고 0.15mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,Sigma) 2,000㎕를 첨가하여 혼합하였다. 그리고 25℃, 암소에서 30분간 방치한 후, 파장 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출시료 대신 추출용매를 첨가한 후, 상기와 같이 동일한 과정을 수행하여 흡광도를 측정한 것을 대조구로 하였으며, 하기 식 2를 사용하여 라디칼 소거 효과를 수치로 나타내었다.

[식2]

이 결과, 하기 표 3과 도 1에 나타난 바와 같이, 가용성 변수가 37∼42 사이에 있는 추출용매로 추출한 추출액인 경우, 공통적으로 라디칼 소거 효과가 우수하였고, 가용성 변수가 낮을수록, 공통적으로 라디칼 효과가 낮음을 알 수가 있었다.

증류수	가용성 변수	라디칼 소거 효과
100% 증류수	47.86	67.40
20%(v/v) 메탄올	44.22	68.26
40%(v/v) 메탄올	40.58	79.86
60%(v/v) 메탄올	36.94	85.30
80%(v/v) 메탄올	33.30	74.83
100%(v/v) 메탄올	29.65	13.06
20%(v/v) 에탄올	43.48	78.66
40%(v/v) 에탄올	39.11	80.46
60%(v/v) 에탄올	34.60	61.40
80%(v/v) 에탄올	30.19	54.56
100%(v/v) 에탄올	25.97	4.03
20%(v/v) 이소프로판올	42.99	60.10
40%(v/v) 이소프로판올	38.12	57.43
60%(v/v) 이소프로판올	33.25	37.30
80%(v/v) 이소프로판올	28.39	23.60
100%(v/v) 이소프로판올	23.52	3.83
20%(v/v) n-부탄올	23.31	2.83

[실시예 4] 티로시나아제 활성 억제효과

상기 실시예 1의 가용성 변수가 다른 혼합용매별 뽕나무잎 시료를 가지고 티로시나아제 활성의 억제 효과를 측정하여, 생리활성물질의 미백효과를 정성분석하였다.

이때, 티로시나아제 활성 억제효과는 Masamoto 등(1980)의 방법을 이용하여 측정하였다. 적당히 희석된 추출시료 320㎕, 0.83mM L-DOPA(Sigma) 960㎕, 그리고 인산염완충용액(pH6.8)에 녹인 티로시나아제(mushroom, Sigma) 320㎕를 microfuge tube에 넣고 잘 섞어준 후, 37 항온조에서 10분간 방치하였다. 10분 후, 각 시료들을 얼음물에서 냉각시키고 파장 490㎚에서 흡광도를 측정하였다(T). 추출시료 대신에 추출용매를 첨가하고 상기와 동일한 과정을 수행한 후, 흡광도를 측정한 것을 억제효과에 대한 대조구(Ci), 그리고 위에서 티로시나아제 대신 0.1M 인산염완충용액을 첨가한 것을 효소반응에 대한 대조구(Ce)로 하였으며, 하기 식 3을 사용하여 티로시나아제 활성의 억제 효과를 수치로 나타내었다.

[식 3]

그 결과, 하기 표 4와 도 1에 나타낸 바와 같이, 가용성 변수가 30∼35 사이에 있는 추출용매로 추출한 추출액인 경우, 공통적으로 티로시나아제 활성 억제 효과가 우수함을 알 수가 있었다.

증류수	가용성 변수	티로시나아제 활성억제효과
100% 증류수	47.86	11.91
20%(v/v) 메탄올	44.22	4.00
40%(v/v) 메탄올	40.58	28.01
60%(v/v) 메탄올	36.94	18.35
80%(v/v) 메탄올	33.30	32.30
100%(v/v) 메탄올	29.65	35.91
20%(v/v) 에탄올	43.48	20.81
40%(v/v) 에탄올	39.11	26.22
60%(v/v) 에탄올	34.60	54.58
80%(v/v) 에탄올	30.19	36.25
100%(v/v) 에탄올	25.97	26.59
20%(v/v) 이소프로판올	42.99	29.82
40%(v/v) 이소프로판올	38.12	41.32
60%(v/v) 이소프로판올	33.25	42.90
80%(v/v) 이소프로판올	28.39	51.39
100%(v/v) 이소프로판올	23.52	2.16
20%(v/v) n-부탄올	23.31	36.47

한편, 상기 실시예 3내지 4의 결과를 종합해보면, 정량적 추출효율성의 폴리페놀 추출효율과 그 경향성을 같이하였는 데, 순수 추출용매 종류에 따라서는 물을 사용한 경우가 가장 높게 평가되었고, 다음은 용매의 극성순서에 따랐다. 또한 혼합용매의 경우에서도 마찬가지로 60%(v/v) 메탄올 수용액, 40%(v/v) 에탄올 수용액, 20%(v/v) 이소프로판올 수용액, 그리고 20%(v/v) n-프로판올 수용액의 경우에서 단순 물을 이용하여 추출하였을 경우에서 보다 높은 항산화효과를 나타내었다.

따라서, 본 발명에서는 상기 실시예에서 생리활성물질을 추출하는 다양한 추출용매에서 공통적인 가용성 변수를 알아낼 수 있었다.

이의 결과는 천연물에 존재하는 생리활성물질별로 가용성 변수의 범위를 설정하여 데이타베이스를 구축한다면, 추후 동일하거나 유사한 생리활성물질을 용매로 추출할 시, 상기 구축된 데이타베이스를 이용하여 추출용매의 선택이나 제조를 매우 용이하게 해 줄 수 있을 것이다.

이상과 같이, 본 발명은 가용성 변수를 이용하여, 생리활성 및 생리활성물질추출률의 저하없이 천연물에서 생리활성물질을 추출하게 하는데 중요한 역할을 하는 추출용매의 선택을 효율적이면서 용이하게 하는 효과가 있다.

이는 가용성 변수가 다른 추출용매별로 생리활성물질의 추출 수득율 또는 생리활성 효과를 데이타베이스화하게 함으로써, 상기 데이타베이스에 의해, 사용하고자하는 용매의 가용성 변수로부터 생리활성물질의 추출률과 생리활성을 예측할 수 있고, 가용성 변수는 다양한 종류의 용매 및 이들의 혼합용매로부터 용이하게 조절할 수 있기 때문이다.

또한, 본 발명은 종래의 생리활성물질의 추출공정에서 최적의 추출용매를 결정하기 위한 반복적인 시행착오를 생략할 수 있는 추출방법의 개선 효과가 있다.

도 1은 다양한 용매들의 가용성 변수와 폴리페놀 추출량, 항산화효과, 그리고 티로시나아제 활성 억제효과간의 상관관계를 나타낸 그래프.

Claims

특정 용매에 대한 가용성의 차이를 이용하여 천연물로부터 생리활성물질을 분리하는 방법에 있어서,

(a) 천연물에서 생리활성물질을 가용하는 특정 용매에 대해 가용성 변수를 설정하고, 이를 생리활성물질의 지표로 데이타베이스화하는 단계; 및

(b) 생리활성물질의 추출시, 상기 생리활성물질을 상기 데이타베이스에 해당되는 가용성 변수의 용매로 추출하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법.
제 1 항에 있어서,

상기 천연물은 식물, 동물, 미생물인 것을 특징으로 하는 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법.
제 1 항에 있어서,

상기 가용성 변수는 힐데브란드의 가용성 변수를 사용하는 것을 특징으로 하는 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (b) 단계의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 클로르포름, 아세톤, 에틸 아세테이트, 프로필렌 클리콜, 에틸렌 글리콜 및 n-부탄올로 이루어지는 용매군으로부터 적어도 1개 이상 선택된 극성용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 가용성 변수를 이용한 생리활성물질의 추출방법.