KR100522714B1 - 탄저병 방제용 조성물 및 이를 이용한 탄저병 방제방법 - Google Patents

탄저병 방제용 조성물 및 이를 이용한 탄저병 방제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄저병 방제용 조성물 및 이를 이용한 탄저병 방제방법에 관한 것이다. 특히 본 발명에서는 이투린계 화합물의 항-탄저병균 활성을 확인하여, 이투린계 화합물을 생산하는 균주를 이용한 탄저균 방제용 조성물 및 방제방법을 제공한다. 본 발명으로, 작물 재배에 큰 손실을 유발하는 탄저병을 효과적이고도 환경친화적으로 방제가능하다.

Description

탄저병 방제용 조성물 및 이를 이용한 탄저병 방제방법{COMPOSITION FOR CONTROL ANTHRACNOSE AND CONTROL METHOD OF ANTHRACNOSE WITH SAME}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 탄저병 방제용 조성물 및 이를 이용한 탄저병 방제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 작물 재배에 큰 손실을 유발하는 탄저병을 효과적이고도 환경친화적인 방법으로 방제할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
바실러스 섭틸러스는 다수의 항진균성 펩타이드 항생제를 생산하는데(Katz, E. and Demain, A.L. (1977) The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis, and possible functions. Bacteriol. Rev. 41, 449-474 ; Besson, F., Peypoux, F., Michel, G. and Delcambe, L. (1978) Identification of antibiotics of iturin group in various strains of Bacillus subtilis. J. Antibiot. 31, 284-288 ; Peypoux, F., Guinand, M., Michel, G., Delcambe, L., Das, B.C. and Lederer, E. (1978) Structure of iturin A, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis. Biochemistry 17, 3992-3996 ; Zuber, P., Nakano, M. and Marahiel, M.A. (1993) Peptide antibiotics. In: Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics (Sonenshein, A.L., Hoch,J.A. and Losick, R., Eds.), pp. 897-916. American Society of Microbiology, Washington, DC) 항생제의 이투린 군에 속하는 항생제는 강력한 항진균 활성을 나타낸다(Eshita, S.M., Roberto, N.H., Beale, J.M., Mamiya, B.M. and Workman, R.F. (1995) Bacillomycin Lc, a new antibiotic of iturin group: isolation, structures, and antifungal activities of the congeners. J. Antibiot. 48, 1240-1247 ; Gueldner, R.C., Reilly, C.C., Pusey, P.L., Costello, C.E., Arrendale,R.F., Cox, R.H., Himmelsbach, D.S., Crumley, F.G. and Cutler, H.G. (1988) Isolation and identification of iturins as antifungal peptides in biological control of peach brown rot with Bacillus subtilis. J. Agric. Food Chem. 36, 366-370 ; Schreiber, L.R., Gregory, G.F., Krause, C.R. and Ichida, J.M. (1988) Production, partial purification, and antimicrobial activity of novel antibiotic produced by a Bacillus subtilis isolate from Ulmus americana. Can. J. Bot. 66, 2338-2346 ; Klich, M.A., Arthur, K.S., Lax, A.R. and Bland, J.M. (1994) IturinA: a potential new fungicide for stored grains. Mycopathology 127, 123-127 ; Yu, G.Y., Sinclair, J.B., Hartman, G.L. and Bertagnolli, B.L. (2002) Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizoctonia solani. Soil Biol. Biochem. 34, 955-963). 이러한 물질은 지질로 수식된 아미노산들로 이루어져 있으며 화학 살충제에 비하여 토양에서 쉽게 생분해된다.
또한 바실러스 속 균주는 다른 종류의 식물 병원체에 대한 생물학적 방제제로 연구되어 왔다(Asaka, O. and Shoda, M. (1996) Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14. Appl. Environ. Microbiol. 62, 4081-4085 ; Chen, T.W. and Wu, W.S. (1999) Biological control of carrot black rot. J. Phytopathol. 147, 99-104 ; Harris, A.R. and Adkins, P.G. (1999) Versatility of fungal and bacterial isolates for biological control of damping-off disease caused by Rhizoctonia solani and Pythium spp. Biol. Control 15, 10-18).
일 예로, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 식물 병원체에 대하여 다양한 항진균성을 나타내며, 특히 이들은 항생제 쯔비테미신(zwittermicin) 및 카노사민(kanosamine)을 생산한다. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 주는 항생제 이투린A를 생산하며, 이는 동물에서 질병을 야기하는 곰팡이 방제에 효과적이다. 바실러스 섭틸러스의 경우에는 다양한 주에서 항진균성 활성이 확인된바 있으며, 매우 광범위한 항진균성 항생제를 생산하는 것으로 알려져 있다. 다양한 바실러스 섭틸러스 주들에서의 곰팡이의 생물학적 방제 효과는 이미 21개의 균주에서 14개의 곰팡이 병원체에 대한 자연적인 활성확인으로 입증된 바 있으며(Utkhede and Sholberg, 1986, Can. J Microbiol. 32:963-967), 다수개의 바실러스 섭틸러스 주들이 분리 및 동정되어 특허출원되어 있다.
한편, 탄저병균은 학명이 글로에오스포리움 글로에오스포리오이데스(Gloeosporium gloeosporioides) 또는 콜레토트리컴 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)로, 식물 및 과실에 탄저병을 유발한다. 탄저병균은 농작물, 특히 사과, 포도, 고추 및 수박에 기생하여 수관에서 조직을 공격한다. 식물의 감염된 부분은 표백된 후 갈변된다. 고추나 다른 종의 식물에서 탄저병은 심각한 수준의 과실소실을 유발하며, 종종 줄기 또는 잎에까지 해를 가하기도 한다. 감염초기단계에서는 작은 원형의 움푹 들어간 반점이 형성되고, 과실이 익으면서 반점들은 커지고 반점 중앙부분은 어두워지고 다소 울퉁불퉁해진다(Agrios, G.N. (1978) Plant diseases caused by fungi. In: Plant Pathology(Agrios, G.N., Ed.), pp. 298-301. Academic Press, New York.).
고추 탄저병의 경우 6월 중하순경부터 발생하기 시작하며, 일반 고추농가에서는 탄저병 방제를 위하여 6월에서 8월사이에 살균제를 평균 15회이상 살포하고 있다. 그러나 독성 살균제의 빈번한 살포는 오히려 사람에서 해를 입히기도 하고, 살균제에 대하여 내성을 가지는 탄저병균이 출현하고 있어 효과적인 방제에 문제가 되고 있다.
본 발명은 탄저병균에 대하여 항균활성을 가지는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이로부터 분리한 항-탄저병균 화합물을 포함하는 탄저병 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 탄저병 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항-탄저병균 활성을 갖는 바실러스 섭틸러스 KS03(수탁번호: KACC 91059)을 제공한다.
또한 본 발명은 이투린계 화합물을 생산하는 바실러스 속 균주, 이의 배양액 및 상기 균주로부터 생산되는 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 탄저병 방제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 이투린계 화합물을 생산하는 바실러스 속 균주, 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 조성물을 작물에 적용하여 탄저병을 방제하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 탄저병 방제방법에 관한 것으로, 이투린계 화합물이 항-탄저병균 활성을 가짐을 확인하여 이투린계 화합물을 생산하는 균주를 탄저병 방제에 활용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 탄저병균은 글로에오스포리움 속 균주 또는 콜레토트리컴 속 균주이다.
본 발명의 탄저병 방제방법은 이투린(iturin)계 화합물을 생산하는 균주를 이용한 방법이다. 보다 구체적으로는 이투린계 화합물을 생산하는 균주, 이의 배양액 및 이로부터 분리한 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 탄저병 방제용 조성물을 작물에 적용하는 것이다.
본 발명의 탄저병 방제용 조성물은 이투린계 화합물을 생산하는 균주, 이의 배양액 및 이로부터 분리한 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 유효성분으로 포함하는 것이다. 상기 조성물은 상기 유효성분만을 단독으로 포함할 수 있으나, 그 외 방제용 미생물 제제, 살균제 또는 항균효과를 증진시킬 수 있는 통상의 물질을 더욱 포함할 수 있다. 탄저병 방제용 조성물은 작물에 적용방법에 따라 적절한 제형으로 제조할 수 있으며, 바람직하기로는 액제 또는 입제이다. 상기 이투린계 화합물을 생산하는 균주, 이의 배양액 또는 이투린계 화합물은 탄저병 방제용 조성물에 0.01 내지 40 중량%로 포함될 수 있으나, 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다
이투린계 화합물을 생산하는 균주는 바람직하기로는 바실러스 속 균주로, 대표적인 것으로는 바실러스 섭틸러스가 있다. 본 발명에서는 벼짚에서 바실러스 섭틸러스 KS03을 신규로 분리하였고, 이를 농용미생물보존센터에 2003년 7월 29일자로 수탁하였으며 수탁번호 KACC 91059를 부여받았다. 바실러스 섭틸러스 KS03은 16S rDNA 서열분석을 토대로 한 계통분석상 도 1로 나타낸 계통도에 속한다.
균주 배양액은 균주의 종류에 따라 공지의 방법으로 배양하여 수득할 수 있으며, 바람직하기로는 액체배양하는 것으로 더욱 바람직하기로는 세포를 제거한 배양여액이다. 바실러스 속 균주의 경우 PDA 배지나 LB 배지에 배양온도 30 ℃로 30 내지 70 시간 배양한 후, 원심분리 또는 여과를 통하여 세포를 제거한 배양액을 준비할 수 있다. 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KS03은 도 2에 도시한 성장양상 및 항균활성을 나타낸다. 즉, 바실러스 섭틸러스 KS03 배양액에서는 항균활성이 정체기 이후에서 관찰되기 시작하여 사멸기에서 최고조에 이른다. 따라서, 바실러스 섭틸러스 KS03은 항진균성 물질을 배양 후 최소 30시간 이후에 생산하기 시작하는 것으로 보이며, 55 내지 70시간 배양하는 것이 다량의 항균성 물질을 수득하기 좋다.
이투린계 화합물은 도 6에 기재한 서열을 갖는 환형 펩타이드로, 다양한 이성체 화합물들이 알려져 있다. 이투린계 화합물의 예로는 이투린 A 내지 E가 있으며, 이투린 A에는 지방산의 조성에 따라 이소화합물인 A1 내지 이투린 A8, 바실로마이신(bacillomycin) D, F, L, 및 마이코섭틸린(mycosubtilin)이 있다. 이투린계 화합물은 공지의 방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 공지의 방법으로는 C18 또는 ODS 컬럼을 사용한 HPLC 방법과, 이온교환수지, 젤여과크로마토그라피 및 실리카젤의 연속적인 과정을 통한 분리하는 방법 등이 있으나, 본 발명에서 제공하는 분리방법을 통하여 이투린계 화합물을 수득할 수 있다.
본 발명의 이투린계 화합물 분리방법은 바실러스 속 균주의 배양액을 부탄올로 추출한 다음 이를 양이온교환크로마토그래피 및 실리카겔을 이용한 TLC를 실시하는 것이다.
보다 구체적으로는, (a) 바실러스 속 균주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계, (b) 상기 배양액을 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거한 배양여액을 준비하는 단계, (c) 상기 배양여액에 부탄올을 가하여 부탄올 추출물을 수득하는 단계, (d) 상기 부탄올 추출물의 부탄올을 제거한 다음 잔여물을 DEAE 세파로즈 컬럼에 통과시켜 흡착시키고, NaCl 농도구배를 이용하여 용출물을 수득하는 단계 및 (e) 상기 용출물을 실리카겔 박막에 전개시켜 항진균성 물질을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서, 바실러스 속 균주는 균주의 종류마다 공지된 배양조건으로 배양하여 배양액을 수득할 수 있으며, 바실러스 섭틸러스 KS03의 경우 LB 배지에 접종하고, 이를 30 ± 2 ℃에서 55 내지 70시간 배양하여 배양액을 수득할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 배양액내의 세포제거는 원심분리하여 펠렛을 제고하거나, 여과를 통하여 실시할 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 배양여액에 부탄올을 가하여 추출한다. 이때 배양여액에 대하여 부탄올을 1: 1 내지 3 부피배 가한 후 수용액층과 부탄올층을 분획하여 부탄올층만을 수득한다.
상기 (d) 단계에서는 부탄올 추출물을 증류시켜 부탄올을 제거하고, 잔여물은 양이온교환크로마토그래피를 실시한다. 상기 양이온교환크로마토그래피는 수지로 DEAE(diethylaminoethyl) 세파로즈 CL-6B가 바람직하며, 이는 상용화된 것을 구입하여 사용할 수 있다. 양이온 크로마토그래피에서 사용되는 평형화 완충액 또는 세척완충액으로는 컬럼실험에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인산완충용액 또는 트리스완충용액이 좋다. 양이온 크로마토그래피에서 상기 잔여물을 통과시켜 흡착시키고, 0 내지 1.0 M NaCl 농도구배를 이용하여 용출시킨다. 항진균성 물질의 용출에 바람직한 농도는 0.06 내지 0.33 M NaCl이다. 상기 용출물은 수득한 후 투석하거나 동결건조하여 이후 과정에 시료로 제공할 수 있으며, 이후 과정에 사용되는 용매시스템과 동일한 경우 별도의 처리과정없이 사용할 수 있다.
상기 (e) 단계에서는 용출물을 실리카겔을 이용하여 TLC를 실시하는 것이다. TLC에서 이동상 용매는 클로로포름, 메탄올 및 증류수 혼합물이 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 클로로포름:메탄올:증류수를 60 내지 70:20 내지 30 :1 내지 10 부피비로 혼합하여 사용하는 것이다.
본 발명에서는 일실시예로, 바실러스 섭틸러스 KS03 균주 배양액을 시료로 하고 상기에 언급한 방법에 따라 실시하여 이투린계 화합물을 수득하였다.
본 발명의 탄저병 방제용 조성물은 작물에 통상의 방법으로 적용한다. 구체적인 방법은 탄저병 방제용 조성물은 토양, 식물의 잎, 줄기, 꽃 또는 열매에 살포하는 것으로, 물에 상기 조성물을 희석하여 사용할 수 있다. 살포시기는 탄저병균의 증식이 원활한 시기에 하는 것이 좋으며, 고추 탄저병의 경우 6월 내지 8월에 살포한다.
본 발명의 탄저병 방제용 조성물 및 탄저병 방제방법은 미생물 제제를 이용하여 환경친화적이며, 부작용을 야기시키지 않을 뿐만 아니라 작물에 방제 효과뿐만 아니라 균주에 의한 2차적인 대사물질을 제공할 수 있는 효과가 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주 분리 및 동정
1-1. 균주 동정
볏짚으로부터 항진균성을 나타내는 균주를 분리하였고, 생화학적 및 생리학적 특성과 16S rDNA 서열분석법으로 동정하였다.
균주의 16S rDNA 유전자는 서열번호1 및 서열번호2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켰다(Lane, D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial systematics (Stackebrandt, E. and Goodfellow, M., Eds.), pp. 115-175. Wiley, New York). 중합효소 연쇄 반응(PCR) 조건은 94 ℃에서 3분 반응후, 94 ℃에서 1분 -> 50 ℃에서 1분 -> 72 ℃에서 2분간 연속적인 반응을 35회 실시하고, 마지막 단계로 72 ℃에서 10분간 반응시킨다. 증폭 후 PCR 산물은 정제하고, ABI PRISM1 모델 377 DNA 서열분석기로 서열을 확인하였다.
동정 결과, 균주는 바실러스 섭틸러스임을 확인할 수 있었으며, 상기 균주의 16S rDNA 서열분석으로부터 바실러스 섭틸러스 ATCC21331과 98 %의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 상기 균주는 바실러스 섭틸러스 KS03로 명명하였고, 이의 16S rDNA 서열은 유전자은행 데이터베이스에 승인번호 AY207468로 입력하였다.
도 1은 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KS03의 계통도를 16S rDNA 서열을 토대로 작성한 것이다.
1-2. 항진균성 확인
글로에오스포리움 글로에오스포리오이데스 BA19는 전북대학교 환경생물원예학과에서 분주받아 사용하였으며, PDA(potate detrose agar: potatd dextrose agar 20 g, agar 18 g, chloram phenicol 50 ppm, nalidixic acid 20 ppm 및 D.W 1 L) 배지에서 유지시켰다.
바실러스 섭틸러스 KS03 배양동안 항진균성 화합물의 생산을 확인할 목적으로, 항진균성을 나타내는 세포가 제거된 시료를 다양한 시간차로 취하여 그 활성을 측정하였다.
바실러스 섭틸러스 KS03는 LB 액체배지에 접종하여 30 ℃에서 12시간 150 rpm으로 회전배양하였다. 배양물 0.1 ㎖을 취하여 100 ㎖의 LB 배지에 접종하여 동일한 조건으로 72시간 배양하면서 시간대별 배양물을 취하여 세포성장율(O.D560) 및 항진균 활성을 확인하였다.
항진균 활성은 4일간 배양한 글로에오스포리움 글로에오스포리오이데스 BA19의 배양물 0.2 ㎖을 PDA 고체배지에 도말하고, 바실러스 섭틸러스 KS03 배양액 50 ㎕를 종이 디스크(8 ㎜)에 떨어뜨린 후 상기 종이 디스크를 도말한 고체배지상에 두어 28 ℃에서 배양하고, 4일 후 저해환의 직경을 측정하여 결정하였다.
도 2는 바실러스 섭틸러스 KS03의 배양곡선(○) 및 항진균 활성(●)을 나타낸 그래프이다. 바실러스 섭틸러스 KS03은 배양 32시간후인 거의 세포 정체기 종결시점에서 항진균 활성을 나타내기 시작하여 세포 사멸기에서(배양시간 60 시간) 그 활성이 최고에 이르렀으며, 최고시점을 전후하여서는 현저한 변화가 관찰되지 않았다. 즉 바실러스 섭틸러스 KS03은 세포 성장단계에서 정체기 이후에 항진균성 물질들을 생산하기 시작함을 확인할 수 있었다.
도 3은 바실러스 섭틸러스 KS03에 의한 고추 탄저병균 생장저해환을 나타낸 것이다.
실시예 2: 항진균성 물질 분리
2-1. 항진균성 물질 추출 및 정제
바실러스 섭틸러스 KS03 배양액으로부터 항진균성 물질 추출은 용매추출법을 통하여 실시하였다. 다수의 용매(부탄올, 크로로포름, 헥산, 또는 에칠아세테이트)를 사용하여 추출물을 제조하여 추출물의 항진균성을 확인한 결과, 부탄올 추출물에서만 항진균성이 확인되어, 추출용매로는 부탄올이 바람직하였다.
이에, 바실러스 섭틸러스 KS03를 상기와 동일한 방법으로 60시간 배양하였고, 배양액은 원심분리 및 여과과정을 실시하여 세포를 제거하였다. 세포가 제거된 여액은 동일 부피배의 부탄올을 사용하여 3회 추출하였다. 다양한 용매를 이용한 추출실험에서, 항진균성은 부탄올을 용매로 사용하였을 때 검출되어, 항진균성 화합물은 높은 소수성을 가지는 것으로 추정되었다. 바실러스 섭틸러스 KS03 배양물의 상등액을 부탄올로 추출하므로써 항진균성 활성이 유기상으로 전이되었다. 추가적인 정제는 DEAE 세파로스 크로마토그래피 및 분리용 TLC로 실시하였다.
부탄올 추출물은 수득하여 부탄올은 증류시켜 제거한 다음 잔류물은 증류수에 용해시켜 DEAE(diethylaminoethyl) 세파로즈 CL-6B 컬럼을 통과시켰다. 이때 용출용매는 0 내지 1.0 M NaCl의 농도구배를 사용하였으며, 각 분획을 수득하여 이의 항진균성을 확인하였다. 그 결과 상기 컬럼에서 항진균성 물질들을 포함하는 분획은 0.06 내지 0.33 M NaCl 농도에서 용출된 것이었다.
상기 항진균성이 확인된 분획들은 실리카겔 박막에 전개시켜 더욱 정제하였다. 실리카겔 60 F254 플레이트(Merck, 2 ㎜)를 이용한 TLC를 실시하였으며, 용매시스템으로는 클로로포름:메탄올:증류수(65:25:4(v/v/v))을 사용하였다.
도 4는 바실러스 섭틸러스 KS03로부터 생산된 항진균성 물질의 실리카겔 박막 전개 사진으로, 화살표시 부분의 시료를 수거하여 항진균성을 가짐을 확인하였다.
2-2. 항진균성 물질의 분석
상기 항진균성 물질의 구조 분석을 실시하였다.
정제한 항진균성 물질의 적외선 스펙트럼을 해상도 4 ㎝-1의 Shimadzu FTIR-8300 (Shimadzu, Japan)와 DLATGS 검출기를 통하여 확보하였다. TLC상에 전개된 항진균성 물질은 상기와 동일한 용매 시스템을 이용한 실리카겔 60 F254 플레이트(Merck, 0.2 ㎜)로 TLC를 실시하였다. 산물은 UV광(254 ㎚) 또는 나인하이드린 시약을 사용하여 140 ℃에서 루쎌방법(Russell, D.W. (1960) Revelation des N-methylaminoacides. J. Chromatogr.4, 251-252)에 따라 검출하였다. 상기 조건에서 항진균성 물질의 Rf 수치는 0.29이었다.
도 5는 바실러스 섭틸러스 KS03으로부터 정제한 항진균성 화합물의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 정제된 화합물은 푸리에 변환 적외선(Fourier transform infrared: FTIR) 스펙트럼에서 중간 부분의 3300 ㎝-1 근처의 넓은 밴드는 내부분자의 결합을 나타내는 NH 구조를 나타내고 있고, 1647 및 1510 cm-1에서는 각각 아민I 및 아민II 밴드를 나타내고 있다.
고분해능 매트릭스 보조 레이저 탈착(matrix-assisted laser desorption ionization: MALDI) TOF/TOF(time-of-fight/time-of-flight) 질량스펙트럼을 4700 프로테오믹 분석기(Proteomic Analyzer, Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)로 측정하였다. 항진균성 물질을 Nd:YAG 레이저의 200 Hz의 반복율을 갖는 UV 광(355 ㎚)에 노출시켰다. 1000 및 6000 레이저 주사의 평균은 각각 정상 질량 스펙트럼 및 MS/MS 스펙트럼을 구하는데 사용하였고, 항진균성 물질은 MS 모드에서 두 단계 반사를 갖는, 25 kV의 발생원 가속 전압에서 분석하였다.
MS/MS 실험에서는 발생원 가속 전압(8 kV)과 부유 충돌 셀(7 kV)간의 전위차로 정의되는 충돌 에너지는 1 kV로 설정하였다. α-시아노-4-하이드로시-신남산(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid; CHCA) 기질은 CHCA 10 ㎎을 1:1 부피비의 아세토니트릴/0.1 % TFA(trifluoroacetic acid) 1 ㎖에 용해시켜 준비하였다. 시료 25 pmol은 MALDI 타겟상에 놓고, 기질용액 0.5 ㎕를 혼합하였다.
도 6은 바실러스 섭틸러스 KS03으로부터 정제한 항균성 물질의 MALDI 질량 분석결과이다.
MALDI 질량 스펙트럼으로, 본 발명의 항균성 물질이 m/z 1043, 1057 및 1071로 각각 측정된 3개의 물질을 포함하는 혼합물임을 확인할 수 있었다. 이들은 각각 14 Da 차를 나타내어 지방산 체인의 길이에 차이가 있는 예를 들어 CH2의 분자량은 14 Da, 상동물질들의 시리즈로 추정된다.
MALDI MS/MS 스펙트럼에서 주된 양성자화 물질(protonated molecule) [M+H]+는 m/z 1043에서 관찰된 것으로 상용화된 이투린A의 「M+H]+과 동일하였다. 3개의 물질은 항진균성 리포펩타이드로 Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA은 β-아미노산)으로 이루어져 있다. MS/MS 스펙트라의 저질량 부위는 각각을 이루는 아미노산들, Ser(m/z 60), Pro(m/z 70), Gln(m/z 84), Asn(m/z 87) 및 Tyr (m/z 136)의 이모니움 이온(H2N+=CH-R)에 해당하는 피크들을 나타낸다. 상기 β-아미노산은 또한 m/z 184에서 이모니움 이온(H2N+=CHC11H23)을 가지고 있다. 이투린 이모니움의 주된 선형 아킬리움 이온들은 분자내 존재하는 프롤린에 의하여 Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln-CO+ 형을 갖는다.
충돌로 인한 분열(collision induced dissociation: CID) 스펙트라에서 이투린의 아미노산 서열을 표시하는 절편 이온들이 확인되었다. 특히 도 4에서 b형과 상보적인 y형 이온의 두 가지 연속물이 포함되어 있었으며, 이는 펩타이드 벡본(backbone)과 함께 두 개의 인접한 아미노산 잔기들 간의 아미드 결합이 절단되었기 때문이다. 또한 n-, iso- 또는 anteiso-형과 같은 지방산의 곁사슬의 구조차로 인하여 이투린 이성체들이 존재하고 있다. 이투린 A의 서열은 βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser이다.
자연상태에서 이투린 A는 이투린 A1 내지 A8의 여덟 개의 이성체로 이루어진 혼합물 형태이다. 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KS03으로부터 정제한 항진균성 물질은 이투린 A2와 동일한 서열 및 분자량을 가진다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 이투린계 화합물의 항-탄저병균 활성 및 이투린계 화합물을 생산하는 균주를 이용한 탄저균 방제방법을 제공하여, 작물 재배에 큰 손실을 유발하는 탄저병을 효과적이고도 환경친화적으로 방제가능하다.
도 1은 본 발명의 바실러스 섭틸러스 KS03의 계통도를 16S rDNA 서열을 토대로 작성한 것이다.
도 2는 바실러스 섭틸러스 KS03의 배양곡선(○) 및 항진균 활성(●)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 바실러스 섭틸러스 KS03에 의한 고추 탄저병균 생장저해환을 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 섭틸러스 KS03로부터 생산된 항진균성 물질의 실리카겔 박막 전개 사진이다.
도 5는 바실러스 섭틸러스 KS03으로부터 정제한 항진균성 화합물의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 섭틸러스 KS03으로부터 정제한 항균성 물질의 MALDI 질량 분석결과이다.
<110> SHIN, Kwang-Soo KOO, Bon-Sung CHA, Byeongjin <120> COMPOSITION FOR CONTROL ANTHRACNOSE AND CONTROL METHOD OF ANTHRACNOSE WITH SAME <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forword primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ggytaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

  1. 항-탄저병균 활성을 갖는 바실러스 섭틸러스 KS03(수탁번호: KACC 91059).
  2. 바실러스 섭틸러스 KS03(수탁번호: KACC 91059), 이의 배양액 및 상기 균주로부터 생산되는 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 탄저병 방제용 조성물.
  3. 삭제
  4. 바실러스 섭틸러스 KS03(수탁번호: KACC 91059), 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 이투린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 조성물을 작물에 적용하여 탄저병을 방제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 작물은 사과, 포도, 고추 또는 수박인 것인 방법.
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