KR100516207B1 - 아실화 호모세린 락톤 분해능을 갖는 신균주 로도코커스속 ｌｓ－３１ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아실화 호모세린 락톤 분해능을 갖는 신균주 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양으로부터 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해하여 병원성 세균을 생물학적으로 제어하며 생물학적 환경정화에 효과적으로 이용할 수 있는 신균주 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)[KCTC 10521BP] 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

아실화 호모세린 락톤 분해능을 갖는 신균주 로도코커스 속 ＬＳ－３１ {Rhodococcus sp. LS-31 Decomposing Acylated Homoserine Lactone}
본 발명은 아실화 호모세린 락톤 분해능을 갖는 신균주 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양으로부터 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해하여 병원성 세균을 생물학적으로 제어하며 생물학적 환경정화에 효과적으로 이용할 수 있는 신균주 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)[KCTC 10521BP]에 관한 것이다.
지금까지 농작물의 세균병을 제어하기 위해서 화학농약 및 항생제가 일반적으로 이용되어 왔다. 그러나, 상기의 화학농약 및 항생제의 사용은 토양내의 약물잔류, 유용미생물 사멸, 항생제 내성 균주의 출현 등의 문제점을 안고 있다. 이러한 문제점들을 극복할 수 있는 한 방법으로서 병원성 미생물의 밀도인식 신호 전달 체계를 타겟으로 하는 새로운 방법이 대두되고 있다.
곤충들이 페로몬이라는 화학물질을 분비하여 배우자를 유인하거나 공격 신호를 보내는 것처럼, 미생물도 병발생과 관련된 화학물질을 분비하는 것이 호흡기 감염 병원균인 슈도모나스 에어로기노사(Pseudomonas aeroginosa)에서 발견되었다. 이러한 화학물질을 아실화 호모세린 락톤(acylated homoserine lactone; AHL)이라 하는데, 주로 동식물 병원균의 병원성을 유발시키는 분자를 생산하도록 신호를 주고, 이로 인해 병이 유발되게 한다.
AHL의 종류로는 OHHL(N-β-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone), OOHL(N-β-oxo-octanoyl-L-homoserine lactone), ODHL(N-β-oxo-decanoyl-L-homoserine lactone), HHL(N-hexanoyl-L-homoserine lactone), BHL(N-butanoyl-homoserine lactone), OdDHL(N-β-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone) 등이 있다.
섬유성 낭포증 환자의 호흡기 감염을 유발하는 슈도모나스 에이로기노사(Pseudomonas Aeroginosa)의 경우, 상기의 아실화 호모세린 락톤에 의한 병발 신호 전달 기작이 자세히 밝혀져 있으며, 이러한 기작의 교란을 통한 새로운 항생제 개발이 진행 중에 있다.
국제 공개 번호 96/029392호에 아실화 호모세린 락톤을 미생물 상호간의 신호전달의 매개체로 활용하여 병원성 미생물을 제어하고자 하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 특허는 아실화 호모세린 락톤 자체의 저해를 통해 병원성 미생물을 제어하는 것이 아니라, 아실화 호모세린 락톤과 구조적으로 유사한 퓨라논(Furanone) 및 그 유도체를 사용하여 아실화 호모세린 락톤이 조절단백질과 결합하는 것을 경쟁적으로 방해함으로써 병원성 미생물을 제어하는 방법에 관한 것이다.
현재까지 아실화 호모세린 락톤 자체의 저해에 대해서는 3건의 연구가 특허 출원된 바가 있으나(한국 특허 공개 제 2003-42624호, 한국 특허 출원 제 2002-17167호, 제2002-68797호), 현재까지 출원된 균주는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 아르트로박터 속(Arthrobacter sp.) 두 균주로서, 본 발명의 로도코커스 속(Rhodococcus sp.)과는 전혀 다른 균주이다.
이에, 본 발명자들은 아실화 호모세린 락톤 분해능을 가지면서 기존에 알려진 균주와는 전혀 다른 균주를 분리하고자 연구한 결과, 토양으로부터 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해하는 신균주 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]를 분리하고 이의 용도를 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해하는 신균주 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 신균주를 이용하여 병발 신호 물질을 분해시킴으로써 세균간의 병발 신호 전달을 근원적으로 차단하여 세균병 억제 및 효과적인 생물학적 환경정화에 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 아실화 호모세린 락톤 분해능을 갖는 신균주 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)[KCTC 10521BP]을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양으로부터 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해하여 병원성 세균을 생물학적으로 제어하며 생물학적 환경정화에 효과적으로 이용할 수 있는 신균주 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP] 및 이의 용도에 관한 것이다.
먼저, 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤(AHL)을 분해하는 미생물을 수득하기 위하여, AHL의 일종인 HHL(N-hexanoyl-L-homoserine lactone)이 유일탄소원으로 첨가된 최소배지에 토양시료를 접종하여 배양한다. 상기 배양 시료를 3차례 계대배양하고, 이를 한천배지(nutrient broth agar plate)에 옮겨서 24시간 배양하여 단일 콜로니를 수득한다.
상기 수득된 단일 콜로니를 형성하는 균주의 AHL 분해능을 측정하기 위하여 HHL(N-Hexanoyl-L-homoserine lactone)을 유일 탄소원으로 함유한 최소배지에 접종하여 시간별 세포생육 및 HHL의 잔존량을 측정한 결과, 분리된 미생물이 AHL을 분해하는 것을 확인하였다.
또한, 분리 미생물을 동정한 결과, 로도코커스 속(Rhodococcus sp.)과 유사한 성질을 갖는 근연균으로 동정되었으며, 이를 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)로 명명하였다. 상기 신균주를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC) 2003년 10월 8일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 10521BP이다.
상기 분리된 로도코커스 속 LS-31은 HHL과 OHHL의 아실화 호모세린 락톤을 효과적으로 분해할 수 있고, 이외에도 OHL, DHL, OdDHL의 아실화 호모세린 락톤도 분해할 수 있음을 확인하였다.
한편, 상기 균주의 병원성 세균 제어 능력을 알아보기 위해 감자무름병 병원성 균주인 어위니아 카로도보라에 적용한 결과 감자무름병이 현저하게 감소함을 확인하였고, 이에 분리 균주가 병원성 세균을 제어하는 것을 확인하였다.
또한, 유류오염 토양 및 녹조 발생 오염수의 샘플을 조사한 결과, 이들 샘플에서 세균의 신호물질인 AHL이 존재하고 있음을 크로모박테리움 바이올라세움(Chromobacterium violaceum) CV026과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) NT1 리포터 균주로서 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 AHL을 분해할 수 있는 로도코커스 속 LS-31 균주를 활용하여 신호물질 농도의 변화를 유도함으로써 효과적인 생물학적 정화에 응용할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물 분리
밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤(AHL)을 분해하는 미생물을 선별하기 위하여, 충남 공주시에 위치한 논에서 토양시료를 채취하여, 최소배지에서 증균배양(Enrichmenet culture)을 수행하였다.
상기의 최소 배지(NaCl 1.5 g/L, KCl 0.4g /L, MgCl2ㆍ6H2O 0.4 g/L, CaCl2ㆍ2H2O 0.3 g/L, KH2PO4 0.2 g/L, Na2SO4 0.1 g/L. MES 1 g/L. NH4Cl 0.2 g/L, HCl 100 mM, FeSO4ㆍ7H2O 7.5 mM, H3BO3 0.5 mM, MnCl2 ㆍ4H2O 0.5 mM, CoCl2ㆍ6H2O 0.8 mM, NiCl2ㆍ6H2O 0.1 mM, CuCl2ㆍ2H2O 0.01 mM, ZnSO4 ㆍ7H2O 0.5 mM, Na2MoO4ㆍ2H2O 0.15 mM, Na2SeO3ㆍ5H2O 0.02 mM, Na2WO4ㆍ2H2O 0.02 mM, pH 6.0)에 유일한 탄소원으로 HHL을 최소배지 ㎖당 250 ㎍을 첨가하였으며, 접종된 배지를 30 ℃와 37 ℃에서 72시간동안 배양하였다.
상기 배양된 시료를 역시 HHL이 ㎖당 250 ㎍씩 첨가된 최소배지에 5%(v/v) 접종하여 3차례 계대배양하였다. 배양 조건은 상기에서와 동일하게 하였다. 최종 계대배양 후 배양액을 영양한천배지(nutrient broth agar plate)에 스트리킹(streaking)하여 30 ℃의 온도에서 자란 균주를 24시간 동안 배양하였다. 배양결과 형성된 단일 콜로니를 계속 3회 상기와 동일한 방법으로 계대 배양하여 최종적으로 단일 균종을 분리하였다.
실시예 2: 미생물 동정
상기 실시에 1에서 얻은 균주를 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)과 의약 박테리아의 동정 매뉴얼(Manual for the Identification of Medical Bacteria)을 참고하여 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 조사한 후 균주 동정을 실시하였다.
그 결과, 상기 분리균주는 흰색에 점성을 띄는 집락(colony)을 형성하였다. 본 분리균주는 그람 양성균으로 생육 pH 범위는 6.5 ∼ 7.0이었고, 생육 온도 범위는 28 ∼ 32 ℃이며, 호기성 세균이다. 분리 균주의 당 자화성 조사결과 프럭토오스(Fructose), 수크로오스(Sucrose)를 이용할 수 있고, 말토오스(Maltose)는 이용하지 못함을 확인하였다. 또한, 통상의 방법으로 분리된 균주의 16S rDNA 서열을 분석하였으며, 반응조건은 다음과 같다.
① 프라이머: 증류수 9 ㎕, 9F / 1542R(50X) 0.4 ㎕, PCR 마스터(2X) 10 ㎕,
DNA 주형 0.5 ㎕
② PCR 조건: 94 ℃ 5분, 94 ℃ 30초, 55 ℃ 45초, 72 ℃ 2분, 72 ℃ 2분
(30 cycle)
PCR을 통해 증폭된 16S rDNA의 서열(서열번호 1)을 분석한 결과 상기 선별 분리된 균주는 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis)와 99.2%의 유사성을 보임으로써 로도코커스 속(Rhodococcus sp.)에 속하는 것으로 확인되었다.
이상의 결과로부터 본 발명에 따른 로도코커스 속과 유사한 성질을 갖는 근연균으로 동정되었으며, 이를 로도코커스 속 LS-31로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC) 2003년 10월 8일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 10521BP이다.
실시예 3: 분리균주의 AHL 분해 측정
상기 실시예 2에서 분리된 로도코커스 속 LS-31이 AHL을 분해하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
AHL의 일종인 HHL 및 OHHL을 실험대상으로 하였으며, 에틸 아세테이트 ㎖당 OHHL 및 HHL 5 ㎎을 각각 용해시키고 빙초산 0.1%(v/v)첨가하여 약산성 상태로 스톡(stock) 용액을 만들어 -30 ℃에 보관하면서 사용하였다.
(1) 로도코커스 속 LS-31의 HHL 분해 측정
HHL 스톡 용액 100 ㎕를 진공 상태에서 에틸 아세테이트를 제거한 후 이를 상기 실시예 1과 동일한 조성의 최소배지 2 ㎖에 첨가하였다. HHL이 첨가된 최소배지 2 ㎖에 로도코커스 속 LS-31을 접종하여 30 ℃에서 배양하면서 시간대별로 100 ㎕씩 샘플을 채취하였다. 상기의 샘플을 분석하여 각각 균체량과 HHL 잔존량을 측정하였다.
균체량은 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 OD값을 측정하여 결정하였고, HHL 잔존량은 다음과 같이 바이오어쎄이를 수행하였다.
먼저, 상기에서 시간대별로 100 ㎕씩 취한 샘플을 400 ㎕의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트는 진공상태에서 제거하고 이 샘플을 최소배지 20 ㎕에 녹였다. 30 ℃, LB배지에서 24시간 동안 배양한 크로모박테리움 바이올라세움(Chromobacterium violaceum) CV026을 LB 평판배지 위에 올려놓았다. LB 평판배지에 구멍을 만든 다음, 구멍에 에틸아세테이트로 추출하고 최소배지에 녹인 샘플 20 ㎕를 올려놓았다. 바이오어쎄이 평판배지를 30 ℃에서 하룻밤 배양한 다음, 구멍 주변에 생긴 바이올라세인 존(violacein zone)의 직경을 구하여 HHL의 잔존량을 측정하였다. 도 1에서 보이듯이 분리한 로도코커스 속 LS-31이 HHL를 24시간 안에 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 또한, 특히 균주의 성장(OD값)과 AHL의 감소가 대응됨을 확인할 수 있었다.
사전에 크로모박테리움 바올라세움 CV026 평판배지에서 HHL 농도에 따라 생성된 바이올라세인 존(violacein zone)과의 관계를 분석하여 얻어진 다음의 수학식 1로 표시되는 상관관계식을 활용하여 실제 HHL 분해 정도를 계산하였다.
상기 수학식 1에서, X는 zone의 직경(cm), Y는 HHL의 농도(pmole), R-sqaure(신뢰도)는 0.99이다.
(2) 로도코커스 속 LS-31의 OHHL 분해 측정
로도코커스 속 LS-31의 OHHL 분해 측정은 HHL 대신에 OHHL을 사용하였고, OHHL 보관 용액(100 μM) 40 ㎕을 진공상태에서 에틸 아세테트(Etyl acetate)를 제거한 후 트리스-Cl 버퍼(pH 7.0) 180 ㎕에 녹이고, 이것과 배양액(final OD600=0.5) 20 ㎕와 30 ℃에서 반응시켜 30분, 1시간, 2시간째 샘플링하고, 반응 정지를 위해 샘플들을 90 ℃에서 열 처리하였다. 사용한 바이오어세이 평판배지는 50 ㎕/㎖ salts(20X), 0.2% 만니톨, 50 ㎕/㎖ PO4 버퍼(20X), 100 ㎍/㎖ 카베니실린(carbenicillin), X-gal(40 ㎍/㎖)로 구성된 최소배지 평판배지로, 30 ℃에서 24시간 배양한 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 최소배지 평판배지에 올려놓았다. 바이오어세이 평판배지에 구멍을 만든 다음, 구멍에 200배 희석한 샘플 20 ㎕을 올려놓았다. 바이오어세이 평판배지를 30 ℃에서 24시간 동안 배양한 후 구멍 주변에 β-갈락토시다아제(β-galatosidase) 활성의 결과로 생성된 블루 존(blue zone)의 직경을 구하여 OHHL 잔존량을 측정하였다[도 2].
사전에 X-gal이 첨가된 아그로박테리움 평판배지(agrobacterium plate)에서 OHHL 농도에 따라 생성된 블루 존(blue zone)과의 관계를 분석하여 얻어진 다음 수학식 2로 표시되는 상관관계식을 활용하여 실제 OHHL 분해 정도를 계산하였다.
상기 수학식 2에서, X는 zone의 직경(cm), Y는 OHHL의 농도(pmole), R-sqaure는 0.99이다.
상기의 결과를 종합해 볼 때 분리한 로도코커스 속 LS-31은 HHL 및 OHHL를 분해할 수 있고, 또한 OHL, DHL, OdDHL도 분해할 수 있으며, 이를 이용하여 성장할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 로도코커스 속 LS-31의 AHL 분해 효소 존재 확인
상기 실시예 3에서 로도코커스 속 LS-31이 AHL을 분해하여 성장하는 것을 확인하였다. 로도코커스 속 LS-31에서 아실화 호모세린 락톤을 분해하는 효소가 어디에 존재하는지를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1) HHL 분해 효소의 세포외 분비 확인
로도코커스 속 LS-31을 영양 배지(Nutrient Broth)[Merck 사] 5 ㎖에 접종한 다음, 30 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액과 세포를 따로 분리하였다. 위의 상층액 25 ㎕(cell 250 ㎕에 해당)에 HHL이 들어있는 MES 버퍼(pH 6.5) 175 ㎕를 첨가한 후(HHL 10 μM) 30 ℃에서 5시간 반응시켰다. 상기 실시예 3의 (1)에서와 동일한 방법으로 크로모박테리움 바이올라세움 CV026을 LB 평판배지에 올려놓은 바이오어쎄이 평판배지를 사용하여 바이올라세인 존의 직경을 측정하였다. 그 결과 1409 pmole의 HHL이 분해되었음을 확인하였다.
그러나, 세포를 초음파 분쇄처리 후 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음 수득한 상층액에서의 HHL 분해 활성을 조사한 결과, HHL이 분해되지 않았다. 따라서, HHL 분해 효소는 세포 내부에 존재하는 것이 아니라 세포 밖에 존재하는 효소임을 확인할 수 있었다.
(2) 로도코커스 속 LS-31의 OHHL 분해 효소의 존재 확인
상기 (1)에서와 동일한 방법을 사용하여 로도코커스 속 LS-31의 OHHL 분해 효소의 존재를 확인하였다. 수득한 상층액 50 ㎕(cell 500 ㎕에 해당)에 OHHL이 들어있는 MES 버퍼(pH 6.5) 150 ㎕를 첨가하여(OHHL 10 μM) 30 ℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 상기 실시예 3의 (2)에서와 동일한 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스를 LB 평판배지에 올려놓은 바이오어쎄이 평판배지를 사용하여 블루 존의 직경을 측정하였다. 그 결과, 1930 pmole의 OHHL이 분해되었음을 확인하였다.
상기의 결과들에서 로도코커스 속 LS-31은 세포 외부로 밀도인식 신호물질인 HHL과 OHHL를 분해하는 효소를 분비하며, 그 효소가 HHL과 OHHL을 분해하는 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 로도코커스 속 LS-31를 이용한 식물병 억제 실험
밀도인식 신호물질인 AHL을 분해하는 로도코커스 속 LS-31이 실제로 식물병을 조절하는 능력이 있는지를 살펴보았다.
식물 병원성 균주로는 AI(autoinducer)로 인해 병원성이 나타난다고 알려져 있는 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)를 사용하였으며, 적용 대상 작물로는 감자를 이용하였다. 병원균인 어위니아 카로토보라와 로도코커스 속 LS-31의 농도를 변화시키면서 감자에 처리하여 실험을 수행하였다.
병원균인 어위니아 카로토보라를 영양 배양액(Nutrient Broth)에서 30 ℃, 16시간 동안 배양하였다. 새로운 영양 배양액에 상기의 배양균을 1% 접종하여 30 ℃, 5시간 동안 재배양하였다.
상기와 같이 배양한 어위니아 카로토보라 배양액의 OD값을 1로 조정하고 10-1에서 10-4까지 연속희석하여 감자에 20 ㎕씩 접종시켰다. 감자는 가로 세로 3 ×3 ㎝로 잘라 사용하였으며, 아무것도 처리하지 않은 자연 그대로의 것을 사용하였다. 병의 발생은 육안으로 관찰하였으며, 16 내지 20시간이 경과한 후에 문드러진 형태의 무름병 증세가 나타나고 짙은 갈색을 띠면 감자에 병이 발생한 것으로 판단하였다.
로도코커스 속 LS-31은 영양 배양액에서 30 ℃, 16시간 동안 배양하였다. 새로운 영양 배양액에 상기의 배양균을 1% 접종하여 30 ℃, 5시간 동안 재배양하였다. 상기와 같이 배양한 LS-31 균주의 농도는 OD 값을 1로 조정하였다.
상기와 같이 준비한 로도코커스 속 LS-31과 어위니아 카로토보라의 균주 혼합액을 준비하고 균주 혼합액과 0.9% NaCl 수용액을 1 : 1로 혼합한 액 20 ㎕를 피펫팁으로 절단된 감자의 표면에 살짝 상처를 내면서 접종하고 24시간 후에 병의 발생을 확인하였다. 이때, +의 개수가 많을수록 무름병의 발생 정도가 심한 것이며, 이는 상기에서와 같이 육안으로 무른 부위를 측정하여 판별하였다.
병원균의 농도 10-1 10-2 10-3 10-4
무른 부위 크기 +++ ++ - -
-:무른 부위 없음, +: 무른 부위 약 1cm 이하, ++:약 1.5cm, +++:약 2.5cm
상기 표 1에서 나타냈듯이, 병원균인 어위니아 카로토보라 농도가 10-3일 때,로도코커스 속 LS-31의 농도가 1이면 무름병 발생이 억제됨을 확인하였다.
따라서, 상기 표 1과 도 3에 나타낸 바와 같이 로도코커스 속 LS-31이 병원균의 무름병 발생을 억제함을 확인하였다.
실시예 6: 유류오염 토양 및 녹조형성 오염수로부터 신호물질 분석
본 발명에서 분리한 신호물질 분해균주 로도코커스 속 LS-31이 다양한 신호물질을 분리할 수 있으므로, 로도코커스 속 LS-31이 오염환경의 생물학적 정화를 위한 미생물제로서의 응용 가능성이 있는지를 확인하기 위하여 다양한 오염원부터 그 자체에 다양한 신호물질들이 존재하는지를 조사하였다.
국내 유류 오염 토양 및 녹조 생성 오염수 샘플로부터 에틸아세테이트로 추출한 후 리포터 균주를 이용하여 자체에 존재하는 미생물에 의한 신호물질이 존재하는 지를 확인하였다.
상기의 방법을 통하여 분리한 유류 오염 토양 샘플 1 g에 트리스-Cl 버퍼(pH 7.0) 1 ㎖로 현탁하여 2 ∼ 3일 동안 실온에 방치한 후 상등액을 수득하여 에틸아세테이트 용매 500 ㎕을 넣고 잘 섞어 원심분리 후 에틸아세테이트 층만 수득한 다음 공기 중에서 에틸아세테이트만 제거하여 AHLs를 추출하였다. 그 후 소량의 에틸아세테이트 1 ㎕에 녹인 후 트리스-Cl 버퍼(pH 7.0) 20 ㎕에 현탁하여 상기 실시예 3의 (1)과 (2)처럼 바이오어쎄이 평판배지의 구멍에 올려놓았다. 또한, 녹조 발생 오염수의 경우는 오염수 500 ㎕에 에틸아세테이트 용매 500 ㎕을 넣고 잘 섞어 원심분리 후 에틸아세테이트 층만 수득한 다음 공기 중에서 에틸아세테이트만 제거하여 AHLs를 추출하였고, 이 후 과정은 유류 오염 토양 샘플에서와 같이 실행하였다.
유류 오염 토양 및 녹조 발생 오염수 중의 존재하는 신호물질로서 DHL (N-Decanoyl-homoserine lactone), OHHL(N-Oxohexanoyl-homoserine lactone)과 HHL(N-hexanoyl-homoserine lactone) 등이 확인되었다[도 4].
상기의 신호물질들은 분리균 로도코커스 속 LS-31에 의해서 분해가 가능하므로 본 발명에 의한 로도코커스 속 LS-31을 활용하여 생태계의 신호물질 농도를 변화시킴으로써 효과적인 생물학적 정화를 유도할 수 있을 것이다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 로도코커스 속 LS-31은 기존의 화학농약의 잔류 및 항생제 내성 균주 출현의 문제점 등을 해결하면서 환경 친화적으로 병원성 세균을 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 또한, 오염환경(오염토양 및 오염수)에 존재하는 신호물질을 분해시켜 신호물질 농도의 변화를 유도하여 신호물질 농도에 따라 변화하는 생태계 미생물의 다양한 대사활성을 변화시킴으로써 환경정화에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 분리된 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]의 HHL이 첨가된 최소배지에서 성장과 분해를 나타낸 그래프이다.
도 2는 분리된 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]에 의한 OHHL의 분해를 보여주는 바이오어쎄이 평판배지(bioassay plate) 사진이다.
도 3은 분리된 로도코커스 속 LS-31[KCTC 10521BP]의 병원성 균주 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 감자무름병에 대한 제어능을 보여주는 사진이다.
도 4는 유류 오염토양 및 녹조 발생 오염수에 존재하는 미생물에 의해서 AI(autoinducer)가 분비됨을 보여주는 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Rhodococcus sp. LS-31 Decomposing Acylated Homoserine Lactone <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1471 <212> DNA <213> Rhodococcus sp. LS-31 <400> 1 cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgagcgg taaggccttt cggggtacac 60 gagcggcgaa cgggtgagta acacgtgggt gatctgccct gcacttcggg ataagcctgg 120 gaaactgggt ctaataccgg atatgacctc ctatcgcatg gtgggtggtg gaaagattta 180 tcggtgcagg atgggcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ctaccaaggc 240 gacgacgggt agccgacctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga 360 cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg acgaagcgca 420 agtgacggta cctgcagaag aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480 tagggtgcaa gcgttgtccg gaattactgg gcgtaaagag ttcgtaggcg gtttgtcgcg 540 tcgtttgtga aaaccagcag ctcaactgct ggcttgcagg cgatacgggc agacttgagt 600 actgcagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660 accggtggcg aaggcgggtc tctgggcagt aactgacgct gaggaacgaa agcgtgggta 720 gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggcgct aggtgtgggt 780 tccttccacg gaatccgtgc cgtagctaac gcattaagcg ccccgcctgg ggagtacggc 840 cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat 900 taattcgatg caacgcgaag aaccttacct gggtttgaca tataccggaa agctgcagag 960 atgtggcccc ccttgtggtc agtntacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtngt 1020 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat cttatgttgc cagcacgtna 1080 tggtggggac tcgtaagaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatgtc cagggcttca cacatgctac aatggccagt acagagggct 1200 gcgagaccgt gaggtggagc gaatccctta aagctggtct cagttcggat cggggtctgc 1260 aactcgaccc cgtgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatga aagtcggtaa cacccgaagc 1380 cggtggctta accccttgtg ggagggagcc gtcgaaggtg ggatcggcga ttgggacgaa 1440 gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg c 1471

Claims (3)

  1. 아실화 호모세린 락톤(AHL)을 분해하는 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31) [KCTC 10521BP].
  2. 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)[KCTC 10521BP] 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아실화 호모세린 락톤(AHL)을 대사하는 병원성 식물병 억제제.
  3. 오염토양(汚染土壤) 및 오염수(汚染水)를 로도코커스 속 LS-31(Rhodococcus sp. LS-31)[KCTC 10521BP] 배양액으로 처리하여, 병원성 미생물 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤(AHL)의 농도를 감소시키는 방법.
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