KR100490699B1 - Trans-Splicing Ribozyme Mediated Selective Induction of Gene Activity in Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site-Expressing Cells - Google Patents

Trans-Splicing Ribozyme Mediated Selective Induction of Gene Activity in Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site-Expressing Cells Download PDF

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스의 IRES(Internal Ribosome Entry Site) 발현 세포에서만 표적된 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 선택적으로 특정 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 관한 것이다. 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임의 변형으로서, 상기 리보자임의 3' 엑손 부위에, HCV IRES 발현 세포에서 발현되어 HCV의 증식을 저해하는 유전자가 삽입되어 있고, 상기 HCV 증식저해-관련 유전자 앞에는 상기 리보자임에 의한 상기 HCV IRES의 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 상기 HCV IRES로부터 잘려 나가는 부위 이후의 3'부위에 해당되는 유전자가 삽입되어 있는 구조를 포함한다. 따라서 상기 HCV IRES 발현 세포에 주입하여 상기 HCV IRES와 트랜스-스플라이싱 반응시키면 상기 HCV IRES의 특정부위를 인지하여 상기 HCV의 생존에 필요한 유전자의 발현을 억제하거나 상기 HCV 증식저해-관련 유전자의 발현을 유도한다. 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의하면, HCV가 감염된 세포내에서 HCV RNA를 파괴할 수 있을 뿐만 아니라 항바이러스 단백질을 생산할 수 있을 것이므로 보다 효과적인 HCV의 증식을 억제시킬 수 있는 치료제를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. The present invention relates to trans-splicing ribozymes that selectively induce specific gene activity by targeted trans-splicing reactions only in IRES (Internal Ribosome Entry Site) expressing cells of hepatitis C virus. The trans-splicing ribozyme of the present invention is a modification of the trans-splicing group I ribozyme, wherein a gene that is expressed in HCV IRES expressing cells at the 3 'exon region of the ribozyme and inhibits the proliferation of HCV The gene is inserted in the 3 'region after the site cut out from the HCV IRES by the trans-splicing reaction of the HCV IRES by the ribozyme before the HCV proliferation-related gene It includes. Therefore, when injected into the HCV IRES-expressing cell and trans-splicing the HCV IRES, the specific region of the HCV IRES is recognized to inhibit the expression of a gene necessary for survival of the HCV or to express the HCV proliferation-associated gene. Induce. According to the trans-splicing ribozyme of the present invention, since HCV can not only destroy HCV RNA in infected cells but also produce antiviral protein, it can provide a therapeutic agent that can inhibit the growth of HCV more effectively. It is expected to be able.

Description

씨형 간염 바이러스의 아이알이에스 발현 세포에서만 선택적으로 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임{Trans-Splicing Ribozyme Mediated Selective Induction of Gene Activity in Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site-Expressing Cells}Trans-Splicing Ribozyme Mediated Selective Induction of Gene Activity in Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site-Expressing Cells}

(기술분야)(Technology)

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus: HCV)의 IRES(Internal Ribosome Entry Site) 발현 세포에서만 표적된 트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 반응에 의해 선택적으로 특정 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 관한 것이며, 보다 상세하게는 표적된 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 유전자의 활성을 유도하도록 하여, HCV에 감염된 세포에 대해서 HCV의 RNA를 파괴하거나 항바이러스 단백질을 생산하도록 함으로써, 효과적으로 HCV의 증식을 억제시킬 수 있는, 트랜스-스플라이싱 리보자임에 관한 것이다. The present invention is directed to trans-species that selectively induces specific gene activity by a targeted trans-splicing reaction only in IRES (Internal Ribosome Entry Site) expressing cells of Hepatitis C virus (HCV). Splicing ribozymes, and more specifically, targeted trans-splicing reactions to selectively induce the activity of HCV IRES dependent genes only in HCV IRES expressing cells, thereby allowing RNA of HCV against HCV infected cells. To trans-splicing ribozymes, which can effectively inhibit the proliferation of HCV by disrupting or producing antiviral proteins.

(배경기술)(Background)

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 non-A, non-B(아래의 참고문헌 1 및 2 참조, 이하 동일함) 간염을 유발하는 요인으로써 전세계적으로 대략 170만명이 감염되어있는 것으로 보고되고 있다(참고문헌 3). HCV는 간염을 일으키고 만성으로 진행되면 간경변을 거처서 종국에는 간암을 유발하게 된다(참고문헌 4 및 5). HCV 간질환은 아직까지 효과적인 치료법이 존재하지 않는다. 다만 HCV 감염 치료제로서 α-인터페론(interferon)과 리바비린(ribavirin)을 동시에 투여하는 방법과, PEG에 의해 변형된 α-인터페론을 이용한 방법이 있지만, 한정된 환자에서만 바이러스가 제거되거나 독성을 유발시킬 수 있는 문제가 있기 때문에(참고문헌 6 내지 8 참조), 좀더 특이적이며 효과적인 항바이러스제 또는 치료법이 개발될 것이 요구되고 있다. Hepatitis C virus (HCV) is a factor that causes non-A and non-B (see references 1 and 2 below, same below) hepatitis, which affects approximately 1.7 million people worldwide. It is reported (Ref. 3). HCV causes hepatitis and chronic progression to cirrhosis, eventually leading to liver cancer (Refs. 4 and 5). HCV liver disease does not yet have an effective treatment. However, there is a method of simultaneously administering α-interferon and ribavirin as a therapeutic agent for HCV infection, and a method using α-interferon modified by PEG, which can remove or cause toxicity in a limited number of patients. Because of the problems (see references 6 to 8), more specific and effective antiviral agents or therapies are required to be developed.

HCV는 플라비비리다에(Flaviviridae) 과에 속하는 약 9600개의 염기서열을 가진 양성 단일가닥 RNA 바이러스이다(참고문헌 9, 10). 바이러스의 게놈이 오직 RNA 형태로 존재함에 따라, HCV의 치료제로서 HCV 염기서열을 표적으로 하는 여러 가지 리보자임(ribozyme)을 이용한 방법이 개발되어 있으나(참고자료 11-14), 트랜스-클리비지(절단) 리보자임(trans-cleavage ribozyme)을 이용하는 경우 감염된 세포내에 존재하는 HCV RNA를 완전히 절단하거나 제거하기 어렵기 때문에 HCV의 증식이 계속 유지될 수 있다는 한계가 있다. 따라서 바이러스가 감염된 세포내에서 바이러스의 RNA를 파괴할 수 있을 뿐만 아니라 항바이러스 단백질을 생산할 수 있는 방법을 시도함으로써 좀 더 효과적으로 HCV의 증식을 억제시킬 수 있는 치료제를 개발할 필요성이 요구된다. HCV is a positive single-stranded RNA virus with about 9600 nucleotide sequences belonging to the family Flaviviridae (Refs. 9 and 10). Since the genome of the virus is only in the form of RNA, several ribozymes have been developed to target HCV sequences as a therapeutic for HCV (Refs. 11-14). When using trans-cleavage ribozyme, it is difficult to completely cleave or remove HCV RNA present in infected cells, thereby limiting the proliferation of HCV. Therefore, there is a need to develop a therapeutic agent that can more effectively inhibit the proliferation of HCV by attempting a method capable of producing antiviral protein as well as destroying the RNA of virus in infected cells.

테트라하이메나 서모필라(Tetrahymena themophila)로부터 셀프-스플라이싱 그룹 Ⅰ 인트론(self-splicing group I intron)은, 자기 자신의 3' 끝에 부착되어 있는 엑손(exon) RNA를 트랜스하게 존재하는 5'엑손을 표적으로 하여 스플라이싱 시키므로써 분리되어 존재하는 전사체를 서로 연결시킬 수 있는 트랜스-스플라이싱 반응을 일으키며, 이런 반응은 실험관(참고문헌 15 참조)에서 뿐만 아니라 E.coil(참고문헌 16 참조)와 포유류 세포내(참고문헌 17 참조)에서도 일어날 수 있다는 것이 보고되었다. Self-splicing group I introns from Tetrahymena themophila are transfected with 5 'exons present in the exon RNA attached to their 3' end. By splicing the target to produce a trans-splicing reaction that can separate the existing transcripts from one another, such as in E. coil (Ref. 16) as well as in a test tube (see Ref. 15). And also in mammalian cells (see Ref. 17).

이런 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용했을 경우 여러 유전질환과 암에 관련 있는 유전자의 전사체도 보정될 수 있다는 것 또한 알려져 있고(참조문헌 18-21), 이스트 세포내에서 바이러스 RNA만을 선택적으로 트랜스-스플라이싱 한 후에 자기 자신의 3' 엑손에 부착되어 있는 독성을 가진 유전자의 발현을 유도함으로서 세포의 성장을 억제할 수 있다는 연구가 보고되었다(참고문헌 22). It is also known that the use of such trans-splicing ribozymes can also correct transcripts of genes involved in several genetic diseases and cancers (Refs. 18-21), and selectively transfects only viral RNA within yeast cells. A study has been reported that after splicing can inhibit the growth of cells by inducing the expression of toxic genes attached to their own 3 'exons (Ref. 22).

본 발명의 목적은, HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 클리비지(절단)나 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제공하고자 하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a trans-splicing ribozyme that selectively induces HCV IRES dependent cleavage (cleavage) or gene activity only in HCV IRES expressing cells.

본 발명의 목적은, 표적된 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 클리비지나 유전자 활성을 유도하여, HCV에 감염된 세포에 대해서 HCV의 RNA를 파괴하거나 항바이러스 단백질을 생산하도록 함으로써, 새로운 개념의 효과적인 HCV의 치료(증식억제) 방법으로 사용할 수 있도록 하고자 하는 것이다. An object of the present invention is to selectively induce HCV IRES dependent cleavage or gene activity in HCV IRES expressing cells only through targeted trans-splicing reactions, thereby destroying the RNA of HCV or blocking antiviral protein against HCV infected cells. It is intended to be used as a new concept of effective HCV treatment (proliferation suppression).

본 발명에 따라, HCV의 IRES을 표적으로 한 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 클리비지나 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임이 제공된다. In accordance with the present invention, trans-splicing ribozymes that selectively induce HCV IRES dependent cleavage or gene activity are provided only in HCV IRES expressing cells via a trans-splicing reaction targeting the IRES of HCV.

본 발명에 따라, 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임의 변형으로서, 상기 리보자임의 3' 엑손 부위에, HCV IRES 발현 세포에서 발현되어 HCV의 증식을 저해하는 유전자가 삽입되어 있고, 상기 HCV 증식저해-관련 유전자 앞에는 상기 리보자임에 의한 상기 HCV IRES의 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 상기 HCV IRES로부터 잘려 나가는 부위 이후의 3'부위에 해당되는 유전자가 삽입되어 있는 구조를 포함하고, 상기 HCV IRES 발현 세포에 주입하여 상기 HCV IRES와 트랜스-스플라이싱 반응시키면 상기 HCV IRES의 특정부위를 인지하여 상기 HCV의 생존에 필요한 유전자의 발현을 억제하거나 상기 HCV 증식저해-관련 유전자의 발현을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임이 제공된다. According to the present invention, as a modification of the trans-splicing group I ribozyme, at the 3 'exon region of the ribozyme, a gene expressed in HCV IRES expressing cells and inhibiting the proliferation of HCV is inserted, and the HCV proliferation Inhibition-related genes include a structure in which the gene corresponding to the 3 'region after the site cut out from the HCV IRES by the trans-splicing reaction of the HCV IRES by the ribozyme is inserted, and the HCV IRES Trans-splicing reaction with the HCV IRES by injecting into expressing cells recognizes a specific region of the HCV IRES to inhibit expression of genes necessary for survival of the HCV or to induce expression of the HCV proliferation-related gene. Splicing ribozymes are provided.

이런 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 선택적으로 HCV IRES를 발현시킨 세포에서만 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 상기 HCV 증식저해-관련 유전자를 HCV IRES 의존성 번역에 의해 유도할 수 있게 된다. 따라서 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은, HCV 감염성 질환에 대한 특이적이고 효과적으로 신규유전자 활성을 유도시킬 수 있는 항바이러스제로서의 가능성을 가지게 된다. Such trans-splicing ribozymes according to the present invention can induce the HCV proliferation-related gene by HCV IRES dependent translation by a trans-splicing reaction only in cells that selectively express HCV IRES. . Thus, the trans-splicing ribozyme according to the present invention has the potential as an antiviral agent capable of inducing novel gene activity specifically and effectively for HCV infectious diseases.

상기 HCV 증식저해-관련 유전자는 세포내에서 발현되어 HCV의 증식을 억제시킬 수 있는 유전자로서, 예를 들어 디프테리아 독소 A 체인(diphtheria toxin A chain)과 같은 독소 유전자를 적용할 수도 있다. 이 경우 HCV IRES가 발현되는 세포내에서 독성 유전자의 발현이 유도되고 따라서 특이적으로 HCV IRES가 발현되는 세포의 성장이 억제한다. 상기 증식저해-관련 유전자는 외부에서 리보자임에 도입하는 유전자라는 개념에서 이하, "신규유전자"라는 명칭을 혼용해 사용한다. The HCV proliferation-related gene is a gene that can be expressed in a cell to inhibit the growth of HCV. For example, a toxin gene such as diphtheria toxin A chain may be applied. In this case, expression of virulence genes is induced in cells expressing HCV IRES, thus inhibiting growth of cells expressing HCV IRES specifically. The proliferation-associated gene is used interchangeably with the name "new gene" in the concept of a gene introduced into the ribozyme from the outside.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은, 세포내에 주입되었을 때 HCV IRES의 특정부위를 인식하는 선택적인 트랜스-스플라이싱 반응을 일으키며, 결과로서 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 절단을 유발하여 HCV의 생존에 필요한 유전자의 발현을 억제시킨다. Trans-splicing ribozymes according to the invention, when injected intracellularly, result in a selective trans-splicing reaction that recognizes a specific site of HCV IRES, resulting in selective HCV IRES dependent cleavage only in HCV IRES expressing cells. Inhibits the expression of genes necessary for the survival of HCV.

또한, 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱은, 세포내에 주입되었을 때 HCV IRES의 특정부위를 인식하는 선택적인 트랜스-스플라이싱 반응을 일으키며, 결과로서 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 유전자(증식저해-관련 유전자: 신규유전자)의 활성을 유도한다. In addition, trans-splicing according to the present invention, when injected into a cell, results in a selective trans-splicing reaction that recognizes a specific site of HCV IRES, resulting in selective HCV IRES dependent genes only in HCV IRES expressing cells. Induces the activity of (proliferation-associated genes: novel genes).

본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은, HCV의 5'비해독 부위(5'untranslated region: 5'UTR)에 존재하는 IRES를 표적으로 한다. 이 부위는 여러 다른 HCV 이소타입(isotype)들 간에 매우 보전적인 부위로 알려져 있으며(참조문헌 23), HCV 복제에 중요한 HCV IRES 의존성 번역과정에 관여하는 것으로 알려져 있다(참고문헌 24, 25). The trans-splicing ribozymes of the present invention target the IRES present in the 5'untranslated region (5'UTR) of HCV. This site is known to be a very conserved site between several different HCV isotypes (Ref. 23) and is involved in HCV IRES dependent translation processes important for HCV replication (Refs. 24 and 25).

RNA 내의 어떠한 우리딘 부위와도 결합 할 수 있는 무작위적인 IGS(internal guide sequence)를 가진 리보자임 라이브러리를 이용하여 HCV IRES RNA와 트랜스-스플라이싱 반응시켜 IRES RNA에 대한 최적인지부위를 지도로 제작한다. Mapping the optimal site for IRES RNA by trans-splicing with HCV IRES RNA using a ribozyme library with a random internal guide sequence (IGS) that can bind to any uridine site in RNA do.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임으로 HCV RNA를 절단하면 절단된 염기 이후의 HCV RNA 염기들은 잘려져 나가고, 대신에 절단된 HCV RNA의 3' 부위에 리보자임의 3' 엑손 부위가 연결되게 되는데, 이때 리보자임의 3' 엑손에는 상기 잘려져 나간 HCV 5'UTR의 3'부위와 이에 연결되어 있는 상기 신규유전자가 융합된다(도1 참조). When the HCV RNA is cleaved with the trans-splicing ribozyme according to the present invention, the HCV RNA bases after the cleaved base are cut off, and instead, the 3 'exon portion of the ribozyme is linked to the 3' region of the cleaved HCV RNA. In this case, the 3 'exon of the ribozyme is fused to the 3' region of the cut out HCV 5'UTR and the novel gene connected thereto (see FIG. 1).

도1은 HCV IRES를 표적으로 한 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 상기 신규유전자 RNA의 선택적 유발에 관한 모식도로서, HCV IRES의 어떠한 U 염기도 상기 리보자임의 IGS를 통한 염기결합을 통해 인식되어 잘려질 수 있다. 본 발명의 리보자임은 표적 RNA의 3'의 잘려진 생산물을 배출시키고, 그곳을 HCV IRES 5'UTR 염기서열의 3'부분(IRES 3'부분)과 연결되어진 새로운 유전자 RNA 염기서열을 가지는 것으로 대치시킨다. 1 is a schematic diagram of selective induction of the novel gene RNA by trans-splicing ribozyme according to the present invention targeting HCV IRES, wherein any U base of HCV IRES is subjected to base binding through IGS of ribozyme Can be recognized and truncated. The ribozyme of the present invention releases the 3 'truncated product of the target RNA and replaces it with a new gene RNA sequence linked to the 3' portion (IRES 3 'portion) of the HCV IRES 5'UTR sequence. .

따라서, 트랜스-스플라이싱 된 결과산물의 앞에는 완전한 HCV IRES가 존재하게 되고, 상기 신규유전자의 발현이 HCV IRES에 의존된다. 이때 HCV의 코어 단백질의 N-말단 부위가 HCV의 IRES 의존성 번역과정을 효과적으로 수행하기 위해 필요하다고 보고되어 있으므로(참고문헌 26), 상기 신규유전자를 HCV의 5'UTR 바로 뒤에 있는 코어의 5' 말단 염기서열과 프레임 안으로 융합되게 한다. Thus, the complete HCV IRES is present in front of the trans-spliced product, and the expression of the novel gene is dependent on the HCV IRES. Since the N-terminal region of the core protein of HCV is reported to be necessary for effectively performing the IRES-dependent translation process of HCV (Ref. 26), the 5 'end of the core immediately behind the 5'UTR of HCV is reported. Allow fusion with the base sequence into the frame.

결국 정확한 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 HCV의 완전한 5'UTR이 복구되며, 그 결과 HCV의 코어 단백질의 N-말단과 융합된 하이브리드 단백질 형태로 신규유전자 산물이 유도된다. Eventually, the correct trans-splicing reaction restores the complete 5'UTR of HCV, resulting in a novel gene product in the form of a hybrid protein fused with the N-terminus of the HCV's core protein.

본 발명자들은 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의하여 HCV IRES가 존재하는 세포에서만 특이적으로 상기 신규유전자의 활성이 유도될 수 있는지 알기 위해, 상기 신규유도 유전자(리포터)로서 개똥벌레 루시페라제(firefly luciferase)를 사용하여 실험하였다. In order to know whether the activity of the novel gene can be specifically induced in a cell in which HCV IRES is present by the trans-splicing ribozyme according to the present invention, the firefly Lucy as the novel inducing gene (reporter) Experiments were carried out using firefly luciferase.

또한 본 발명자들은, 인간세포에서 선택적인 표적 RNA의 발현으로 본 발명의 리보자임이 HCV IRES를 특이적으로 인식하여 단백질 번역과정을 저해하고 세포파괴를 일으키는 세포독성활성을 유도하는지를 알기 위해, 신장인자(elongation factor) 2(ef2)의 디프타미드 그룹을 효소적으로 리보스화(ribosylation) 시키는 디프테리아 독소(diphtheria toxin A: DTA) 등을 사용하여 실험하였다(참고문헌 27, 28). In addition, the present inventors, to know whether the ribozyme of the present invention specifically recognizes HCV IRES by inducing expression of target RNA in human cells, inhibits the protein translation process and induces cytotoxic activity that causes cell destruction. The diphtamide group of elongation factor 2 (ef2) was tested using diphtheria toxin A (DTA) to enzymatically ribose (ribosylation) (Refs. 27 and 28).

이와 같이, 본 발명자들은 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임(trans-splicing group I ribozyme)이 HCV IRES RNA를 특이하게 인식하는 부위를 찾아내고, 상기 리보자임의 트랜스-스플라이싱에 의해 신규유전자를 HCV IRES RNA에 융합함으로써, HCV IRES RNA가 발현되는 인체의 세포내에서만 상기 신규유전자가 선택적으로 활성 유도됨을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이른 것이다. As such, the inventors have found a site where the trans-splicing group I ribozyme specifically recognizes HCV IRES RNA, and by trans-splicing the ribozyme By fusion of HCV IRES RNA, the novel gene is found to be selectively induced only in cells of the human body in which HCV IRES RNA is expressed, thus completing the present invention.

(실시예)(Example)

이하, 실시예와 첨부도면을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. The following examples are merely illustrative of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

실시예 1: HCV IRES RNA를 이용한 실험관내 지도의 제작Example 1 Preparation of In Vitro Map Using HCV IRES RNA

HCV IRES RNA 내에서 트랜스-스플라이싱 리보자임에 대한 최적인지부위를 탐색하기 위해 무작위적인 IGS를 가진 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용해 RNA 지도를 제작했다(참고문헌 17, 18). RNA maps were constructed using trans-splicing ribozymes with random IGS to search for optimal recognition sites for trans-splicing ribozymes in HCV IRES RNA (Refs. 17 and 18).

이를 위해 HCV IRES의 +18 부위부터 +402부위까지 포함되어 있는 DNA (pSK(-)18-402 IRES CAT) 플라스미드(참고문헌 35)를 BamHI으로 절단한 후 T7RNA 폴리머라제를 이용해 생체외 전사를 통하여 RNA를 만들었다. 표적 RNA(HCV IRES)에 대한 상기 리보자임의 최적인지 부위를 탐색하기 위해 우선 표적 RNA인 HCV IRES RNA(50nM)를 스플라이싱 조건 반응버퍼(50mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl, 5nM MgCl2)와 0.1mM GTP와 섞은 후 37℃에서 5분간 열을 가해주며 리보자임 RNA 라이브러리(50nM)는 반응버퍼와 섞은 후 50℃에서 5분간 반응시킨 후 37℃에서 2분간 반응시킴으로써 올바른 3차 구조 형성을 유도한 후 두 반응물을 잘 섞어준 다음 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 산물을 역전사-PCR 클로닝 및 염기서열 분석하였다.To this end, DNA (pSK (-) 18-402 IRES CAT) plasmid (Reference 35), which is contained from +18 to +402 of HCV IRES, was digested with BamHI and in vitro transcription using T 7 RNA polymerase. RNA was made through. In order to search for the optimal site of the ribozyme for the target RNA (HCV IRES), the target RNA, HCV IRES RNA (50 nM), was first spliced under a reaction buffer (50 mM HEPES pH7.0, 150 mM NaCl, 5 nM MgCl 2 ). After mixing with 0.1mM GTP and heat for 5 minutes at 37 ℃, ribozyme RNA library (50nM) is mixed with the reaction buffer and reacted for 5 minutes at 50 ℃ and 2 minutes at 37 ℃ to form the correct tertiary structure After induction, the two reactants were mixed well and reacted at 37 ° C. for 3 hours. The reaction product was reverse transcription-PCR cloning and sequencing.

실시예 2: 트랜스-스플라이싱 리보자임의 제작Example 2 Preparation of Trans-Splicing Ribozyme

pT7L-21 플라스미드(참고문헌 16)를 이용해 T7프로모터와 각각의 IRES의 seq를 포함한 5'프라이머와 3'엑손에 특이하게 결합하는 프라이머(참고문헌 16,17)를 이용해 PCR 과정을 거쳐 Rib195-, Rib199-, Rib251-, Rib380-3' 태그 리보자임들을 만들었다. 이때 컨트롤로서 촉매 코어 부위가 제거된 각각의 불활성 리보자임도 제작하였다. Rib199-3' 태그된 리보자임을 ScaI으로 절단한 후 생체외 전사를 통해 3'엑손이 제거된 Rib199 리보자임 RNA를 얻었다. PCR was carried out using a pT7L-21 plasmid (Ref. 16) using a T7 promoter and a primer that specifically binds to the 5 'primer containing the seq of each IRES and a 3'exon (Refs. 16, 17). Rib199-, Rib251-, and Rib380-3 'tagged ribozymes were created. At this time, each inert ribozyme having a catalyst core portion removed as a control was also prepared. Rib199-3 'tagged ribozyme was cleaved with ScaI and Rib199 ribozyme RNA from which 3' exons were removed through in vitro transcription was obtained.

Rib199FL 구조의 경우, 와일드-타입 그룹 I 인트론의 IGS인 GGAGGG를 GAGAAA로 바꾸고 3'엑손의 멀티클로닝 사이트를 이용해 HCV 5UTR의 일부인 200-402 seq와 개똥벌레 루시페라제 유전자를 삽입하였다. 또한 Rib 199??FL의 경우 3' 엑손에 IRES(264-380)/개똥벌레 루시페라제 유전자를 삽입하였다. For the Rib199FL structure, GGAGGG, the IGS of the wild-type group I intron, was changed to GAGAAA, and 200-402 seq and the firefly luciferase gene, part of HCV 5UTR, were inserted using the multicloning site of the 3 'exon. In the case of Rib 199 ?? FL, IRES (264-380) / firefly luciferase gene was inserted into 3 'exon.

pSVR199DT 구조의 경우 Rib199IFL에서 Fluc RNA를 제거하고 대신에 DTA의 유전자를 삽입한 후 Rib199 리보자임 seq와 3'엑손 부위의 IRES/DTA유전자를 EcoRI, XbaI으로 자른 후 SV40 프로모터에 의해 발현되는 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 가지고 있는 pSEAP에 삽입하였다. pSVR199DTAS 구조의 경우 pSVR199DT에 HindIII와 EcoRI으로 자른 후 fluc 유전자에 결합할 수 있는 210개의 안티센스를 삽입하고 다시 EcoRI 사이트를 이용해 200개의 링커 DNA 염기를 삽입하였다. In the case of pSVR199DT structure, Fluc RNA was removed from Rib199IFL, and instead, DTA gene was inserted. Instead, Rib199 ribozyme seq and IRES / DTA genes of 3 'exon were cut with EcoRI and XbaI and alkaline phosphatase expressed by SV40 promoter. (alkaline phosphatase) was inserted into pSEAP. In the case of pSVR199DTAS structure, 210 antisenses capable of binding to the fluc gene were inserted into pSVR199DT, which were cut by HindIII and EcoRI, and 200 linker DNA bases were inserted again using EcoRI site.

실시예3: 기질의 제작Example 3 Preparation of Substrate

IRES/Fluc RNA는 Fluc RNA가 HCV IRES에 연결되어 있는 형태로 pR/HCV/F를 Not I로 절단한 후 실험관내에서 전사 시켰으며. Fluc RNA의 경우 pR/HCV/F 플라스미드에서 HCV IRES와 Rluc유전자를 제거한 후 실험관내에서 전사시켰다. Rluc RNA 는 pR/HCV/F플라스미드를 SalI으로 자른 후 실험관내에서 전사시켰다. pR/IRES플라스미드는 pR/HCV/F플라스미드를 XbalI과 NotI으로 자른 후 E.coil의 DNA 중합효소 중에 하나인 Klenow 효소를 이용해 매운 후 형태로 CMV 프로모터 조절 아래에 Rluc유전자가 발현되고 그 뒤에 HCV IRES가 연결되어있다. IRES / Fluc RNA is a form in which Fluc RNA is linked to HCV IRES and pR / HCV / F was cut to Not I and transcribed in vitro. In the case of Fluc RNA, HCV IRES and Rluc genes were removed from the pR / HCV / F plasmid and transcribed in vitro. Rluc RNA was transcribed in vitro after cutting the pR / HCV / F plasmid with SalI. pR / IRES plasmid is cut into pR / HCV / F plasmid with XbalI and NotI, and then spliced with Klenow enzyme, one of E.coil's DNA polymerases, followed by expression of Rluc gene under CMV promoter control followed by HCV IRES. Is connected.

pIRES/F벡터의 경우 pR/HCV/F플라스미드를 PstI을 자른 후 자신끼리 연결시킨 형태로 CMV 프로모터와 HCV IRES에 의존성 번역을 하는 Fluc유전자를 포함하고 있다. pCMV/R은 pR/HCV/F를 Sal I와 Not I로 잘라서 메운 형태로 CMV프로모터 조절아래에 RLuc 유전자가 발현된다. The pIRES / F vector contains the Fluc gene, which translates the pR / HCV / F plasmid into a CMV promoter and HCV IRES in the form of a linkage between themselves after cutting PstI. pCMV / R cuts pR / HCV / F into Sal I and Not I and fills it with RLuc gene expression under CMV promoter control.

실시예4: 트랜스-클리비지와 트랜스-스플라이싱Example 4 Trans-Clibbage and Trans-Splicing

세포내로 RNA를 주입하기 위해 Poly(A) 폴리머라제를 이용해 RNA 3'말단에 poly(A)를 첨가 해 주었다. 35mm 디시에 293T 셀을 3.0X105 셀로 심고 70-80% 자랐을 때 세포내로 주입시켰다. 이때 0.5㎍ IRES/Fluc RNA 또는 Fluc RNA를 0.5㎕ Rluc RNA와 각각 4㎕의 Rib199 RNA, tRNA Rib(d)199 RNA와 잘 섞은 후 3㎕의 DMRIE-C를 사용해 세포내로 주입시켰다. 세포주입 후 24시간 이후 세포를 깨고 루미노메터 TD-20/20(Tumer Desiges Instrument)을 이용해 루시페라제 활성을 측정하였다.In order to inject RNA into the cell, poly (A) was added to the RNA 3 'end using Poly (A) polymerase. 293T cells were seeded into 3.0 × 10 5 cells at 35 mm dish and injected intracellularly when grown 70-80%. 0.5 μg IRES / Fluc RNA or Fluc RNA was mixed well with 0.5 μl Rluc RNA, 4 μl Rib199 RNA and tRNA Rib (d) 199 RNA, respectively, and injected into the cell using 3 μl of DMRIE-C. After 24 hours after cell injection, cells were disrupted and luciferase activity was measured using a luminometer TD-20 / 20 (Tumer Desiges Instrument).

세포내에서의 트랜스-스플라이싱 반응을 확인하기 위해서 1㎍의 HCV IRES RNA와 4㎍의 Rib199-3 태크 RNA 또는 rib(d)199-3' 태그 RNA를 293T 세포내로 주입시켰다. 이때 'mix' 샘플을 만들기 위해서 HCV IRES만 그리고 Rib199-3 태그만 각각 주입시킨 세포를 얻은 후 그 용해물을 섞었다. 세포 주입 후 24시간 후에 세포를 깨고 세포의 전체 RNA를 얻었다(참고자료 36). 이중 5㎍의 RNA를 가지고 100mM L-아르기닌아미드와 3'엑손에 특이성을 가진 3'프라이머(5'-GGGGAATTCA CCGGGTCCTTTCTTCGA-3')를 PCR을 통해 DNA를 증폭시킨 후 클론링 염기서열을 분석했다. To confirm the trans-splicing response in cells, 1 μg of HCV IRES RNA and 4 μg of Rib199-3 tag RNA or rib (d) 199-3 ′ tagged RNA were injected into 293T cells. At this time, in order to make a 'mix' sample, cells obtained by injecting only HCV IRES and only Rib199-3 tags were mixed, and the lysates were mixed. Twenty four hours after the cell injection, the cells were broken and cell total RNA was obtained (Ref. 36). Among them, 5 μg of RNA was used to amplify the DNA by PCR with a 3 'primer (5'-GGGGAATTCA CCGGGTCCTTTCTTCGA-3') having specificity for 100 mM L-arginineamide and 3 'exon.

실시예5: 세포내에서 트랜스-스플라이싱 리보자임 활성 측정Example 5: Determination of trans-splicing ribozyme activity in cells

35mm 디시에 293T 세포 또는 Huh-7세포를 3.0X105 셀로 심고 24 시간 후에 1㎍ pR/IRES와 각각 5㎍의 Rib199FL, tRNA Rib199??FL를 세포내로 주입시켰다. 이때 리보자임 자체의 활성을 측정하기 위해서 표적 RNA 없이 Rluc가 발현되는 pTKR(TK프로모터에 의해 Rluc가 발현됨) 플라스미드를 5㎍의 Rib199FL, tRNA Rib199??FL와 같이 세포내로 주입시켰다. 세포주입 실험 후 24시간 뒤에 세포를 깨고 전술한 방법으로 루시페라제 활성을 측정하였다. 이때 컨트롤로써 불활성 리보자임을 사용하였을 경우 루시페라제 활성이 보이는 것을 관찰하였는데 이는 트랜스-스플라이싱에의 결과라기보다는 불활성 리보자임 내에 fluc유전자의 번역을 시작할 수 있는 부위가 있다고 보고되어 있으므로(참고문헌 21), 따라서 컨트롤로서 사용을 할 수가 없었다.293T cells or Huh-7 cells in 35 mm dish were planted with 3.0 × 10 5 cells, and after 24 hours, 1 μg pR / IRES, 5 μg Rib199FL and tRNA Rib199 ?? FL were injected intracellularly. At this time, in order to measure the activity of ribozyme itself, pTKR (Rluc is expressed by the TK promoter) plasmid expressing Rluc without target RNA was injected into cells, such as 5 μg of Rib199FL and tRNA Rib199 ?? FL. 24 hours after the cell injection experiment, cells were disrupted and luciferase activity was measured by the method described above. When inert ribozyme was used as a control, luciferase activity was observed, which is reported to be the site where translation of fluc gene can be started in inactive ribozyme rather than as a result of trans-splicing. Document 21), therefore, could not be used as a control.

독성효소를 측정하기 위해 Huh-7세포에 0.2㎍의 pCMV/R과 5㎍의 pIRES/F를 0.75㎍ pSVR199T 또는 pSVR199asdt를 세포내로 주입시켰다. 이때 리보자임자체의 독성효과를 측정하기 위해서 HCV IRES 없이 각각의 리보자임 0.75㎍과 pCMV/R, pCMV-?? gal(Clonetech)을 세포내로 주입시켰다. 또한 300ng pEGFP-N1(Clonetech)과 1.4㎍ pSVR199DT, pSVR199ASDT를 300ng pIRES/F와 같이 세포내로 주입시킨 후 24시간 이후 GFP의 발현을 관찰하였다. 컨트롤로서 pEGFP-N1, pIRES/F, 1.4㎍ SEAP를 주입시켰다. Huh-7 cells were injected with 0.25 μg pCMV / R and 5 μg pIRES / F intracellularly with 0.75 μg pSVR199T or pSVR199asdt. In order to measure the toxic effects of ribozyme itself, each of ribozyme 0.75㎍, pCMV / R, pCMV- ?? gal (Clonetech) was injected intracellularly. In addition, the expression of GFP was observed 24 hours after injection of 300ng pEGFP-N1 (Clonetech), 1.4μg pSVR199DT, and pSVR199ASDT into cells, such as 300ng pIRES / F. PEGFP-N1, pIRES / F, 1.4 μg SEAP was injected as a control.

결과result

이상과 같은 방법들을 통해 분석된 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 관련된 결과들은 다음과 같다. Results related to the trans-splicing ribozyme according to the present invention analyzed through the above methods are as follows.

1. 접근하기 쉬운 우리딘을 찾기 위한 HCV IRES RNA 지도제작1. HCV IRES RNA Mapping to Find Accessible Uridine

스플라이싱 부위의 염기서열 분석을 토대로 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 인식되는 HCV IRES에서의 몇 개의 우리딘 위치를 알 수 있었으며, 반응을 통해 얻어진 결과 대부분의 반응을 도메인 IIIb의 루프 부위에서 일어나는 것을 관찰되었다(도2 참조). Based on the sequencing of the splicing site, several uridine positions in the HCV IRES recognized by the trans-splicing ribozyme were identified. Most of the results obtained from the reaction resulted in the loop region of domain IIIb. What happened was observed (see Figure 2).

도2는 HCV IRES RNA을 이용한 실험관내 지도제작을 설명하는 모식도로서, Honda(참고문헌 37) 등의 연구에 근거하여 HCV 5'UTR과 바로 이어져 나오는 ORF 하류부분의 2차 구조예측과 RNA 내 리보자임이 접근하기 쉬운 부분의 지도제작의 결과를 나타낸다. 여기에서 화살표로 나타낸 염기서열은 실험관내 지도제작 분석으로부터 확인된 리보자임이 접근하기 쉬운 우리딘이다. 스플라이싱 부분에 주어진 우리딘을 가지는 클론수는 괄호 안에 나타내었다. 342염기서열에 A잔기를 가지는 HCV 껍질 단백질을 발현하는 유전자의 시작 암호는 영역Ⅳ에 위치한다. 도2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 HCV IRES RNA의 199U 부위가 가장 많이 인식되었다. FIG. 2 is a schematic diagram illustrating in vitro mapping using HCV IRES RNA, based on Honda's (Ref. 37), etc., secondary structure prediction of the ORF downstream portion directly linked to HCV 5'UTR, and ribo RNA in RNA. Represents the results of cartography of parts that Zime is easily accessible. Here, the nucleotide sequences indicated by the arrows are uridines that are accessible to ribozymes identified from in vitro mapping analysis. The number of clones with uridine given in the splicing section is shown in parentheses. The starting code of the gene expressing the HCV shell protein having the A residue in the 342 base sequence is located in region IV. As shown in Figure 2, the 199U site of HCV IRES RNA was most recognized by the trans-splicing ribozyme according to the present invention.

상기 부위들이 정말로 가장 잘 인식되는 부위인가를 알아보기 위해 지도제작분석을 통해 확인된 195U, 199U, 251U를 인식하는 리보자임과 지도제작 결과에서 나오지 않는 380U를 인식하는 리보자임을 제작해, HCV IRES RNA와 반응을 시킨 후 역전사 PCR를 수행한 결과는 도3과 같다. HCV IRES was designed to recognize the 195U, 199U and 251U identified by the cartographic analysis and the 380U not recognized in the mapping results to see if the sites were really recognized. After the reaction with the RNA, the result of reverse transcription PCR is shown in FIG. 3.

도3은 실험관내 트랜스-스플라이싱 RNA 결과물의 RT-PCR을 통한 분석결과의 도면이며, 활성(Rib-3'태그, 100nM; 레인 3-6) 또는 불활성(R9(d)-3'태그, 100nM: 레인 7-10) 리보자임들을 HCV IRES(10nM)와 반응시키고 난 후, 트랜스-스플라이싱 되어진 결과물을 증폭시킨 것이다. FIG. 3 is a diagram of the results of analysis via RT-PCR of in vitro trans-splicing RNA results and is either active (Rib-3 ′ tag, 100 nM; lane 3-6) or inactive (R9 (d) -3 ′ tag. , 100 nM: lanes 7-10) After the ribozymes were reacted with HCV IRES (10 nM), the trans-spliced result was amplified.

도3에 도시된 바와 같이, Rib195-, Rib199-, Rib251-3' 태그에서 예상된 크기의 반응 산물을 확인할 수 있었으며(도3의 레인 3-5), Rib380-3'태그의 경우에는 트랜스-스플라이싱 반응 산물을 관찰할 수 없었다(도3의 레인 6). 이러한 결과로부터 HCV의 380U 부위는 리보자임이 인식하기 어려운 부위라는 것을 알 수 있었다. As shown in FIG. 3, the reaction products of the expected size were identified in the Rib195-, Rib199-, and Rib251-3 'tags (lanes 3-5 in FIG. 3), and in the case of the Rib380-3' tag, the trans- No splicing reaction product could be observed (lane 6 in FIG. 3). From these results, it can be seen that the 380U site of HCV is a difficult site to recognize ribozyme.

또한 컨트롤러서 촉매 코어(catalytic core) 부위가 제거된 불활성 리보자임 또는 HCV IRES RNA만을 가지고 트랜스-스플라이싱 반응시켰을 경우와 HCV RNA Rib199-3'태그만을 가지고 역전사 PCR을 수행했을 경우 어떠한 반응 산물도 나오지 않았다(도3의 레인 7-12). 이러한 증폭된 산물은 트랜스-스플라이싱 리보자임의 활성에 의한 결과임을 나타낸다. In addition, when the controller was trans-spliced with only inert ribozyme or HCV IRES RNA from which the catalytic core site was removed and reverse transcription PCR was performed with only HCV RNA Rib199-3 'tag, no reaction product was produced. It did not come out (lanes 7-12 of Figure 3). This amplified product is a result of the activity of trans-splicing ribozymes.

2. 세포내에서의 특이성을 가진 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 IRES 의존성 번역을 하는 리포터(reporter)유전자 발현의 감소2. Reduction of reporter gene expression with IRES dependent translation by trans-splicing ribozymes with specificity in cells

본 발명에 따른 리보자임의 일 예인 상기 Rib199 리보자임이 실험관에서와 같이 세포내에서도 HCV IRES의 199U를 특이하게 인식하는지를 테스트하기 위한 세포내 트랜스-클리비지 활성을 측정하였는바, Rib199와 IRES/FLuc RNA을 코트랜스펙션(co-transfection) 시킨 세포에서 리포터인 루시페라제 활성을 모니터링하므로서, 본 발명에 따른 리보자임의 세포내 트랜스-클리비지 활성을 조사하였다. 여기에서, IRES/FLuc RNA는 HCV IRES에 리포터인 개똥벌레 루시페라제(FLuc)를 엔코딩하는 RNA를 링크시킨 것이다. As an example of the ribozyme according to the present invention, the Rib199 ribozyme was measured for intracellular trans-clibage activity to test whether it specifically recognizes 199U of HCV IRES in a cell as in vitro, and Rib199 and IRES / FLuc RNA were measured. By monitoring the reporter luciferase activity in the co-transfected cells, the intracellular trans-clage activity of the ribozyme according to the present invention was investigated. Here, IRES / FLuc RNA is linked to the RNA encoding the reporter firefly luciferase (FLuc) to HCV IRES.

세포내에서 Rib199에 의한 클리비지는, 표적 RNA HCV IRES의 양을 감소시키고 결국 루시페라제의 활성을 감소시키는 결과를 유발하였다. 트랜스펙션 효율, 독성 또는 샘플의 회복으로 인한 HCV IRES 의존성 FLuc 발현의 차이를 제어하기 의해, 레닐라(renilla) 루시페라제를 엔코딩하는 RNA(RLuc)도 코트랜스펙션 시켰다. The cleavage by Rib199 intracellularly resulted in a decrease in the amount of target RNA HCV IRES and eventually in the activity of luciferase. RNA (RLuc) encoding renilla luciferase was also transfected by controlling differences in HCV IRES dependent FLuc expression due to transfection efficiency, toxicity or recovery of the sample.

도4는 세포내에서 특이적인 리보자임의 클리비지 활성을 보여주는 그래프이다. 여기에서 도4A는 컨트롤 tRNA, 본 발명에 따른 활성 리보자임(Rib199), 불활성 리보자임(R(d)199)을 탐색 RNA인 IRES/FLuc RNA에 주입한 결과이고, 도4B는 FLuc RNA와 함께 293T세포로 주입시킨 결과이다. 루시페라제의 상대적 활성은 컨트롤 RNA를 주입시킨 세포의 백분율로 측정되어졌다. 보여주는 값은 3번의 반복 실험값을 표준 편차 하여 나타낸 것이다. 4 is a graph showing the cleavage activity of specific ribozymes in cells. 4A is a result of injecting control tRNA, active ribozyme (Rib199), inactive ribozyme (R (d) 199) according to the present invention into the search RNA, IRES / FLuc RNA, and FIG. 4B together with FLuc RNA. Injected into 293T cells. The relative activity of luciferase was measured as the percentage of cells injected with control RNA. The values shown represent the standard deviation of three replicates.

도시된 바와 같이, Fluc(cap-Renilla Luciferase-IRES-firely Luciferase) 유전자를 가진 RNA(IRES/FLuc RNA)를 사용하여, 본 발명의 리보자임(Rib199-3'태그) RNA 또는 불활성 리보자임 (Rib199(d)-3'태그)과 세포내로 주입 시켰을 때, 컨트롤 tRNA에 대비하여 Rib199는 상기 리포터 유전자(루시페라제)의 IRES 의존성 발현을 70%까지 효과적으로 억제하였으며, 반면 불활성 리보자임 Rib199(d)는 미세한 억제만을 보였다(도4A). Rib199에 의해 표적된 어떤 서열도 FLuc RAN에서 발견되지 않았다. Rib199는 FLuc RAN와 코트랜스펙션 시킨 세포에서 리포터의 활성을 전혀 저해하지 않았다(도4B). 나아가 그 데이터를 첨부하지는 아니하였지만, 실험관에서 HCV IRES와 반응하지 아니한 Rib380은 IRES/FLuc RNA와 FLuc RNA 어느 것에서도 그 발현을 차단하지 아니하였다. 따라서 Rib199에 의한 IRES/FLuc 발현의 억제는 거의 HCV IRES RNA의 세포내 클리비지에 기인하는 것으로 보인다. As shown, the ribozyme (Rib199-3 ′ tag) RNA or inactive ribozyme of the present invention, using RNA (IRES / FLuc RNA) with the Fluc (cap-Renilla Luciferase-IRES-firely Luciferase) gene (Rib199) When injected intracellularly with (d) -3 ′ tag), Rib199 effectively inhibited IRES dependent expression of the reporter gene (luciferase) by 70% compared to control tRNA, whereas inactive ribozyme Rib199 (d) Showed only slight inhibition (FIG. 4A). No sequence targeted by Rib199 was found in FLuc RAN. Rib199 did not inhibit the reporter activity in cells transfected with FLuc RAN (Fig. 4B). Further, the data was not attached, but Rib380, which did not react with HCV IRES in vitro, did not block its expression in either IRES / FLuc RNA or FLuc RNA. Thus, inhibition of IRES / FLuc expression by Rib199 seems to be due almost to intracellular clage of HCV IRES RNA.

3. 세포내에서의 HCV-IRES를 인식하는 리보자임에 의한 트랜스-스플라이싱 반응3. Trans-splicing reactions by ribozymes that recognize HCV-IRES in cells

포유류 세포내에서의 본 발명의 리보자임에 의해 HCV IRES RNA의 199 부위가 잘 인지되어 트랜스-스플라이싱 반응이 일어나는지 확인하기 위해서 293T 세포에 본 발명의 리보자임 RNA(Rib199)와 HCV IRES RNA를 같이 주입시킨 후 세포내 모든 RNA를 추출하여 역전사-PCR을 수행하였다(도5 참조). The ribozyme RNA (Rib199) and HCV IRES RNA of the present invention were applied to 293T cells to confirm that the 199 site of the HCV IRES RNA was well recognized by the ribozyme of the present invention in mammalian cells. After injecting together, all RNAs were extracted from the cells to perform reverse transcription-PCR (see FIG. 5).

도5는 세포내에서 본 발명에 따른 리보자임의 HCV IRES의 트랜스-스플라이싱 반응을 보여주는 도면으로서, 도5A는 세포내에서 생산되어진 트랜스-스플라이싱 된 RNA결과물의 RT-PCR 분석결과이다. 여기에서 HCV IRES RNA(레인 4-6, 8)를 홀로(레인 6) 또는 활성 리보자임(Rib199-3't태그: 레인 4,7,8)과 함께, 또는 불활성 리보자임(레인 5)과 함께 293T 세포에 주입시켰다. RT-PCR로 증폭되어진 트랜스-스플라이싱 RNA 생산물은 151bp의 길이를 보였다. 5 is a diagram showing the trans-splicing reaction of the ribozyme HCV IRES according to the present invention in the cell, Figure 5A is a result of RT-PCR analysis of the trans-spliced RNA product produced in the cell . Wherein HCV IRES RNA (lanes 4-6, 8) is either alone (lane 6) or with an active ribozyme (Rib199-3't tag: lanes 4,7,8), or with an inactive ribozyme (lane 5) Together 293T cells were injected. The trans-spliced RNA product amplified by RT-PCR was 151 bp in length.

도5B는 세포내에서 얻어진 트랜스-스플라이싱 전사체의 염기서열 분석한 것으로서, 도5A의 레인4에서 얻어진 증폭 결과물들의 염기서열이 분석되어졌다. 같은 염기서열을 나타내는 10개의 다른 클론들 중에서 대표적인 하나의 클론 염기서열을 보여준다. 정확한 스플라이싱 접경은 사각형으로 표기된 리보자임의 인식염기서열과 원으로 표기된 199번째 핵산위치와 함께 화살표로 표시하였다. FIG. 5B shows the nucleotide sequence analysis of the trans-splicing transcript obtained in the cell. The nucleotide sequence of the amplification products obtained in lane 4 of FIG. 5A was analyzed. A representative one clone sequence is shown among 10 different clones showing the same sequence. The exact splicing border is indicated by an arrow with the ribozyme recognized base sequence in square and the 199th nucleic acid position in circle.

도5에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 리보자임(Rib199-3'태그) RNA와 IRES를 같이 주입한 세포에서 151bp 크기의 반응산물을 얻을 수 있었다(도5A의 레인 4). 반면에 모의 트랜스펙트된 세포 또는 표적 RNA만 트랜스펙션 시킨 세포, 또는 본 발명의 리보자임만을 주입한 세포에서는 트랜스-스플라이싱 산물을 관찰할 수 없었다(도5A의 레인 3, 6, 7). 불활성 리보자임(Rib199(d)-3'태그)와 표적 RNA를 코트랜스펙션 시킨 세포에서도 어떤 산물도 발견되지 않았다(도5A의 레인 5). 또한 IRES RNA와 리보자임 RNA를 각각 따로 주입시킨 후에 이 두 세포들을 섞은 후 RNA를 얻어서 RT-PCR을 수행한 결과에도 어떠한 산물도 검출되지 않았다(도5A의 레인 8). 이 결과 산물인 151bp단편을 클로닝하고 시??싱한 결과 HCV IRES의 U 199 핵산위치에서 정확히 트랜스-스플라이싱 반응이 일어난 것을 확인 할 수 있었다(도5B). As shown in FIG. 5, a reaction product having a size of 151 bp was obtained in cells injected with ribozyme (Rib199-3 ′ tag) RNA and IRES according to the present invention (lane 4 of FIG. 5A). On the other hand, trans-splicing products could not be observed in mock transfected cells, cells transfected only with target RNA, or cells injected only with the ribozyme of the present invention (lanes 3, 6 and 7 in FIG. 5A). . No products were found in cells transfected with inactive ribozyme (Rib199 (d) -3 ′ tag) and target RNA (lane 5 in FIG. 5A). In addition, after injection of IRES RNA and ribozyme RNA separately, these products were mixed, and no products were detected even when RNA was obtained and RT-PCR was performed (lane 8 in FIG. 5A). As a result, the cloning and sequencing of the 151 bp fragment of the product showed that the trans-splicing reaction occurred accurately at the U 199 nucleic acid position of HCV IRES (FIG. 5B).

4. 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 HCV IRES 의존성 번역을 통한 트랜스진의 발현유도4. Induction of transgene expression through HCV IRES dependent translation by specific trans-splicing ribozymes

HCV IRES가 발현되는 세포내에서 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 신규유전자의 활성이 나타나는지 확인하기 위해서 HCV IRES(pR/IRES)와 Rib199를 293T 세포(도6A)와 Huh7(도6B) 세포에 주입시켰으며, Fluc 발현과 Rluc의 발현을 비교해 트랜스진(transgene)의 발현이 어느 정도 유도되는지 측정하였다(도6 참조).HCV IRES (pR / IRES) and Rib199 to 293T cells (Fig. 6A) and Huh7 (Fig. 6A) to confirm whether the gene activity is expressed by the trans-splicing ribozyme according to the present invention in cells expressing HCV IRES. 6B) cells were injected, and Fluc expression and Rluc expression were compared to determine how much transgene expression was induced (see FIG. 6).

도6은 HCV IRES를 발현하는 293T세포(도6A)와, Huh-7세포(도6B) 내에서의 특이적인 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 루시페라제 활성의 선택적 유발을 보여주는 도면으로서, Figure 6 shows selective induction of luciferase activity by trans-splicing ribozyme according to the present invention specific to 293T cells (Figure 6A) expressing HCV IRES and Huh-7 cells (Figure 6B). As the figure shows,

HCV IRES를 암호화하는 벡터 pR/IRES(IRES)와 컨트롤 tRNA를 함께, 리보자임 RNA(Rib199FL)만, IRES를 Rib199FL과 함께 또는 IRES를 변형된 리보자임(Rib199△FL)과 함께 세포내로 주입시켰다. Fluc활성에 대한 Rluc의 상대적 활성이 측정되어졌으며, 값은 3번의 반복 실험을 통해 얻어진 표준편차로 나타내어졌다.The vector pR / IRES (IRES) and the control tRNA encoding HCV IRES were injected intracellularly with only ribozyme RNA (Rib199FL), IRES with Rib199FL or IRES with modified ribozyme (Rib199ΔFL). Rluc's relative activity to Fluc activity was measured and the values were expressed as standard deviations obtained from three replicates.

도6에 도시된 바와 같이, Rib199-3'태그의 LacZ 유전자 대신에 HCV 5'UTR의 3'부위와 연결된 fluc의 발현이 리보자임 홀로 주입시 매우 적다는 것을 관찰 할 수 있었다. 반대로 pR/IRES와 같이 주입시켰을 경우 리보자임만을 주입시켰을 때보다 루시페라제 활성이 약 13배 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 Huh-7세포에서도 HCV IRES가 발현되는 세포에서 리보자임을 주입시켰을 경우 Fluc가 6배정도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. As shown in FIG. 6, instead of the LacZ gene of the Rib199-3 ′ tag, the expression of fluc linked to the 3 ′ portion of HCV 5′UTR was observed to be very small when injected by ribozyme alone. Conversely, when injected with pR / IRES, luciferase activity was increased by about 13 times than when only ribozyme was injected. In addition, in Huh-7 cells, HCV IRES-expressing cells showed a 6-fold increase in Fluc when injected with ribozyme.

그와는 반대로 Rib199??FL(HCV 5'UTR의 3'부위 중 200-263제거)과 pR/IRES를 같이 주입시켰을 경우 Fluc의 발현이 유도되지 않는 것을 볼 수 있었는데 그 이유는 HCV IRES 의존성 번역에 중요하다고 알려져 있는 HCV IRES부위 중 스템-루프(stem-loop) III의 염기서열과 구조가 파괴되었기 때문이라고 생각된다(참고문헌 29). 따라서 표적 RNA가 발현되는 세포내에서 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 생성된 신규유전자의 발현이 HCV IRES 의존성 번역에 의해 유도되는 것을 알 수 있다.Conversely, injecting Rib199 ?? FL (200-263 out of the 3 'region of HCV 5'UTR) and pR / IRES did not induce Fluc expression because of HCV IRES-dependent translation. It is thought that the nucleotide sequence and structure of stem-loop III among HCV IRES sites known to be important are destroyed (Ref. 29). Thus, it can be seen that the expression of novel genes produced by trans-splicing ribozymes in cells expressing target RNA is induced by HCV IRES dependent translation.

5. 특이적 트랜스 스플라이싱 리보자임에 의한 세포 특이적 독성 유도5. Induction of Cell Specific Toxicity by Specific Transsplicing Ribozymes

앞서 표적 RNA가 발현되는 세포내에서 선택적으로 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 신규유전자의 발현이 유도됨을 확인하였는 바, 또한 본 발명의 리보자임에 의하면 선택적으로 HCV IRES가 발현되는 세포에서만 독성효과가 유도된다는 것도 확인되었다. Previously, it was confirmed that expression of a novel gene is induced by a trans-splicing ribozyme according to the present invention selectively in a cell in which the target RNA is expressed. Also, according to the ribozyme of the present invention, HCV IRES is selectively expressed. It was also confirmed that toxic effects were induced only in cells.

이를 위해 3'엑손으로서 HCV 5'UTR의 3' 부위(염기 200-402)와 연결된 DTA 개방된 판독 프레임(open reading frame)을 함유하고 있는 리보자임의 세포내 발현을 유도하기 위해 SV40 프로모터 시스템을 이용하였다.To this end, the SV40 promoter system was used to induce intracellular expression of ribozyme containing a DTA open reading frame linked to the 3 'site (bases 200-402) of the HCV 5'UTR as a 3' exon. Was used.

특히 단지 6 염기 길이의 IGS를 가진 그룹 I 트랜스-스플라이싱 리보자임을 박테리아에서 발현시 그 활성이 매우 떨어진다는 보고가 있으므로(참고문헌 30), 확장된 IGS를 가진 두 개의 리보자임 플라스미드를 제조하였다. In particular, there have been reports that the activity of Group I trans-splicing ribozymes with IGS only 6 bases in length is very poor when expressed in bacteria (Ref. 30), thus preparing two ribozyme plasmids with expanded IGS. It was.

하나는 확장된 P1과 7 염기길이의 P10 헬릭스(helix)를 가진 pSVR199DT이며, 다른 하나는 상기 리보자임에 표적 RNA인 Fluc RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 210 염기길이의 안티센스(antisense)를 함유한 pSVR199DTAS이다(도7). One is pSVR199DT with extended P1 and 7 bases of P10 helix, and the other contains 210 bases of antisense capable of complementarily binding to the target RNA, Fluc RNA, the ribozyme. One is pSVR199DTAS (Figure 7).

특정 세포에서 독성효과가 유도되는지 알기 위해 주입한 플라스미드의 발현억제 정도(도8A)와 세포에 직접적인 독성효과(도8B)를 측정하였다. To determine whether a toxic effect is induced in specific cells, the degree of expression inhibition of the injected plasmid (FIG. 8A) and the direct toxic effect on the cell (FIG. 8B) were measured.

우선 발현의 억제 정도를 알아보기 위해 Huh-7세포에 Rluc가 발현되는 플라스미드와 리보자임(pRSVR199DT) 플라스미드를 표적 HCV IRES(pIRES/F)와 같이 넣거나 혹은 홀로 주입하였다. First, in order to determine the degree of inhibition of expression, Rluc-expressing plasmids and ribozyme (pRSVR199DT) plasmids were put together with the target HCV IRES (pIRES / F) or injected alone into Huh-7 cells.

도7은 본 발명에 따른 예시적인 트랜스-스플라이싱 리보자임의 모식도이다. 여기에서 표적 트랜스크립(transcrip)을 이탤릭체로 표기한 스플라이싱 사이트 주위의 염기서열과 함께 보여주고 있다. 확장된 IGS를 가진 두 개의 리보자임들도 대문자로 표기된 3'엑손 염기서열과 함께 나타나 있다. 리보자임과 표적 RNA간의 가능한 염기결합이 수직선으로 표기되어져 있다. 7 is a schematic of an exemplary trans-splicing ribozyme in accordance with the present invention. The target transcrip is shown here with the nucleotide sequence around the splicing site in italics. Two ribozymes with extended IGS are also shown with the capitalized 3 'exon sequence. Possible base bonds between the ribozyme and the target RNA are indicated by vertical lines.

도8은 HCV IRES를 발현하는 Huh-7세포내에서 본 발명에 따른 리보자임에 의한 특이적 독성 유전자의 선택적 유발을 보여주는 도면이다. 도8A는 pCMV/R과 pIRES/F(HCV IRES)를 컨트롤 벡터를 함께, pIRES/F와 디프테리아 독소 A 체인을 암호화하는 리보자임벡터(pSVR199DT)를 함께, pSVR199DT만을, pIRES/F와 Fluc유전자에 대한 상보적 염기서열(210nt)을 가지는 리보자임 벡터(pSVR199ASDT)를 함께, 또는 pSVR199DT만을 세포내로 주입하여 코트랜스펙션 시킨 것에 따른 결과이다. 발광 효소활성은 pIRES/F만을 주입시킨 세포에서 얻어진 활성에 대한 상대적 값으로 표현되어졌다. 오차막대는 3번의 반복 실험에서 얻어진 SD(표준편차)를 의미한다. 8 shows selective induction of specific virulence genes by ribozymes according to the present invention in Huh-7 cells expressing HCV IRES. 8A shows pCMV / R and pIRES / F (HCV IRES) together with control vectors, ribozyme vector (pSVR199DT) encoding pIRES / F and diphtheria toxin A chain, pSVR199DT alone, pIRES / F and Fluc genes. This is a result of coat-transfecting the ribozyme vector (pSVR199ASDT) having the complementary nucleotide sequence (210nt) together or injecting only pSVR199DT into cells. Luminescent enzyme activity was expressed as a relative value for activity obtained in cells injected with pIRES / F only. Error bars represent SD (standard deviation) obtained in three replicates.

도8B는 도8A에서와 동일한 플라스미드 조건을 따라 pEGFP-N1을 코트랜스펙션 시킨 결과이다. GFP발현하는 세포는 세포내 주입 후 24시간에 형광현미경으로 관찰되어졌다. 각각의 주입체에서 보여지는 GFP발현 세포 수를 세고, pIRES/F만을 주입시킨 것으로부터 얻어진 GFP발현 세포 수에 대한 백분율로 환산하였다. 3번의 반복 실험으로 얻어진 평균값을 표준편차 오차막대로 나타내었다.FIG. 8B shows the result of coatfection of pEGFP-N1 following the same plasmid conditions as in FIG. 8A. GFP expressing cells were observed by fluorescence microscopy 24 hours after intracellular injection. The number of GFP expressing cells seen in each injection was counted and converted as a percentage of the number of GFP expressing cells obtained from injecting only pIRES / F. The average value obtained from three repeated experiments is shown as a standard deviation error bar.

도8에 도시된 바와 같이, pIRES/F와 본 발명의 리보자임을 모두 넣었을 때 Rluc의 발현이 약 70%정도 감소하였고, pIRES/F만을 주입한 세포에 비해 본 발명의 리보자임만을 주입했을 경우 Rluc발현이 약 13%정도 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다. As shown in Figure 8, when both the pIRES / F and the ribozyme of the present invention when the expression of Rluc was reduced by about 70%, when the injection of only the ribozyme of the present invention compared to cells injected only with pIRES / F Rluc expression decreased by about 13%.

또한 Fluc 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열과 링커(linker) 염기를 가진 pSVR199DTAS를 IRES가 발현하는 세포에 주입했을 경우에 비록 pSVR199DT와 IRES를 주입한 경우보단 덜 효과적이지만 Rluc 발현이 줄어드는 것을 관찰하였으나 pSVR199DTAS만을 주입했을 때 Rluc의 발현이 단지 8%정도 감소되는 것을 볼 수 있었다(도7B). In addition, when pSVR199DTAS having a nucleotide sequence and a linker base capable of complementarily binding to the Fluc gene was injected into cells expressing IRES, the expression of Rluc was reduced although it was less effective than the injection of pSVR199DT and IRES. Observation of only 8% of the expression of Rluc was observed when injecting only pSVR199DTAS (FIG. 7B).

HCV IRES이 발현되는 세포에서만 본 발명의 리보자임에 의해 단백질의 발현이 억제되고 이것에 의해 세포사멸이 유도되는지 알아보기 위해서 GFP를 발현할 수 있는 플라스미드를 위와 같은 조건으로 같이 세포내로 주입시켰다(도7C). 주입 후 24시간 뒤 각각의 샘플에서의 GFP발현 세포를 비교해 본 결과 pSVR199DT 또는 pSVR199DTAS와 pIRES/F를 같이 주입했을 경우 pIRES/F만을 주입했을 때보다 GFP를 발현하는 세포들이 약 85.7%, 71.4%가 감소하였다. 그러나 pSVR199DT나 pSVR199DTAS만을 주입했을 경우 약 35.7%, 7.1%정도가 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다. In order to determine whether the expression of the protein is inhibited by the ribozyme of the present invention and the cell death is induced only in the cells expressing HCV IRES, a plasmid capable of expressing GFP was injected into the cells under the above conditions (Fig. 7C). 24 hours after injection, GFP-expressing cells in each sample were compared. When pSVR199DT or pSVR199DTAS and pIRES / F were injected together, 85.7% and 71.4% of GFP-expressing cells were compared with pIRES / F alone. Decreased. However, infusion of only pSVR199DT or pSVR199DTAS decreased about 35.7% and 7.1%.

이상과 같은 일련의 실시예를 통해 살펴본 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임에 따르면, HCV IRES RNA가 발현되는 인체세포에서만 선택적으로 신규유전자 활성을 유도시킬 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임이 제공된다. 트랜스-스플라이싱 리보자임의 경우 절단과 연결 반응을 모두 수행하기 때문에(참고문헌 31), 본 발명의 리보자임에 의하면, HCV IRES RNA를 항바이러스 물질을 발현할 수 있도록 변형시킬 수 있을 것이다. According to the trans-splicing ribozyme of the present invention as described above through a series of examples, trans-splicing group I ribo that can selectively induce novel gene activity only in human cells expressing HCV IRES RNA Self-confidence is provided. Since trans-splicing ribozymes perform both cleavage and ligation reactions (Ref. 31), the ribozymes of the present invention will allow the modification of HCV IRES RNA to express antiviral agents.

이에 관련하여, 본 발명에 따른 리보자임은 세포내에서 HCV IRES에 의해 유도되는 Fluc 유전자 발현을 억제할 수 있으며(도4), 또한 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 리보자임의 3' 끝에 부착되어 있는 Fluc나 DTA 활성을 유도할 수 있음을 알 수 있다(도6 및 도8). In this regard, ribozymes according to the present invention can inhibit Fluc gene expression induced by HCV IRES in cells (FIG. 4), and are also attached to the 3 ′ end of ribozyme selectively only in HCV IRES expressing cells. It can be seen that it can induce Fluc or DTA activity (Figs. 6 and 8).

따라서 본 발명에 따른 리보자임을 적용하면, HCV 단백질의 생성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 항바이러스 활성을 가진 기능적인 유전자를 생산할 수 있다. Therefore, applying the ribozyme according to the present invention, not only can reduce the production of HCV protein, but also can produce a functional gene with antiviral activity.

더욱이 본 발명에 따른 리보자임이 세포내에서의 매우 높은 정확성을 갖고 트랜스-스플라이싱 반응을 일으킨다는 결과(도5)로부터, HCV가 감염된 세포내에서 주로 RNA의 치환에 의해 신규 트랜스진의 발현이 유도될 수 있을 것으로 보인다.Furthermore, from the result that the ribozyme according to the present invention has a very high accuracy in cells and causes a trans-splicing reaction (FIG. 5), expression of a novel transgene is mainly caused by substitution of RNA in HCV-infected cells. It can be derived.

따라서, 본 발명에 따른 리보자임을 통한 선택적인 치료용 유전자 활성 유도방법은, HCV RNA를 파괴할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스에 감염된 세포에서만 특이적이고 선택적으로 항바이러스 유전자를 전달함으로써 유용한 항바이러스 치료법이 될 수 있을 것임을 보여준다. Therefore, the method of inducing selective therapeutic gene activity through ribozyme according to the present invention may not only destroy HCV RNA, but also be useful antiviral therapy by delivering specific and selective antiviral genes only to cells infected with the virus. Show that you can.

본 발명에 따른 리보자임에 의한 선택적인 DTA 활성 발현결과(도7 및 도8)는, 본 발명에 따른 리보자임의 HCV 감염 환자 세포내 주입을 통해 바이러스가 감염된 세포만을 선택적으로 제거하여 바이러스 증식을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 쥐 세포내에서 소량의 DTA만 존재하여도 충분히 세포를 죽일 수 있다는 보고(참고문헌 32)는, 바이러스 감염 세포의 제거를 위해선 바이러스의 전사체 중 아주 소량만이 DTA의 발현이 유도되도록 변형이 되어도 된다는 것을 의미한다. Expression of selective DTA activity by ribozyme according to the present invention (Fig. 7 and Fig. 8), the virus proliferation by selectively removing only the virus-infected cells through the intracellular injection of ribozyme HCV infected patients according to the present invention It means that it can be suppressed. Reports that even a small amount of DTA in rat cells are sufficient to kill cells (Ref. 32) suggest that only a small amount of viral transcripts can be modified to induce DTA expression in order to eliminate virally infected cells. It means.

또한 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 만들어진 생산물이 세포내에서 안정하고 그래서 쉽게 감지(도5) 및 분석(도6)될 수 있다는 것은, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임이 세포내에서 리보자임 활성을 최적화할 수 있는 모델임을 제시하는 것이다(참고문헌 33).It is also the trans-splicing ribozyme of the present invention that the product made by the trans-splicing ribozyme according to the invention is stable intracellularly and thus can be easily detected (Fig. 5) and analyzed (Fig. 6). This suggests that this model can optimize ribozyme activity in cells (Ref. 33).

이러한 근거로부터 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임을 통한 사이토톡신(cytotoxin) 활성전달방식은 HCV 감염 치료를 위한 하나의 방법이 될 수 있을 것이다. From this evidence, the cytotoxin activity delivery method through the trans-splicing ribozyme of the present invention may be one method for treating HCV infection.

치료제로서 트랜스-스플라이싱 리보자임을 매개로 한 독성 전달체를 활용하기 위해선 특이성이 가장 문제가 될 것이다. 독성효과는 시스-스플라이싱 반응이나 세포내 RNA와의 비특이적인 반응 그 외에 다른 여러 가지 요인들로 인해 비특이적으로 독성 유전자의 발현이 유도될 수도 있을 것이다. Specificity will be the most problematic for utilizing toxic carriers mediated by trans-splicing ribozymes as therapeutic agents. Toxic effects may be induced by non-specific expression of toxic genes due to cis-splicing reactions, nonspecific reactions with intracellular RNA, and many other factors.

이러한 의도하지 않은 독성 효과를 최소화하기 위해 본 발명의 리보자임은 리보자임의 3'엑손에 있는 트랜스진 앞에 IRES의 199U이후의 염기서열을 (200-402)을 삽입했다. To minimize this unintended toxic effect, the ribozyme of the present invention inserted (200-402) the nucleotide sequence after 199U of the IRES before the transgene in the ribozyme's 3 'exon.

표적 RNA를 가지고 있는 세포에서 트랜스진의 활성을 유도시킬 수 있는 리보자임의 선택성과 특이성은 HCV 코어 번역 시작부위 앞에 프레임 안에 두 개의 종결 코돈(294, 297)이 존재하기 때문에 리보자임 내부에서 일어날 수 있는 번역과정을 미리 종결시키거나 리보자임이 세포내에 있는 RNA와 트랜스-스플라이싱이 일어나도 RNA 생성물의 번역을 중단시킬 수 있다는 것에 있을 것이다. 더구나 HCV 5'UTR의 3'부위의 일부 염기서열(200-264)이 제거된 리보자임을 이용했을 때 활성이 나타나지 않은 것을 보아 완전한 HCV IRES가 만들어져야만 트랜스진의 발현이 유도된다는 것을 알 수 있고 또한 본 발명자들이 개발한 리보자임 구조를 이용시 비특이적인 트랜스진 활성유도가 최소화될 수 있음을 알 수 있다. The selectivity and specificity of ribozymes that can induce transgene activity in cells with target RNA is due to the presence of two stop codons (294, 297) in the frame before the start of HCV core translation. It may be that the translation process is terminated in advance or ribozymes can disrupt the translation of the RNA product even if trans-splicing occurs with intracellular RNA. Furthermore, when the ribozyme was removed from the 3 'region of the HCV 5'UTR using the removed ribozyme, it was found that the expression of the transgene was induced only when the complete HCV IRES was made. Using the ribozyme structure developed by the present inventors, it can be seen that non-specific transgene induction can be minimized.

비록 확장된 P1과 P10 헬릭스를 함유한 리보자임이 어느 정도 특이적으로 DTA 발현을 유도하지만(도7A), 리보자임만을 세포내에 주입했을 시의 살아있는 세포의 수가 리보자임이 없는 세포에 비해 훨씬 감소되었으므로(도8B), 이러한 비특이적인 결과는 세포내의 RNA와 잘못된 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 나타난 것으로 예상된다. 이러한 결과는 세포내에서 단지 6개 염기 길이의 IGS를 갖는 리보자임이 발현시 비특이적인 트랜스-스플라이싱 된 RNA가 생성된다는 보고와 일치한다(참고문헌 17). Although ribozymes containing expanded P1 and P10 helices induce DTA expression to some extent (FIG. 7A), the number of live cells when injected only with ribozyme intracellularly is significantly reduced compared to cells without ribozyme. (FIG. 8B), this nonspecific result is expected to result from a false trans-splicing reaction with intracellular RNA. These results are consistent with the report that ribozymes with only 6 bases long IGS in cells produce nonspecific trans-spliced RNA upon expression (Ref. 17).

이러한 한계점을 극복하기 위해 기술한 바와 같이 HCV-IRES에 연결된 fluc RNA에 대한 상보적인 염기서열을 포함하도록 하여 리보자임의 IGS를 확장할 수 있고(참고문헌 21, 22, 30), 6개 염기 길이의 IGS만을 갖는 리보자임과는 대조적으로 확장된 IGS를 가진 리보자임의 경우 비특이적인 독성이 뚜렷이 감소한다(도8B). 이 결과로부터 표적 RNA와 본 발명의 리보자임 사이의 결합길이가 증가함으로써 독성 유도의 특이성이 증가함을 알 수 있다. To overcome this limitation, ribozyme's IGS can be extended to include complementary base sequences for fluc RNA linked to HCV-IRES as described (Refs. 21, 22, 30), and 6 bases in length. In contrast to ribozymes with only IGS of, the nonspecific toxicity is significantly reduced for ribozymes with expanded IGS (FIG. 8B). From this result, it can be seen that the specificity of toxicity induction increases by increasing the binding length between the target RNA and the ribozyme of the present invention.

그러나 실질적으로 환자에 적용되기 위해선 세포내로의 선택적 독성 유도를 통한 HCV 감염세포의 제거방법이 환자를 치료하기 위한 유전자치료법으로는 적당치 않을 수 있다. 왜냐하면 거대 간세포의 파괴가 유도될 수도 있기 때문이다. 그 대신 바이러스의 네거티브 우성 돌연변이(negative dominant mutant)나 면역유도 단백질들의 선택적 유도 등이 실제 HCV 감염을 조절하기에 더 적당할 수도 있다. However, in order to be applied to a patient, a method of removing HCV-infected cells through selective induction of intracellular toxicity may not be suitable as a gene therapy for treating a patient. Because the destruction of giant hepatocytes may be induced. Instead, the negative dominant mutant of the virus or the selective induction of immunogenic proteins may be more suitable for controlling actual HCV infection.

그러나 본 발명에서 실현된 독성 유도실험은 표적세포에서의 트랜스-스플라이싱 리보자임의 특이성을 감지할 수 있는 매우 민감한 실험모델을 제공할 수 있을 것이다. 또한 트랜스-스플라이싱을 위해선 3'엑손에 어떠한 염기서열이 있어도 무방하다는 사실(참고문헌 34)은 곧 본 발명에 따른 리보자임을 골격으로 하여 우리가 원하는 어떠한 치료용 유전자라도 그 리보자임의 3'엑손에 부착시킴으로써 HCV 감염세포에서의 그러한 유전자 발현을 선택적으로 유도할 수 있을 것이다. However, the toxicity induction experiments realized in the present invention may provide a very sensitive experimental model capable of detecting the specificity of trans-splicing ribozymes in target cells. In addition, the fact that any nucleotide sequence may be present in the 3 'exon for trans-splicing (Ref. 34) is based on the ribozyme according to the present invention. 'Attachment to exons may selectively induce such gene expression in HCV infected cells.

본 발명은 트랜스-스플라이싱 그룹Ⅰ리보자임이 RNA 치환기능을 통해 HCV 감염 환자세포로 선택적이며 특이적으로 항바이러스 활성을 전달할 수 있는 신규 전달 시스템으로 적용될 수 있다는 실험적 증거들을 제시한 것에 의미가 있다. The present invention is meant to present experimental evidence that the trans-splicing group I ribozyme can be applied as a novel delivery system capable of delivering selective and specific antiviral activity to HCV-infected patient cells through RNA substitution. have.

또한 이외에도 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임과 같은 리보자임은 특정 RNA를 발현하는 암세포나 다른 종류의 바이러스에 감염된 세포로 특이적으로 치료유전자 활성을 전달하는 데에도 응용 될 수 있을 것이다. In addition, ribozymes such as the trans-splicing ribozyme of the present invention may be applied to specifically deliver therapeutic gene activity to cancer cells expressing specific RNA or to cells infected with other kinds of viruses.

특히 주목할 점은 HCV 치료제에 있어 본 발명에 따른 리보자임에 대한 표적서열은 대부분의 HCV 유전자형에 존재한다는 점이다. 이는 곧 본 발명에 따른 리보자임이 감염 환자 대다수에서 사용 될 수 있음을 함축한다. 환자 대다수에서 독성 없이 HCV 제거가 유지됨을 증명하고 특이적이며 효과적인 유전자 전달체계의 개발 등이 동반된다면 RNA 치환을 통해 HCV 감염에 대한 특이적이고 효과적인 치료 방법이 제공될 것이다. Of particular note is that the target sequence for ribozymes according to the present invention in HCV therapeutics is present in most HCV genotypes. This implies that the ribozyme according to the invention can be used in the majority of infected patients. If the majority of patients demonstrate that HCV removal is maintained without toxicity and are accompanied by the development of specific and effective gene delivery systems, RNA substitution will provide specific and effective treatments for HCV infection.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의하면, 표적된 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 HCV IRES 발현 세포에서만 선택적으로 HCV IRES 의존성 절단이나 유전자 활성을 유도하여, HCV에 감염된 세포에 대해서 HCV의 RNA를 파괴하거나 항바이러스 단백질을 생산하도록 함으로써, 새로운 개념의 효과적인 HCV의 치료(증식억제) 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. According to the trans-splicing ribozyme according to the present invention described above, the HCV IRES-dependent cleavage or gene activity is selectively induced only in HCV IRES-expressing cells through a targeted trans-splicing reaction to cells infected with HCV. By destroying the RNA of HCV or producing antiviral proteins, it is expected to provide a new concept of effective treatment of HCV.

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도1은 본 발명에 따른 HCV IRES를 표적으로 한 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 새로운 유전자 RNA의 선택적 유발에 관한 도식도, 1 is a schematic diagram of selective induction of a novel gene RNA by trans-splicing ribozyme targeting HCV IRES according to the present invention;

도2는 HCV IRES RNA을 이용한 실험관내 지도제작을 설명하는 모식도, Figure 2 is a schematic diagram illustrating in vitro mapping using HCV IRES RNA,

도3은 트랜스-스플라이싱 RNA 결과물의 RT-PCR을 통한 분석결과 도면, Figure 3 is a result of analysis via RT-PCR of the trans-splicing RNA result,

도4는 본 발명 리보자임의 세포내 특이적인 절단활성을 보여주는 그래프, 4 is a graph showing the intracellular specific cleavage activity of the ribozyme of the present invention,

도5는 본 발명에 따른 리보자임의 세포내 HCV IRES의 트랜스-스플라이싱 반응을 보여주는 도면, Figure 5 shows the trans-splicing response of intracellular HCV IRES of ribozyme according to the present invention,

도6은 HCV IRES를 발현하는 293T세포와, Huh-7세포 내에서의 특이적인 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 루시페라제 활성의 선택적 유발을 보여주는 도면, Figure 6 shows selective induction of luciferase activity by 293T cells expressing HCV IRES and trans-splicing ribozyme according to the present invention in Huh-7 cells,

도7은 본 발명에 따른 예시적인 트랜스-스플라이싱 리보자임의 모식도, 7 is a schematic diagram of an exemplary trans-splicing ribozyme in accordance with the present invention;

도8은 HCV IRES를 발현하는 Huh-7세포내에서 특이적 본 발명에 따른 리보자임에 의한 독성 유전자의 선택적 유발을 보여주는 도면. 8 shows selective induction of virulence genes by ribozyme according to the present invention specific in Huh-7 cells expressing HCV IRES.

Claims (5)

트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임의 변형으로서, HCV IRES 발현 세포에서 발현되어 HCV의 증식을 저해하는 유전자가 상기 리보자임의 3' 엑손 부위에 삽입되어 있고, 상기 HCV 증식저해-관련 유전자 앞에는 상기 리보자임에 의한 상기 HCV IRES의 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 상기 HCV IRES로부터 잘려 나가는 부위 이후의 3'부위에 해당되는 유전자가 삽입되어 있는 구조를 구비하고, 상기 HCV IRES 발현 세포에 주입하여 상기 HCV IRES와 트랜스-스플라이싱 반응시키면 상기 HCV IRES의 특정부위를 인지하여 상기 HCV의 생존에 필요한 유전자의 발현을 억제하거나 상기 HCV 증식저해-관련 유전자의 발현을 유도하며; As a variant of trans-splicing group I ribozyme, a gene expressed in HCV IRES expressing cells that inhibits the proliferation of HCV is inserted at the 3 'exon region of the ribozyme, and in front of the HCV proliferation-related gene The gene corresponding to the 3 'region after the site cut out from the HCV IRES by the trans-splicing reaction of the HCV IRES by ribozyme has a structure inserted therein, and injected into the HCV IRES expressing cell Trans-splicing the HCV IRES to recognize a specific site of the HCV IRES to inhibit expression of a gene necessary for survival of the HCV or to induce expression of the HCV proliferation-related gene; 여기에서 상기 HCV IRES의 특정부위는 도메인 IIIb의 루프 부위에 있는 199U 부위이고, 상기 HCV IRES로부터 잘려 나가는 부위 이후의 3'부위에 해당되는 유전자는 상기 HCV 5UTR의 200-402 seq이고, 상기 HCV 증식저해-관련 유전자는 디프테리아 독소 A 체인을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임. Wherein the specific region of the HCV IRES is a 199U region in the loop region of domain IIIb, and the gene corresponding to the 3 ′ region after the region cut out from the HCV IRES is 200-402 seq of the HCV 5UTR, and the HCV proliferation. Inhibition-associated genes are trans-splicing ribozymes characterized by genes encoding the diphtheria toxin A chain. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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