KR100488965B1

KR100488965B1 - 아미노글라이코사이드 인산전이효소를 암호화하는 유전자염기서열 및 아미노산 서열과 그의 항생제 다량 생산에의이용

Info

Publication number: KR100488965B1
Application number: KR10-2003-0067971A
Authority: KR
Inventors: 김재종; 문영호; 이미옥; 이현숙; 김상윤; 이금순; 송재경; 이희찬
Original assignee: 주식회사 대웅; (주) 제노텍
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-05-11
Also published as: KR20050031723A

Abstract

본 발명은 아미노글라이코사이드계 항생제 저항성에 관여하는 효소의 유전자 염기서열 및 아미노산 서열에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(micromonospora purpurea, ATCC 15835)로부터 유래한 아미노글라이코사이드 변형효소(aminoglycoside-modifying enzyme)인 아미노글라이코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferase)의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 결정하여 제공한다. 상기 APH는 젠타마이신 등 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 저항성을 부여할 뿐 아니라, 항생제 생산균주에 도입하여 얻은 형질전환체로부터 항생제의 대량생산을 유도하는 효과가 있다.

Description

아미노글라이코사이드 인산전이효소를 암호화하는 유전자 염기서열 및 아미노산 서열과 그의 항생제 다량 생산에의 이용{Nucleotide sequences and amino acid sequences of aminoglycoside phosphotransferase and uses thereof}

본 발명은 아미노글라이코사이드계 항생제 저항성에 관여하는 효소의 유전자 염기서열 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(micromonospora purpurea, ATCC 15835)로부터 유래한 아미노글라이코사이드 변형효소(aminoglycoside-modifying enzyme)인 아미노글라이코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferase; 이하 본 명세서에서 "APH"와 혼용함)의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 결정하여 제공한다. 또한 항생제 생산균주에 도입하여 얻은 형질전환체로부터 다량의 항생물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

아미노글라이코사이드계 항생제는 넓은 항균 스펙트럼(spectrum)과 강한 살균 작용을 갖추어 감염증 치료제로 널리 이용되고 있으며, 통상적으로 아미노사이클리톨(aminocyclitol)의 구조적 차이에 따라 스트렙티딘(streptidine), 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine), 액틴아민 (actinamine)을 포함하는 항생제 등으로 분류하고 있고 각각의 아미노사이클리톨 (aminocyclitol)에 6-데옥시헥소스(6-deoxyhexose) 당이 붙어 있는 구조를 띠고 있다.

아미노글라이코사이드 변형효소는 아미노글라이코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferases; APHs), 아미노글라이코사이드 핵산전이효소(aminoglycoside nucleotidyltransferases; ANTs) 그리고 아미노글라이코사이드 아세틸트랜스퍼레이즈(aminoglycoside acethyltransferases; AACs)로 크게 3부류로 나눌 수 있다. APH는 카나마이신(kanamycin)과 네오마이신(neomycin) 등과 같은 아미노글라이코사이드계 항생제에 저항성을 부여하는 것으로 알려져 있으나, 그 기작은 잘 알려져 있지 않다. 다만 화학식 1에서 보는 바와 같이 3‘-하이드록시기(hydroxyl group)를 O-인산화(phosphorylation)시킴으로써 저항성을 부여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 분리한 APH는 젠타마이신 생합성 유전자군에서 분리한 아미노글라이코사이드 변형효소로서 아미노글라이코사이드 저항 어세이(aminoglycoside resistance assay)를 수행한 결과, 적어도 100㎍/ml 젠타마이신(gentamicin)이 함유된 배지에서 APH가 발현되는 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans)가 생장함을 확인하였다.

또한 데이터베이스를 통하여 아미노산 상동성을 검색한 결과, 187번째 아미노산부터 199번째 아미노산(VcHgDFCldNVLV)까지 티로신 단백질 키나아제 특이 활성부위 서명(tyrosine protein kinases specific active-site signature)[LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-[RSTAC]-x(2)-N-[LIVMFYC](3)을 지니고 있는 것으로 확인되었다. APH (3)-IIIa에 대한 3차원 구조를 규명한 결과, 진핵생물 단백질 키나아제(eukaryotic protein kinases; EPKs)와 구조적으로 매우 유사함이 밝혀졌으며, 여러 진핵생물 단백질 키나아제의 억제제(inhibitor)에 의해 활성이 저해된다는 사실도 밝혀졌다. 따라서 APH는 아미노글라이코사이드 키나아제(aminoglycoside kinase)로서 다양한 진핵생물 단백질 키나아제 기질을 인산화시킬 수 있음을 짐작할 수 있다.

단백질 인산화가 세포 내의 기능과 생리활성을 조절한다는 것이 알려져 있으며, 이러한 단백질 인산화 시스템은 진핵생물 세린/트레오닌/티로신 인산화 시스템(eukaryotic Ser/Thr/Tyr phosphorylation system), 원핵생물 2요소 조절 시스템(prokaryotic two-component regulatory system), 포스페놀-피루브산: 당 인산화 시스템(phosphoenol-pyruvate: sugar phosphotransferase system)으로 나눌 수 있다. 방선균에서도 단백질 인산화가 이차대사산물의 생산 및 분화 조절과 밀접한 관계가 있음이 여러 연구에 의해 밝혀졌다. 방선균에서 스트렙토마이세스 코엘리콜비(S. coelicolor)의 색소성 항생물질의 생산을 유도하는 afsQ1/afsQ2 시스템이 2요소 시스템(two-component system)의 예이며, 진핵생물 세린/트레오닌/티로신 인산화 시스템(eucaryotic Ser/The/Tyr phosphorylation system)의 예로서 세포 외의 신호에 의해 AfsK 키나아제(kinase)의 세린(serine), 트레오닌(threonine)잔기가 자기인산화되면, 인산화된 AfsK가 AfsR의 세린과 트레오닌 잔기를 인산화시킴으로써, 인산화된 AfsR이 색소성 항생물질의 생산을 유도하는 것을 들 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 젠타마이신 생합성 유전자군에 존재하는 아미노글라이코사이드 변형효소인 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자를 분리하고 그의 효소활성 즉, 아미노글라이코사이드계 항생물질에 대한 저항성 부여 및 인산화 효소 활성을 이용하여, 궁극적으로는 항생제를 대량 생산 균주를 활용하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(Micromonospora purpurea, ATCC15835) 유래의 젠타마이신 생합성 유전자 군이 삽입된 코스미드 클론 안에 일부분으로 삽입된 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자의 염기서열을 결정하여 제공하려는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아미노글라이코사이드 인산전이효소의 유전자 염기서열로부터 번역된 아미노산 서열을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 이용하여 대량의 항생제 생산 방법을 제공하려는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 젠타마이신 생산균주인 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(M. purpurea ATCC 15835)의 게놈을 이용하여 작성한 코스미드 유전자 도서관을 젠타마이신 생합성 및 저항성 유전자 아미노트랜스퍼레이즈 (aminotransferase)와 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)를 탐침으로 사용하여, 동시에 둘에 대하여 양성 반응을 보이는 클론을 분리한 후 산탄식 서열결정(shotgun sequencing) 방법으로 전체 염기서열을 결정하고 BLAST 검색 및 유전자 주석(gene annotation) 과정을 거쳐 기존의 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자와 상동성이 있는 부위를 선별한 후, 아미노 글라이코사이드 인산전이효소를 암호화하고 있을 것으로 추정되는 부위를 스트렙토마이세스 리비단스 발현 벡터에 삽입하고 발현하여, 항생제에 저항성을 부여한다는 것과 대량의 항생제 생산을 유도하는 것을 밝힘으로써 달성하였다.

본 발명은 마이크로모노스포라 퍼퓨레아(ATCC 15835)로부터 분리되었으며, 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는 아미노글라이코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferase) 유전자 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 기능적 등가물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 염기서열로부터 번역된 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는 아미노글라이코사이드 인산전이효소 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 아미노글라이코사이드 인산전이효소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 아미노글라이코사이드 인산전이효소 제조 형질전환체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 코스미드에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 아미노글라이코사이드 인산전이효소를 사용하여 형질전환체로부터 항생제 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항생제 생산방법에 관한 것이다.

당업자들은 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 염기서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함다는 것을 분명히 이해하고 있을 것이다.

따라서, 본 발명에 의해 해석되는 핵산분자는 본 발명 핵산서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 염기서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.

본 발명은 아미노글라이코사이드 인산전이효소 아미노산 서열(서열번호 2)뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. silent change란 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있음을 말한다. 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다.

또한, 본 발명의 아미노글라이코사이드 인산전이효소 단백질 또는 아미노산 서열간의 일정범위의 상동성, 예컨대 90-100% 범위내의 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편(fragments)이나 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명은 젠타마이신 생산균주인 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(M. purpurea ATCC 15835)의 게놈을 이용하여 유전자 도서관을 작성한 후, 젠타마이신 생합성 및 저항성 유전자 아미노트랜스퍼레이즈와 메틸트랜스퍼레이즈를 탐침으로 사용하여, 동시에 둘에 대하여 양성 반응을 보이는 클론을 분리하는 단계; 상기 분리된 코스미드 클론을 산탄식 서열결정(shotgun sequencing) 전략으로 전체 염기서열을 해독하는 단계; 상기 코스미드 클론의 염기서열을 분석하여 코스미드 유전자 클러스터 내에 아미노트랜스퍼레이즈와 메틸트랜스퍼레이즈가 존재함을 확인하고, APH 효소 유전자가 상기 코스미드 클론의 유전자 클러스터 내에 존재함을 확인하는 단계; 상기 APH 효소를 암호화하고 있을 것으로 추정되는 유전자를 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans)에서 발현하여 그의 항생제 내성 활성을 측정함으로써 코스미드 클론의 유전자 클러스터 내에서 젠타마이신의 내성에 관여하는 APH 합성효소임을 밝히는 단계; 상기 APH 효소를 암호화하고 있을 것으로 추정되는 유전자를 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans)에서 발현하여 그의 항생제의 대량 합성 유도 능력을 측정하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마이크로모노스포라 퍼퓨리아의 전체 게놈 DNA(total genomic DNA) 분리

젠타마이신 생산 균주인 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(Micromonospora purpura)를 100ml 당 1g 글루코스, 2g 수용성 전분, 0.5g 효모 추출물, 0.5g N-Z 아민 타입 A, 0.1g CaCO₃이 들어 있는 배지에서 28℃, 200rpm으로 7일간 진탕 배양하였다. 배양후 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)는 다음과 같이 얻었다. 세포 펠렛(Cell pellet)을 용균 완충액(lysis buffer; 15% 수크로스, 2M TrisCl(pH 7.5), 0.5M EDTA)으로 2번 세척한 후 용균 완충액에 현탁하고, 라이소좀(lysozyme) 5mg/㎖을 넣어, 37℃에서 15분 이상 유리막대로 세포를 으깨어 주었다. 0.5M EDTA 2㎖와 프로나아제(pronase) 200㎕를 넣고 흔들어서 잘 섞고, 37℃에서 5분 이상 반응시킨 후, 10% SDS 2.5㎖를 넣고 용액이 맑아질 때까지 흔들어서 섞어준 다음 70℃에서 10분 반응 후 바로 얼음물에 10분 방치하였다. 5M 아세트산 칼륨(Potassium acetate) 3.5㎖ 넣고 섞어주고, 얼음물에 10분 둔 후, 동일 부피의 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) (50 : 50)을 넣고 잘 섞이게 흔들어준 다음, 4℃에서 4000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고, 0.5배 부피의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 다음 4℃에서 4000rpm으로 10분 원심분리하고 다시 상층액에 0.5×클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 다시 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고, RNase 200㎕을 넣고 잘 섞어 37℃에서 1시간 반응하였다. 0.7×이소프로필알코올과 2.5×에탄올을 넣고 잘 섞은 다음 게놈 DNA가 실처럼 눈에 보이면 꺼내서 튜브에 담고 상온에서 말린 후 물에 녹여서 다음 실험에 사용하였다.

실시예 2. 코스미드 라이브러리(Cosmid library) 제작

전체 DNA(Total DNA)를 제한효소 Sau3AⅠ으로 절단하여 사용하였다. Sau3A I 처리는 다음과 같은 조건으로 3분 내지 3분 30초간 수행하였으며, 0.5M EDTA를 10㎕ 처리한 후, 0.1×3M 아세트산 나트륨(sodium acetate) pH 5.4, 2.5×100% EtOH를 섞고, -70℃ 딥 프리저(deep freezer)에서 30분정도 인큐베이션한 후, 4℃에서 14,000rpm으로 10분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다.

	사용량
전체 DNA	25㎕
10×효소 완충액	3㎕
Sau3AⅠ	1/300으로 희석후 2㎕

침전된 Sau3A I로 절단된 DNA를 제한 효소 BamH과 HapⅠ으로 이중절단한 pOJ446과 다음과 같은 조건으로 16℃에서 하룻밤 라이게이션(ligation)하였다.

삽입 DNA(insert DNA)	4㎕
벡터(Vector) POJ446	4㎕
10×리가아제 완충액(ligase buffer)	1㎕
리가아제(ligase)	1㎕

패키징(Packaging)은 패키징 엑스(packaging extract; stratagene사)와 라이게이션(ligation)된 DNA를 섞어 수행하였다. 라이게이션된 DNA를 4㎕ 취하여 패키징 엑스(packaging extract)에 넣은 후 22℃에서 2시간 방치하였다. SM 완충액 500㎕와 클로로포름 20㎕를 넣고 잘 섞은 후, 원심분리하여 상층액을 새 튜브에 옮긴 다음 4℃에 보관하여 다음 실험에 사용하였다. 적정(Titration) 결과 약 7만개 정도의 콜로니를 얻을 수 있었다.

실시예 3. 젠타마이신 생합성 관련 유전자를 지닌 클론 선별

젠타마이신 생합성 과정에 관여할 것으로 예상되는 아미노트란스퍼레이즈 (scyllo-inosose aminotransferase)의 유사성을 비교하여 제작한 프라이머를 이용하여 전체 DNA로부터 폴리머레이즈 중합반응(polymerase chain reaction; 이하 "PCR") 산물을 얻어낸다. PCR 반응은 1 ㎕의 게놈 DNA, 1 ㎕의 프라이머-1(5'- ggC/g gAC gAg gTC/g ATC gTC/g CCC/g- 3'), 1 ㎕의 프라이머-3(5'- C/ggC CTg C/ggC gCA gTC CTC gAT-3')와 10×PCR 완충액, Taq 폴리머레이즈, 17㎕의 H₂O를 첨가하여 95℃ 7분, 60℃ 1분, 74℃ 1분으로 1 사이클, 95℃ 1분, 60℃ 1분, 74℃ 1분으로 30 사이클, 95℃ 1분, 60℃ 1분, 74℃ 1분으로 1 사이클 수행하여 258bp의 DNA 절편을 증폭하였다. 또한 젠타마이신 저해 유전자(gentamicin resistance gene)를 증폭하기 위하여 프라이머(5'- TCGGAGGACTCGATGACGAC -3')와 프라이머(5'- GATAATCGGCGAGTTGACAATG - 3')를 사용하여 600bp의 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 T-클로닝 벡터에 클로닝하여 탐침용으로 사용하였다.

탐침 제조는 다음과 같이 수행하였다. PCR 산물 5㎕, H2O 21㎕, 라담 프라이머(radam primer) 10㎕를 섞고 끓는 물에서 5분 동안 처리한 후, 5×완충액 10㎕, ³²P-레이블된 누클레오타이드(labeled nucleotide) 1㎕, 엑소(-) 클리나우(klenow) 1㎕를 넣어 섞은 다음 37℃에서 10분동안 반응시켰다. 2㎕의 중단 혼합물(Stop mix)을 넣고 반응을 중지시킨 다음 G-50컬럼을 이용하여 ³²P로 표지된 탐침을 분리하였다.

상기에서 제조한 코스미드 라이브러리를 10^-4으로 희석한 것을 500㎕씩 플레이팅한 다음, 콜로니 하이브리디제이션(colony hybridization)으로 양성 클론을 선별하였다. 콜로니 하이브리디제이션은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 나일론 멤브레인(Nylon membrane)을 플레이트에 올린 후 바로 떼어내어 솔루션 Ⅰ(10% SDS), 솔루션 Ⅱ(5M NaOH 10㎖ + 5M NaCl 30㎖ + H₂O 60㎖), 솔루션 Ⅲ(2M TrisCl 25㎖ + 5M NaCl 30㎖ + H₂O 45㎖) 그리고 솔루션 Ⅳ(20×SSPE 10㎖ + H₂O 90㎖)에 각각 5분 처리하고 상온에서 30분정도 말린다. 80℃ 오븐에서 2시간 처리한 후 UV에 7 내지 8분 정도 쬐어주었다.

나일론 멤브레인을 하이브리다이저(hybridizer)에서 선세척 용액(prewashing solution) (20×SSPE 25㎖ + 10% SDS 5㎖ + 0.5M EDTA 200㎕ + H2O 69.8㎖)으로 50℃에서 15분간 처리한 다음 상기에서 제조한 탐침을 변성(denaturation)시킨 뒤, 하이브리다이저 컨테이너에 하이브리디제이션 용액 20㎖(20×SSPE 12㎖ + 포름아마이드 12㎖ + Blotto 1㎖ + 3차 증류수 15㎖)를 넣고 50℃, 15분 처리하였다. 하이브리디제이션은 하이브리디제이션 용액 20㎖와 변성된 탐침(250㎕)을 넣고 50℃에서 하룻밤 수행하였다. 세척은 세척용액 Ⅰ(20×SSPE 10㎖ + 10% SDS 1㎖ + 3차 증류수 88㎖)으로 상온에서 15분, 세척용액 Ⅱ(20×SSPE 1㎖ + 10% SDS 1㎖ + 3차 증류수 98㎖)로 60℃에서 15분간 수행하였다. 감광은 카세트에 랩(wrap)에 싼 나일론 멤브레인을 엑스레이 필름(X-ray film)과 같이 넣고 -70℃ 딥 프리저에서 수행하였다. 그 결과 1차 스크리닝에서는 12개의 양성 클론을 얻을 수 있었다.

2차 스크리닝은 1차 스크리닝에서 양성으로 밝혀진 클론을 가지고 상기 1차 스크리닝과 같은 방법으로 수행하였으며, 다만 사용한 탐침은 메틸트란스퍼레이즈를 사용하였다. 그 결과 1개의 양성 클론을 얻을 수 있었다.

실시예 4. 산탄식 라이브러리(Shotgun library) 제조 및 전체 염기서열 해독

선별된 클론의 전체 염기서열 결정은 산탄식 서열결정방법(shotgun sequencing)을 사용하였다. 콜로니 하이브리디제이션으로 선별한 재조합 코스미드 클론을 LB/아프라마이신(apramycin) 배지에 접종하여 진탕 배양한 뒤 원심분리로 세포 배양체를 회수하였다. 표준적인 알칼리 용해 방법을 사용하여 맑아진 용균액(cleared lysate)을 얻은 다음 글래스비드 레진(glass bead-based resin)에 흡착·세척하여 코스미드 DNA를 분리, 정제하였다. DNA의 농도와 순수도는 시료의 일부를 아가로스 겔에 전기영동하여 판별하였다. 소니케이터를 사용하여 단편화시킨 코스미드 DNA를 아가로스 겔에 전기영동하여 1.5 - 2kb 범위에 해당되는 겔 조각을 오려낸 다음 퀴아젠사(QIAGEN) 킷트를 사용하여 단편화된 DNA를 회수하였다. T4 DNA 폴리머레이즈와 T4 폴리누클레오타이드 키나아제(T4 polynucleotide kinase)를 사용하여 단편화 DNA의 양 말단을 평활화한 다음 SmaI으로 절단한 뒤 탈인산화한 pUC 계열의 플라즈미드에 연결하여 재조합 벡터를 만들었다. 이 콜리(E. coli) DH5에 전기천공(electroporation)법으로 재조합 벡터를 도입하여 X-gal/IPTG/앰피실린이 함유된 LB 한천 배지에 도말 배양하였다. 하나의 코스미드 클론에 대하여 약 400개의 백색 콜로니를 채취하여 1ml씩의 LB/앰피실린 배지가 들어있는 96 딥-웰 플레이트(deep-well plate)에 접종하여 약 2일간 진탕 배양하였다. 세포 배양체를 회수하여 표준적인 알칼리 용해 방법으로 재조합 플라스미드 DNA로 농축된 맑은 용균액(cleared lysate)을 얻은 다음 GF/B 글래스 화이버 필터 플레이트(glass fiber filter plate)에 흡착·세척하여 재조합 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. DNA의 염기서열 결정 반응은 ABI사의 BigDye terminator kit를 사용한 사이클 시퀀싱(cycle sequencing) 반응을 이용하였으며 M13 정방향/역방향 프라이머를 사용하여 삽입 DNA의 양 말단의 염기서열을 모두 판독하였다. 시퀀싱 반응물은 ABI Prism 3700 DNA 분석기에서 모세관 전기영동을 통해 염기별로 전개하였으며 결과 파일(chromatogram)은 리눅스 환경에서 phred로 분석하여 텍스트 형식의 염기 서열 파일로 전환한 다음 phrap을 이용하여 contig를 작성하였다. Contig간의 순서 결정은 mate information에서 얻었으며 간격(gap) 부분은 PCR 산물 또는 플라스미드 서브클론을 사용하여 프라이머 워킹(primer walking)으로 채워나갔다. 워킹용 프라이머의 선정, contig 서열의 확인 및 편집 등은 consed 프로그램 환경에서 수행하였다.

실시예 5. 염기서열 분석 및 유전자 주석(annotation)

모든 염기서열의 분석 과정은 리눅스 환경에서 실시하였다. Contig 서열을 GenBank nt 및 nr dataset에 대하여 blastn/blastx (version 2.2.3)를 수행하여 상동성 검색에 의한 유전자 주석(gene annotation)을 실시하였다. Contig 서열상의 정확한 유전자 위치를 예측하기 위하여 glimmer 2.02 프로그램으로 500 bp 이상의 potential gene을 검색하였다. BLAST 매치(match) 중에서 기대치(expectation value)가 10^-6 이하이고 전체 길이의 60% 이상 유사도를 보이는 subject match에 기반하여 유전자를 명명하였다. 그 결과 선별된 코스미드 클론은 L-글루타민:실로 이노소스 아미노트랜스퍼레이즈, BtrM(글라이코실트랜스퍼레이즈), 2-디옥시 실로 이노소스 합성효소, 젠타마이신 저항성 16S rRNA 메틸레이즈, 글라이코실트랜스퍼레이즈(glycosyltransferase), BtrB(글루타메이트-1-세미알데하이드 2,1-아미노뮤테이즈) 등 젠타마이신 생합성에 관여하는 효소로 추정되는 유전자들을 암호화하고 있는 유전자 군(gene cluster)을 발견할 수 있었으며, 선별과정에 사용한 탐침용 유전자 및 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자도 이 유전자 군에 있음을 확인하였다.

아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자로 추정되는 유전자는 번역개시코돈(translation start codon) 'GTG'로부터 11bp 위에 리보조옴 결합부위(ribosome binding site)인 AGGAA 서열을 확인할 수 있었으며, 이 결합부위는 814 bp로 이루어 있었으며, 271개의 아미노산을 암호화하고 있는 것으로 확인하였다. 그리고 스트렙토마이세스 리보시디피커스(S. ribosidificus)의 APH와 47%, 스트렙토마이세스 프라디에(S. fradiae)의 APH와 45%의 동일성(identity)을 보였다(도 1, 2, 3 참조). 이들 효소는 ATP의 Υ-phosphate를 아미노글라이코사이드의 하이드록시기(hydroxyl group)에 전달하는 효소활성을 지니고 있는 것으로 밝혀져 있으며, 기질의 하이드록시기의 deprotonation을 촉매하는 conserved region(HDGXXXXN, X, any amino acid)을 지니고 있는 것으로 밝혀져 상기의 추정 유전자는 아미노글라이코사이드 인산전이효소임을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK24에서 항생제 저항성 확인

APH 효소의 항생제 내성 부여 활성을 측정하기 위하여 aph 유전자를 방선균 발현벡터 pWHM3에 삽입하여 스트렙토마이세스 리비단스에서 발현하기 위하여 APH 효소 유전자를 정방향 프라이머: 5'- GACCCGGATCCTGGCGTAGGA -3'와 역방향 프라이머: 5'-GAAGCTTTCAGAGAAATTCGTCCAGCAG - 3'를 이용하여 PCR을 통하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA 산물을 EcoRI으로절단하여 EcoRI으로 절단된 pWHM3 벡터에 라이게이션을 통하여 삽입하였다(도 5 참조). 완성된 APH 효소 발현용 벡터를 스트렙토마이세스 리비단스 TK24 균주로 통상의 방법대로 도입시킨 후, 발현벡터가 도입된 균주를 선별하였다. 형질전환 균주의 항생제 내성 활성을 측정하기 위하여 pWHM3 발현벡터만 도입된 균주와 APH를 지닌 발현벡터를 도입한 균주를 70㎍/ml 젠타마이신 함유된 R2YE 한천 플레이트에 배양한 결과, pWHM3 발현벡터만 도입된 균주는 자라지 못하였으나 APH를 지닌 발현벡터를 도입한 균주는 잘 자라는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).

실시예 7. 스트렙토마이세스 리비단스( S. lividans ) TK24에서 항생제 생산량 증가 확인

APH 발현에 의한 항생제 생산 증가를 하기와 같이 실험함으로써 입증하였다. 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) TK24에 APH 효소의 유전자를 도입하기 위하여 에스세리시아 콜라이(E. Coli) ·방선균 셔틀벡터인 pWHM3의 EcoRI 제한효소 인식부위에 클로닝한 후 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) TK24에 도입하였다. 제조된 APH 발현벡터는 티오스트렙톤 유도 프로모터(thiostrepton inducible promoter) tipAdml 조절하에 APH가 발현되도록 제조하였다. 그 후 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) TK24에서 생산되는 대표적인 항생물질인 액티노로딘(actinorhodin)의 생산량을 측정하였다. 액티노로딘(actinorhodin)의 생산 배지는 글리세롤(glycerol) 50g, 글루탐산(glutamic acid) 5g, 모포리노프로페인 설포닉산(morpholinopropane sulfonic acid) 21g, MgSO_4·7H₂O 200mg, CaCl₂·2H₂O 100mg, NaCl 100mg, KH₂PO₄ 82mg, FeSO₄·7H₂O 9mg, 트레이스 엘리먼트 용액(trace element solution) 2 ml (per liter)와 pH 6.5로 맞추어 사용하였다. 그 후 28 ℃에서 진탕 배양하면서 7일 간 항생제 생산량을 측정하였다.

APH 효소의 유전자의 발현으로 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) TK24에서 항생제의 다량 생산을 유도하는지 알아보기 위하여 12㎍/ml 티오스트렙톤(thiostrepton)이 함유된 R2YE 한천 플레이트에서 pWHM3 벡터를 지닌 S. lividans, pAPH 발현벡터를 지닌 S. lividans 배양한 결과 도 7에서 보는 바와 같이 pAPH 발현벡터를 지닌 S. lividans TK24 균주에서 항생제가 다량 발현함을 확인할 수 있었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 마이크로모노스포라 퍼퓨레아(ATCC 15835)에서 유래한 아미노글라이코사이드 인산전이효소의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 결정하여 제공하는 효과가 있으며, 이 유전자를 이용하여 항생제 생산균주에 도입시켜 그로부터 얻은 형질전환체에서 다량의 항생물질을 직접 분리할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명의 APH 효소 유전자의 염기서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 APH 효소 유전자의 염기서열로부터 추론한 APH 효소의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3는 본 발명의 APH 효소 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열을 기초로 하여 미국 젠뱅크(GenBank) 데이터와 비교한 상동성 검색 결과이다.

도 4는 APH 효소 유전자를 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) TK24에서 발현하기 위한 발현벡터 pAPH의 모식도를 나타낸다.

도 5는 발현벡터 pAPH를 BamHI과 HindII로 절단한 후 아가로스 젤에서 전기영동한 그림을 나타낸다.

레인 1: DNA 사이즈 마아커

레인 2: pAPH 발현벡터를 BamHI과 HindIII로 절단한 것

도 6은 발현벡터 pAPH가 도입된 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans)를 70㎍/ml 젠타마이신(gentamicin) 함유된 R2YE 한천 플레이트(agar plate)에 배양한 그림을 나타낸다.

A, pWHM3 벡터를 지닌 스트렙토마이세스 리비단스

B, pAPH 발현벡터를 지닌 스트렙토마이세스 리비단스

도 7은 발현벡터 pAPH가 도입된 스트렙토마이세스 리비단스를 12㎍/ml 티오스트렙톤(thiostrepton)이 함유된 R2YE 한천 플레이트(agar plate)에서 배양한 그림을 나타낸다.

A, pWHM3 벡터를 지닌 스트렙토마이세스 리비단스

B, pAPH 발현벡터를 지닌 스트렙토마이세스 리비단스

도 8은 데이터베이스를 통한 아미노글라이코사이드 인산전이효소의 상동성 검색결과를 나타낸다.

<110> GENOTECH CORP. <120> Nucleotide sequences and amino acid sequences of aminoglycoside phosphotransferase and uses thereof <130> WJTJSHK-030930 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 814 <212> DNA <213> Micromonospora purpurea <220> <221> CDS <222> (1)..(813) <400> 1 gtg aag atg gtt gca gca ccg ata ccg gtg gct ggc tgg ggc gac aag 48 Val Lys Met Val Ala Ala Pro Ile Pro Val Ala Gly Trp Gly Asp Lys 1 5 10 15 gac gac ccg tgg gag tgc ctg ggc gag cgt tcg tcc ggc gcg acg gtc 96 Asp Asp Pro Trp Glu Cys Leu Gly Glu Arg Ser Ser Gly Ala Thr Val 20 25 30 tac cgc gtg ggg gag gtt ccc tcc ttc tac gtg aag acc acg ccg ccc 144 Tyr Arg Val Gly Glu Val Pro Ser Phe Tyr Val Lys Thr Thr Pro Pro 35 40 45 agg cac cct gac gac cac cgg ttc aac ccg acc aag gag gcc gag cgg 192 Arg His Pro Asp Asp His Arg Phe Asn Pro Thr Lys Glu Ala Glu Arg 50 55 60 ctc cgc tgg ctg gcc gcc cag ggg ctg ccc gtc ccc gag gtg gtg gcc 240 Leu Arg Trp Leu Ala Ala Gln Gly Leu Pro Val Pro Glu Val Val Ala 65 70 75 80 ctc gat gcc aac gac gag ctg gcg tgg gtg gtc acc agg gcg ctg ccc 288 Leu Asp Ala Asn Asp Glu Leu Ala Trp Val Val Thr Arg Ala Leu Pro 85 90 95 ggg cgg ccc gcc gcc cgg cac tgg aaa ccg gag gaa cgc tgg cgg gtg 336 Gly Arg Pro Ala Ala Arg His Trp Lys Pro Glu Glu Arg Trp Arg Val 100 105 110 atc gac gtc gtc gcc gac gtc gcg cgt acg ctg cac gcg ctt ccg gtg 384 Ile Asp Val Val Ala Asp Val Ala Arg Thr Leu His Ala Leu Pro Val 115 120 125 gcg gag tgc ccg ttc gag cgt cgg ctg gcc gac ctg atc cac cag gcc 432 Ala Glu Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ala Asp Leu Ile His Gln Ala 130 135 140 agc tcc tcg atg gcg ctg ggc gcg ctc gac ctc gac gac gtg gac ccc 480 Ser Ser Ser Met Ala Leu Gly Ala Leu Asp Leu Asp Asp Val Asp Pro 145 150 155 160 tcg cac gag ggc tgg acg gct cag cag ctc tgg gac gag ttg agc aag 528 Ser His Glu Gly Trp Thr Ala Gln Gln Leu Trp Asp Glu Leu Ser Lys 165 170 175 atg aca ccc ccg gcc gag gac gac ctc gtc gtc tgc cac ggt gac ttc 576 Met Thr Pro Pro Ala Glu Asp Asp Leu Val Val Cys His Gly Asp Phe 180 185 190 tgc ctc gac aac gtg ctg gtc gat ccg gag acg ctg acc ctg gcc ggc 624 Cys Leu Asp Asn Val Leu Val Asp Pro Glu Thr Leu Thr Leu Ala Gly 195 200 205 atc ctc gac gtc gac cgg gcc ggg gtg tcg gac cgg tgg atg gac ctc 672 Ile Leu Asp Val Asp Arg Ala Gly Val Ser Asp Arg Trp Met Asp Leu 210 215 220 gcc ctg gcg ctg tac aac atc ggc cag gac gac gtc atg ggg cta cgg 720 Ala Leu Ala Leu Tyr Asn Ile Gly Gln Asp Asp Val Met Gly Leu Arg 225 230 235 240 tcc gcc gca cgc cga gca ctt cct ccg gcg gta cgg cat cac cgt cga 768 Ser Ala Ala Arg Arg Ala Leu Pro Pro Ala Val Arg His His Arg Arg 245 250 255 cca gca caa gct gac cta cat cca act gct gga cga att tct ctg 813 Pro Ala Gln Ala Asp Leu His Pro Thr Ala Gly Arg Ile Ser Leu 260 265 270 a 814 <210> 2 <211> 271 <212> PRT <213> Micromonospora purpurea <400> 2 Val Lys Met Val Ala Ala Pro Ile Pro Val Ala Gly Trp Gly Asp Lys 1 5 10 15 Asp Asp Pro Trp Glu Cys Leu Gly Glu Arg Ser Ser Gly Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Arg Val Gly Glu Val Pro Ser Phe Tyr Val Lys Thr Thr Pro Pro 35 40 45 Arg His Pro Asp Asp His Arg Phe Asn Pro Thr Lys Glu Ala Glu Arg 50 55 60 Leu Arg Trp Leu Ala Ala Gln Gly Leu Pro Val Pro Glu Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Asp Ala Asn Asp Glu Leu Ala Trp Val Val Thr Arg Ala Leu Pro 85 90 95 Gly Arg Pro Ala Ala Arg His Trp Lys Pro Glu Glu Arg Trp Arg Val 100 105 110 Ile Asp Val Val Ala Asp Val Ala Arg Thr Leu His Ala Leu Pro Val 115 120 125 Ala Glu Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ala Asp Leu Ile His Gln Ala 130 135 140 Ser Ser Ser Met Ala Leu Gly Ala Leu Asp Leu Asp Asp Val Asp Pro 145 150 155 160 Ser His Glu Gly Trp Thr Ala Gln Gln Leu Trp Asp Glu Leu Ser Lys 165 170 175 Met Thr Pro Pro Ala Glu Asp Asp Leu Val Val Cys His Gly Asp Phe 180 185 190 Cys Leu Asp Asn Val Leu Val Asp Pro Glu Thr Leu Thr Leu Ala Gly 195 200 205 Ile Leu Asp Val Asp Arg Ala Gly Val Ser Asp Arg Trp Met Asp Leu 210 215 220 Ala Leu Ala Leu Tyr Asn Ile Gly Gln Asp Asp Val Met Gly Leu Arg 225 230 235 240 Ser Ala Ala Arg Arg Ala Leu Pro Pro Ala Val Arg His His Arg Arg 245 250 255 Pro Ala Gln Ala Asp Leu His Pro Thr Ala Gly Arg Ile Ser Leu 260 265 270 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> putative primer sequence of scylloinosose aminotransferase <400> 3 tcggaggact cgatgacgac 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> putative primer sequence of scylloinosose aminotransferase <400> 4 gataatcggc gagttgacaa tg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Micromonospora purpurea <400> 5 gacccggatc ctggcgtagg a 21 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Micromonospora purpurea <400> 6 gaagctttca gagaaattcg tccagcag 28

Claims

마이크로모노스포라 퍼퓨레아(ATCC 15835)로부터 분리되었으며, 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는 아미노글라이코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferase) 유전자 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 기능적 등가물.
상기 제1항의 유전자 염기서열로부터 번역된 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는 아미노글라이코사이드 인산전이효소.
상기 제1항의 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 발현벡터.
상기 제3항의 발현벡터를 포함하는 아미노글라이코사이드 인산전이효소 제조 형질전환체.
상기 제1항의 아미노글라이코사이드 인산전이효소 유전자 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 기능적 등가물을 포함하는 코스미드.
상기 제2항의 아미노글라이코사이드 인산전이효소를 사용하여 형질전환체로부터 항생제 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항생제 생산방법.