KR100481390B1 - 폴리하이드록시알카노이트 마이크로스피어 및 이를 이용한상호작용 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리하이드록시알카노이트 (PHA) 마이크로스피어에 목적단백질 또는 목적리간드가 부착되어 있는 결합체에 있어서, 목적단백질 또는 목적리간드와 PHA 마이크로스피어 사이에 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 링커로 삽입되어 있어 목적단백질 또는 목적리간드가 상기 링커를 통해 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 PHA 마이크로스피어의 결합체는 목적단백질-반응단백질간의 반응, 목적단백질-반응리간드간의 반응, 목적리간드-반응단백질간의 반응 또는 목적리간드-반응리간드 간의 반응을 효율적으로 검출하는 데 유용하다.

Description

폴리하이드록시알카노이트 마이크로스피어 및 이를 이용한 상호작용 검출방법 {PHA Microsphere and the Method for Detecting a Reaction}

발명의 분야

본 발명은 목적단백질 또는 목적리간드가 기질분해효소의 기질결합 영역을 링커로 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 폴리하이드록시알카노이트 (PHA) 마이크로스피어에 목적단백질 또는 목적리간드가 부착되어 있는 결합체에 있어서, 목적단백질 또는 목적리간드와 PHA 마이크로스피어 사이에 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 링커로 삽입되어 있어 목적단백질 또는 목적리간드가 상기 링커를 통해 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체에 관한 것이다.

발명의 배경

최근 게놈 프로젝트들이 완료되어 감에 따라, 생명현상의 기본이 되는 유전자에 대한 관심이 고조되고 있다. 현재 10 여만 개로 예측되는 인간 유전자 중, 1 만여 개의 기능이 밝혀져 있고, 이러한 유전자들은 대부분이 질환과 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 질병이 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 유발되기 때문에, 현재까지 개발되었거나 개발 중에 있는 의약품의 95% 이상이 단백질을 목적으로 하고 있다. 따라서, 특정 단백질 및 리간드에 상호작용 하는 생체분자의 기능을 밝히고, 단백질 기능분석 및 네트워크 분석을 통하여 얻어진 자료를 바탕으로 고전적인 방법으로는 불가능하였던 질병에 대한 치료 및 예방법을 개발하는 연구에 있어서 필수적인 것이 효율적인 단백질과 단백질 그리고 단백질과 리간드의 반응 검출기술이다. 고분자 마이크로비드(microbead) 또는 마이크로스피어(microsphere)를 이용한 기술은 고체상 (solid-phase) 화학적 합성에 처음으로 도입되었다 (참조: Merrifield R. et al, JACS, 85:2149-2154, 1963). 주로 직경 사이즈가 50-200 ㎛이고 구형 모양으로 된 가교된 다공성 폴리스티렌 (polystyrene)을 사용하여 혼합화학적 합성 (combinatorial chemical synthesis) 연구에 주로 사용되어져 왔다. 지금까지 진행되어온 단백질과 단백질 반응검출에 관한 최신 기술은 DNA 칩 기술을 응용한 단백질 칩 기술이며, 목적 단백질에 친화성 태그를 이용하여 생체분자의 배향성 (orientation)을 분자수준에서 조절하여, 균일하고 안정된 생체분자의 단일층을 지지체 표면에 형성시키는 기술을 이용하여 특이적으로 고정하여 단백질과 단백질 상호작용을 분석하는 기술이라 할 수 있다 (참조: Paul J. et al., JACS, 122:7849-7850, 2000; RaVi A. et al., Anal. Chem. , 73:471-480, 2001; 및, Benjamin T. et al., Tibtech., 20:279-281, 2002). 한편 단백질-리간드 반응으로써 대표적인 것이 아비딘(avidin)-바이오틴(biotin) 반응인데 단백질 덴드리머(dendrimer) 단일층(monolayer)을 형성한 골드 기판에 고정 후 바이오틴으로 활성화하여 아비딘 결합을 통해 활성을 측정하였다 (참조: Mi-young H. et al., Langmuir, 19: 416-421, 2002). 또한 생체 외에서 결합된 DNA-단백질 결합체를 이용하여 다양한 분자 리간드를 사용하여 단백질 칩으로 분석가능성을 제시하였다 (참조: Christof M. et al., Rev. Mol. Biotech., 82:47-66, 2001). 이와 아울러 펩타이드 및 작은 화합물과 지지체에 고정된 단백질과의 반응 검출에 사용되어져 왔다 (참조: Douglas A J. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 14:87-95, 2003; Bogyo M. et al., Chem. Biol., 7:27-38, 2000; Bogyo M. et al., PNAS, 94:6629-6634, 1997 및 Thornberry N. et al., Biochemistry, 33:3934-3940, 1994).

리간드-단백질 반응 검출을 위해 고체 지지체 (solid supports)에 알려진 리간드를 합성, 고정하여 목적 단백질과의 반응을 검색하는 연구는 많이 보고 되었다. 예를 들면, ATP (adenosine triphosphate) 또는 GTP(guanosine triphosphate)와 작은 화합물을 고체 지지체에 리간드로 고정하여 이를 다시 펩타이드에 접합시켜 리셉터의 신호전달 양상을 분석하였다 (참조: Shawn C. et al., JACS, 125:1114-1115, 2003 및 MacBeath G. et al., JACS, 121:7967-7968, 1999). 그리고 지방산(fatty acid) 및 지질막(lipid membrane)을 지지체에 올려 패터닝(patterning)을 형성하여 지질막을 이용한 분석에 응용 가능성을 제시하였다 (참조: Jay T. G. et al., Acc. Chem. Res., 35:149-157, 2002). 또한 탄수화물을 지지체에 어레이를 형성하여 이를 이용한 단백질 결합 및 효소반응을 분석하였다 (참조: Benjamin T. H. et al., Chemistry & Biology, 9:443-454, 2002). DNA 탐침 (probe)이 고정된 마이크로비드를 이용한 cDNA 클로닝, 병렬 시퀀싱(parallel sequencing) 반응에 사용되어져 왔다 (참조: Kohara Y. et al, Nucleic Acids Res., 30: 87, 2002; Brenner, S. et al., Proc. Natl Acad. Sci., 97:1665-1670, 2000 및 Brenner, S. et al., Nat. Biotechnol., 18:630-634, 2000). 최근 마이크로비드에 올리고뉴클레오타이드를 접합하여 RNA와 이와 결합하는 단백질의 반응을 플로우사이토메트리 기법을 통해 보고된 바 있다 (Alexander S. et al., Molecular & Cellular Proteomics, 1:922-929, 2002). 마이크로어레이 기법을 통해 펩타이드를 재조합 및 생체 외(in vitro) 화학적 합성법을 통해 합성한 펩타이드를 기판에 고정하여 단백질-펩타이드 반응을 검출하였다 (참조: 대한민국특허 출원번호: 10-2003-0000464 및 Cleo M. et al., JACS, 124:14868-14870, 2002).

그러나, 상기와 같은 다양한 기술이 개발되었음에도 불구하고 고가의 장비들이 필요하고 제조공정이 복잡하여 실용성이 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한 PHA 마이크로스피어에 특이적으로 고정된 단백질, 펩타이드 및 작은 화합물을 이용하여 단백질-단백질, 단백질-리간드, 리간드-단백질 반응검출에 대한 보고는 전무한 실정이다. 이에 본 발명자들은 PHA에 세포외 PHA 분해효소가 특이적으로 흡착하여 분해하는 성질을 이용하여 PHA로 제조된 마이크로스피어를 이용한 단백질-단백질, 단백질-리간드 반응 검출 시스템을 착안하게 되었으며 또한 PHA 마이크로스피어에 고정된 리간드를 이용하여 리간드-단백질 반응검출에 대한 가능성을 제시하였다.

이와 같은 성질을 잘 만족하는 시스템을 위하여 본 발명자들은 단백질을 특이적으로 PHA 마이크로스피어 상에 고정하기 위하여 PHA 분해효소 (depolymerase)를 본 발명에 적용하였다. PHA의 단량체의 탄소수의 개수에 따라 탄소수 3개에서 5개인 짧은 탄소사슬길이의 폴리머 (short-chain-length polyhydroxyalkanoates, SCL-PHA), 탄소수 6개에서 12개로 구성된 중간 사슬 길이의 폴리머(medium-chain-length polyhydroxyalkanoates, MCL-PHA), SCL-PHA중 하나 혹은 하나 이상과 MCL-PHA중 하나 혹은 하나 이상의 그 단량체로 구성된 공중합체 (copolymer), SCL-PHA로 구성된 PHA와 MCL-PHA로 구성된 PHA로 구성된 블렌드(blend)로 분류될 수 있다. 가츠야는 미생물유래의 분해효소 (depolymerase)를 이용하여 서로 다른 성질의 폴리하이드록시알칸산 필름 (PHA film) 표면에서 기질과의 흡착(adsorption)과 가수분해(hydrolysis)의 동력학적인 연구를 발표하였다 (Kasuya et al., Int. J. Biol. Macromol., 19:35, 1996). 1989년 이후로 약 20종류의 폴리하이드록실알카노에이트 분해효소(PHA depolymerase)에 대해서 보고가 되었다 (Jendrossek and Handrick Annu. Rev. Microbiol., 56:403-432, 2002). 이들 중 알칼리제네스 페칼리스 유래의 PHA 분해효소는 특이적으로 3-하이드록시부틸산(3HB)과 하이드록실발레노닌산(3HV)에도 활성을 가지기도 한다. 이와는 반대로 슈도모나스 플루오레선스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 분해효소 (depolymerase)는 3-하이드록실옥탄산(3-HO)에 특이적으로 활성을 가진다는 보고도 있었다 (Schrimer et al., Can. J. Microbiol. 41:170-179, 1995). 결론적으로 이러한 분해효소 (depolymerase)는 탄소수에 따른 체인 길이에 따라서 특이적으로 활성을 나타내기도 한다. 폴리하이드록시알칸산 분해효소 (PHA depolymerase) 단백질은 도메인 구조(domain structure)를 가지면서 다음과 같은 성질이 있다는 것이 보고되었다. 첫째 22-58개의 펩타이드로 구성된 인식서열(signal sequence)을 가지고 있다. 두 번째로 N 말단에 큰 촉매부위(catalytic domain)가 있다. 세 번째로 촉매부위와 기질 반응 부위사이에 링크 부분(linker region)을 가지고 있다. 아직까지 이 부위에 대한 자세한 작용기전에 대해서 보고된 바는 없다. 네번째로 카르복실 말단 부위(C terminal)에 있는 기질결합영역(substrate binding domain)이 폴리하이드록시알칸산 과립(PHA granule)과 직접 결합한다는 것이다. 이와 같은 기질결합영역(substrate binding domain)은 크게 두 형태(type 1과 type 2)로 나눌 수가 있으며 이에 대한 많은 보고가 있었다 (Jendrossek et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 46:451-463, 1996; Shinomiya et al., FEMS Microbiol. Lett., 154:90-94,1997). 이 기질결합영역(substrate binding domain)의 기능은 말토스 결합 단백질 (maltose-binding protein)이나 글루타치온-에스-트란스퍼라아제(GST-S-transferase)를 이용한 퓨전 단백질 (fusion protein)을 이용한 분석으로부터 그 기능에 대한 연구가 보고되어 왔다 (Kasuya et al., Int. J. Biol. Macromol., 24:329-336, 1999). 여기에 슈도모나스 스츄쩌리 (Pseudomonas stutzeri), 알칼리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis AE122), 슈도모나스 GM101 (Pseudomonas sp. GM101)가 하나가 아닌 두 개의 기질결합영역(substrate binding domain)을 가진다는 것이 보고되었다 (Kita et al., Biochim. Biophys. Acta. 1352:113-122, 1997; Ohura et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:189-197, 1999; Kita et al., Biochim. Biophys. Acta., 1352:113-22, 1997). 이들은 기질결합영역(substrate binding domain)이 폴리하이드록시 알칸산 분해효소 (PHA depolymerase)의 솔리드 기질(solid substrate)을 가수분해하는데 매우 중요한 역할을 할 것이라고 보고했지만 아직도 여기에 관한 구체적인 작용기전에 대해서는 보고된 바는 없다. 예를 들어 이와타 등은 이러한 성질을 확인하고자 폴리하이드록시 부틸산(P3HB) 싱글 크리스탈(single crystal)에 슈도모나스 스투쩌리(Pseudomonas stutzeri YM1006) 유래의 세포외 분해효소(depolymerase)를 이용하여 이뮤노-골드 라벨링 방법(Immuno-gold labeling technique)으로 확인하였다 (Iwata et al., Macromolecules, 30:833-839, 1997). 또한 카쥬야 등은 글루타치온-에스-트란스퍼라아제 (GST-S-transferase)와 기질결합영역(substrate binding domain)을 흡착실험결과 폴리하이드록실부틸산(P(3HB)에 결합된 융합 단백질(fusion protein)은 시간이 지남에 따라 그 양이 증가되었다 (Kasuya et al., Int. J. Biol. Macromol., 24:329-336, 1999). 폴리하이드록실부틸산 (P(3HB))과 폴리하이드록실프로피온산 (P(3HP))에 흡착된 단백질은 사용한 버퍼(buffer)나 밀리큐 증류수 (Milli Q water)에 아주 오랜 시간 떨어지지 않았고 이는 융합 단백질이 그 표면에 아주 강하게 결합되어 있다는 것을 의미한다. 폴리에스터 (polyester)의 표면(surface)과 기질결합영역(substrate binding domain)사이에 분자 인식(molecular recognition)을 기초로 특이적 결합 양상(specific interaction)을 가진다고 할 수 있다.

최근 본 발명의 발명자들은 세포외 PHA 분해효소의 기질결합영역 단백질과 융합시킨 형태의 단백질을 사용하여 PHA 칩 또는 마이크로어레이 상에서 목적단백질과 반응 단백질간의 반응분석을 위한 시스템에 대하여 특허출원 한 바 있다 (대한민국특허출원번호: 10-2003-0005730). 비록 단백질과 단백질, 단백질과 리간드, 리간드와 단백질간 반응의 고밀도 분석 시스템에는 적합하나 형광스캐너 등의 고가의 장비가 필요하여 실용성이 떨어지는 특징을 가지고 있으며 한번 제조된 칩은 고정된 단백질을 재배열 할 수 없어 분석하고자 하는 반응 단백질에 따라 매번 칩을 제조하여야 하는 단점을 가지고 있다. 이에 본 발명자들은 좀더 우수하고 경제성이 높으며, 목적단백질을 세포외 분해효소의 기질결합영역에 융합 발현시켜 PHA 마이크로스피어 상에 특이적으로 고정하여 비특이적인 단백질 결합이 일어나지 않음으로써 복잡한 반응공정이 필요하지 않고 액상에서 마이크로스피어를 통해 단백질과 리간드와의 상호반응을 효율적으로 플로우사이토메트리(flow cytometry)를 이용하여 분석할 수 있는 시스템을 개발하게 되었다.

본 발명의 목적은 PHA 마이크로스피어에 목적단백질 또는 목적리간드가 부착되어 있는 결합체에 있어서, 목적단백질 또는 목적리간드와 PHA 마이크로스피어 사이에 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 링커로 삽입되어 있어 목적단백질 또는 목적리간드가 상기 링커를 통해 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 결합체를 이용하여 목적단백질-반응단백질간의 반응, 목적단백질-반응리간드간의 반응, 목적리간드-반응단백질간의 반응 또는 목적리간드-반응리간드 간의 반응을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 목적단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적 펩타이드를 코딩하는 핵산과 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 PHA에 기질특이성을 가지는 PHA 분해효소의 기질결합 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질 또는 목적 펩타이드와 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 융합된 단백질을 제조하는 단계; 및 b) 상기 융합 단백질을 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 PHA의 마이크로스피어에 고정시키는 단계를 포함하는 목적 단백질 또는 목적 리간드가 PHA 분해효소의 기질결합 영역을 링커로 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 목적단백질 유전자 또는 목적 펩타이드를 코딩하는 핵산에 PHA에 특이적으로 결합하는 분해효소의 기질결합영역을 발현시키는 유전자를 대장균에 도입, 융합 발현시킨 후, 상기 융합 단백질을 PHA 마이크로스피어에 특이적(specific)으로 고정되도록 하고자 연구 노력한 결과, 목적단백질 유전자 또는 목적 펩타이드를 코딩하는 유전자 말단에 알카리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis)의 세포외 PHA 분해효소 (depolymerase) 기질결합영역이 융합 발현되도록 플라스미드를 제작하고, 상기 플라스미드로 대장균을 형질전환하여 배양함으로써 녹색형광단백질에 PHA 분해효소의 기질결합영역이 결합된 융합 단백질을 생성하고, 이를 PHA 마이크로스피어에 특이적 (specific)으로 고정하고, 제작된 마이크로스피어를 이용하여 단백질-단백질 반응을 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명은 목적 단백질 유전자의 C 말단에 알카리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis)의 세포외 PHA 분해효소(depolymerase)의 기질결합영역(substrate binding domain)을 융합된 형태로 발현시키는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 수득하고, 이를 제조된 PHA 마이크로스피어에 특이적(specific)으로 고정하는 단계를 포함한다.

PHA 분해효소의 기질결합 영역은 목적단백질의 C-말단, N-말단 또는 N-말단과 C-말단의 사이에 융합되어 있는 것이 바람직하다.

PHA 분해효소의 기질결합 영역과 융합형태로 발현이 곤란한 리간드는 PHA 분해효소의 기질결합 영역에, 화학적 수정(chemical modification), 친화성 태그 및 공유결합 등을 이용한 다양한 방법으로 고정할 수 있다.

상기 마이크로스피어의 제조에 바람직한 PHA는 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 고분자(polymer), 공중합체(copolymer) 또는 고분자 블렌드(polymer blend)가 가능하다.

본 발명에서 사용되는 목적단백질의 구체적인 예로는 효소 또는 항체가 있으며, 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지방산 또는 지질을 포함한다.

본 발명자들이 GFP-PHA 분해효소 기질결합영역 형태의 융합단백질을 생산하고 수용성으로 발현되는 형질전환된 대장균을 제조하기 위한 pTacGFP-AfBD는 GFP를 암호화 (coding)하는 유전자와 알카리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis)의 세포외 PHA 분해효소 (depolymerase)의 기질결합영역 (substrate binding domain)를 암호화하는 유전자 및 엠피실린 저항 유전자(ampicilline resistance gene)를 포함한다. 이때, 대장균에서 GFP와 기질결합영역을 융합단백질 형태로 발현하기 위해 GFP 유전자를 암호화하는 재조합 플라스미드 pGFPuv (Clonetech Laboratories, Inc., 미국)로부터 2개의 프라이머 (primer)을 합성하여 PCR (polymer chain reaction)을 통해 제작하였으며, 알카리제네스 페칼리스의 염색체 DNA로부터 GenBank에 등록된 염기서열을 이용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 의해 알카리제네스 페칼리스의 세포외 PHA 분해효소 기질흡착영역 유전자를 얻어 중첩 PCR을 통해 GFP와 기질결합영역이 융합된 형태의 cDNA를 수득하였으며, 균주의 선별을 위하여 엠피실린 저항 유전자를 이용한다.

상기 균주로부터 발현된 GFP-기질결합영역의 융합단백질을 수용성 형태로 발현하여 간단한 세포 파쇄 공정을 거쳐 이들을 PHA로 제작된 마이크로스피어에 기질결합영역이 결합된 GFP를 특이적으로 일정방향으로 고정함으로써, 단백질과 단백질 또는 단백질과 리간드의 상호작용이 구조적으로 효율적인 반응을 유도하고, 결국 형광체가 표지된 항체를 이용하여 반응을 쉽게 검색할 수 있었다. 이들 마이크로스피어에 사용될 수 있는 목적단백질은 실시예에 국한되지 않고 PHA 마이크로스피어를 이용한 여러 다른 단백질 또는 리간드를 이용한 단백질과 단백질, 단백질과 리간드, 리간드와 단백질 반응하는 모든 상호작용에 적용할 수 있다는 것은 바이오 분야 전문가들에게는 자명한 사항이다. 본 발명에서 사용되는 리간드에는 특정한 단백질과 반응할 수 있는 펩타이드, DNA와 RNA를 포함하는 핵산, 단백질이나 펩타이드와 반응하는 화합물, 탄수화물(carbohydrates), 지방산(fatty acids) 또는 지질(lipids) 등을 포함한다. 다양한 기질결합영역을 합성할 수 있는 미생물로는 에시도보랙스 스피시즈 (Acidovorax sp.), 알칼리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis), 코마모나스 에시도보란스 (Comamonas acidovorans),코마모나스 테스토스테로니 ( Comamonas testosteroni) ,코마모나스 스피시즈 (Comamonas sp), 렙토스길스 스피시즈 (Leptothrix sp.), 슈도모나스 스피시즈 (Pseudomonas sp.), 슈도모나스 플로레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 레모이네 (Pseudomonas lemoignei),슈도모나스 스튜체리 (Pseudomonas stutzeri) , 스트렙토마이세스 하이드로스코피커스 ( Streptomyces hygroscopicus)로 알려져 있다. 이로부터 다양한 기질결합영역을 본 발명에 적용되는 것은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명하다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : PHA를 이용한 마이크로스피어 제조

재조합 대장균으로부터 추출한 PHA 0.25 g을 5 mL의 클로로포름 (chloroform)에 용해하여 5% 중량퍼센트로 포함된 폴리비닐알코올 (PVA, poly(vinyl alcohol), 평균분자량 22,000)이 함유한 15 mL의 증류수를 용해된 고분자 용액에 첨가한다. 오일/물이 상 분리된 용액을 호모지나이저를 이용하여 이멀젼(emulsion) 시킨다. 이멀젼된 용액을 원심분리 (3,000 rpm, 10 분)하여 제조된 마이크로스피어를 수득한다. 증류수로 수득한 마이크로스피어를 세 번 세척하여 동결건조기를 이용하여 진공상태로 하루정도 건조시킨다. 제조된 PHA 마이크로스피어를 주사전자현미경(SEM, JSM-5610, JEOL)을 이용해서 모폴로지(morphology)를 분석하여 그 크기 및 형태가 균일하다는 것을 확인하였다 (도 3).

또한 마이크로스피어 사이즈는 원심입자크기분석기(CPSA, Shimadzu)를 이용하여 분석하였다. 본 발명에서는 1-8 ㎛ 마이크로스피어를 사용하였으나 다양한 사이즈의 마이크로스피어가 본 발명에 적용되는 것은 자명하다 할 것이다.

실시예 2 : GFP- 알카리제네스 페칼리스의 세포외 PHA 분해효소 기질결합영역 유전자의 클로닝

GFP-알카리제네스 페칼리스 세포외 PHA 분해효소 기질결합영역을 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 마머 (Marmur)의 방법 (참조: Marmur, J. Mol. Biol., 3:208-218, 1961)으로 분리한 알카리제네스 페칼리스 염색체 유전자를 주형 DNA로 하여, 알카리제제스 페칼리스 세포외 PHA 분해효소 유전자 서열 (참조: Kita, K., et al., NCBI Sequence Database, U55775, 1997)로부터 GFP 및 기질결합영역이 융합된 형태로 발현되도록 주형 DNA로 사용하기 위한 중첩 중합효소 연쇄반응 반응에 이용하기 위하여 제작한 하기의 프라이머 1과 2(서열번호 1과 2)를 이용하였으며, 클로닝을 위해 제한효소 EcoRI (프라이머 1)과 기질결합영역 앞부분이 중첩되도록 고안되어 있다.

5'-CGGAATTCATGCATCACCATCATCACCATAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3' (서열번호 1)

5'-GGCCGATTTCGTCGTCGCTTTGTAGAGCTCATCCATGC-3' (서열번호 2)

재조합 플라스미드 pGFPuv (Clonetech., 미국)를 주형 DNA로 사용하여 합성된 프라이머 1과 2를 이용해 PCR로 증폭한 후 GFP 및 기질결합영역이 융합된 형태 PCR 산물을 얻기 위해서 프라이머 3과 프라이머4(서열번호 3과 4)를 사용하였다.

5'-GCGACGACGAAATCGGCC-3' (서열번호 3)

5'-GCGAAGCTTTATGGACAATTCCCGACGATG-3' (서열번호 4)

합성된 프라이머 4에는 클로닝을 위해 쉽게 제한 효소 HindIII의 절단위치 (site)가 삽입되어 있다. 상기 제작된 각각 PCR 산물을 주형 DNA로 사용하여 최종적으로 프라이머 1 및 프라이머 4를 이용하여 최종적으로 GFP 및 기질결합영역이 융합된 형태 PCR 산물을 얻기 위하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 수행조건으로 첫번째 변성 (denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며 이후 두번째 변성 (denaturation)은 94℃에서 1분간, 교잡 (annealing)은 56℃에서 1분간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장 (extension)을 한번 하였다. 이 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동법으로 약 950 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 HindIII으로 절단하여 DNA 절편을 얻고 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pTac99A(참조: pTac99A 플라스미드는 pTrc99A (Pharmacia Biotech., 스웨덴) 플라스미드에 PvuII and EcoRI 제한효소로 pKK223-3 (Pharmacia Biotech, 스웨덴)의 tac 프로모터를 절단하여 붙임으로써 제조된 플라스미드)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTacGFP-AfBD를 제작하였다. 아울러, pTacGFP-AfBD를 열충격 (heat shock) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 엠피실린 (ampicillin, 50 ㎎/L)과 박토-아가 (bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 XL1-Blue/pTacGFP-AfBD를 제조하였다.

상기 플라스미드 pTacGFP-AfBD를 다시 제한효소 EcoRI/HindⅢ로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 약 950 bp 크기의 GFP 및 기질흡착영역이 융합된 형태의 DNA 절편을 분리하였다. 상기 제조한 플라스미드 pTacGFP-AfBD에 삽입한 DNA 절편은 GFP N 말단에 6개의 히스티딘 잔기 및 C 말단에 알카리제네스 페칼리스 세포외 PHA 분해효소 기질결합영역을 포함하고 있다. 실시예에서는 목적단백질의 C 말단에 세포외 PHA 분해효소의 기질결합영역 단백질이 결합하는 형태를 사용하였고 본 발명의 요지상 N말단 또는 N-말단과 C-말단 중간에 세포외 PHA 분해효소의 기질결합영역 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명한 사실이다. 또한 재조합 단백질의 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 현재 널리 이용되어 왔다. 그러나 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하는 사례가 늘고 있어 실시예에 있어서는 대장균을 숙주세포로 사용하였으나 상기와 같은 다른 숙주세포를 다양하게 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 본 발명의 범위가 실시예에 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

실시예 3 : PHA 마이크로스피어를 이용하여 재조합 플라스미드 pTacGFP-AfBD로부터 생산된 단백질을 통한 단백질-단백질 상호작용 검사

강력하고 유도 가능한 tac 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pTacGFP-AfBD로 형질 전환된 대장균 XL1-Blue (Stratagene, 미국)에서 발현하였다. tac 프로모터는 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pTacGFP-AfBD로 형질 전환된 대장균 XL1-Blue의 경우 다음과 같이 GFP에 융합된 알카리제네스 페칼리스 세포외 PHA 분해효소 기질결합영역를 제조하였다. 형질 전환된 재조합 대장균을 LB 액체 배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pTacGFP-AfBD 재조합 플라스미드는 tac 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현 유도 (induction)는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도가 (OD)가 0.6일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다. 유도 발현 후 4시간 후에 배양액 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼 (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼 (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기 (Branson Ultrasonics Co., 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 ㎛ 여과기로 여과하였다. 여과한 용액은 브래드포드 단백정량법 (Bradford, M. et al., Anal. Biochem. 72;248-254, 1976)을 이용하여 정량 후 고정용액 (PBS, pH 7.4)으로 1 mg/mL 농도로 희석하여 준비한다. 준비된 용액을 상기 방법에 의해 제작된 마이크로스피어를 세척버퍼 (PBS, pH 7.4)로 잘 분산(suspension) 시킨 후 단백질 용액과 1:1 비율로 잘 섞어준 다음 37℃에서 30 분간 고정하고 세척버퍼 (PBS, pH 7.4)로 상온에서 3 회 세척하였다. 단백질이 고정된 마이크로스피어를 이용하여 토끼 항 GFP 항체를 37℃에서 30 분간 반응시킨 후 세척버퍼로 상온에서 3 회 세척 후 마지막으로 FITC가 접합된 마우스 항 토끼 면역글로블린을 37℃에서 30 분간 반응시킨 후 세척버퍼 (1% BSA, PBS, pH 7.4)로 상온에서 3 회 세척후 세척버퍼로 충분히 세척하고 그 결과를 FACSort^TM (Beckon Dickinson, 미국)를 이용하여 반응을 검출한다 (도 4). 도 4에서 보듯이, PHA 마이크로스피어 및 GFP 단백질에 비해, GFP-AfBD 융합단백질만이 마이크로스피어 상에 특이적으로 고정되고, 항 GFP 항체와 특이적으로 반응한 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 목적단백질로 GFP를 예시하였으나, 다른 다양한 단백질이나 리간드도 적용이 가능하다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명에서 제공되는 PHA 마이크로스피어 결합체는 목적단백질-반응단백질간의 반응, 목적단백질-반응리간드간의 반응, 목적리간드-반응단백질간의 반응 또는 목적리간드-반응리간드 간의 반응을 효율적으로 검출하는 데 유용하다. 기존의 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 시스템과 비교할 때, PHA 마이크로스피어 결합체를 이용한 본 발명은 모든 반응이 액상의 마이크로스피어 상에서 일어나므로 보다 안정적이고 높은 효율로 상기 여러 가지 반응을 검출할 수 있으며, 제조공정이 단순하여 높은 생산성과 경제성을 가진다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

도 1은 본 발명의 PHA 세포외 분해효소의 기질결합영역을 이용한 PHA 마이크로스피어를 이용한 단백질과 단백질 상호작용 검출 시스템의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 사용된 알카리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis) 및 녹색형광단백질(green flourescent protein, GFP) 융합 단백질 도메인 구조 (domain structure)를 보여주고 있다.

도 3은 본 발명을 위해 제조된 PHA 마이크로스피어의 결합체에 대한 SEM 분석사진이다.

도 4는 PHA 마이크로스피어를 이용한 GFP-세포외 분해요소의 기질결합영역 융합단백질이 특이적으로 결합한 것과 이를 다시 토끼 항 GFP 항체와의 반응을 통해 다시 FITC가 컨쥬게이션된 마우스 항 토끼 면역글로블린 항체와의 반응을 FACS를 통해 분석한 결과이다.

<110> KAIST <120> PHA Microsphere and the Method for Detecting a Reaction <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 cggaattcat gcatcaccat catcaccata gtaaaggaga agaacttttc a 51 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggccgatttc gtcgtcgctt tgtagagctc atccatgc 38 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gcgacgacga aatcggcc 18 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gcgaagcttt atggacaatt cccgacgatg 30

Claims (17)

1. PHA 마이크로스피어에 목적단백질 또는 목적리간드가 부착되어 있는 결합체에 있어서, 목적단백질 또는 목적리간드와 PHA 마이크로스피어 사이에 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 링커로 삽입되어 있어 목적단백질 또는 목적리간드가 상기 링커를 통해 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체.
2. 제1항에 있어서, 목적단백질이 PHA 분해효소의 기질결합 영역에 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 결합체.
3. 제2항에 있어서, 목적 단백질의 C-말단, N-말단 또는 N-말단과 C-말단의 사이에 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질.
4. 제1항에 있어서, 목적단백질은 효소 또는 항체인 것을 특징으로 하는 결합체.
5. 제1항에 있어서, 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지방산 또는 지질인 것을 특징으로 하는 결합체.
6. 제1항에 있어서, PHA는 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 고분자(polymer), 공중합체(copolymer) 또는 고분자 블렌드 (polymer blend)인 것을 특징으로 하는 결합체.
7. 제6항에 있어서, PHA는 탄소수가 3 내지 5인 짧은 탄소 사슬 길이 (short-chain length) 단량체를 함유하는 고분자인것을 특징으로 하는 결합체.
8. 제6항에 있어서, PHA는 탄소수가 6 내지 12인 중간 탄소 사슬 길이 (medium-chain length) 단량체를 함유하는 고분자인 것을 특징으로 하는 결합체.
9. 제6항에 있어서, PHA는 탄소수가 3 내지 5인 단량체 하나 이상과 탄소수가 6 내지 12인 단량체 하나 이상을 함유하는 공중합체인 것을 특징으로 하는 결합체.
10. 제6항에 있어서, PHA는 탄소수가 3 내지 5인 단량체로 구성된 것과 탄소수가 6 내지 12인 단량체로 구성된 것의 고분자 블렌드인 것을 특징으로 하는 결합체.
11. 제6항에 있어서, 상기 PHA는 a) 탄소수가 6 내지 12인 단량체를 함유하는 고분자, b) 탄소수가 3 내지 5인 단량체 하나 이상과 탄소수가 6 내지 12인 단량체 하나 이상을 함유하는 공중합체, 또는 c) 탄소수가 3 내지 5인 단량체로 구성된 것과 탄소수가 6 내지 12인 단량체로 구성된 것의 고분자 블렌드인 것을 특징으로 하는 결합체.
12. 제1항에 있어서, PHA 분해효소의 기질결합 영역은 알칼리제네스 페칼리스 (Alcaligenes faecalis)에서 유래된 것을 특징으로 하는 결합체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적단백질-반응단백질간의 반응, 목적단백질-반응리간드간의 반응, 목적리간드-반응단백질간의 반응 또는 목적리간드-반응리간드 간의 반응 검출방법.
14. 제13항에 있어서, 반응단백질은 효소 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 지방산 또는 지질인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제14항에 있어서, 반응 검출은 형광체로 표지된 항체를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 다음의 단계를 포함하는 목적 단백질 또는 목적 리간드가 PHA 분해효소의 기질결합 영역을 링커로 PHA 마이크로스피어에 연결되어 있는 결합체의 제조방법:

    a) 목적단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적 펩타이드를 코딩하는 핵산과 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 PHA에 기질특이성을 가지는 PHA 분해효소의 기질결합 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질 또는 목적 펩타이드와 PHA 분해효소의 기질결합 영역이 융합된 단백질을 제조하는 단계; 및

    b) 상기 융합 단백질을 탄소수가 3 내지 12인 단량체를 함유하는 PHA의 마이크로스피어에 고정시키는 단계.