KR100471605B1 - 군소 투-하이브리드 시스템 - Google Patents

군소 투-하이브리드 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 군소 투-하이브리드 시스템에 관한 것이다. 특히 본 발명은 기억과정에서 전사인자들간의 상호작용을 확인할 수 있으며, 단백질간의 상호작용에 관여하는 약물을 스크리닝하는 용도로 활용할 수 있는 4xGal4-LacZ 벡터, pNEX-Gal4DB-베이트(bait) 벡터 및 pNEXδGal4AD-프레이(prey) 벡터를 포함하는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공한다.

Description

군소 투-하이브리드 시스템{APLYSIA TWO-HYBRID SYSTEM}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 군소 투-하이브리드 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물에서의 신경전달과정 또는 기억기작에서 작용하는 단백질들간의 상호작용을 확인하고, 특정 단백질과 상호작용하는 다수의 단백질을 스크리닝 할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템에 관한 것이다.
[종래기술]
효모는 단세포 생물로서, 진핵세포이나 유전물질이 원핵 생물인 대장균(E. coli)의 3.5배 정도밖에 안되고, 한 세대가 짧고(약 90 분) 배양이 용이하며 그 게놈의 염기서열이 완전히 밝혀져 분자생물학에 좋은 모델로 사용되고 있다.
이러한 장점으로 인하여 효모를 이용한 투-하이브리드 시스템이 개발되었으나(Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.), 결합인자(associating factors), 단백질 수정(such as signal-induced phosphorylation) 또는 단백질 폴딩(folding) 등의 이유로 단백질들간의 상호작용을 모두 효모에서 확인하기에는 한계가 있다(Shioda T., Andriole S., Yahata T., and Isselbacher, K.J. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5220-5224). 그 예로, GAL4DB(DNA binding domain)-융합 SMAD4(bait)와 MSG1(prey)는 포유세포에서 상호작용을 하나, 효모에서는 성장인자 β의 부재로 이러한 상호작용이 형성되지 않는다.
이로 인하여, 효모시스템에서 검정하기 어려운 단백질간의 상호작용을 확인할 수 있는 포유세포 투-하이브리드 스크리닝 시스템들이 개발되고 있다(Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., and Zhu, L. 1997. BioTechniques 22: 350-352; Fearon, E.R., Finkel, T., Gillison, M.L., Kennedy, S.P., Casella, J.F., Tomaselli, G.F., Morrow, J.S. and Dang, C.V. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7958-7962; Shioda et al. 2000).
한편, 군소는 기억연구에서 중요한 동물모델시스템이다. 따라서, 군소에서의 기억에 작용하는 신호전달과정 또는 여기에 작용하는 각 전사촉진인자들간의 상호작용을 확인하기 위해서는 군소 투-하이브리드 시스템의 확립이 요구된다.
군소 장기기억에 관여하는 전사인자들로는 ApCREB1a, ApCREB2 및 ApC/EBP가 있다. 생체외 결합법(in vitro binding assay) 또는 효모 투-하이브리드 시스템을 이용한 이전연구들에서, 상기한 전사인자들간의 상호작용들은 루신 지퍼 도메인(basic-leucine zipper (bZIP) domain)에 의하여 매개되어짐이 확인된바 있으며(Landschulz, W.H., Johnson, P.F., and McKnight, S.L. 1989. Science 143: 1681-), bZIP 도메인은 이량체형성과 특이적 DNA 결합이라는 두 가지 기능을 수행한다(Landschulz, W.H., Johnson, P.F., and McKnight, S.L. 1988. Science 240: 1759-1764). ApCREB2와 ApC/EBP는 각각의 bZIP 도메인을 통하여 상호작용하며(Bartsch et al. 1995), ApCREB2의 bZIP 도메인은 포유류의 CREB1(ApCREB1a와 상동성이 있음)과 상호작용한다(Bartsch et al. 1995). 또한 쥐의 C/EBP은 교차결합분석에서 bZIP 도메인을 통하여 동종이량체를 형성시킴이 확인된 바 있다. 그러나, ApCREB1a 및 ApC/EBP간이 상호작용에 대해선 알려진 바가 없다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 기억과정에 작용하는 신호전달과정을 검정할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 신호전달과정에 작용하는 각 전사촉진인자들간의 상호작용을 확인할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 신호전달과정에 작용하는 각 전사촉진인자들간의 상호작용에 직접적으로 관여하는 아미노산 서열을 검정할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 특정 단백질에 대하여 상호작용하는 다수의 단백질들을 스크리닝 할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은(a) Gal4 결합부위 및 LacZ 유전자를 포함하는 리포터 벡터(4xGal4-LacZ), (b) pNEX 벡터내에 Gal4DB(Gal4 DNA binding domain)-베이트(bait) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 베이트 벡터(pNEX-Gal4DB-베이트 벡터) 및 (c) pNEXδ 벡터내에 Gal4AD(Gal4 transcription activation domain)-프레이(prey) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프레이 벡터(pNEXδ-Gal4AD-프레이 벡터)를 포함하는 군소 투-하이브리드 시스템을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 군소 투-하이브리드 시스템을 군소 신경세포에 미세주입하고, 군소 신경세포에서의 베타-갈락토시데이즈 발현을 X-gal염색하여 단백질들간의 상호작용을 검정하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 단백질들간의 상호작용에 필수적인 아미노산 서열을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 특정 단백질에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 기존의 투-하이브리드 시스템(Fields, S. and Song, O. 1989. Nature 340: 245-246)을 변형하여 기억과정에 관여하는 다수의 단백질들 간의 상호작용을 확인할 수 있는 군소 투-하이브리드 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 군소 투-하이브리드 시스템은
(a) Gal4 결합부위 및 LacZ 유전자를 포함하는 리포터 벡터(4xGal4-LacZ);
(b) pNEX 벡터내에 Gal4DB(Gal4 DNA binding domain)-베이트(bait) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 베이트 벡터(pNEX-Gal4DB-베이트 벡터); 및
(c) pNEXδ 벡터내에 Gal4AD(Gal4 transcription activation domain)-프레이(prey) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프레이 벡터(pNEXδ-Gal4AD-프레이 벡터)를 포함하며, 간략한 벡터구조는 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 4xGal4-LacZ 벡터는 4개의 Gal4 결합부위(서열번호 1, GENBANK/K02115)가 베타-갈락토시데이즈를 암호화는 LacZ 유전자 상위에 포함된 것으로, Gal4 결합부위에 Gal4 DNA 결합 도메인(Gal4DB)가 결합하고 Gal1 전사 활성화 도메인(Gal4AD)가 근접하여 존재할 때 베타-갈락토시데이즈를 발현시킨다. 4xGal4-LacZ 벡터는 통상의 군소 발현용 벡터에 4xGal4 및 LacZ를 삽입하여 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 일예로 공지된 CRE-LacZ(Kaang, B.-K., Kandel, E.R., and Grant S.G.N. 1993. Neuron 10: 427-435)의 CRE부위를 NsiI 제한효소부위를 이용하여 4xGal4로 치환하여 제조한다.
pNEX-Gal4DB(서열번호 2)-베이트(bait) 벡터는 군소에서 Gal4DB-베이트 융합단백질을 발현하는 벡터로, Gal4DB는 4xGal1 결합부위에 결합한다. 또한 Gal4DB-베이트 융합단백질에 융합된 베이트 단백질은 프레이 단백질과 상호작용 여부를 확인하기 위한 단백질이다.
pNEXδ-Gal4AD(서열번호 3)-프레이(prey) 벡터 역시 군소에서 Gal4AD-프레이 융합단백질을 발현하는 벡터로, 프레이 단백질은 베이트 단백질과의 상호작용 여부를 확인하기 위하여 사용되는 단백질이다. 또한 GalAD는 Gal4 단백질의 전사를 활성화시키는 도메인으로, 프레이 단백질이 4xGal4에 결합된 융합단백질의 베이트 단백질과 상호작용할 경우 4xGal4 하단에 있는 유전자를 발현시킨다(도 2).
상기 언급된 베이트 및 프레이 폴리뉴클레오타이드는 통상의 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드이며, 바람직하게는 기억과정에서 전사인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다. 본 발명에서는 일예로 ApCREB1a, ApCREB2 및 ApC/EBP를 베이트 및 프레이로 이용하여 상호간의 결합여부를 확인하였다. 그 결과 ApCREB2는 ApCREB1a 및 ApC/EBP와 각각 상호작용을 하나, ApCREB1a 및 ApC/EBP 서로간에는 상호작용이 없는 것으로 확인되었다(도 3 및 도 4).
본 발명의 군소 투-하이브리드 시스템은 단백질들 간의 상호작용을 검정하는 방법으로 이용할 수 있으며, 단백질들간의 상호작용에 필수적인 아미노산 서열을 스크리닝하는 방법으로 이용할 수 있다. 이러한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 종사하는 자라면 용이하게 실시할 수 있다.
또한 본 발명의 군소 투-하이브리드 시스템은 기억과정에 관여하는 특정단백질에 결합하는 다수의 단백질을 스크리닝하여 신호전달과정을 체계화시킬 수 있으며, 단백질 간의 상호작용을 억제 또는 강화시키는 약물을 스크리닝하는 용도로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 군소 투-하이브리드 시스템은 동물모델에서의 투-하이브리드 시스템을 확립하였을 뿐만 아니라 기억과정에서 전사인자들간의 상호작용을 확인할 수 있어, 향후 정신관련질환에 원인인자를 검정하고, 단백질간의 상호작용에 관여하는 약물을 스크리닝하는 용도로 활용할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 플라스미드 제조
군소 투-하이브리드 시스템에 사용되는 플라스미드는 도 1에 도시한 바와 같은 구조를 가지도록 제조하였다.
도 1에서, 4xGal4-LacZ(보고자 유전자)는 LacZ 프로모터 부위에 4개의 Gal4 DNA 결합부위를 포함한다. 상기 Gal4 DNA 결합부위에 Gal4DB가 결합한다.
pNEX-Gal4DB는 Gal4DB 도메인과 이에 전사인자의 bZIP 도메인이 융합된 형태로 포함하며 상기 전사인자의 bZIP 도메인이 베이트(bait)로 작용하고, pNEX-Gal4AD는 Gal4AD 도메인과 이에 전사인자 전체를 융합된 형태로 포함하며, 상기 전사인자 전체가 프레이(prey)로 작용한다.
pNEX2-루시퍼라제는 루시퍼라제 코딩 유전자를 포함하며, 미세주입시 양성대조군으로 사용된다.
도 1에서 도시한 구조체를 포함하는 벡터를 세포에 공동 주입하였을 때, 베이트와 프레이간에 단백질 상호작용이 이루어지면 4xGal4-LacZ 벡터에서 베타-갈락토시데이즈가 발현되며, 베이트와 프레이간 상호작용이 이루어지지 않으면 베타-갈락토시데이즈는 발현되지 않는다(도 2).
따라서, 4xGal4-LacZ의 베타-갈락토시데이즈 발현의 유무를 확인하여 베이트와 프레이간의 상호작용여부를 알 수 있다.
본 실험에서는 pAS99, pASCA, pACT12.1, pAS1 및 pACT2 벡터(Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.-H., and Elledge, S.J. 1993. Genes Dev. 7: 555-569)를 사용하여 군소 투-하이브리드 시스템에 필요한 플라스미드들을 각각 제조하였다(Bartsch, D., Ghirardi, M., Skehel, P.A., Karl, K.A., Herder, S.P., Chen, M., Bailey, C.H., and Kandel E.R. 1995. Cell 83: 979-992). 또한 pNEX(U51721), pNEX2 및 pNEXδ(U51722)은 군소 뉴런 발현용 벡터로 사용하였다(Kaang, B.-K. 1996. Neurosci. Lett. 221: 29-32).
1-1. pNEX-Gal4DB 군(베이트)
pAS1의 Gal4DB(Gal4 DNA binding domain), pAS99의 Gal4DB-CREB2bZIP 및 pASCA의 Gal4DB-C/EBPbZIP 각각을 pNEX-Gal4 벡터의 XhoI-BamHI 부위(pNEX-Gal4는 Gal4 DNA 이외의 전제 Gal4 부위는 삭제됨)에 삽입하여 pNEX-Gal4DB, pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP 및 pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP 각각을 제조하였다.
1-2. pNEXδGal4AD 군(프레이)
pACT2의 Gal4AD(Gal4 transcription activation domain) 및 pACT12.1의 Gal4AD-CREB2을 pNEXδ의 HindIII-BamHI에 삽입하여 pNEXδGal4AD 및 pNEXδGal4AD-C/EBP을 각각 제조하였다. 또한 pNEXδCREB1a의 CREB1a를 pNEXδGal4AD의 BamHI-SacI에 삽입하여 pNEXδGal4AD-CREB1a를 제조하였다.
1-3. 4xGal4-LacZ (보고자 벡터)
CRE-LacZ(Kaang, B.-K., Kandel, E.R., and Grant S.G.N. 1993. Neuron 10: 427-435)의 CRE 부분을 NsiI를 이용하여 4개의 Gal4 결합부위로 치환하였다. Gal4 결합부위는 베타-갈락토시데이즈를 암호하는 LacZ의 상위에 위치한다.
1-4. pNEX2-루시퍼라제(대조군)
루시퍼라제 유전자를 pNEX2에 삽입하여 발현되도록 하였다(Kaang 1996).
1-5. pNEXδhrGFP
phrGFP-1(Stratagene)의 푸른 형광 단백질(Green fluorescent protein; hrGFP) 코딩 부위를 BamHI-KpnI를 이용하여 수득하고, pNEXδ에 삽입하여 pNEXδhrGFP를 제조하였다.
1-6. pNEX-Gal4
pMA210으로부터 전체 Gal4 유전자를 HindIII-BamHI를 이용하여 수득하고, pNEX에 삽입하여 pNEX-Gal4를 제조하였다.
실시예 2: 군소 투-하이브리드 시스템을 이용한 장기기억 전사인자들 간의 상호작용 검증
미세주입(Microinjection), 베타-갈락토시데이즈/루시퍼라제 활성 분석 및 X-gal 염색은 공지방법(Kaang, B.-K. 1996. Neurosci. Lett. 221: 29-32)으로 실시하였다.
미세주입용 신경세포로는 군소 구신경절(buccal ganglia), 족신경절(pedal ganglia) 및 복부신경절(abdominal ganglia)을 이용하였고, 베타-갈락토시데이즈/루시퍼라제 분석시에는 베이트, 프레이, 보고자 유전자 및 대조군을 각각 70, 70, 760 및 50 ng/㎕의 농도로 미세주입하였다. 또한 pNEX-Gal4등의 단일 구조체를 주입하는 경우에는 단일구조제, 보고자 유전자 및 대조군은 각각 70, 760, 및 50 ng/㎕로 사용하였다. X-gal 염색시에는 베이트, 프레이, 보고자 유전자 및 pNEXδhrGFP를 각각 140, 140, 1520, 및 100 ng/㎕ 농도로 사용하였다.
신경절에 구조체들이 공동주입된 신경절들은 18 ℃에서 24 내지 48시간 배양한 다음 베타-갈락토시데이즈/루시퍼라제 분석 또는 X-gal 염색을 실시하였다.
도 2는 CREB2, CREB1a 및 C/EBP 서로간의 상호작용 정도를 베타-갈락토시데이즈 활성으로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 높이는 평균 베타-갈락토시데이즈 활성± SEM을 의미한다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA analysis of variance)으로 상호작용의 정도 차이를 측정하였다(F = 14.94, DF=7, p<0.0001)고, 전체 ApC/EBP와 ApCREB2 bZIP 도메인, 전체 ApCREB1a와 CREB2 bZIP 도메인, 전체 C/EBP와 C/EBP bZIP 도메인간의 상호작용을 SNK 검정(Student-Newman-Keuls test)으로 Gal4 AD와 Gal4 DB간의 상호작용과 비교하였다. 각 전사인자들을 포함하는 벡터들의 공동-미세주입에 따른 신경세포에서의 베타-갈락토시데이즈 활성정도를 도 3 및 표 1에 나타내었다.
실험군 공동-미세주입벡터 베타-갈락토시데이즈 활성(평균±SEM) LacZ 발현여부
가 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.63±0.14, n=5 O
4xGal4 DNA 결합부위에 작용하는 벡터 pNEX-Gal4
나 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.017±0.003, n=6 X
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB
Gal4AD를 포함하는 벡터 pNEXδ-Gal4AD
다 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.0030±0.0016, n=6 X
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP
라 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.0018±0.0006, n=7 X
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP
마 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.28±0.06, n=10 O
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP
Gal4AD를 포함하는 벡터 pNEXδGal4AD-C/EBP
바 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.015±0.004, n=8 X
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP
Gal4AD를 포함하는 벡터 pNEXδGal4AD-CREB1a
사 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.23±0.03, n=8 O
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP
Gal4AD를 포함하는 벡터 pNEXδGal4AD-CREB1a
아 보고자 벡터 4xGal4-LacZ 0.25±0.04, n=6 O
Gal4DB를 포함하는 벡터 pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP
Gal4AD를 포함하는 벡터 pNEXδGal4AD-C/EBP
표 1 및 도 3에서, ApCREB2는 bZIP 도메인을 통하여 CREB1a 및 C/EBP와 각각 상호작용함을 확인할 수 있으며, 반면에 CREB1a와 C/EBP는 서로간의 상호작용을 하지 않음을 확인할 수 있다.
도 4는 복부신경절의 X-gal 염색사진으로, A는 4xGal4-LacZ, pNEXδGal4AD-C/EBP, pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP 및 pNEXδhrGFP를 공동주입한 것이고, B는 4xGal4-LacZ, pNEXδGal4AD-CREB1a, pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP 및 pNEXδhrGFP를 공동주입한 것이다.
도 4에서, A 패널의 세포들은 X-gal로 염색됨이 확인되었으나, B 패널의 세포들에서는 염색이 관찰되지 않았다. 또한 GFP의 발현을 확인한 결과, A 패널의 세포들중 한 세포만이 GFP를 발현하였으나, B 패널의 세포들은 13개의 세포가 GFP를 발현함이 관찰되어 미세주입에는 오차가 없었음을 확인하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 군소에서의 투-하이브리드 시스템을 확립하여 기억과정에서 전사인자들간의 상호작용을 확인할 수 있으므로, 향후 정신관련질환의 원인인자를 검정하고, 단백질간의 상호작용에 관여하는 약물을 스크리닝하는 용도로 활용할 수 있다.
도 1은 군소 투-하이브리드 시스템의 벡터 구조를 도시한 것이고,
도 2는 군소 투-하이브리드 시스템의 작동 기작을 도시한 것이고,
도 3은 군소 투-하이브리드 시스템을 이용하여 ApCREB1a, ApCREB2 및 ApC/EBP간의 상호작용을 베타-갈락토시데이즈 활성정도로 나타낸 그래프이고,
도 4는 복부신경절의 X-gal 염색사진으로, A는 4xGal4-LacZ, pNEXδGal4AD-C/EBP, pNEX-Gal4DB-CREB2bZIP 및 pNEXδhrGFP를 공동주입한 것이고, B는 4xGal4-LacZ, pNEXδGal4AD-CREB1a, pNEX-Gal4DB-C/EBPbZIP 및 pNEXδhrGFP를 공동주입한 것이다.
<110> KAANG, Bong-Kiun <120> APLYSIA TWO-HYBRID SYSTEM <130> dpp20022597 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 tgaagtacgg attagaagcc gccgagcggg tgacagccct ccgaaggaag actctcctcc 60 gtgcgtcctc gtcttcaccg gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg 120 ctccg 125 <210> 2 <211> 517 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60 tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120 tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180 ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240 ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300 aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360 acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420 caaagacagt tgactgtatc gccggaattc atggcttacc catacgatgt tccagattac 480 gctagcttgg gtggtcatat ggccatggag gccccgg 517 <210> 3 <211> 481 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 atggataaag cggaattaat tcccgagcct ccaaaaaaga agagaaaggt cgaattgggt 60 accgccgcca attttaatca aagtgggaat attgctgata gctcattgtc cttcactttc 120 actaacagta gcaacggtcc gaacctcata acaactcaaa caaattctca agcgctttca 180 caaccaattg cctcctctaa cgttcatgat aacttcatga ataatgaaat cacggctagt 240 aaaattgatg atggtaataa ttcaaaacca ctgtcacctg gttggacgga ccaaactgcg 300 tataacgcgt ttggaatcac tacagggatg tttaatacca ctacaatgga tgatgtatat 360 aactatctat tcgatgatga agatacccca ccaaacccaa aaaaagagat ctctatggct 420 tacccatacg atgttccaga ttacgctagc ttgggtggtc atatggccat ggaggccccg 480 g 481

Claims (6)

  1. (a) Gal4 결합부위 및 LacZ 유전자를 포함하는 리포터 벡터(4xGal4-LacZ);
    (b) pNEX 벡터내에 Gal4DB(Gal4 DNA binding domain)-베이트(bait) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 베이트 벡터(pNEX-Gal4DB-베이트 벡터); 및
    (c) pNEXδ 벡터내에 Gal4AD(Gal4 transcription activation domain)-프레이(prey) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프레이 벡터(pNEXδ-Gal4AD-프레이 벡터)
    를 포함하며,
    상기 베이트 폴리뉴클레오타이드 또는 프레이 폴리뉴클레오타이드는 ApCREB1a, ApCREB2 및 ApC/EBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 군소 투-하이브리드용 벡터.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 따른 군소 투-하이브리드용 벡터를 군소 신경세포에 미세주입하고, 군소 신경세포에서의 베타-갈락토시데이즈 발현을 X-gal염색하여 단백질들간의 상호작용을 검정하는 방법.
  5. 제 4항의 방법으로 단백질들간의 상호작용에 필수적인 아미노산 서열 스크리닝 방법.
  6. 제 1항에 따른 군소 투-하이브리드용 벡터를 약물이 처리된 군소 신경세포에 미세주입하고, 군소 신경세포에서의 베타-갈락토시데이즈 발현을 X-gal염색하여 베이트 폴리뉴클레오타이드와 프레이 폴리뉴클레오타이드간의 상호작용을 검정하는 것을 포함하는 베이트 폴리뉴클레오타이드와 프레이 폴리뉴클레오타이드간의 상호작용을 조절하는 약물 스크리닝 방법.
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